KR20070110838A - 인플루엔자 바이러스의 구제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 백신 제조 분야에 관한 것이다. 인플루엔자 백신은 50년에 걸쳐서 닭의 발육란에서 제조되어 왔지만, 최근에는 백신 제조를 위한 세포 배양물을 개발하고자 하는 상당한 노력이 있었다. 본 발명은 인플루엔자 유전자 절편 및 박테리오파아지 폴리머라제 프로모터를 포함하는 핵산 또는 당해 핵산의 상보적 쇄, 및 목적하는 인플루엔자 바이러스를 생산할 수 있는, 이러한 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 세포로부터 유래된 세포 또는 물질, 및 본 발명에 따른 바이러스 입자로부터 유래된 바이러스 또는 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
인플루엔자 백신, T7 프로모터, 박테리오파아지 폴리머라제
Description
본 발명은 인플루엔자 바이러스 백신 제조 분야에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(오르토믹소비리대; Orthomyxoviridae)는 절편형 게놈(segmented genom)을 갖는, 외피를 갖는 네가티브 쇄 RNA 바이러스이다[참조: Taubenberger and Layne, Molecular Diagnosis Vol. 6 No. 4 2001]. 이들 바이러스는 핵단백질 및 매트릭스 단백질 간의 중요한 항원성 차이에 근거하여 다음의 2가지 속으로 나뉜다: 인플루엔자 A 및 B를 포함하는 한 속 및 인플루엔자 C로 이루어진 다른 속. 이들 3가지 바이러스 유형은 또한 병원성 및 게놈 구성에 있어서도 상이하다. A형은 광범위한 온혈 동물에서 발견되지만, B형 및 C형은 주로 사람 병원체이다. 인플루엔자 A 바이러스는 비리온의 표면으로부터 돌출되어 있는 NA 표면 및 헤마글루티닌(HA)의 항원성 특징에 따라서 추가로 세분된다. 현재 15가지의 HA 및 9가지의 NA 아유형이 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 조류, 돼지, 말, 사람 및 기타 동물을 포함하는 광범위한 동물을 감염시킨다. 수생조류는 인플루엔자 A의 모든 공지된 아유형에 대한 천연 저장소 및 아마도 범유행성 사람 인플루엔자 계통(strain)에 대한 유전 물질 공급원으로서 작용한다.
관련 파라믹소바이러스와 달리, 인플루엔자 바이러스는 절편형 RNA 게놈을 갖고 있다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 유사한 구조를 갖는 반면에, 인플루엔 자 C는 보다 다양하다. A형 및 B형 바이러스는 하나 이상의 단백질을 각각 암호화하는 8개의 분리된 유전자 절편을 각각 함유하며, C형은 A형 및 B형의 절편 4 및 6이 조합된 7개의 분리된 절편을 함유한다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 3개의 단백질 돌출부로 덮여 있다: HA, NA 및 매트릭스 2(M2). 인플루엔자 C 바이러스는 오직 1개의 표면 당단백질을 갖고 있다. 각각의 인플루엔자 RNA 절편은 핵단백질(NP)로 캡시드화되어 리보뉴클레오타이드핵단백질(RNP) 복합체를 형성한다. 3개의 폴리머라제 단백질은 RNP 복합체의 한쪽 말단에 결합된다. RNP는 내재성 부분으로서 매트릭스 단백질(매트릭스 1)을 갖는 막으로 둘러쌓여 있다. 외피의 인지질 부분은 세포성 숙주 막으로부터 유래한다. 바이러스 입자내에서는 비구조 단백질 2(NS2)도 발견된다.
인플루엔자 바이러스의 명명법에 대한 세계보건기구(WHO)의 지침은 다음과 같다. 먼저, 바이러스의 유형이 지정되고(A, B 또는 C), 이어서 숙주(비사람인 경우), 분리 장소, 분리 번호 및 분리 년도(슬래시로 나뉨)가 지정된다. 인플루엔자 A의 경우, HA 및 NA 아유형은 괄호 안에 표시된다. 예를 들면, 2000년도부터 2001년 동안 최근의 3가 백신에 포함된 계통은 A/파나마/2007/99(H3N2), A/뉴칼레도니아/20/99(H1 N1) 및 B/야마나시/16/98이다. 1977년 이래로 사람들 사이에 유행한 2가지 인플루엔자 A 아유형은 H1N1 및 H3N2이다.
인플루엔자 바이러스는, 이의 RNA 폴리머라제 복합체가 교정 활성을 갖지 않기 때문에, 복제 동안 점 돌연변이를 축적시킨다. 표면 당단백질의 항원성 부분내의 아미노산을 변화시키는 돌연변이는 바이러스 계통이 기존의 면역을 피할 수 있 도록 함으로서 바이러스 계통에 선택적 이점을 제공할 수 있다. HA 분자는 특정 숙주 세포상의 수용체에 결합함으로써 감염을 개시한다. HA 단백질에 대한 항체는 수용체 결합을 방지하고 동일한 계통에 의한 재감염을 방지하는데 있어 매우 효과적이다. HA는, 현재 퍼져있는 HA 유전자의 돌연변이가 항체 결합을 파괴하는 항원 소변이(antigenic drift) 또는 바이러스가 새로운 아유형의 HA를 획득하는 항원 대변이에 의해, 이미 획득된 면역을 피할 수 있다. 항원 소변이 압력은 HA 분자에 걸쳐서 동일하지 않은데, 이때 양성적으로 선택된 변화는 HA 단백질의 구형 헤드상에서 주로 일어난다. 이러한 변화는 또한 NA보다 HA에 보다 큰 정도로 축적된다. 다른 인플루엔자 단백질에서의 변화는 보다 서서히 일어난다. 마찬가지로, 항원 소변이 압력은 사람-적응된 인플루엔자 계통에서 가장 크고, 돼지- 및 말-적응된 계통에서 중간 정도이고, 조류-적응된 계통에서 가장 적다.
인플루엔자 바이러스는 절편형 게놈을 갖기 때문에, 2가지의 상이한 계통이 동일한 숙주에 동시 감염하는 것은 모 유전자 절편의 상이한 조합을 함유하는 신규한 재분류된 인플루엔자 계통의 생산을 유도할 수 있다. 15개의 HA 아유형이 야생 조류에 존재하는 것으로 공지되어 있으며 사람에게는 새로운 것인 HA의 공급원을 제공한다. 사람에 퍼져있는 항원 대변이에 의한 새로운 아유형과 인플루엔자 계통의 출현은 1957년 및 1968년의 마지막 2가지 인플루엔자 범유행성의 원인이 되었으며, 1918가지의 인플루엔자 범유행의 원인이었을 가능성이 크다. 범유행성 인플루엔자 바이러스의 출현에 관해 알려진 모든 것과 일치하기 위해, 범유행성 계통은 현재 만연한 것과 항원적으로 전혀 다른 HA를 가져야만 한다; 이러한 HA는 60년 내 지 70년 동안 사람에 퍼지지 않을 수 있다. 1957년 및 1968년 모두에서, 범유행은 HA에서의 변이로부터 야기되었으며, 두 경우 모두에서 범유행성 계통의 HA는 조류 계통과 밀접하게 관련되었다. 범유행성의 절대적 요건중 하나가 HA가 변화되어만 한다는 것이지만, 나머지 바이러스가 어느 정도로 변화될 수 있는지 또는 변화되어야 하는지는 공지되어 있지 않다. 오로지 1957년 및 1968년의 범유행 바이러스가 직접적 연구를 위해 사용될 수 있으며, 분자 고고학(molecular archeology)을 사용하여 1918가지의 인플루엔자 바이러스가 특성화되어 있다. 1957년에, 3가지 유전자, HA, NA 및 폴리머라제 복합체(PB1)의 서브유닛이 조류-유사 유전자에 의해 대체되었다. 1968년에는 오직 HA 및 PB1만이 대체되었다.
인플루엔자 감염은 바이러스 분리, 적혈구응집 억제(HI) 시험, 면역분석에 의한 항원 검출, 혈청학적 시험, 분비에서의 NA 활성의 입증 또는 분자 기반 분석에 의해 특이적으로 진단될 수 있다. 표본을 객담, 비인두 면봉 또는 완충된 염 용액을 가글하여 수득된 비인두 세척액으로서 수집할 수 있다. 인플루엔자 진단에 대한 표준은 배양 후의 면역학적 특성화였다. 혈청학적 분석은, 예민 혈청(acute sera) 및 회복기 혈청 둘다의 수집을 요구하기 때문에, 인플루엔자 감염에 대한 정확하지만, 회고적인(retrospective) 방법을 제공한다.
인플루엔자 바이러스는 닭의 발육란 또는 다수의 조직 배양 시스템에서 성장시킬 수 있다. 트립신(HA의 절단 활성화를 위해)의 부가는 인플루엔자 바이러스가 매딘-다비 개 신장(MDCK) 세포 및 기타 세포주에서 증식할 수 있도록 한다. 백신 생산을 위한 1차적 방법은 여전히 난에서의 인플루엔자 바이러스의 배양이다. 세 포주에서의 배양은 통상 사람 인플루엔자 바이러스(A형 및 B형 둘다)의 1차 분리를 위해 사용된다. 많은 사람 인플루엔자 바이러스는 발육란의 요막공간에서 직접 배양할 수 있다. 일부 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 요막공간에의 적응 후에 양막공간에서의 초기 배양을 요구한다. 배양물 분리 후, 대부분의 인플루엔자 분리체는 면역분석 또는 면역형광을 사용하여 명확하게 동정된다. 인플루엔자 바이러스의 HA 분자가 호흡기 세포의 표면상의 시알산 잔기에 결합하여 바이러스가 진입하게 된다.
