MXPA02001177A - Recuperacion del virus de las paperas del acido desoxirribonucleico recombinante. - Google Patents

Recuperacion del virus de las paperas del acido desoxirribonucleico recombinante.

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Abstract

Esta invencion se refiere a un metodo para producir recombinantemente, por medio de la recuperacion del virus de las paperas, un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, y a las composiciones inmunogenicas formadas a partir del mismo. Las modalidades adicionales se refieren a los metodos de produccion del virus de las paperas como un virus atenuado y/o infeccioso. Los virus recombinantes son preparados a partir de los clones de ADNC, y, en consecuencia, los virus que tienen cambios definidos, incluyendo deleciones, inserciones, substituciones y rearreglos de nucleotidos/polinucleotidos, en el lugar del genoma, son obtenidos.

Description

RECUPERACIÓN DEL VIRUS DE LAS PAPERAS DEL ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO RECOMBINANTE Campo de la Invención Esta invención se refiere a un método para producir recombinantemente el virus de laS paperas, un virus del ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, y a las composiciones inmunogénicas formadas a partir del mismo. Las modalidades adicionales se refieren a métodos de producción del virus de las paperas como un virus infeccioso y/o atenuado. Los virus recombmantes son preparados a partir de clones de ADNc, y, de acuerdo con esto, se obtienen virus que tienen cambios definidos en el genoma. Esta invención también se refiere al uso del virus recombinante formado a partir del mismo como vectores para la expresión de la información genética extraña, por ejemplo genes extraños, para muchas aplicaciones, incluyendo las composiciones inmunogénicas o farmacéuticas para los patógenos diferentes de las paperas, la terapia genética, y la ubicación como blanco de las células.
Antecedentes de la Invención Los virus del ARN de una sola hebra, de sentido Ref . 136025 negativo, envueltos, son expresados y organizados de manera única. El ARN genómico de los virus de una sola hebra, de sentido negativo, sirve para dos funciones del molde en el contexto de un nucleocápsida: como un molde para la síntesis de los ARNs mensajeros (ARNms) y como un molde para la sitnesis de la hebra del antigenoma (+) . Los virus del ARN de una sola hebra, de sentido negativo, codifican y empacan su propia ARN Polimerasa dependiente del ARN. Los ARNs mensajeros son sintetizados solamente una vez que el virus se ha introducido al citoplasma de la célula infectada. La replicación viral ocurre después de la síntesis de los ARNms y requiere la síntesis de las proteinas virales. La hebra del antigenoma (+) sintetizado recientemente sirve como el molde para la generación de copias adicionales del ARN genómico de hebra (-) . El agente etiológico de la parotiditis se mostró primero reproduciblemente que va a ser un virus por Johnson y Goodpasture en 1935 (Johnson y Goodpasture, 1935) . Desde entonces, la propagación en el cultivo del tejido ha facilitado la clasificación del virus y los estudios sobre las propiedades biológicas del virus de la parotiditis (MUV) . Originalmente clasificado con los virus de la influenza en la familia de los Myxovirus, el virus de la parotiditis ha sido reasignado desde entonces a la familia de Paramixoviridae, subfamilia Paramyxovirinae, género Rubulavirus, basado en la morfología de la nucleocápsida, la organización del genoma y las propiedades biológicas de las proteinas. Otros ejemplos del género Rubulavirus incluyen el virus 5 del simio (SV5) , el tipo 2 y el tipo 4 del virus de parainfluenza humana y el virus de la enfermedad de Newcastle (Lamb y Kolakofsky, 1996) . De manera semejante a todos los virus de Paramyxoviridae, el virus de la parotiditis es pleomórfico en su forma, comprendiendo una membrana de lipidos derivada de la célula huésped que rodea un núcleo de ribonucleoproteina; este núcleo de nucleocápsida forma una estructura helicoidal compuesta de un genoma de ARN de sentido negativo no segmentado, de 15,384 nucleótidos, asociado estrechamente con la proteina de la nucleocápsida del virus (NP) . La organización genética gel genoma de MUV se ha determinado que va a ser 3 '-NP-P-M-F-SH-HN-L-5' (Elango et al., 1998). Cada gen codifica una sola proteína excepto para el cistrón P, a partir del cual tres ARNms únicos son transcritos; uno es una copia exacta del gen P, que codifica la proteína V, los otros dos ARNms contienen dos y cuatro residuos G no templados insertados durante la transcripción por un mecanismo de edición de ARN, y codifican las proteínas P e í respectivamente (Paterson y Lamb, 1990) . Las proteínas P y L en asociación con la nucleocápsida forman el complejo de ARN polimerasa funcional del virus de la parotiditis. Las proteínas F y HN son proteínas de la membrana integral las cuales se proyectan desde la superficie del virion, y están involucradas en la fijación del virus y la entrada de las células. La proteína hidrofóbica pequeña (SH) y la proteína de la matriz (M) también están asociadas con la membrana (Takeuchi et al, 1996 y Lamb y Kolakofsky, 1996) ; el papel de las proteínas V e I en el crecimiento del virus todavía no es claro. El ciclo de replicación del virus de la parotiditis se inicia durante la fusión de la envoltura del virus con la membrana del plasma de la célula hospedera y la liberación subsiguiente de la nuclecápsida del virus en el citoplasma de la célula. Entonces sigue la transcripción primaria conduciendo a la producción de todas las proteínas de los virus; un cambio a la replicación del genoma del virus ocurre más tarde, seguido por la unión de los componentes del virus para formar nuevas partículas del virus las cuales brotan de la membrana del plasma de la célula hospedera. Solo la estructura de la nucleocápsida intacta puede actuar como el molde para la transcripción del ARN, la replicación y la amplificación del virus subsiguiente; en esto radica la dificultad en la manipulación genética del MUV y otros virus del ARN de la cepa negativa. A diferencia de esto, los virus i?-t-A»3E----fc-fc-át-- -L-a*------^^ ...i-. ..F., ...f,.-!.f.fí..$íf .ifXyr LL .----..-.i Ife-fcf É-L--, de ARN de hebra positiva en donde el ARN genómico desnudo es infeccioso y el virus infeccioso puede ser recuperado de una copia de ADNc del genoma en la ausencia de los factores virales adicionales (Taniguchi et al., 1978; Racaniello y Baltimore, 1981), el genoma desnudo de los virus de ARN de hebra negativa no es infeccioso y la recuperación del virus desde al ADNc requiere la coexpresión intracelular de las proteínas NP, P y L virales, en compañía de una transcripción de ARN del genoma, de sentido positivo, o de sentido negativo, de longitud total, todo bajo el control del promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 (Schnell et al., 1994; Lawson et al. 1995; Whelan et al., 1995; Radecke et al., 1995; Collins et al., 1995; Hoffman y Banerjee, 1997; Durbin et al., 1997; He et al., 1997; Barón y Barrett, 1997; Jin et al., 1998; Buchholz et al., 1999; Peeters et al., 1999) . En todos los sistemas reportados la T7 ARN polimerasa ha sido suministrada ya sea por un virus de vaccinia recombinante coinfeccioso (Fuerst et al., 1986; Wyatt et al., 1995) , o por la expresión endógena de la T7 ARN polimerasa en una línea celular transformada (Radecke et al., 1995). El complejo de polimerasa actúa y logra la transcripción y replicación por la unión o acoplamiento de las señales de actuación cis en el extremo 3' del genoma, en particular, la región promotora. Los genes virales son Í¿¿¿.-fate, -«---^.