인플루엔자 계통은 시험관내에서 적혈구를 응집시키는 인플루엔자 바이러스의 능력을 이용함으로써 항원과 관련해 특성화될 수 있다. 항-HA 항체는 응집을 억제할 수 있다. 따라서, 적혈구응집 억제(HI) 분석은 인플루엔자 계통을 특성화화기 위해 사용되는 표준 방법중 하나이다. HI 분석을 사용하여, 샘플 계통이 최근의 백신 계통과 면역학적으로 관련되는지(즉, 교차-반응성인지)를 결정한다. 일반적으로 페렛에서 생산되는 형결정용 혈청(typing sera)을 일련의 2배 희석액 중의 웰에 부가하고, 실험실 작업자들이 현탁된 적혈구 및 응집된 적혈구를 관찰하여분석 웰을 스코어화한다. 대부분의 상황에서, 혈청의 패널은 백신 및 참조 계통에 대해 샘플을 매치시키기 위해 사용되며, 임의의 소정의 인플루엔자 유행 기간 동안, 대다수의 샘플 계통은 HI 분석에 의해 성공적으로 매치된다. WHO는 지침을 제공하고 있으며 WHO 협력 센터는 개개 바이러스 계통의 항원성 특징의 동정에 관한 지침을 제공하고 있으며, 이들 계통을 수득하기를 희망하는 이들에게 이들 계통을 제공할 수 있다. 샘플 계통은 A/모스크바/10/99 (H3N2)-유사, A/뉴칼레도니아 /20/99 (H1N1)-유사 및 B/베이징/184/93-유사 바이러스와 같이 면역원성 계도(系圖)에 따라서 분류된다. HI 분석에서 특성화에 실패한 샘플 계통에 대해서, 실험실 작업자들은 이들 샘플 계통을 페렛에게 접종시켜 계통-특이적 항혈청을 제조해야 한다. 새로운 항혈청이 준비되면, HI 분석을 상기한 바와 같이 다시 수행한다. 새로운 혈청이 교차-반응성(일반적으로 샘플과 백신 계통간의 4배수 차이로서 정의됨)에서 현저한 차이를 보이는 경우, 이를 통상의 실험실 패널에 혼입시키고 새로운 유행성 계통을 찾아내는데 사용한다. 따라서, HI 분석은 백신 계통 선별을 위한 인플루엔자 바이러스 감시 노력에서 매우 중요하며 항원 소변이를 평가하는 가장 통상적으로 사용되는 방법이 된다.
인플루엔자 계통은 개개 유전자 절편의 서열 비교에 의해 유전학적으로 특성화될 수 있으며, 다시, WHO 지침 및 WHO 협력 센터는 인플루엔자 게놈을 포함하는 RNA 절편의 개별적 정체의 동정에 관한 지침을 제공한다; 핵단백질(NP), 염기성 폴리머라제 1(PB1), 염기성 폴리머라제 2(PB2), 산 폴리머라제(PA), 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 매트릭스 단백질(M 1 및 M2) 및 비구조 단백질(NS1 및 NS2)을 암호화하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 핵산 절편, 및 핵단백질(NP), 염기성 폴리머라제 1(PB1), 염기성 폴리머라제 2(PB2), 헤마글루티닌-뉴라미다제 유사 당단백질(HN), 매트릭스 단백질(M1 및 M2) 및 비구조 단백질(NS1 및 NS2)을 암호화하는 인플루엔자 C 바이러스 핵산 절편.
예를 들면, 항원성 분석, 핵산 서열 비교 및 백신 바이러스의 동정을 위해서 참조 계통을 인플루엔자에 대한 참조 및 조사에 관한 WHO 협력 센터(WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, 주소: 45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia (팩스: +61 3 9389 1881 , 웹사이트: http//www. influenza centre.org); 인플루엔자에 대한 참조 및 조사에 관한 WHO 협력 센터, 감염병 국립 연구소(WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute of Infectious Diseases, 주소: Gakuen 4-7-1, Musashi-Murayama, Tokyo 208- 0011 , Japan (팩스: +81 42 5610812 또는 +81 42 5652498); 인플루엔자의 감시, 역학 및 통제를 위한 WHO 협력 센터( Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza, Centers for Disease Control and Prevention, 주소: 1600 Clifton Road, Mail stop G 16, Atlanta, GA 30333, United States of America (팩스: +1 404 639 23 34)); 또는 인플루엔자에 대한 참조 및 조사에 관한 WHO 협력 센터, 국립의학연구소(WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute for Medical Research, 주소: The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, England (팩스: +44 208 906 4477))에 요청할 수 있다. 갱신된 역학 정보는 주소[http://www.who.int/influenza]의 웹 사이트 및 주소 [http://www.who.int/flunet Awareness of the impact of influenza]의 지리학적 정보 시스템인 FluNet에서 입수할 수 있다. 인플루엔자의 영향 및 건강 및 이의 예방의 경제학적 이익에 대한 인식이 점차 증가하고 있으며, 과거 수세기는 백신접종의 사용 및 이익을 조사하였으며, 다수의 항-인플루엔자 약물이 상당히 증가하고 있다. 많은 국가에서 보다 길어진 기대 수명의 결과로서, 보다 많은 사람들이 합 병증의 위험에 쳐해 있으며, 인플루엔자 유행 동안 건강 관리 시스템에 대한 부담이 보다 널리 인식되고 있으며, 보다 빈번한 국제 여행은 바이러스 확산의 기회를 제공하였으며, 새로운 제품 도입은 당해 질환의 예방 및 치료에 대한 선택의 기회를 증가시켰다. 약 50개국들이 정부 지원하의 국제적 인플루엔자 면역화 프로그램을 갖고 있으며, 다른 많은 국가에서 백신이 이용가능하다. 백신 사용에 관한 구체적 권장사항은 다양하지만, 일반적으로 기존의 만성 의학적 상태로 인해 중증 질환의 위험이 증가된 노령층 및 6개월령 이상의 개체에 대한 연간 면역화를 수반한다. 일부 국가에서, 백신은 의학적 위험이 증가된 이들에게까지 인플루엔자가 확산되는 것을 감소시키기 위해 사용된다. 회원국은 전반적 공중보건 우선권의 범주에서 인플루엔자 예방 활동의 이익을 고려해야할 필요가 있다. 불활성화된 백신은 이들이 함유하는 전체 바이러스 입자, 부분적으로 파괴된 바이러스 입자(분할 백신) 또는 정제된 외피 항원(서브유닛 백신)을 함유하는지에 따라서 몇가지 유형으로 분류된다. 일부 서브유닛 백신은 보조제 또는 전달 시스템과 배합되었다.
적은 수의 국가들만이 특정 대상 그룹에 대해 약독화된 생 인플루엔자 백신을 허가하였다. 러시아 연방에서는 1개 백신의 2개의 상이한 제형이 건강한 성인 및 아동에서 사용되었으며, 다른 생 백신은 널리 시험되었지만 아직 허가되지 않았다. 약독화된 생 백신이 보다 널리 이용가능해질 때까지, 이들 생 백신은 일반적으로 아직까지는 인플루엔자 예방용으로 권장되지 않고 있다.
2가지 항바이러스제 부류가 인플루엔자 예방 및 치료를 위해 개발되었다. M2 억제제인 아만타딘 및 리만타딘은 인플루엔자 A 바이러스의 치료로 제한되며, 감염의 예방에서 효과적인 것으로 또한 보고되었다. 두 제품 모두 일부 부작용을 유발하며, 현저한 신경학적 부작용은 아만타딘을 사용한 경우에 보다 통상적이다. 자나미비르 및 오셀타미르와 같은 뉴라미다제 억제제은 최근에 다수의 국가에서 A형 및 B형 인플루엔자의 치료용으로 허가되었으며, 예방에 효과적인 것으로 보고되었다. 이들 두 항바이러스제 부류를 투여받은 환자 모두에서 내성 돌연변이체가 검출되었다. 이것은 통상적으로 중요한 공중보건 문제로서 고려되지는 않지만, 이들 약물이 매우 대규모로 사용된다면 상황은 바뀔 수 있다.
WHO는 82개국에 위치한 110개의 국제 인플루엔자 센터 및 아틀란타(미국), 런던(영국), 멜버른(호주) 및 됴코(일본)에 위치한 인플루엔자 참조 및 조사에 대한 4개의 WHO 협력 센터에 의해 작동되는 전세계적 감시 프로그램을 유지하고 있다. 이들 센터는 출현 계통과 유행 잠재성에 대한 조기 경보 시스템을 제공한다. 당해 시스템은 중요한데, 그 이유는 인플루엔자 백신의 효능이 이들 인플루엔자 백신이 현재 퍼져있는 계통을 함유하지 않는다면 감소되기 때문이다. WHO는 2월에는 북반구에서 사용되는 백신에 대한 및 9월에는 남반구에서 사용되는 백신에 대한, 세계보건기구에 의해 발행되는 주간 역학 기록(Weekly Epidemiological Record)(예를 들면, issue 9, 2004, 79, page 88 또는 http://www.who.int/wer 참조)]에서 찾아볼 수 있는 백신 조성물에 대한 권장사항을 공표하고 있다. 인플루엔자가 적도 지역에서는 계절적 패턴이 거의 정의되지 않았기 때문에, 역학적 고려사항이, 이러한 권장(2월 또는 9월)중 어느 것이 적도 국에서 사용하기 위한 백신용으로 적절한지에 영향을 줄 것이다.
협력 센터는 국내 센터에 의해 제출된 인플루엔자 분리체의 항원성 및 유전적 분석을 수행한다. 항원성 변화의 증거가 관찰되는 경우, 이는 변이의 역학적 중요성을 평가하기 위해 역학 데이타와 대조 확인된다. 대표적 분리체를 백신접종 전과 후에 수집된 사람 혈청의 패널을 사용하여 현행 백신과 비교하여, 현행 백신이 이들 바이러스로부터 보호하는 것으로 예상될 수 있을지를 평가한다. WHO의 연간 백신 권장사항의 공표 후, 고성장 계통이 개발되어 참조 바이러스로서 제조업자에게 제공되어, 백신 제조를 위한 종균 바이러스를 생산하는데 도움이 되고 있다. 인플루엔자 백신의 안정성 및 효능에 대한 시험은 바이러스 불활성화, 미생물 멸균성, 바이러스를 파괴하기 위해 사용되는 화학물질의 측정 및 권장된 항원 농도의 확인을 포함한다. 백신이 WHO 요건을 충족하는 것이 권장되지만, 국내 통제 기관이 각국에서 사용되는 특정한 백신 바이러스를 승인해야 한다. 국내 공중보건기관은 백신 사용에 관한 권장을 책임지고 있다. 또한, WHO는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방에 관한 권장을 공표하였다[참조: WER No. 35, 2002, pp. 281-288]. 인플루엔자 백신은 50년에 걸쳐서 닭의 발육란에서 생산되어 왔지만, 최근에는 백신 제조를 위한 세포 배양 시스템을 개발하고자 하는 상당한 노력이 있었다. 닭의 발육란에서의 통상의 표준 방법은 극히 번거로우며 다음과 같은 몇가지 주요 단점을 갖고 있다: 수백만개의 난이 요구되고, 미국에서 계절마다 1000만개 이상의 난이 개별적으로 접종되고 수거되어야 한다; 난 단백질로부터의 유리를 보장하여 알레르기의 위험을 최소화하기 위해 다수의 여과 및 원심분리 단계와 함께 광범위한 정제가 요구된다; 자동화하기 어렵고 노동 집약적인, 즉 시간 소모적이고 오염되기 쉬운 많은 제조 단계가 요구된다. 따라서, 기존의 제조 방법을 대체하기 위한, 인플루엔자 바이러스의 성장을 뒷받침할 수 있는 세포의 특수한 계통을 사용할 수 있고 자동화된 생물반응기, 바이오캐리어(biocarrier) 또는 기타 세포 배양 시스템에서의 성장에 적합화된 제조 프로토콜을 개발함으로써, 산업상 현행 백신 제조 기술보다 탁월한 장점을 나타내는 백신 제조 기술의 개발이 장기간 요구되어 왔다.
흔히, VERO 세포와 같은 잘 특성화된 연속적 세포주 또는 기타 영장류 기원의 세포가 인플루엔자 바이러스 백신 제조용으로 제안되고 있다. 그러나, 현재 등록기관은 사람에서의 사용이 의도되는 영장류 세포에서 제조된 백신을 거부하고 있다. 이러한 보다 많은 기관들은 영장류 세포(예: Vero)로부터 유래된 모든 생성물이 나머지 온전한 세포를 함유하지 않도록 권고하였으며, 이들 세포에서 제조된 생성물 중의 영장류 세포 DNA와 같은 잔류 물질의 수준에 관한 지속적 염려를 표명하고 있다. 세계보건기구(WHO)는 현재 연속적 세포주로부터의 잔류 DNA의 한계치를 비경구 투여되는 경우 바이러스 백신의 용량당 10ng로서 채택하고 있으며, 등록기관은 DNA와 같은 잔류 영장류 세포 물질에 의해 야기되는 위험 수준을 바이러스 백신에 대한 사례별로 지속적으로 고려하고 있다.
오랫 동안, 인플루엔자 A 바이러스의 심도있는 조사는 효과적 역유전학 시스템의 이용가능성 부족에 의해 방해되었다. 사실 네가티브 쇄 RNA 바이러스에 대한 초창기 역유전학 기술이 인플루엔자 A 바이러스용으로 개발되었지만, 전적으로 재조합 DNA로부터의 이러한 바이러스의 구제(rescue)는 최근에서야 달성되었다.
재조합 인플루엔자 바이러스는, 진핵세포를 각각의 게놈성 바이러스성 RNA (vRNA) 절편이 RNA 폴리머라제 I에 의해 전사되는 8개 플라스미드의 한 셋트 및 핵단백질(NP) 및 폴리머라제 단백질 PB1, PB2 및 PA를 발현하는 4개의 추가 플라스미드의 한 셋트로 형질감염시켰을 때 생산되었다. 이들 12-플라스미드 시스템을 사용한 경우에 보고된 바이러스 생산의 효율성은 비교적 낮았다.
헤마글루티닌(HA), 뉴라미다제(NA), 매트릭스 단백질 1 및 2(M1 및 M2) 및 비구조 단백질 2(NS2)를 암호화하는 5개의 추가 플라스미드의 공동 발현시, 상청액에서의 바이러스 역가는 증가될 수 있었다. 이들 12- 및 17-플라스미드 시스템의 정교한 변형은 이방향성 벡터를 사용하여 형질감염된 플라스미드의 수를 8개까지 감소시킨 것이다. 당해 시스템을 사용함으로써, 네가티브 쇄 vRNA 및 포지티브 쇄 mRNA를 동일 플라스미드로부터 합성할 수 있다.
재조합 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 능력은 장래의 인플루엔자 바이러스 조사를 촉진하지만, 역유전학 시스템에 관여하는 폴리머라제와 가장 흔히 사용되는 세포 종 간의 부적합성으로 인해, 백신 제조에서 사용되는 대부분의 세포 시스템(비록 모든 세포 시스템은 아니지만)이 상기한 재조합 바이러스의 복제를 허용하지 않거나 단지 적은 정도만 복제를 허용한다는 사실을 고려하면, 역유전학 기법으로 수득된 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 백신 제조에서 충분히 높은 역가로 사용하기 위한 실질적 해결책은 아직 밝혀지지 않았다. 인플루엔자 A 바이러스는 네가티브 쇄 RNA 바이러스이다. 이는 1회의 복제 사이클에서, 3가지 종류의 RNA: 네가티브 센스 vRNA, 포지티브 센스 cRNA 및 포지티브 센스 mRNA가 생산됨을 의미한다. 바이러스성 RNA(vRNA)와 달리, mRNA는 캡핑되어 있고 폴리(A) 테일을 갖고 있다. mRNA의 폴리(A) 테일의 첫번째 A 잔기는 전사 종결/폴리아데닐화 시그날로서 간주되는 게놈내의 U 잔기의 짧은 신장부와 매치된다. 폴리머라제가 이러한 U 잔기의 신장부에 도달하면, 반복적 역행 미끄러짐(backward slippage) 사이클을 겪게 되고 이러한 방식으로 mRNA의 전체 폴리(A) 테일을 생성시키는 것으로 사료된다.
발명의 개요
본 발명은 상이한 종의 세포 유형에 적용될 수 있는 인플루엔자 바이러스의 역유전학 시스템을 제공한다. 폴리머라제 I은 리보솜 RNA를 전사시키고 성장하는 세포에서 풍부하게 발현되는 핵인 효소이다. vRNA와 마찬가지로 rRNA는 캡과 폴리(A) 테일을 갖지 않으며, 따라서 폴리머라제 I은 cDNA로부터의 vRNA의 생산을 위해 사용될 수 있다. 폴리머라제 I에 의해 바이러스성 cDNA가 전사되면, 정확한 5' 및 3' 말단을 갖는 바이러스 유사 RNA가 생산될 수 있다. 그러나, 폴리머라제 II의 전사 기구는 흔히 상이한 종의 유전자와 양립가능한 반면, 폴리머라제 I 전사는 절대적이지는 않지만 엄격한 종 특이성을 나타낸다. 이러한 종-특이성은 전사 인자와 프로모터와의 상호작용에 의해 부여되며, 인자들 간의 단백질-단백질 상호작용에 의해서는 보다 적은 정도로 부여된다. 폴리머라제 I에 기반한 역유전학 시스템의 종-특이성은 백신 개발에 있어 주요한 불이익이 되며, 그 한가지 이유는 개 또는 조류 폴리머라제 I 프로모터와 같은 사람이 아닌 세포 종을 위한 폴리머라제 I 프로모터가 아직 기술된 바 없기 때문이고, 산업적으로 잘 정의된 개(즉, 매딘 다비 개 신장(Madin Darby Canine Kidney; MDCK)) 또는 조류 세포(닭 배아 섬유모 세포(CEF))는 흔히 인플루엔자 바이러스 백신 제조를 위해 사용되기 때문이다.
본 발명은 인플루엔자 유전자 절편 및 박테리오파아지 폴리머라제 프로모터를 포함하는 핵산 또는 상기 핵산의 상보적 쇄를 제공한다. 비절편형 바이러스와 달리 T7 폴리머라제가 효과적이지 않은 것으로 사료된 명백한 예외 바이러스가 인플루엔자 바이러스(이의 제조는 폴리머라제 및 클로닝된 cDNA로부터의 핵단백질 이외에도 8개의 바이러스성 RNA의 합성의 가중된 복잡함을 수반한다)였음을 나타내는 뉴만 및 가와오카(Neumann & Kawaoka)[참조; Virology 287, 243-240, 2001]의 발견과 대조적으로, 본 발명은 이러한 박테리오파아지-폴리머라제 기반 역유전학 기술을 위한 플라스미드 벡터 및 이것이 함유하는 요소에 관한 현저한 유연성을 제공한다. 예를 들면, 본 발명자들은 vRNA 또는 cRNA-유사 RNA 분자를 생산하기 위해 박테리오파아지 T7의 RNA 폴리머라제를 사용하였지만, SP6 RNA 폴리머라제와 같은 다양한 다른 RNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 유전자 절편 및 T7 프로모터를 포함하는 핵산 및 당해 핵산의 상보적 쇄를 제공하며, 이는 본 발명자들이 T7 프로모터의 제어하의 인플루엔자 바이러스의 유전자 절편의 발현에 근거하는 본 발명의 시스템을 제조할 수 있도록 하였다. 하나의 양태에서, 폴리머라제 터미네이터는 결여된다. 상기 핵산이 프로모터 다음에 1개 또는 2개의 추가 구아닌 잔기를 포함한 것이 바람직하다. 백신 목적상, WHO에 의해 백신용으로 권장되는 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 유전자 절편을 포함하는 본 발명에 따른 핵산이 제공된다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 A 유전자 절편 및 T7 프로모터를 포함하는 핵산 또는 이의 상보적 쇄를 제공한다. 특히 이방향성 시스템에서, 본 발명의 핵산이 T7 프로모터를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 폴리머라제는 바람직하게는 바이러스를 발현하는 플라스미드와 함께 형질감염된 플라스미드로부터 발현되기 때문에, 본원에 제공된 시스템은 특정 종으로 제한되지 않는다. T7 폴리머라제-기반 역유전자 시스템은 때로 비절편형 네가티브 쇄 바이러스의 구제를 위해 사용되지만, 박테리오파아지 폴리머라제 기술에 기초하는 절편형 인플루엔자 바이러스의 역유전학 시스템이 이전에 성공적으로 사용된 적이 없었다. cDNA를 전사시키기 위한 T7 폴리머라제를 사용한 역유전학 시스템에서의 한가지 제한 요소는, 때로 전사 출발 부위에 G 잔기를 도입시켜 T7-폴리머라에 구동된 전사를 증진시킴으로써 극복하고자 시도된다. 이러한 접근법은 예를 들면, RV, VSV 및 SV의 구제에서 사용된 바 있으나, 조벨(Zobel) 등[참조: Virology. 1994 Jul;202(1):477-9; Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11;21(16):3607-14]은 바이러스성 폴리머라제가 적절히 기능하기 위해서는 인플루엔자 A 유전자 절편의 5' 및 3' 말단 둘다가 정확히 한정됨으로써 전사 부위에 추가의 뉴클레오타이드 부가를 위한 공간을 남기지 않아야할 필요가 있다고 규정하고 있으며 이는 전사 출발 부위에의 G 잔기의 도입과 반대되는 것을 교시하는 것이다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명자들은 T7 프로모터 다음에 하나 이상의 추가 구아닌 잔기가 제공된 본 발명에 따른 핵산을 제공하며, 2개의 추가 구아닌 잔기가 T7 프로모터 다음에 제공되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명은 T7 폴리머라제가 제공된, 매딘 다비 개 신장(Madin Darby Canine Kidney; MDCK) 세포 또는 닭 배아 섬유모세포(CEF)를 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 하나 이상이 제공된 세포를 제공한다. 본 발명은 17-플라스미드, 12-플라스미드 또는 8-플라스미드 시스템과 같은 다중-플라스미드 시스템의 사용을 촉진하며, 본 발명이 바람직하게는 본 발명에 따른 인플루엔자 유전자 절편을 발현할 수 있는 하나 이상의 플라스미드와 함께 형질감염된 플라스미드로부터 발현되는 T7 폴리머라제가 추가로 제공된 본 발명에 따른 핵산을 갖는 세포를 제공하기 때문에, 당해 시스템은 특정 종으로 제한되지 않는다. 본원에서 당해 시스템은 상기 T7 폴리머라제가 핵 국소화 시그날을 포함하는 본 발명에 따른 세포를 사용하기 위해 제공된다. 바람직한 양태에서, 본원에 제공된 세포는 비-영장류 세포이고, 이에 따라 본 발명에 따른 핵산 또는 세포로부터 유래된, 세포 물질 또는 백신에 영장류 DNA가 도입되는 것이 회피된다. 바람직하게는, MDCK 세포 또는 CEF 세포가 사용된다. 