---------fc- transcritos entonces desde el molde del genoma unidireccionalmente desde su extremo 3' hasta 5'. Existe generalmente menos ARNm hecho de los genes corriente abajo (por ejemplo, el gen de polimerasa (L) ) con relación a sus entornos corriente arriba (es decir, el gen de nucleoproteína (NP) ) . Por lo tanto, existe siempre un gradiente de abundancia de ARNm de acuerdo con la posición de los genes conr elación al extremo 3' del genoma. El análisis genético molecular de tales virus del ARN no segmentado tuvo dificultad probada hasta recientemente a causa de que el ARN genómico desnudo o el ARN producido intracelularmente desde un plásmido transfectado no es infeccioso (Boyer y Haenni, 1994) . Estos métodos son referidos aquí como "recuperación". Existen publicaciones sobre los métodos de manipulación de los métodos de recuperación del ADNc que permiten el aislamiento de algunos virus de ARN de hebra negativa, no segmentados, recombinantes (Schnell et al., 1994). Las técnicas para la recuperación de estos virus de hebra negativa diferentes siguen tema común; sin embargo cada virus tiene componentes de requisitos distintivos para la recuperación exitosa (Barón y Barret, 1997; Collins et al., 1995; Garcin et al., 1995; Hoffman y Banerjee, Lawson et al. 1995; 1995; Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; He et al, 1997; Schnell et al., 1994; Whelan et al., 1995). Después de la transfección de un plásmido del ADNc genómico, una copia exacta del ARN del genoma es producida por la acción combinada de la ARN polimerasa del fago T7 y una secuencia del ribozima codificada por el vector que segmenta el ARN para formar las terminales 3' Este ARN es empacado y replicado por las proteínas ' virales suministradas inicialmente por los plásmidos de (expresión cotransfectados . En el caso del virus de la parotiditis, un método de recuperación tiene que ser establecido todavía y de acuerdo con esto, existe una necesidad de contemplar un método de recuperación del virus de la parotiditis. Contemplar un método de recuperación del virus de la parotiditis es complicado por la ausencia de estudios extensos sobre la biología del virus de la parotiditis, cuando se compara con los estudios sobre otros virus de IARN. También, el virus de la parotiditis no crece eficientemente en los sistemas de cultivo del tejido. Además, la secuencia para las terminales del genoma del virus de la parotiditis no ha sido caracterizada previamente con sufic±iente detalle para llevar a cabo la recuperación. Para que la recuperación] exitosa del virus de la parotiditis desde el ADNc sea logrado, numerosos eventos moleculares deben ocurrir después de la transfección, incluyendo: 1) la síntesis de longitud completa, exacta, del j--to ??l ARN del genoma o antigenoma por la T7 ARN polimerasa y el procesamiento del extremo 3' por la secuencia del ribozima; 2) la síntesis de las proteínas de NP, P, y L virales a los niveles apropiados para iniciar la replicación; 3) el empaque de novo del ARN genómico en las estructuras de la nucleocápsida competentes en la replicación y activas transcripcionalmente; y 4) la expresión de los genes virales a partir de las nucleocápsidas formadas recientemente a niveles suficientes para que la replicación progrese. La presente invención proporciona un método de recuperación del virus de la parotiditis que se produce recombinantemente. El virus de la parotiditis rescatado posee numerosos usos, tales como la generación de anticuerpos, aplicaciones de diagnóstico, profilácticas y terapéuticas, la ubicación como blanco de las células, la preparación del virus mutante y la preparación de la composición inmunogénica. Además, existe un número de ventajas de utilizar una cepa de Jeryl Lynn producida recombinantemente de la parotiditis para estas aplicaciones. Algunas de estas ventajas incluyen (1) un fenotipo atenuado, (2) un registro de seguridad substancial basado en las arriba de 100 millones de dosificaciones administradas, (3) la capacidad para inducir la inmunidad a largo plazo con una sola dosis y (4) un nivel relativamente bajo de recombinación del genoma.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para la producción de un virus de parotiditis recombinante que comprende, en al menos una célula hospedera, llevar a cabo la transfección de una composición de recuperación la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende la molécula del ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de la parotiditis y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, transcripción y replicación. La transfección es llevada a cabo bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de estos vectores y la producción del virus recombinante. El virus recombinante es colectado entonces. Las modalidades adicionales se refieren a las secuencias de nucleótidos, las cuales durante la transcripción del ARNm expresan una o más, o cualquier combinación de, las siguientes proteínas del virus de la parotiditis: NP, M, F, SH, HN L y las proteínas V, P, e I las cuales son generadas a partir del "cistrón" P del virus de la parotiditis como se señaló anteriormente. Las modalidades relacionadas se refieren a las moléculas del ácido nucleico las cuales comprenden tales secuencias de nucleótidos. Una modalidad preferida de esta invención son las secuencias de nucleótidos de las SEC ID NOS. 1, 11 y 12. Las modalidades adicionales se refieren a estos nucleótidos, las secuencias de los aminoácidos de las proteínas del virus de la parotiditis anterior y las variantes de los mismos. La proteína y las secuencias de nucleótidos de esta invención poseen utilidad de diagnóstico, profiláctica y terapéutica para el virus de la parotiditis. Estas secuencias pueden ser utilizadas para diseñar los sistemas de selección para los compuestos que interfieren o alteran el desarrollo del virus normal, por medio de la encapsidación, la replicación, o la amplificación. La secuencia de nucleótidos también puede ser utilizada en la preparación de las composiciones inmunogénicas para el virus de la parotiditis y/o para otros patógenos cuando son utilizados para expresar genes extraños. Además, los genes extraños expresados pueden tener aplicación terapéutica. En las modalidades preferidas, el virus recombinante infeccioso es producido para su uso en las composiciones y métodos inmunogénicos de tratamiento o prevención de la infección por el virus de la parotiditis y/o la infección por otros patógenos, en donde el método emplea tales composiciones. ¡¡-j^-táa-á^^^-^*^ En las modalidades alternativas, esta invención proporciona un método para generar el virus de la parotiditis recombinante el cual es atenuado, infeccioso o ambos. Los virus recombinantes son preparados a partir de los clones del ADNc, y, en consecuencia, los virus que tienen cambios definidos en el genoma pueden ser obtenidos. Las modalidades adicionales emplean la secuencia del genoma de consenso y/o cualquiera de las secuencias del genoma dentro de la población de la cepa Jeryl Lynn de la parotiditis para expresar los genes extraños puesto que esta cepa de la vacuna con autorización incluye un fenotipo atenuado establecido para seguridad. Puesto que la secuencia de consenso es derivada de un promedio propuesto de los genomas del virus de la parotiditis, las secuencias de polinucleótidos para los genomas dentro de la población de la cepa de Jeryl Lynn son modalidades de esta invención. Esta invención también se refiere al uso del virus recombinante formada a partir del mismo como los vectores para la expresión de la información genética extraña, por ejemplo los genes extraños, para muchos aplicaciones, incluyendo las composiciones inmunogénicas para los patógenos diferentes de la parotiditis, la terapia genética, y la ubicación como blanco de las células.