역유전학 시스템에 대해 헬퍼 바이러스가 요구되지 않고, 형질감염으로 제공된 모든 바이러스 입자가 목적 핵산을 포함하고 후속적 백신 제조 시스템에서 복잡한 클로닝 없이 사용될 수 있다는 것이 본 발명의 이점이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 복제성 바이러스 입자를 최초로 제공한다. 미국 특허 제5,166,057호에는 이러한 복제가능한 바이러스 입자가 제공되어 있지 않고, 본 발명까지, 절편형 인플루엔자 바이러스용으로 T7 시스템을 사용하고자 하는 다른 시도는 실패로 끝났다. 본원에 제공된 바와 같은 바이러스 역가가 약 104인, 바이러스 입자의 세포 배양물 조성물은 형질감염된 세포 배양물에서 바이러스 복제 없이도 용이하게 수득될 수 있으며, 이는 바이러스가 복제될 수 있는 경우에 107을 초 과하도록 상승될 수 있다. 본 발명에 따른 입자의 복제가 헬퍼 바이러스 없이 성취된다는 것이 특히 유용하다. 본 발명에 따른 세포로부터 유래된 세포 또는 물질 또는 본 발명에 따른 바이러스 입자로부터 유래된 바이러스 또는 물질을 포함하는 이러한 세포 배양물 조성물은 인플루엔자 바이러스에 의한 피험체의 감염에 대한 면역학적 보호를 유발하도록 지시된 약제학적 조성물의 제조를 위해 유리하게 사용될 수 있다. 확실히, 본원에 제공된 이러한 세포는 미국 특허 제5,166,057호에 제공된 바 없다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 하나 이상을 갖는 세포를 배양함을 포함하는, 복제성 인플루엔자 바이러스 입자의 제조방법을 또한 제공한다. 상기 방법에서 사용된 하나 이상의 핵산은 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 7개 또는 8개의 인플루엔자 유전자 절편 및 박테리오파아지 폴리머라제 프로모터 또는 당해 핵산 또는 핵산들의 상보적 쇄를 포함한다. 상기 절편이 박테리오파아지 폴리머라제 터미네이터를 포함하지 않는 것이 더욱 바람직하고, 이에 따라 유리하게도 이러한 절편에 프로모터 다음의 하나 이상의 추가 구아닌 잔기가 제공되거나 프로모터 다음의 2개의 추가 구아닌 잔기가 제공된다. 바람직하게는, 상기 절편은 백신용으로 WHO에 의해 권장되는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되며, 예로는, 인플루엔자 A 유전자 절편이 있다. 마지막으로, 본 발명은 상기 개시한 당해 방법으로 수득할 수 있는 복제성 인플루엔자 바이러스 입자를 제공한다. 이와 함께 본 발명은 본원에 제공된 조성물을 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 대한 면역학적 보호가 필요한 피험체에게 제공함을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 의한 피험체의 감염에 대한 면역학적 보호를 유발하는 방법을 또한 제공한다. 이러한 조성물은 바람직하게는 백신으로서, 즉 바이러스 입자 또는 이러한 입자로부터 유래된 바이러스성 단백질(서브유닛-백신)을 염 용액 또는 보조제(예: 알루미늄 염 또는 통상적으로 사용되는 기타 부형제; 예를 들면 http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf. 참조)와 같은 적절한 약제학적 담체와 혼합함으로써 제형화된다.
도 1. T7poI-기반 역유전학 시스템을 위해 사용된 작제물. 클로닝 전략에 관한 상세사항은 본문을 참조.
도 2. GFP 미니게놈(0.6㎍), T7poI(0.6㎍) 및 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 유전자(각각 1㎍)를 암호화하는 작제물로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석. 좌측 패널: 형질감염 30시간 후의 GFP 양성 세포%. 우측 패널: GFP 양성 분획에서의 GFP 발현 수준(평균 형광). X축상에는, 센스(S) 또는 안티센스(AS) 배향의 형질감염된 GFP 미니게놈 작제물이 도시되고, 이와 함께 추가 G 뉴클레오타이드의 수가 명시된다. 검은색 막대는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 복합체(PB2, PB1, PA 및 NP)의 모든 4개 성분의 공동형질감염을 나타내며, 흰색 막대는 pHMG-NP 작제물이 생략된 대조군 형질감염을 나타낸다.
도 3. 2개의 추가 G 잔기를 갖는 안티센스 GFP 미니게놈 0.6㎍, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 작제물 4㎍, 및 0.6㎍의 야생형 T7poI(C), 핵 국소화 시그날을 함유하는 T7poI(N) 또는 1:1 비율의 이들 작제물 둘다(C/N)로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석. 좌측 패널: 형질감염 30시간 후의 GFP 양성 세포%. 우측 패널: GFP 양성 분획에서의 GFP 발현 수준(평균 형광).
도 4. 2개의 추가 G 잔기를 갖는 안티센스 GFP 미니게놈을 암호화하는 작제물 0.6㎍ 및 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 작제물 4㎍로 형질감염된 293T 또는 BSR-T7 세포의 FACS 분석. 세포의 GFP 양성 분획에서의 GFP 발현 수준(평균 형광)이 도시된다. 세포를 핵 국소화 시그날을 함유하는 T7poI을 발현하는 플라스미드로 형질감염시키거나 형질감염시키지 않았다(293T 대 293T N 또는 BSR-T7 대 BSR-T7 N). 검은색 막대는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 복합체의 모든 4개 성분(PB2, PB1, PA 및 NP)으로의 공동형질감염을 나타내고, 흰색 막대는 pHMG-NP 작제물이 생략된 대조군 형질감염을 나타낸다.
도 5. 2개의 추가 G 잔기를 갖는 안티센스 GFP 미니게놈(AS-2G) 또는 센스 GFP 미니게놈(S-OG)을 암호화하는 작제물 0.6㎍, 및 핵 국소화 시그날을 함유하는 T7poI을 발현하는 플라스미드 0.6㎍ 및 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 유전자를 발현하는 플라스미드 4㎍로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석. 좌측 패널: 형질감염 30시간 후의 GFP 양성 세포%. 우측 패널: GFP 양성 분획에서의 GFP 발현 수준(평균 형광). 검은색 막대는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 복합체의 모든 4개 성분(PB2, PB1, PA 및 NP)으로의 공동형질감염을 나타내고, 흰색 막대는 pHMG-NP 작제물이 생략된 대조군 형질감염을 나타낸다.
도 6. 2개의 추가 G 잔기를 갖는 안티센스 GFP 미니게놈(AS-2G)을 암호화하는 작제물 0.6㎍, 핵 국소화 시그날을 함유하는 T7poI을 발현하는 플라스미드 0.6 ㎍ 및 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 유전자를 발현하는 플라스미드 4㎍로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석. 좌측 패널: 형질감염 30시간 후의 GFP 양성 세포%. 우측 패널: GFP 양성 분획에서의 GFP 발현 수준(평균 형광). 검은색 막대는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 복합체의 모든 4개 성분(PB2, PB1, PA 및 NP)으로의 공동형질감염을 나타내고, 흰색 막대는 pHMG-NP 작제물이 생략된 대조군 형질감염을 나타낸다.
실시예 1
T7 RNA 폴리머라제 기반 역유전학 시스템을 사용한 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 생성
서론
오랫 동안, 인플루엔자 A 바이러스의 심도있는 조사는 효과적 역유전학 시스템의 이용가능성 부족에 의해 방해되었다. 사실 네가티브 쇄 RNA 바이러스에 대한 초창기 역유전학 기술이 인플루엔자 A 바이러스용으로 개발되었지만[참조: 7, 18], 전적으로 재조합 DNA로부터의 이러한 바이러스의 구제는 최근에서야 달성되었다[참조: 9, 20].
인플루엔자 A 바이러스는 네가티브 쇄 바이러스이다. 바이러스 복제 사이클 동안, 3가지 유형의 RNA가 생산된다: 네가티브 센스 게놈성 바이러스 RNA(vRNA), 상기 게놈성 RNA에 상보적인 포지티브 센스 RNA(cRNA) 및 포지티브 센스 메신저 RNA(mRNA). vRNA 및 cRNA는 본질적으로 변형되지 않은 말단을 함유하며, mRNA는 캡핑되어 있고 폴리(A) 테일을 갖는다[참조: 16].
RNA 폴리머라제 I(PoII)은 리보솜 RNA(rRNA)를 전사시키고 성장중인 세포에서 풍부하게 발현되는 핵인 효소이다. vRNA와 마찬가지로 rRNA는 캡과 폴리(A) 테일을 갖고 있지 않다[참조: 23]. 호봄 및 동료들[참조: 19, 21, 29]은 PoII을 사용하여 정확한 5' 및 3' 말단을 갖는 인공 인플루엔자 바이러스 vRNA-유사 절편을 성공적으로 생산하였다. PoII 프로모터-터미네이터 카셋트 범위내에서 클로닝된 cDNA의 전사는 정확한 5' 및 3' 말단을 갖는 vRNA-유사 분자를 생산할 수 있게 하였다[참조: 29]. 헬퍼 인플루엔자 바이러스를 포함시킨 후속적 연구는, 이들 게놈성 vRNA 분자가 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체에 의해 인식되고 복제될 수 있으며, 자손 인플루엔자 바이러스내로 포장될 수 있음을 입증한다. 이러한 시스템은 바이러스성 유전자 절편 중 하나 또는 추가의 유전자 절편에서 돌연변이를 함유하는 인플루엔자 바이러스를 생산할 수 있게 하여, 바이러스성 유전자 및 이의 산물을 연구할 수 있게 하였다. 헬퍼 바이러스를 사용한 결과로서, 형질전환체 바이러스의 선별이 요구되며, 이것은 다소 번거로운 일이다.
뉴먼(Neumann) 등은 전적으로 클로닝된 cDNA로부터의 인플루엔자 A 바이러스의 회수를 위한 PoII 시스템을 설계하였다[참조: 20]. 인플루엔자 A 바이러스의 전체길이 vRNA를 암호화하는 cDNA를 사람 PoII 프로모터와 마우스 PoII 터미네이터 간에 클로닝시켰다. 원칙적으로, 이들 8개의 플라스미드의 진핵세포 내로의 형질감염은 모든 8개의 인플루엔자 vRNA의 합성을 야기해야 한다. 사람 배아 신장 세포(293T)를 이들 8개의 vRNA 발현 플라스미드, 및 바이러스성 핵단백질과 RNA 폴리머라제 II(PoIII) 프로모터로부터의 폴리머라제 단백질 PB2, PB1 및 PA를 발현하는 플라스미드로 공동형질감염시켰다. 세포성 PoII에 의해 합성된 vRNA를 RNP 내로 포장하고 ml당 1×103 플라크 형성 단위(pfu/ml)의 감염성 바이러스를 회수하였다. 나머지 바이러스성 구조 단백질을 발현하는 플라스미드로의 공동형질감염은 바이러스 생산을 상당히 증가시켰으며, 즉 3×104 내지 5×107 pfu /ml이 회수되었다[참조: 20]. 포더(Fodor) 등은 인플루엔자 A 바이러스의 회수를 위한 유사 시스템을 보고하였다[참조:9]. 상기 시스템은 사람 PoII 프로모터에 의해 플랭킹되어 있지만, PoII 터미네이터 서열이 아니라 간염 δ 바이러스 리보자임(HδVrib) 서열을 함유하는 모든 8개의 vRNA cDNA를 암호화하는 8개의 플라스미드에 의존한다. 이들 플라스미드를 아데노바이러스 2형 주요 후기 프로모터(adenovirus type 2 major late promoter)로부터의 PB1, PB2, PA 및 NP 단백질을 발현하는 4개의 플라스미드와 함께 Vero 세포내로 공동형질감염시켰다. 각 발현 플라스미드를 동량으로 사용하여, 포더 등은 106개 형질감염된 세포로부터 1 내지 2개의 감염성 바이러스 입자의 구제율을 보고하였다[참조: 9]. 본 발명자들은 재조합 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 생산하기 위해 유사한 역유전학 시스템을 설계하였다. 본 발명자들은 형질감염된 세포 배양물 중에서 바이러스 복제 없이도 약 104의 바이러스 역가가 수득될 수 있으며, 바이러스가 복제되도록 한 경우에는 이 역가가 107 초과로 상승될 수 있다고 결론지었다[참조: 4]. 이들 PoII-구동성 시스템은 12 내지 16개 플라스미드의 공동형질감염을 요구하였기 때문에, 높은 효율로 형질감염될 수 있는 세포주의 사용이 재조합 바이러스의 효율적 생산을 위해 필수적이었다.
이어서, 호프만(Hoffmann) 등은 오직 8개의 플라스미드로부터 인플루엔자 A 바이러스의 생산을 위한 이방향성 PoII-PoIII 전사 시스템을 개발하였다[참조: 12]. 이러한 이방향성 시스템에서, vRNA cDNA는 사람 PoII 프로모터와 최소 마우스 PoII 터미네이터 서열 사이에 삽입되었다. 이러한 전체 카셋트는 PoIII 프로모터와 폴리아데닐화 부위 사이에 삽입되었다. 이로써, 단일 작제물로부터, 각각PoII 및 PoIII 프로모터로부터의 vRNA 및 mRNA의 전사가 가능할 수 있었다. 매딘 다비 개 신장(MDCK) 세포와 공동 배양된 293 세포에서 각각 인플루엔자 A 바이러스 유전자 절편중 하나를 암호화하는 8개의 PoII-PoIII 플라스미드로 공동형질감염시킨 결과, 감염성 인플루엔자 A 바이러스가 2×107 pfu/ml 상청액 이하의 수율로 회수되었다[참조: 12]. mRNA 및 vRNA 둘다의 합성을 위해 1개의 주형을 사용하는 것은 바이러스 생성을 위해 요구되는 플라스미드의 수를 감소시켰다. 당해 시스템에서의 바이러스 생성 효율은 단일방향성(12 내지 16개 플라스미드) PoII 시스템의 바이러스 생성 효율과 유사한 것으로 보고되었다.
PoIII 프로모터는 흔히 상이한 종 유래의 전사 기구와 양립가능한 반면에, 폴리머라제 II 프로모터로부터의 전사는 절대적이지는 않지만 엄격한 종 특이성을 나타낸다. 이러한 종-특이성은 전사 인자와 프로모터와의 상호작용에 의해 부여되며, 이들 인자들 간의 단백질-단백질 상호작용에 의해서는 보다 적은 정도로 부여된다[참조: 23].
PoII-기반 역유전학 시스템의 종-특이성은 주요한 불이익이 된다. 상기 기술한 역유전학 시스템은 사람 PoII 프로모터를 사용하였으며, 이는 재조합 바이러스의 생산을 세포 또는 Vero 세포와 같은 영장류 기원의 세포로 제한한다. PoII 프로모터는 사람, 마우스, 랫트 및 돼지를 포함하는 몇가지 종에 대해 특성화되었지만[참조; 8, 14, 17], 이들 프로모터는 다른 많은 종에 대해서는 여전히 미공지된 상태이다. 개 및 조류 세포가 통상적으로 인플루엔자 A 바이러스 조사 및 백신 제조를 위해 사용되지만, 개 및 조류 PoII 프로모터는 아직 기술되지 않았다. 인플루엔자 바이러스 역유전학 기술의 유전학의 유연성을 개선시키기 위해, 본 발명자들은 다목적 역유전학 시스템을 개발하고자 하였다. 본 발명자들은 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터(pT7)의 제어하의 인플루엔자 A 바이러스의 유전자 절편의 발현에 기반한 시스템을 설계하고자 하였다. 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제(T7poI)는 형질감염에 의해 또는 안정하게 변형된 세포주의 사용을 통해서 세포에 공급될 수 있기 때문에, 당해 시스템은 특정 종 유래의 세포로 제한되지 않는다.
T7poI-기반 역유전학 시스템은 비절편형 음성 쇄 바이러스의 구제를 위해 사용된다. 슈넬(Schnell) 등은 오로지 클로닝된 cDNA로부터 비절편형 네가티브 쇄 바이러스를 최초로 구제하였다[참조: 27]. 광견병(RV)의 전체길이 항-게놈성 RNA를 암호화하는 cDNA 클론을 제조하였다. 상기 cDNA는 T7poI 터미네이터 서열(tT7) 다음의 pT7 및 HδVrib 서열 서열에 의해 플랭킹되어 있다. T7poI에 의한 전사 후에, 게놈의 정확한 3' 말단을 3' 말단에서 HδVrib 서열의 자가 분해에 의해 생성시킨다. 상기 플라스미드를 pT7의 제어하에 바이러스성 N 단백질 및 폴리머라제 단백질 L 및 P를 암호화하는 발현 플라스미드와 함께, T7poI을 발현하는 세포내로 공동 형질감염시켰다. 이러한 과정에 의해, 2×107개의 형질감염된 세포중 하나로부터만 재조합 RV가 구제되었다[참조: 27]. 그 이후로, 비절편형 NSV의 파라믹소비리대, 랍도비리대 및 필로비리대 과에 대한 유사한 시스템이 기술되었다[참조: 10].
cDNA로부터 비절편형 네가티브 쇄 바이러스의 성공적 회수를 위해, 네가티브-센스 vRNA 대신에 포지티브-센스 항게놈성 RNA(cRNA)가 매우 빈번하게 생산된다. 나출형(naked) 네가티브-센스 vRNA 및 바이러스 단백질을 암호화하는 포지티브 센스 mRNA의 동시적 존재는 하이브리드화를 초래하여 리보핵단백질 복합체(RNP)내로의 게놈의 어셈블리를 방해한다[참조: 27]. 네가티브 쇄 바이러스는 항상 이의 게놈을 하이브리드화를 방지하는 RNP 형태로 유지하기 때문에, 정상적으로는 이러한 문제에 직면하지 않는다. 네가티브-센스 게놈성 RNA를 암호화하는 cDNA를 갖는 센다이 바이러스[참조: 15], 사람 파라인플루엔자 바이러스 3형[참조: 6] 및 사람 메타뉴모바이러스[참조: 11]의 회수가 보고되었다; 그러나, 효율성은 포지티브-센스 RNA를 사용했을 때의 결과보다 현저하게 낮았다. 이러한 원리는 또한 재조합 인플루엔자 바이러스의 구제에 대해서도 적용되었다. 또한, 호프만(Hoffmann) 등[참조: 13]은 항게놈성 포지티브-센스 RNA로부터 재조합 인플루엔자 바이러스 생산의 효율성을 측정하였다. 세포질에서만 복제하는 비절편형 및 절편형 네가티브 쇄 바이러스와 달리, 인플루엔자 A 바이러스는 게놈성 벡터 및 항게놈성 벡터 둘다로부터 유사한 효율로 구제될 수 있다.
pT7을 사용한 바이러스 구제 시스템의 한가지 제한 요소는 +1 내지 +3 위치의 잔기가 전사에 영향을 줄 수 있다는 것이다. cDNA의 전사는 pT7의 바로 하류에 2 또는 3개의 G 잔기를 도입시킴으로써 증가될 수 있다는 것이 관찰되었다[참조: 22]. 이러한 관찰결과는 예를 들면, 재조합 RV[참조: 27], 소포성 구내염 바이러스[참조: 28], 호흡기 합포체 바이러스[참조: 3] 및 사람 메타뉴모바이러스[참조: 11]의 구제에도 적용되었다. 명백하게, 이러한 바이러스의 경우, 게놈 말단중 한쪽에 있는 추가의 G 잔기는 바이러스 복제에 영향을 주지 않았지만, T7poI-구동된 전사에는 양성 효과를 미쳤다.
T7poI-기반 시스템은 인플루엔자 바이러스 역유전학 시스템 연구을 위해 널리 사용되어 왔지만[참조 18], 재조합 인플루엔자 바이러스의 플라스미드-기반 생산은 현재까지 기술되지 않았다. 본원에서 본 발명자들은 이러한 재조합 인플루엔자 바이러스의 생산을 위한 T7poI 기반 역유전학 시스템을 최초로 기술한다.