Las modalidades identificadas anteriormente y las modalidades adicionales, las cuales son descritas con detalle aquí, representan los objetos de esta invención.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra un diagrama que muestra la organización de la construcción del ADN de minirreplicón MUVCAT y el genoma del ARN antisentido del minirreplicón transcrito por la T7 ARN polimerasa. Los sitios de la endonucleasa de restricción claves utilizados en la unión o montaje de la construcción del ADN son mostrados. La secuencia promotora de la T7 ARN polimerasa fue diseñada para iniciar la transcripción con el nucleótido 5' terminal de MUV exacto, y una secuencia del ribozima de HDV fue colocada para generar el nucleótido 3' terminal de MUV preciso en las transcripciones del ARN del minirreplicón. Las señales de terminación de la T7 ARN polimerasa duplicadas fueron incluidas en serie después de la secuencia del ribozima de HDV. El CAT ORF reemplaza a la totalidad de las secuencias de codificación e intercistrónicas del genoma de MUV; la secuencia específica de MUV esencial restante comprende el Elemento Delantero 3' MUV (55 nt) con la región no traducida del gen NP de 90nt (UTR) , y el elemento Trasero de 5' MUV (24 nt) adyacente al UTR del gen L de 137 nt.
La Figura 2 es una representación esquemática de la construcción del ADNc del genoma de longitud completa de MUV, incluyendo los fragmentos subgenómicos y los sitios de la endonucleasa de restricción utilizados en el proceso de unión o montaje. El promotor de la T7 ARN polimerasa y la secuencia del ribozima de HDV fueron colocados para iniciar la transcripción con los nucleótidos terminales 5' y generar el nucleótido 3' terminal preciso del genoma de antisentido de MUV, respectivamente. Las secuencias de terminación de la T7 ARN polimerasa en serie fueron colocadas adyacentes al ribozima de HDV para ayudar a mejorar la eficiencia de la segmentación del ARN. Las substituciones de los nucleótidos utilizadas como etiquetas identificadoras para el MUV rescatado son mostradas en la Tabla 1 (Véase la Figura 8) . La Figura 3A muestra tres cromatogramas de capa delgada que muestran la actividad de CAT presente en las células 293 a continuación de la infección con el MUV y la transfección con el ARN transcrito in vitro desde el pMUVCAT como se describió en el Ejemplo 2. La Figura 3B muestra los cromatogramas de capa delgada que muestran la actividad de CAT en las células de Hep2 y A549 infectadas por MVA-T7 a continuación de la transfección con pMUVCAT y los plásmidos que expresan las proteínas de NP, P y L de MUV. El nivel del plásmido de • a-Mfe----,- -. .» . _--»>-..-> *¿M-Mi .i&J¿* .fa»^..-«»a---fcaAM_l--^^ expresión de pMUVNP fue concentrado en ambas líneas celulares; las fajas 1-4 muestran la actividad de CAT a continuación de la transfección con las mezclas que contienen 200 ng de pMUVCAT, 50 ng de pMUVP, 200 ng de pMUVL cada uno, y 300 ng, 450 ng, 600 ng, 750 ng de pMUVNP respectivamente; la faja 5 muestra la actividad de CAT producida cuando el pMUVL fue omitido de la mezcla de transfección. La Figura 4 muestra el Paso (Pl) de los sobrenadantes de las células transfectadas sobre las células A549, como se describió en el Ejemplo 3. Las vistas A, B y C corresponden al virus de la parotiditis rescatado, ningún virus de la parotiditis (control) y la cepa de Jeryl Lynn de la parotiditis. Las vistas muestran sitios infecciosos similares para A y C. La Figura 5 muestra un ELISA de célula completa del virus de la parotiditis rescatado sobre una monocapa de células Vero, como se describió en el Ejemplo 3. La Figura 6 muestra el análisis del gel de los productos de RT/PCR utilizados para identificar el rMUV (como se describió en el Ejemplo 4) . El ARN total fue preparado a partir de las monocapas de las células Vero infectadas con el paso 2 del virus de rMUV desde las células transfectadas. Las reacciones de RT/PCR fueron establecidas para generar los productos del ADNc que se extienden sobre los 3 sitios de rk .lu . áJ ia---_-?¡ ¡¿a?, - j¿MS4j;& -a. «---.«---S^t-» .-- Jk-Ll,U etiqueta del nucleótido separado presentes solamente en pMUVFL y rMUV. La faja 1 muestra la escalera de lkb del marcador (Gibco/BRL) ; las fajas 2, 3 y 4 muestran los productos de RT/PCR que se extienden sobre las posiciones 6081, 8502 y 11731 de la etiqueta del nucleótido, respectivamente. Para demostrar que estos productos de RT/PCR no fueron derivados de la contaminación de los ADNs del plásmido, una reacción idéntica a aquella utilizada para la generación del ADNc mostrado en la faja 4 fue efectuada sin RT; el (los) producto (s) de esta reacción son mostrados en la faja 5. Para demostrar que ningún rMUV podría ser recuperado cuando el pMUVL fue omitido de las mezclas de transfección, una reacción de RT/PCR idéntica a aquella utilizada para generar los productos de ADNc mostrados en la faja 4 fue establecida utilizando el ARN de las células Vero derivadas de las transfecciones llevadas a cabo sin pMUVL, los productos de esta reacción son mostrados en la faja 6. La Figura 7 muestra tres electroferogramas (A, B, y C) que muestran la secuencia de nucleótidos a través de la identificación de los sitios de las etiquetas en rMUV. Los productos de RT/PCR (Figura 6) , los cuales fueron secuenciados a través de cada uno de los tres sitios de la etiqueta. La secuencia de nucleótidos en cada sitio de la etiqueta obtenido para el ADNc de rMUV es comparado con la i-,lt,Wt--i--K,-.fe,...- i..-¿-a.A - -.y^ to-¿.jM:j-¿^-!--i---j.--.a,-¿=--».-a--_>a¿fcS secuencia de consenso para el aislado de la placa de MUV (aislado de la placa 4, Pl 4) utilizado para derivar el pMUVFL. La Figura 8 es una tabla (Tabla 1) que lista las diferencias de los nucleótidos y los aminoácidos entre el clon de ADNc de longitud completa y el aislado 4 de la placa (PI4) y la secuencia de consenso para la cepa de Jeryl Lynn (SEC ID NO. 1) . La Figura 9 es una tabla (Tabla 2) la cual describe un mapa genético completo para el virus de la parotiditis, incluyendo el inicio del gen y el final del gen para las proteínas del virus de la parotiditis. La secuencia del elemento delantero 3' de longitud de 55 nucleótidos y el elemento trasero 5' de 24 nucleótidos también es mostrada. La Figura 10 es una tabla (Tabla 3) que lista las posiciones de los nucleótidos de inicio y parada de la transcripción del gen del virus de la parotiditis, en compañía de las posiciones de inicio y parada de la traducción para los genes individuales del genoma de la parotiditis como se proporcionaron en la SEC ID NO 1. Los nucleótidos de cada posición del nucleótido de inicio de la transcripción (gen) y del nucleótido de parada en la Tabla 3 corresponde a las secuencias de nucleótidos para las proteínas de NP, P, M, F, SH, y L (SEC ID NOS 93-99, respectivamente) . La Figura 11 es un diagrama que muestra la inserción de la luciferasa y el (los) gen (es) de beta-galactosidasa en el genoma del virus de la parotiditis entre los genes M y F. Un sitio AscI fue generado por la mutagénesis dirigida al sitio en la región no codificante 5' del gen M. La PCR empaquetada fue utilizada para generar la(s) secuencia (s) intergénicas M-F específicas para el virus de la parotiditis y los sitios AscI terminales que flanquean cada gen reportero. El (los) producto (s) de PCR resultante (s) fueron digeridos con AscI y se importaron hacia el sitio AscI del genoma. La Figura 12 es un diagrama que muestra la inserción de dos genes (luciferasa y CAT) en el genoma del virus de la parotiditis. Dos unidades de transcripción separadas y una unidad de transcripción única que contiene el sitio de entrada del ribosoma interno para la expresión del segundo gen del policistron, fueron insertados separadamente en el sitio AscI presente en la región intergénica M-F. La PCR en serie fue utilizada para generar la secuencia intergénica M-F del virus de la parotiditis apropiada que flanquea cada gen y la unidad transcripcional. fj fel La Figura 13 muestra los resultados del análisis de MAPREC de diez muestras de la vacuna Mumpsvax® para las porciones relativas de JL5/JL2 como se determinaron del ARN que fueron aisladas de diez frascos pequeños de la vacuna de Jeryl Lynn de la parotiditis y amplificadas por RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 7. Las muestras de prueba en las Fajas 1 y 2 son diluciones en serie del producto de PCR no diluido utilizado para definir los límites inferiores de la linearidad para el ensayo. En la Faja 3 el producto de PCR es a partir de un aislado purificado de JL5. En la Faja 4, el producto de PCR es a partir de un aislado purificado de JL2. En las Fajas 5-8, los productos de PCR son a partir de las muestras de los virus de JL5 y JL2 mezclados en las siguientes relaciones: 99 JL5/ 1 JL2, 95 JL5/ 5 JL2, 85 JL5/ 15 JL2, y 75 JL5/ 25 JL2, respectivamente. Para las Fajas 9- 18, los productos de PCR son a partir de las muestras 1-10 de Mumpsvax®. La Figura 14 muestra un cromatograma de capa delgada que muestra la actividad de CAT presente en los extractos de las células Vero las cuales son infectadas con el rMUV que contiene los genes tanto de CAT como de luciferasa, como se describió en el Ejemplo 5. La Figura 15 es una fotografía que muestra el teñido citológico de las monocapas de las células Vero las cuales fueron infectadas con el rMUV que contiene el gen de la beta-galactosidasa, como se describió en el Ejemplo 5. La presencia de un teñido azul intenso indicó la expresión y actividad de la beta-galactosidasa. El Panel C muestra también una placa "clara" hecha por rMUV la cual no contiene ninguno de los genes extraños adicionales.
Breve Descripción de las Secuencias Primarias La secuencia 1 es la secuencia de los nucleótidos de consenso para el genoma de longitud total para la cepa de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis. (SEC ID NO 1), la cual es escrita en el sentido del mensaje, antigenómico (+, 5' a 3') • La secuencia 2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa NP de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 2) . La secuencia 3 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa P de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 3) . La secuencia 4 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa I de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 4) .
La secuencia 5 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa V de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 5) . La secuencia 6 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa M de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 6) . La secuencia 7 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa F de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 7) . La secuencia 8 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa SH de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 8) . La secuencia 9 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa HN de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 9) . La secuencia 10 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa L de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (SEC ID NO. 10) . La secuencia 11 es la secuencia de nucleótidos completa de la variante JL5 de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis para la placa 2 (SEC ID NO. 11) . La placa 1 fue diferente de la placa 2 en la posición 1703 (Véase la Tabla 6) . La secuencia es escrita como el ADN en el sentido antigenómico (+, 5' a 3').
La secuencia 12 es la secuencia de nucleótidos completa de la variante JL2 de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis para la placa 2 (SEC ID NO. 12) . La placa 1 fue diferente de la placa 2 en 5 posiciones de nucleótidos (Véase la Tabla 7) . La secuencia es escrita como el 7ADN en el sentido antigenómico (+, 5' a 3').