재료 및 방법
세포 및 바이러스
매딘-다비 개 신장(MDCK) 세포는 10% FCS, 100 IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 1.5 mg/ml 중탄산나트륨, 10mM Hepes 및 비필수 아미노산이 보충된 EMEM(BioWhittaker)에서 배양하였다. 293T 세포는 10 % FCS, 100 IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 1 mM 나트륨피루베이트 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM (BioWhittaker)에서 배양하였다. T7 RNA 폴리머라제를 안정하게 발현하는 어린 햄스터 신장 세포주인 BSR-T7 세포[참조: 2]는 10% FCS, 100 IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 1mM 나트륨피루베이트 및 0.5mg/ml G418(Life Technologies, Breda, The Netherlands)가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 닭 발육란에서의 복제에 대해 적합화되고 포유동물 세포 배양물에서 최적으로 복제할 수 있는 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 10 IU/ml 페니실린 및 10㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 Episerf 배지(Gibco BRL)에서 성장시킨 MDCK 세포에서 낮은 감염다중도로 7회 계대하였다. 7번째 계대 후, 108 TCID50/ml의 바이러스 역가가 통상적으로 수득되었다.
293T 세포의 형질감염
293T 세포의 일시적 인산칼슘-매개된 형질감염을 필수적으로 문헌[참조: 24]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 세포를 배양 전날에 젤라틴화된 100mm 직경 배양 접시에 플레이팅하여 50% 컨플루언트(confluent) 단층을 수득하였다. 밤새 형질감염시킨 후, 형질감염 배지를 바이러스 생산용 2% FCS 또는 다른 모든 형질감염용 10% FCS가 보충된 신선한 배지로 교체하였다. 세포를 30 내지 72시간 동안 항온처리한 후, 상청액을 수거하고 세포를 경우에 따라 형광에 대해 분석하였다. 플라스미드 pEGFP-N1(제조원: Clontech, BD Biosciences, Amsterdam, The Netherlands)을 모든 실험에서 동시에 형질감염시키고, 형광 세포의 백분율을 FACSCalibur(Becton Dickinson) 유세포 분석기에서 측정하여, 형질감염 효율이 95% 내지 100%의 범위임을 확인하였다. 바이러스 함유 상청액을 10분 동안 300×g로 원심분리하여 청정화시켰다. 상청액 중의 바이러스 역가를 직접 또는 1주 미만 동안 4℃에서 또는 1주 이상 동안 -80℃에서 저장한 후 측정하였다.
MDCK 세포의 형질감염
MDCK 세포의 일시적 형질감염을 필수적으로 문헌[참조: 1]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게 언급하면, 240㎕의 Optimem I 배지(GibcoBRL)를 10㎕의 리포펙타민 2000에 부가하고 실온에서 5분 동안 항온처리하였다. 상기 혼합물에, Optimem I 배지를 사용하여 50㎕의 용적까지 조정한 의도한 양의 DNA를 부가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하지 않는 200㎕의 MDCK 배양 배지(상기 참조)를 6웰 플레이트내의 상청액 중의 1×106 MDCK 세포에 부가하였다. 5시간 동안 항온처리 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하지 않는 2ml MDCK 배양 배지에서 배양하였다. 상기 배지를 밤새 항온처리 후 2% FCS를 함유하는 MDCK 배양 배지로 교체하였다.
BSR-T7 세포의 형질감염
BSR-T7 세포의 일시적 형질감염을 위해, 400,000개 세포를 형질감염 하루 전날에 6웰 배양 디쉬에 플레이팅하여 50 내지 70% 컨플루언트 단층을 수득하였다. 혈청 비함유 DMEM(240㎕)을 10㎕의 리포펙타민 2000에 부가하고 실온에서 4분 동안 항온처리하였다. 상기 혼합물에, 혈청 비함유 DMEM를 사용하여 50㎕까지 조정된 DNA를 부가하였다. 형질감염 후, 배지를 2ml의 혈청 비함유 DMEM으로 교체하였다. 항온처리 후, 형질감염 혼합물을 세포에 적가하고 37℃에서 5시간 동안 항온처리하였다. 형질감염 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 바이러스 생산용 2% FCS 2ml 또는 FACS 분석용 10% FCS가 보충된 DMEM 2ml를 부가하였다.
플라스미드
T7poI(pAR3126 및 pAR3132)를 암호화하는 진핵성 발현 벡터를 사용하였다. 플라스미드 pAR3126은 야생형 T7poI을 암호화하는 반면, 플라스미드 pAR3132는 세포 핵으로 효과적으로 표적화하는 핵 국소화 시그날(NLS)를 함유하는 T7poI을 발현한다[참조: 5]. 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 단백질이 발현되는 진핵성 발현 플라스미드는 마우스 하이드록시-메틸글루타릴-조효소 A 리덕타제 프로모터, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA 및 pHMG-NP를 사용한다[참조: 25].
pPoII-CAT-RT의 HδVrib[참조: 25]를 PCR로 증폭시키고 pSP72의 Xbal-BamHI 부위로 클로닝하였다. BannHI-EcoRV로 분해시킨 tT7 서열을 pSP72-HδVrib의 BamHI-Hpal 부위내에 클로닝하여, pSP72-HδVrib-tT7(MS24)를 수득하였다. pT7을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 적절한 범주내에서 pSP72-HδVrib-tT7의 Ndel-Xbal 부위내에서 도입된 Bbsl 부위에 연결시켜, 벡터 pSP72-pT7-HδVrib-tT7을 수득하였다(MS25, 도 1). 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 절편 5로부터의 NCR에 의해 플랭킹된 녹색 형광 단백질(GFP) 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을, 주형으로서 pSP-Hu-GFP-Mu(4)를 사용하여 pSP72-pT7-HδVrib-tT7의 Bbsl 부위에 클로닝시켰다. 당해 GFP 미니게놈은 센스 및 안티센스 배향 둘다로 클로닝되었고, pT7의 바로 하류에 0개/2개/3개의 추가 G 잔기를 함유하였다(도 1).
인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 유전자 절편을 pSP72-pT7-HδVrib-tT7내에 클로닝하기 위해, 드 위트(de Wit) 등[참조: 4]에 의해 기술된 2방향성 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 작제물을 PCR용 주형로서 사용하였다(4번째 3' 뉴클레오타이드는 국제 인플루엔자 서열 데이타베이스에 보고된 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 서열에 상응한다). AarI 제한 부위를 함유하는 프라이머를 절편 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8을 클로닝하기 위해 사용하였고, 평활 말단 연결을 절편 5를 위해 사용하였다; 상기 유전자 절편들을 Bbsl 부위에 안티센스 배향으로 클로닝하여 pT7 다음에 2개의 추가 잔기를 함유하도록 하였다.
이방향성 벡터 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV (MS65, 도 1)을, CMV 프로모터(pCMV)를 tT7의 하류에 클로닝하여, 상응하는 유전자 절편으로부터의 mRNA를 생산함으로써 제조하였다. pCMV를 Asel 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. pSP72-pT7-HδVrib-tT7를 Asel로 부분적으로 분해시키고, pCMV를 유전자 절편으로부터의 mRNA의 생산을 위해 적절한 방향으로 tT7로부터의 하류에 연결시켰다.
다시, 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 절편을 클로닝하여, 각각의 이방향성 T7poI-구동된 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 작제물을 수득하였다. 본 발명자들은 또한 tT7가 결실되어진 이방향성 벡터의 한 셋트를 생성시켰다. 이는 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV를 BamHI-BpeEI로 분해시키고, 클레노우 효소로 처리하고, 재연결시켜 pSP72-pT7- HδVrib-pCMV (MS90, 도 1)을 생성시시킴에 의해 달성되었다. 다시, 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 절편을 클로닝하여 각각의 이방향성 T7poI-구동된 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 작제물을 수득하였다. 모든 플라스미드는 Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing 키트(Applied Biosystems) 및 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems)를 제조업자의 지침에 따라서 사용하여 서열분석하였다.
T7poI-기반 시스템을 이용한 재조합 바이러스의 생산
293T 세포를 상기 기술한 바와 같이, PR/8/34의 유전자 절편을 함유하는 단일방향성 플라스미드 각각 5㎍, 발현 플라스미드 HMG-PB2, HMG-PB1, HMG-PA, HMG-NP 각각 5㎍ 및 pAR3132 15㎍으로 형질감염시켰다. 대안으로, 본 발명자들은 PR/8/34의 유전자 절편을 함유하는 단일방향성 플라스미드 각각 5㎍ 및 pAR3132 15㎍으로 형질감염시켰다. 상청액을 형질감염 7시간 후에 수거하고, 1ml을 사용하여 MDCK 세포의 컨플루언트 단층을 감염시켰다.
바이러스 감염 및 역가측정
항온처리 전에, MDCK 세포를 PBS로 2회 세척하고, 1ml의 293T 상청액을 사용하여 6웰 플레이트내의 MDCK 세포의 컨플루언트 단층을 접종시켰다; 40㎍의 트립신(2.5%, Bio Whittaker)을 감염 동안 부가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 저장하고 PBS로 2회 세척한 후, 4% BSA, 100 IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 1.5mg/ml 중탄산나트륨, 10 mM Hepes, 비필수 아미노산 및 20㎍/ml 트립신이 보충된 2ml의 EMEM(BioWhittaker)(감염 배지)를 부가하였다. 감염후 3일째에, 배양물의 상청액을 수거하고, 세포 감염의 지표로서 HA 활성에 대해 시험하였다. 바이러스 역가측정을 문헌[참조: 26]에 이미 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게 언급하면, 형질감염된 세포 상청액의 10배 일련의 희석액을 감염 배지에서 제조하였다. 접종 전에, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 희석액 배양 상청액 100㎕을 사용하여 96웰 플레이트내의 MDCK 세포의 컨플루언트 단층을 접종시켰다. 37℃에서 1시간 후, 세포를 다시 PBS로 세척하고, 신선한 감염 배지 200㎕를 각 웰에 부가하였다. 감염후 3일째에, 배양물의 상청액을 개개의 웰내의 세포 감염에 대한 지표로서 HA 활성에 대해 시험하였다. 감염 역가를 스피어만-카버(Spearman-Karber)의 방법[참조: 26]에 따라 10회 반복 실험으로부터 계산하였다.
결과
단일방향성 T7poI-기반 역유전학 시스템 A를 사용한 GFP 미니게놈 분석
pT7, HδVrib 및 tT7을 함유하는 단일방향성 벡터를 작제하였다. 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 절편 5의 비암호화 영역(NCR)에 의해 플랭킹된 GFP 오픈 리딩 프레임을 pSP72-pT7-HδVrib-tT7내에 0, 2 또는 3개의 추가 G 잔기와 함께 센스(S) 및 안티센스(AS) 배향으로 클로닝하였다(도 1 및 부록 2 및 3 참조). 이들 작제물은 각각 S-OG, S-2G, S-3G, AS-OG, AS-2G 및 AS-3G라 명명하였다. 본 발명자들은 이들 선택사항중 어떠한 것이 가장 우수한 성능을 야기하였는지를 시험하였다. 본 발명자들은 293T 세포를 GFP 미니게놈(S-OG, S-2G, S-3G, AS- OG, AS-2G, AS-3G) 중 하나, T7poI 발현 플라스미드(pAR3132) 및 PB2, PB1, PA 및 NP 단백질을 발현하는 4개의 플라스미드(pHMG-PB2, pHMG-PB1 , pHMG-PA, pHMG-NP)로 형질감염시켰다. 대조군으로서, 본 발명자들은 pHMG-NP가 생략되어 GFP 미니게놈의 복제가 결여되는 동일한 형질감염을 수행하였다. 형질감염후 30분째에, 세포를 FACSCalibur에서 형광에 대해 분석하였다. 당해 결과는 도 2에 도시한다. 좌측 패널로부터, 2개의 추가 G 잔기를 갖는 안티센스 배향의 GFP 미니게놈으로 형질감염시 GFP 양성 세포의 최고 비율이 관찰되었음을 알 수 있다. 다른 GFP 미니게놈 작제물도 또한 일정 비율의 GFP 양성 세포를 산출하였지만, 다소 적었다. GFP 양성 세포의 평균 형광을 비교한 경우(도 2, 우측 패널), 추가의 G 잔기를 갖는 안티센스 배향의 GFP 미니게놈은 최고의 성능을 나타냈다. 당해 실험에서, 2개의 추가 G 잔기를 갖는 센스 배향의 GFP 미니게놈은 가장 저조한 성능을 나타냈고, 나머지 작제물은 중간 정도였다.
본 발명자들은 실험들마다 상이한 GFP 미니게놈 플라스미드 사이에서 GFP-발현 세포의 비율 및 GFP 발현 수준과 관련된 약간의 변동을 관찰하였지만(데이타는 제시하지 않음) 2개의 추가 G 잔기를 갖는 안티센스 배향의 GFP 미니게놈은 일반적으로 가장 우수하게 작용하였고, 따라서 당해 작제물을 후속 실험용으로 선택하였다.
핵 T7poI 별현 대 세포질 T7poI 발현
본 발명자들이 잠재적으로 해결할 필요가 있었던 한가지 문제는 T7poI의 발현이었다. 파라믹소바이러스 역유전학의 경우, 주로 세포의 세포질에서 발현되는 T7poI이 사용되며, 이는 파라믹소바이러스 복제도 세포질내에서 일어나기 때문에 바람직하다. 인플루엔자 바이러스 세포내 핵내에서 복제하며, 따라서 세포질에서의 T7poI의 발현은 최상의 선택이 아닐 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 T7poI의 세포질 버젼을 사용한 경우(플라스미드 AR3126) 또는 핵 국소화 시그날을 함유하는 T7poI(NLS, 플라스미드 pAR3132)을 사용한 경우의 GFP 발현 수준을 비교하고자 하였다. 당해 실험의 결과는 도 3에 도시한다. 야생형 T7poI 발현 플라스미드를 사용한 경우, 양성 세포내의 평균 GFP 형광은 521이었다. 핵 국소화 시그날을 함유한 T7poI를 사용한 경우 GFP 발현 수준은 현저하게 증진될 수 있었다(평균 형광 1106). 핵 국소화 시그날을 함유한 T7poI 작제물 및 핵 국소화 시그날을 함유하지 않은 T7poI 작제물 둘다를 배합한 경우(1:1 비율, 형질감염된 플라스미드의 총량은 변화되지 않도록 유지한다), 중간 정도의 GFP 발현 수준이 관찰되었다(평균 형광 775). 수차례의 독립적 실험에서, 각종 GFP 미니게놈 플라스미드를 사용한 경우, 이들 결과는 재현가능하였다; T7poI의 핵 버젼을 사용한 경우 GFP 발현에서의 2배 내지 10배의 증가가 관찰되었다(데이타는 제시하지 않음). 따라서, 후속 실험에서는, 본 발명자들은 핵 국소화 시그날을 함유하는 T7poI를 사용하였다.
일시적 T7poI 발현 대 안정한 T7poI 발현
몇가지 파라믹소바이러스 역유전학 시스템의 경우, T7poI은 T7poI을 안정하게 발현되도록 하는 세포주의 사용을 통하지 않고서는 플라스미드 형질감염에 의해 제공되지 않는다. 이러한 목적으로, 어린 햄스터 신장 세포(BSR-T7)를 이용할 수 있다. 본 발명자들은, BSR-T7 세포가, 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체에 의해 후속적으로 복제될 수 있는 인플루엔자 바이러스 GFP 미니게놈의 전사를 위해 사용되어 GFP가 발현될 수 있도록 하는지를 시험하였다(도 4).
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 293T 세포내의 GFP 형광은 T7poI의 발현의 매우 의존적이다. BSR-T7 세포에서, pHMG-NP 플라스미드가 생략된 형질감염과 비교하여, GFP 미니게놈을 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체로 공동형질감염시 비교적 높은 GFP 발현 수준이 관찰되었다. T7poI의 핵 버젼을 발현하는 플라스미드의 부가시, GFP 발현은 더욱 높은 것으로 확인되었다. BSR-T7 세포에서의 비교적 높은 GFP 수준은 T7poI의 안정한 발현이 형질감염에 의한 일시적 발현에 비해 보다 효율적임을 시사한다. 그러나, 핵 T7poI이 형질감염에 의해 제공된 실험은 인플루엔자 바이러스 역유전학에 있어 야생형 T7poI이 아니라 핵 T7poI을 발현하는 안정한 세포주가 보다 더욱 효율적일 수 있음을 시사한다.
단일방향성 T7poI-기반 역유전학 시스템을 이용한 재조합 바이러스의 제조
그 다음, 재조합 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 생성을 위해 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 유전자 절편을 벡터 pSP72-pT7- HδVrib-tT7에 클로닝하였다. 본 발명자들은 293T 세포를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 유전자 절편, pT7poI (pAR3132), pHMG-PB1 , pHMG-PB2, pHMG-PA 및 pHMG-NP을 암호화하는 8개의 작제물로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 트립신을 배지에 부가하여 생산된 바이러스가 복제되도록 하였다. 형질감염후 72시간째에, 상청액을 수거하고 MDCK 세포를 접종시키는데 사용하였다. 접종후 3일째에, 바이러스 복제의 지표로서 MDCK 세포의 상청액상에서 HA-시험을 수행하였다. HA-시험 결과는 양성이었다. 이어서, 293T 및 MDCK 상청액의 바이러스 역가는 1.6×101 TCID50/ml인 것으로 나타났으며, MDCK 상청액의 바이러스 역가는 2.0×107 TCID50/ml인 것으로 나타났다. 형질감염후 293T 세포에 트립신을 부가한 경우 293T 세포 및 MDCK 세포에서 다소 낮은 바이러스 역가가 수득되었다(데이타는 제시하지 않음). 즉, 이는 PoII 프로모터를 사용하지 않은 첫번째 플라스미드-단독 재조합 인플루엔자 A 바이러스만이 구제됨을 나타낸다.
이방향성 T7 시스템
그 다음, 본 발명자들은 pT7의 제어하에 있는 이방향성 역유전학 시스템을 개발하고자 하였다. pCMV를 pSP72-pT7-HδVrib-tT7내에 클로닝하여 벡터 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV를 수득함으로써 플라스미드 벡터를 제조하였다(도 1). 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 절편 5의 비암호화 영역(NCR)에 의해 플랭킹되어 있는 GFP 오픈 리딩 프레임을 2개의 추가 G 잔기와 함께 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV내에 안티센스 배향으로 클로닝하였다. 본 발명자들은 상기 플라스미드가 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체(pCMV는 당해 미니게놈에 대해 센스 배향으로 존재한다)를 상승시킬 수 있다고 예상하였기 때문에, 미니게놈(0개 G 잔기)을 pT7에 대해 센스 배향으로(따라서, pCMV에 대해서는 안티센스 배향이 된다) 함유하는 유사 작제물을 또한 제조하였다. 미니게놈 플라스미드를 핵 T7poI 및 pHMG- PB1 , pHMG-PB2, pHMG-PA 및 pHMG-NP를 발현하는 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질감염시켰다. 세포를 30시간 후에 FACS에 의해 분석하였다(도 5).
센스 GFP 미니게놈(S-OG)을 불완전 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체로 형질감염시킨 결과, 매우 적은 GFP 양성 세포가 생성되었으며(도 5, 좌측 패널), GFP 발현은 매우 낮았다(도 5, 우측 패널). 완전한 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체의 존재하에, 세포의 약 7%는 평균 형광이 약 1200으로서 GFP 양성이었다. 안티센스 GFP 미니게놈 플라스미드를 사용한 경우, 비교적 큰 비율의 세포(약 10 %)가 완전한 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체의 부재하에 GFP를 발현하였지만, 단지 낮은 수준으로만 발현하였다(평균 GFP 형광 182). 완전한 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체의 공동형질감염시, GFP를 발현하는 세포의 비율은 증가되지 않은 반면에, 세포당 GFP 발현 수준은 현저하게 증가되었다(평균 GFP 형광 1205). 따라서, 당해 실험으로부터 본 발명자들은 이방향성 발현 벡터는 기능적이였다고 결론을 내렸다; 본 발명자들은 pCMV로부터 GFP mRNA의 생산의 결과로서 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체의 필요없이 낮은 수준의 GFP 발현을 관찰하였다. 주목할 만하게도, 이는 293T 세포를 단독의 AS-2G GFP 미니게놈 플라스미드만으로 형질감염시켜 유사한 GFP 발현 수준( 128의 평균 형광으로 발현하는 세포의 약 19%, 데이타는 제시하지 않음)을 수득함으로써 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 pT7로부터 전사된 미니게놈의 복제의 결과로서 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체의 존재하에 증가된 GFP 발현 수준을 관찰하였다. 따라서, 이방향성 pT7-pCMV 발현 플라스미드는 기능적이었다.