Descripción Detallada de la Invención Como se señaló anteriormente, la presente invención se refiere a un método de producción del virus de la parotiditis recombinante (MUV) . Tales métodos en el arte son referidos como los métodos de "recuperación" o los métodos genéticos inversos. Varios métodos de recuperación para diferentes virus de hebra negativa, no segmentados, son descritos en las siguientes publicaciones referidas: Barón y Barrett, 1997; Collins et al., 1995; Garcin et al., 1995; He et al., 1997; Hoffman y Banerjee, 1997, La son et al., 1995; Radecke y Billeter, 1997, Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; Schnell, 1994; Whelan et al., 1995. Las publicaciones adicionales sobre la recuperación incluyeron la solicitud de patente Internacional publicada WO 97/06270 para el MV y otros virus de la subfamilia Paramyxovirinae, y para la recuperación de RSV, solicitud de patente Internacional publicada WO 97/12032.
Antes de llevar a cabo la recuperación del virus de la parotiditis recombinante, fue necesario desarrollar una secuencia de consenso para el virus de la parotiditis entero (cepa Jeryl Lynn) y también desarrolla un sistema de recuperación de minireplicón para el virus de la parotiditis (MUV) . La secuencia de consenso es obtenida muestreando la población de los genomas de ARN presentes durante una infección por el virus de la parotiditis de una célula.
Correspondientemente, las modalidades adicionales de esta invención se refieren una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica el genoma o antigenoma del virus de la parotiditis o las proteínas del mismo, así como las variantes de tales secuencias. Preferentemente, bajo condiciones de severidad elevadas, estas secuencias variantes se hibridizan a los polinucleótidos que codifican una o más proteínas de la parotiditis (Véase la Tabla 2 de la Figura 9 para un mapa completo del virus de la parotiditis, incluyendo loa extremos de inicio del gen y de parada del gen para las proteínas del virus de la parotiditis) . Más preferentemente, bajo condiciones de severidad elevadas, estas secuencias variables se hibridizan a polinucleótidos que codifican una o más cepas del virus de la parotiditis, tales como las secuencias de los polinucleótidos de las SEC ID NOS. 1, 11 y 12. Para los propósitos de definir condiciones de hibridación de southern •-* ' .X?. . -ÍfjtíJí?M-¿i r¿ iíí»í.F....j»?-t, A «. -.-. -...»,-.--.-- ^_-^--i>----.'i--?-i---Í-----a.a^'^ de severidad elevada, se puede hacer una referencia conveniente a Sambrook et al. (1989) en las pp. 387-389 las cuales son incorporadas aquí para referencia, en donde el paso de lavado en el párrafo 11 es considerado de severidad elevada. Esta invención también se refiere a las variantes conservadoras en donde la secuencia de polinucleótidos difiere de una secuencia de referencia a través de un cambio al tercer nucleótido de una tripleta de nucleótidos. Preferentemente estas variantes conservadoras funcionan como equivalentes biológicos para la secuencia de referencia de los polinucleótidos de referencia del virus de la parotiditis. Las secuencias "aisladas" de la presente invención son secuencias que no ocurren de manera natural. Por ejemplo, estas secuencias pueden ser aisladas de su estado normal dentro del genoma del virus; o las secuencias pueden ser sintéticas, es decir, generadas por medio de técnicas recombinantes, tales como los sistemas de expresión recombinantes bien conocidos, o generados por una máquina. Esta invención también se refiere a las moléculas del ácido nucleico que comprenden uno o más de tales polinucleótidos. Como se señaló anteriormente, una secuencia de consenso del nucleótido dado puede contener uno o más de los genomas dentro de la población de un virus de la parotiditis, tal como la cepa de Jeryl Lynn. Las modalidades específicas emplean la secuencia de los nucleótidos de consenso de las SEC ID NOS 1, 11 o 12, o las secuencias de nucleótidos, las cuales cuando se transcriben, expresan una o más de las proteínas del virus de la parotiditis (NP, P/I/V, M, F, SH, HN y L) . Véase la Tabla 3 de la Figura 10 para el inicio del gen, el inicio de la traducción, el final de la traducción, y el final del gen para estas proteínas del virus de la parotiditis. Las modalidades adicionales se refieren a las secuencias de aminoácidos para las proteínas NP, P/I/V, M, F, SH, HN y L del virus de la parotiditis como se describe en las SEC ID NOS. 2-10, respectivamente y también para los fragmentos o variantes de las mismas. Preferentemente, los fragmentos y las secuencias de aminoácidos variantes y las secuencias de nucleótidos variantes que expresan las proteínas del virus de la parotiditis son equivalentes biológicos, es decir los mismos retienen substancialmente la misma función de las proteínas para obtener el virus de la parotiditis recombinante deseado, ya sea atenuado, infeccioso o ambos. Tales secuencias de aminoácidos variantes son codificadas por las secuencias de polinucleótidos de esta invención. Tales secuencias de aminoácidos variantes pueden tener aproximadamente 70% hasta aproximadamente 80%, y preferentemente alrededor del 90%, de similaridad total con respecto a las secuencias de aminoácidos de la proteína del virus de la parotiditis. Las secuencias de nucleótidos variantes pueden tener ya sea aproximadamente 70% hasta aproximadamente 80%, y preferentemente de manera aproximada 90%, de similaridad total con respecto a las secuencias de nucleótidos las cuales, cuando son transcritas, codifican las secuencias de aminoácidos de las proteínas del virus de la parotiditis o una secuencia de aminoácidos variantes de las proteínas del virus de la parotiditis. Las secuencias de nucleótidos ejemplares para las proteínas NP, P/I/V, M, F, SN, HN y L del virus de la parotiditis son descritas en las Tablas 1 y 2 (de las Figuras 8 y 9, respectivamente) . Los equivalentes biológicos pueden ser obtenidos generando variantes de la secuencia de nucleótidos o la secuencia de la proteína. Las variantes pueden ser una inserción, substitución, deleción o rearreglo de la secuencia del molde. Las variantes de una secuencia de polinucleótidos de las paperas pueden ser generadas por los métodos convencionales, tales como la mutagénesis de PCR, la selección de los aminoácidos (alanina) , y la mutagénesis específica para el sitio. El fenotipo de la variante puede ser evaluado por la conducción de una recuperación con la variante para evaluar si el virus de las paperas recombinante deseado es obtenido o el efecto biológico deseado es obtenido. Las variantes también pueden ser evaluadas para verificar la antigenicidad si el uso deseado es en una composición inmunogénica. Los cambios de los aminoácidos pueden ser obtenidos por el cambio de los codones de las secuencias de los nucleótidos. Ya se sabe que tales cambios pueden ser obtenidos con base en la substitución de ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en la secuencia de los aminoácidos. Por ejemplo, por medio de la substitución de los aminoácidos alternativos, se pueden conferir pequeños cambios conformacionales sobre la proteína lo cual puede conducir a una capacidad reducida para unirse o interactuar con otras proteínas del virus de la parotiditis. Los cambios adicionales pueden alterar el nivel de atenuación del virus de la parotiditis recombinante. Se puede utilizar el índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva sobre un polipéptido, como se describió por Kyte y Doolittle (1982), en donde se encontró que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen índices hidropáticos similares y todavía retienen una actividad biológica similar. Alternativamente, la substitución de los aminoácidos semejantes se pueden hacer sobre la base de la hidrofilicidad, particularmente en donde la función biológica ....-¿y . •*,:.-> «,.--»-" . tt •»«,-,>-..---.A j-?-it-a- --»Jj- - t»«Jii . deseada en el polipéptido que va a ser generado está propuesta para su uso en las modalidades inmunológicas. Véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 4,554,101 (la cual es incorporada aquí para referencia) , la cual establece que la hidrofilicidad promedio local más grande de una "proteína", debido a que está gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad. En consecuencia, se señaló que las substituciones se pueden hacer con base en la hidrofilicidad asignada a cada aminoácido. En el uso ya sea del índice de la hidrofilicidad o el índice hidrofílico, los cuales asignan valores a cada aminoácido, se prefiere introducir substituciones de aminoácidos en donde estos valores son +2, con +1 que es preferido particularmente, y aquellas dentro de + 0.5 que son las substituciones más preferidas. Las características preferibles de las proteínas del virus de la parotiditis, codificadas por las secuencias de nucleótidos de esta invención, incluyen una o más de las siguientes: (a) que sea una proteína de la membrana o que sea una proteína asociada directamente con una membrana; (b) capaz de ser separada como una proteína utilizando un gel de SDS acrilamida (10%); y (c) retener su función biológica en contribución al rescate y la producción del virus de la parotiditis recombinante deseado en la presencia de otras proteínas del virus de la parotiditis apropiados. Con las secuencias de aminoácidos y nucleótidos anterior a la mano, se puede proceder entonces al rescate del virus de la parotiditis. El rescate del virus de la parotiditis es logrado llevando a cabo la transfección, o la transformación, de al menos una célula hospedera, en el medio, utilizando una composición de rescate. La composición de rescate comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada la cual comprende al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de la parotiditis y (ii) al menos un vector de la expresión el cual comprende una o más molécula (s) de ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas de actuación trans para la encapsidación, transcripción y replicación; bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de los vectores y la producción del virus recombinante. Por antigenoma se entiende una secuencia de polinucleótidos de sentido del mensaje positivo, aislada, la cual sirve como el molde para la síntesis del genoma de la progenie. Preferentemente, una secuencia de polinucleótidos es un ADNc el cual es construido para proporcionar durante la transcripción una versión de sentido positivo del genoma de la parotiditis que corresponde al ARN intermedio replicativo, o antigenoma, para minimizar la posibilidad de la hibridación con los transcritos de sentido positivo de las proteínas que codifican las secuencias de complemento necesarias para generar una nucleocápsida de replicación, transcriptora. El vector de transcripción comprende una unidad transcripcional enlazada operativamente que comprende un conjunto de elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión de la parotiditis, por ejemplo, un promotor, un gen estructural o una secuencia de codificación la cual es transcrita en el ARN de la parotiditis, y las secuencias de inicio y terminación de la transcripción apropiadas. El vector de la transcripción es coexpresado con las proteínas NP, P y L del virus de la parotiditis, las cuales son necesarias para producir la nucleocápsida capaz de replicación del ARN, y también volver competentes a las nucleocápsidas de la progenie para tanto la replicación como la transcripción del ARN. Las proteínas de NP, P y L son generadas a partir de uno o más vectores de la expresión (por ejemplo los plásmidos) que codifican las proteínas requeridas, aunque una, o una o más de estas proteínas requeridas pueden ser producidas dentro de la célula hospedera seleccionada diseñada para contener y expresar estos genes y productos genéticos específicos para el virus l ..* A.? ?**¿? Uk,. como agentes de transformación estables. En una modalidad preferida, las proteínas de NP, P y L son expresadas a partir de un vector de la expresión. Más preferentemente, las proteínas de NP, P y L son expresadas cada una a partir de vectores de expresión separados, tales como plásmidos. En este último caso, se puede controlar más fácilmente la cantidad relativa de cada proteína que es provista durante la transfección, o transformación. Las proteínas del virus de la parotiditis adicionales pueden ser expresadas a partir de los plásmidos que expresan las proteínas de NP, P o L, o las proteínas adicionales pueden ser expresadas utilizando plásmidos adicionales. Aunque la cantidad de NP, P y L variará dependiendo de la tolerancia de la célula huésped para su expresión, los plásmidos que expresan NP, P y L son ajustados para lograr una relación molar efectiva de NP, P y L, dentro de la célula. La relación molar efectiva es una relación de NP, P y L que es suficiente para proporcionar la recuperación exitosa del virus de la parotiditis recombinante deseado. Estas relaciones pueden ser obtenidas con base en las relaciones de los plásmidos de expresión como se observó en los ensayos del minireplicon (CAT/reportero) . En una modalidad, la relación molecular de los plásmidos de transfección pMUVNP:pMUVP es al menos de aproximadamente 16:1 y pMUVP:pMUVL es de al menos --.-.-_.- ...-: aproximadamente 1:6. Preferentemente, la relación molecular de pMUVNP :pMUVP es de aproximadamente 16:1 hasta aproximadamente 4:1 y la pMUVP:pMUVL es de aproximadamente 1:6 hasta aproximadamente 1:1. Más preferentemente, la 5 relación del pMUVNP:pMUVP es de aproximadamente 6:1 hasta aproximadamente 5:1 y pMUVP:pMUVL es de aproximadamente 1:3 hasta aproximadamente 1:2. Después de la transfección, o la transformación, de un plásmido del ADNc genómico en compañía de los plásmidos de 10 expresión pMUVNP, pMUVP y pMUVL del virus de la parotiditis, una copia exacta del ARN del genoma es producida por la acción combinada de la T7 ARN polimerasa del fago y una secuencia del ribozima codificado por el vector que segmenta el ARN para formar las terminales 3'. Este ARN es empacado y 15 replicado por las proteínas virales suministradas inicialmente por los plásmidos de expresión cotransfectados. En el caso de la recuperación del virus de la parotiditis, una fuente que expresa la T7 ARN polimerasa es agregada a la célula huésped (o línea celular), en compañía de la(s) 20 fuente (s) para NP, P y L. La recuperación de la parotiditis es lograda por la cotransfección de esta línea celular con un clon del ADNc genómico del virus de la parotiditis que contiene un promotor de la T7 ARN polimerasa colocada apropiadamente y el (los) plásmido (s) de expresión que -su..x-yx*" codifican las proteínas NP, P y L del virus de la parotiditis. Para la recuperación del virus de la parotiditis, un equivalente del ADN clonado del genoma viral deseado es colocado entre un promotor de la ARN polimerasa dependiente del ADN adecuado (por ejemplo, el promotor de la T7 ARN polimerasa) y una secuencia del ribozima de autosegmentación (por ejemplo, el ribozima de la hepatitis delta) el cual es insertado en un vector de transcripción adecuado (por ejemplo un plásmido bacteriano) . Este vector de la transcripción proporciona el molde de ADN manipulable fácilmente a partir del cual la ARN polimerasa (por ejemplo, la T7 ARN polimerasa) transcribe una copia del ARN de una sola hebra del antigenoma (o genoma) viral con las terminales precisas, o casi precisas, de 5' y 3'. La orientación de la copia del ADN genómico viral y el promotor de flanqueo y las secuencias del ribozima determinan si los equivalentes de ARN del genoma o el antigenoma son transcritos. En consecuencia, en el método de recuperación se emplea una composición de recuperación. La composición de recuperación se puede hacer variar cuando se desee para una necesidad o aplicación particular. Un ejemplo de una composición de recuperación es una composición la cual comprende (i) un vector de la transcripción que comprende una r?ti,*.?t,- ...