이방향성 T7poI-기반 역유전학 시스템을 이용한 재조합 바이러스의 생산
그 다음, 재조합 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 생성을 위해 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 유전자 절편을 벡터 pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV내에 클로닝하였다. 본 발명자들은 293T 세포를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 유전자 절편 및 pT7poI(pAR3132)을 암호화하는 8개의 작제물로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 트립신을 당해 배지에 부가하여 생산된 바이러스가 복제되도록 하였다. 형질감염후 72시간째에, 상청액을 수거하고 MDCK 세포를 접종시키는데 사용하였다. 접종후 3일째에, 바이러스 복제의 지표로서 MDCK 세포의 상청액상에서 HA-시험을 수행하였다. HA-시험 결과는 음성이였으며, 이는 재조합 바이러스가 회수되지 않았음을 나타낸다.
PB2, PB1, PA 및 NP 유전자를 발현하는 이방향성 벡터를 사용한 미니게놈 리포터 분석으로부터, 본 발명자들은 이들 플라스미드로부터의 단백질 발현이 매우 낮았다는 증거를 수득하였다(데이타는 제시하지 않음). 본 발명자들은 tT7 서열이 pCMV로부터의 전사를 간섭하여 암호화된 유전자의 낮은 생산을 초래하였다는 가설을 세웠다. 따라서, 본 발명자들은 tT7 서열이 제거되어진 새로운 이방향성 플라스미드(pSP72-pT7-HδVrib-pCMV)를 생성시켰다. 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 유전자 절편을 재조합 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34의 생성을 위해 벡터 pSP72-pT7-HδVrib-pCMV 내에 클로닝시켰다. 초기 시도에서는 재조합 바이러스를 생산되지 않았다. 그러나, 형질감염을 위해 사용되는 플라스미드의 양을 최적화한 경우, 본 발명자들은 재조합 바이러스를 성공적으로 생산하였다. 당해 실험을 위해 사용된 플라스미드의 양은 PB2, PB1, PA 및 HA를 암호화하는 작제물 각각 10㎍ 및 NP, NA, MA 및 NS를 암호화하는 작제물 각각 5㎍이었다. 293T 세포에서의 재조합 바이러스 역가가 측정불가능한 반면에, 후속적으로 MDCK 세포를 항온처리한 결과, 초기 역가가 1.3×105 TCID50/ml인 바이러스가 수득되었다.
MDCK 세포에서의 T7poI 시스템
T7poI에 기반한 역유전학 시스템의 다목적 성질에 대한 추가 증가를 제공하기 위해, 본 발명자들은 293T 세포가 아니라 MDCK 세포에서의 GFP 미니게놈의 복제를 시험하였다. BSR-T7 세포를 이용한 실험이 T7poI 역유전학 시스템이 비-영장류 기원이 세포에서 기능적이라는 증거를 이미 제공하였지만(도 4), 인플루엔자 바이러스 조사 및 백신 제조용으로 MDCK가 보다 널리 사용된다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, T7poI-기반 역유전학 시스템은 MDCK 세포에서 기능적인 것으로 밝혀졌다. BSR-T7 세포에서의 결과(도 4)와 종합하면, 이들 실험은 T7poI 역유전학 시스템이 진정으로 광범위한 세포 유형에 적용될 수 있는 "다목적" 시스템임을 나타낸다. 당해 실험으로부터, 비-영장류 세포로부터의 재조합 인플루엔자 바이러스의 생산이 현재 가능하다는 것도 결론내릴 수 있다.
본원에서, 본 발명자들은 293T 세포에서 T7poI-기반 시스템을 이용한 재조합 인플루엔자 A 바이러스 A/PR/8/34(MDCK-적응된 NIBSC 계통)의 생산을 최초로 제시하였다. 그러나, 이들 방법의 사용이 인플루엔자 A 바이러스 A/PR/8/34로 제한된다고 추측되지 않는다; 이들 방법은 A형, B형 및 C형의 모든 인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 기타 절편형 네가티브 쇄 RNA 바이러스에 적용될 수 있다. 또한, 이들 방법의 사용이 293T 세포, BSR-T7 세포 및 MDCK 세포로 제한된다고 추측되지 않는다; T7poI은 예를 들면, 재조합 바이러스가 생산될 수 있는 광범위한 세포주를 형질감염시킴으로써 공급될 수 있다.
또한, 당해 T7poI-기반 역유전학 기술을 위한 플라스미드 벡터 및 당해 벡터가 함유하는 요소에 대해서는 현저한 유연성이 있다. 본원에서, 본 발명자들은 박테리오파아지 T7의 RNA 폴리머라제를 사용하여 vRNA 또는 cRNA-유사 RNA 분자를 생산하였지만, 박테리오파아지 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 RNA 폴리머라제도 또한 사용될 수 있다. 본원에 제시한 실험에서, T7 RNA 폴리머라제는 SV40 거대 T 항원을 함유하도록 변형시켰지만, RNA 폴리머라제를 다양한 기타 핵 표적화 시그날(예를 들면, hnRNP K 단백질의 핵 표적화 시그날)을 사용하여 변형시킬 수 있다. 본원에서 본 발명자들은 간염 델타 바이러스의 리보자임 서열을 사용하였지만, 대안적으로 사용될 수 있는 기타 리보자임 서열이 기술된 바 있다. 마지막으로, 본원에 기술된 시스템은 마우스 하이드록시-메틸글루타릴-조효소 A 리덕타제 프로모터에 기반한 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 단백질 발현 벡터(pHMG 작제물)의 사용에 의존하지 않는다; 광범위한 인플루엔자 바이러스로부터의 폴리머라제 단백질을 사용할 수 있으며, 이를 광범위한 발현 벡터를 사용하여 발현시킬 수 있다.
참조 문헌
실시예 2
재조합 바이러스는 상기한 바와 같이, 유행 바이러스(예: A/모스크바/10/99)의 관련 HA 및 NA 유전자를 갖는 고처리량 바이러스 골격(예를 들면, 백신 계통 A/PR/8/34로부터 유래)을 기반으로 하여 생산된다. 형질감염에 의한 재조합 바이러스의 생산 후, 당해 바이러스를 적절한 세포성 기질(예: 난(卵), MDCK 세포, Vero 세포)내에서 충히 높은 양으로 증폭시킨다. 닭 발육란에서 증식시키는 경우, 요막액을 10분 동안 1000×g로 원심분리하고 0.45㎛ 필터를 통해 여과하여 청정화시킨다. 즉시 바이러스를 4℃에서 1.5시간 동안 150,000×g로 원심분리하여 펠렛화시키고, 포스페이트 완충 염수(PBS)에 재현탁시킨다. 이어서, 바이러스를 2% 데카노일-N-메틸글카미드(MEGA)로 처리하고, PBS 중의 25% 슈크로스 층에 부하하고, 4℃에서 1.5시간 동안 250,000×g로 원심분리한다.
이어서, HA 및 NA 단백질을 함유하는 최상 층을 PBS에 대해 투석하고, 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색된 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 단백질 제제의 양을 확인한다. 페렛을 약 10㎍ HA/NA 단백질로 근육내 면역화시킨다. 경우에 따라, 후속적 다중 투여를 사용하거나 보조제(MF59, ISCOM)를 사용하여 백신접종을 수행할 수 있다. 백신접종 전과 후에 수집된 혈청 샘플 중의 HA 및 NA에 대한 항체 역가를 적혈구응집 억제 분석, 뉴라미니다제 억제 분석, ELISA, 바이러스 중화 분석 등을 사용하여 측정한다. 백신접종된 동물 및 대조군 동물을 백신접종한지 6주후에 인플루엔자 바이러스 A/모스크바/10/99 또는 이종 바이러스 분리체의 1×105 50% 조직-배양물 감염용량(TCID-50)을 사용하여 시험감염(challenge)시켰다. 시험감염 후, 비강 또는 인두 면봉 샘플을 10일 동안 매일 동물로부터 수거하고, 감염된 동물에 의해 배출된 바이러스의 양을 정량적 PCR 분석 또는 바이러스 역가측정으로 측정한다. 따라서, 수득된 백신-유도된 면역을 항체 역가 또는 시험감염 바이러스에 의한 감염에 대한 보호 수준에서의 상승을 정량함으로써 확인할 수 있다.
Claims (20)
- 인플루엔자 유전자 절편(influenza gene segment)과 박테리오파아지 폴리머라제 프로모터를 포함하는 핵산 또는 당해 핵산의 상보적 쇄.
- 제1항에 있어서, 박테리오파아지 폴리머라제 터미네이터를 포함하지 않는 핵산.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터 다음에 하나 이상의 추가 구아닌 잔기가 제공된 핵산.
- 제3항에 있어서, 프로모터 다음에 2개의 추가 구아닌 잔기가 제공된 핵산.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, WHO에 의해 백신용으로 권장되는 인플루엔자 바이러스 유래의 유전자 절편을 포함하는 핵산.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A 유전자 절편을 포함하는 핵산.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 박테리오파아지 폴리머라제가 T7 폴리머라제인 핵산.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 하나 이상이 제공된 세포.
- 제8항에 있어서, 박테리오파아지 폴리머라제가 추가로 제공된 세포.
- 제9항에 있어서, 박테리오파아지 폴리머라제가 핵 국소화 시그날(nuclear localization signal)을 포함하는 세포.
- 제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 비-영장류 세포.
- 제11항에 있어서, 매딘 다비 개 신장(Madin Darby Canine Kidney; MDCK) 세포 또는 닭 배아 섬유모세포(CEF)인 세포.
- 제8항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 바이러스가 제공되지 않은 세포.
- 제8항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 박테리오파아지 폴리머라제가 T7 폴리머라제인 세포.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 바이러스 입자.
- 제8항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 세포로부터 유래된 세포 또는 물질, 또는 제15항에 따른 바이러스 입자로부터 유래된 바이러스 또는 물질을 포함하는 조성물.
- 인플루엔자 바이러스에 의한 피험체의 감염에 대한 면역학적 보호를 유발하도록 지시된 약제학적 조성물의 제조를 위한 제16항에 따른 조성물의 용도.
- 제16항에 따른 조성물을, 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 대한 면역학적 보호를 필요로 하는 피험체에 제공함을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 의한 피험체의 감염에 대한 면역학적 보호를 유발하는 방법.
- 박테리오파아지 폴리머라제, 바람직하게는 T7 폴리머라제가 제공된, 매딘 다비 개 신장(MDCK) 세포 또는 닭 배아 섬유모세포(CEF).
- 제19항에 있어서, 인플루엔자 유전자 절편 및 박테리오파아지 폴리머라제 프로모터를 포함하는 핵산 또는 당해 핵산의 상보적 쇄가 제공된 세포.
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