--.---^----- .--.--molécula de ácido nucleico aislada la cual comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de la parotiditis y (ii) al menos un vector de la expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, transcripción y replicación. Los vectores de transcripción y expresión son seleccionados de tal modo que la transfección de la composición de recuperación en una célula hospedera conduzca a la coexpresión de estos factores y la producción del virus de la parotiditis recombinante. Como se señaló anteriormente, la molécula del ácido nucleico aislada comprende una secuencia la cual codifica al menos un genoma o antigenoma de un virus de la parotiditis. La molécula del ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia de polinucleótidos la cual codifica un genoma, antigenoma o una versión modificada del mismo. En una modalidad, el polinucleótido codifica un promotor enlazado operativamente, el genoma o antigenoma deseado, una secuencia del ribozima de autosegmentación y el terminador de la transcripción. En una modalidad preferida de esta invención, el polinucleótido codifica un genoma o antigenoma que ha sido modificado a partir de un virus de la parotiditis del tipo •"» - ?&U silvestre por la inserción, el rearreglo, la deleción o la substitución de los nucleótidos. En las modalidades preferidas, la secuencia de polinucleótidos codifica un clon de ADNc para un virus de las paperas recombinante. Se admite que la capacidad para obtener la replicación del virus a partir de la recuperación puede disminuir porque el polinucleótido que codifica el genoma y el antigenoma natural es modificado crecientemente. La secuencia del genoma o antigenoma puede ser derivada de aquella de cualquier cepa del virus de la parotiditis. La secuencia de polinucleótidos también puede codificar un genoma quimérico formado a partir de unir recombinantemente un genoma o antigenoma o los genes de una o más fuentes heterólogas. Puesto que los virus recombinantes formados por los métodos de esta invención pueden ser empleados como herramientas en estudios de investigación de diagnóstico o como composiciones inmunogénicas terapéuticas o profilácticas, el polinucleótido también puede codificar una forma atenuada o del tipo silvestre del virus de las paperas seleccionado. En muchas modalidades, el polinucleótido codifica una forma infecciosa, atenuada, del virus de las paperas. En las modalidades preferidas particularmente, el polinucleótido codifica un genoma o antigenoma de un virus de la parotiditis que tiene al menos una mutación atenuante en la región promotora genómica 3' y ri--- -.£----—- A -i-t tiene al menos una mutación atenuante en el gen de la ARN polimerasa, como se describió por la solicitud de patente Internacional publicada WO 98/13501, la cual es incorporada por el presente para referencia. Además de las secuencias de polinucleotidos que codifican las formas modificadas del genoma y el antigenoma de la parotiditis deseado como se describió anteriormente, la secuencia de polinucleótidos también puede codificar el genoma o antigenoma deseado en compañía de uno o más genes heterólogos o una secuencia de nucleótidos heteróloga deseada. Estas variantes son preparadas introduciendo las secuencias de nucleótidos seleccionados en una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de la parotiditis. Preferentemente, una secuencia heteróloga deseada es insertada dentro de una región intergénica del genoma de la parotiditis. Sin embargo, la secuencia heteróloga deseada puede ser insertada dentro de una región no codificante de la secuencia de polinucleótidos de la parotiditis, o insertada entre una región no codificante y una región codificante, o insertada en cualquier extremo de la secuencia de polinucleótidos. En las modalidades alternativas, una secuencia heteróloga deseada puede ser insertada dentro de la región codificante de un gen no esencial, o en lugar de la región codificante para un gen no esencial. La elección del sitio de inserción puede hacer uso del gradiente 3' a 5' de la expresión del virus de la parotiditis. La secuencia de nucleótidos heteróloga (por ejemplo el gen) se puede hacer variar cuando se desee. Dependiendo de la aplicación del virus recombinante deseado, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar un cofactor, la citocina (tal como una interleucina) , un epítope auxiliador de T, un marcador de restricción, un auxiliar, o una proteína de un patógeno microbiano diferente (por ejemplo el virus, bacteria, hongo o parásito) , especialmente las proteínas capaces de producir una respuesta inmune protectora. Puede ser deseable seleccionar una secuencia heteróloga que codifica una porción inmunogénica de un cofactor, la citocma (tal como la interleucina) , un epítope del auxiliador T, un marcador de restricción, auxiliar, o una proteína de un patógeno microbiano diferente (por ejemplo el virus, bacteria y hongo) para maximizar la probabilidad de rescatar el virus de la parotiditis deseado, o el vector del virus de minirrepliclón. Otros tipos de porciones diferentes de la parotiditis incluyen, pero no están limitados a, aquellos de las células del cáncer o las células tumorígenas, el péptido amiloide de los alérgenos, la proteína u otros componentes macromoleculares. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los genes heterólogos codifican las citocinas, tales como la interleucina 12, las cuales son seleccionadas para mejorar las características profilácticas o terapéuticas del virus recombinante. Los ejemplos de tales células del cáncer o células 5 tumorígenas incluyen, pero no están limitadas a, el antígeno específico de la próstata, el antígeno carcino-embriónico, MUC-1, Her2, CA-125 y MAGE-3. Los ejemplos de tales alérgenos incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos en la Patente de los 10 Estados Unidos de América Número 5,830,877 y la Solicitud de Patente Internacional publicada Número WO 99/51259, las cuales son incorporadas aquí para referencia, e incluyen el polen, los venenos de insecto, la caspa de los animales, las esporas de los hongos y los fármacos (tales como la 15 penicilina) . Tales componentes interfieren con la producción de los anticuerpos de IgE, una causa conocida de las reacciones alérgicas. La proteína del péptido amiloide (APP) ha sido implicada en las enfermedades referidas variablemente como la 20 enfermedad de Alzheimer, amiloidosis o enfermedad amiloidogénica. El péptido ß-amiloide (también referido como el péptido Aß) es un fragmento de 42 aminoácidos de APP, el cual es generado por el procesamiento de la APP por las ^ *-^ xy -i .í-y^^.^ ¿gg enzimas de la secretasa ß y ?, y tiene la siguiente secuencia: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Ala (SEC ID NO 97) . En algunos pacientes, el depósito amiloide toma la forma de un péptido de Aß agregado. Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que la administración del péptido Aß aislado induce una respuesta inmune contra el componente del péptido Aß de un depósito amiloide en un huésped vertebrado (Véase la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 99/27944) .
Tales péptidos de Aß también han sido enlazados con porciones no relacionadas. Así, las secuencias de nucleótidos heterólogas de esta invención incluyen la expresión de este péptido Aß, así como los fragmentos del péptido Aß y los anticuerpos para el péptido Aß o los fragmentos de los mismos. Uno de tales fragmentos del péptido Aß es el péptido de 28 aminoácidos que tiene la siguiente secuencia (Como se describió en la Patente U.S. No. 4,666,829): Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEC ID NO 98) . ?tkXk é u á iAi, .? rm* ~ .- ^A-fe--,.-.-... .* ... ^^A,J^^^-.«»«-ate tA-As ^*- 4Jfeí¡4?f-' Estas secuencias heterólogas pueden ser utilizadas en las modalidades de esta invención que se refieren a los vectores del virus de la parotiditis, los cuales pueden ser utilizados para suministrar ARNs, secuencias de aminoácidos, polipéptidos y proteínas, variados, a un animal o ser humano. Los ejemplos descritos aquí demuestran la capacidad del virus de la parotiditis para expresar uno o más genes heterólogos (y aún 3, 4, o 5 genes) bajo el control del promotor transcripcional del virus de la parotiditis. En las modalidades alternativas, la secuencia del ácido nucleico heteróloga adicional puede ser una sola secuencia de hasta 7 a 10 kb, la cual es expresada como una unidad transcripcional extra única. Preferentemente, la Regla de los Seis (Calain and Roux, 1993) es seguida. En ciertas modalidades preferidas esta secuencia puede ser de hasta 4 a 6 kb. También se puede insertar la información genética heteróloga en la forma de las unidades transcripcionales monocistrónicas adicionales, y las unidades transcripciones policistrónicas . El uso de las unidades transcripcionales monocistrónicas adicionales, y las unidades transcripcionales policistrónicas deben permitir la inserción de más información genética. En las modalidades preferidas, la secuencia de nucleótidos heteróloga es insertada dentro de la secuencia del genoma de la parotiditis como al menos una unidad transcripcional, la cual puede .-«-..--i.-. «&J^. , •>-»*«»-*.«¿&*fc*^ -4^--iai--k--.>-«----contener uno o más sitios de entrada ribosómicos. En las modalidades preferidas alternativamente, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una poliproteína y un número suficiente de proteasas que segmentan la poliproteína para generar los polipéptidos individuales de la poliproteína. La secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser seleccionada para hacer uso de la ruta normal de infección del virus de la parotiditis, el cual se introduce al cuerpo a través del tracto respiratorio y puede infectar una variedad de tejidos y células, por ejemplo, las glándulas salivales, el tejido linfoide, las glándulas mamarias, los testículos y aún las células del cerebro. El gen heterólogo también puede ser utilizado para proporcionar agentes los cuales son utilizados para la terapia genética o para la ubicación como blanco de las células específicas. Como una alternativa a solamente tomar ventaja de las células normales expuestas durante la ruta normal de la infección de la parotiditis, el gen heterólogo, o fragmento, puede codificar otra proteína o secuencia de aminoácidos de un patógeno diferente el cual, cuando es empleado como parte del virus de la parotiditis recombinante, dirige el virus de la parotiditis recombinante a las células o tejidos los cuales no están en la ruta normal del virus de la parotiditis. De esta manera, el virus de la . -«-.--- -&-------• parotiditis recombinante llega a ser un vector para el suministro de una variedad más amplia de los genes extraños. Para las modalidades que emplean los virus de la parotiditis atenuados, se utilizan los medios convencionales para introducir las mutaciones atenuantes para generar el virus modificado, tal como la mutagénesis química durante el crecimiento del virus en los cultivos celulares a los cuales un mutante químico ha sido agregado, seguido por la selección del virus que ha sido sometido a un paso a una temperatura subóptima para seleccionar las mutaciones adaptadas al frío y/o sensibles a la temperatura, la identificación de los virus mutantes que producen placas pequeñas en el cultivo celular, y el paso a través de los huéspedes heterólogos para seleccionar las mutaciones de la gama del huésped. Un medio alternativo para introducir las mutaciones atenuantes comprende la fabricación de las mutaciones predeterminadas utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. Se pueden introducir una o más mutaciones. Estos virus son seleccionados entonces para la atenuación de su actividad biológica en el cultivo celular y/o en un modelo animal. Los virus de la parotiditis atenuados son sometidos a secuenciación de los nucleótidos para localizar los sitios de las mutaciones atenuantes. -i ÍJi--l¿í-.Ami-^. . a ---.j ------ Un virus de la parotiditis recombinante rescatado es probado para verificar su fenotipo deseado (sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, morfología de la placa, y atenuación de la transcripción y la replicación) , primero por medios in vitro, tales como la identificación de la secuencia, la confirmación de las etiquetas de la secuencia, y los ensayos a base de anticuerpos. Si el fenotipo atenuado del virus rescatado está presente, los experimentos de estimulación se pueden llevar a cabo con un modelo animal apropiado. Los primates no humanos proporcionan el modelo animal preferido para la patogénesis de la enfermedad humana. Estos primates son inmunizados primero con el virus producido recombinantemente, atenuado, luego se estimulan con la forma del tipo silvestre del virus. La elección del vector de expresión así como la molécula del ácido nucleico aislada la cual codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación, puede variar dependiendo de la selección del virus deseado. Los vectores de la expresión son preparados para permitir su coexpresión con el (los) vector (es) de transcripción en la célula huésped y la producción del virus recombinante bajo las condiciones seleccionadas.
Una recuperación del virus de la parotiditis incluye un medio celular apropiado, preferentemente de mamífero, en el cual la T7 ARN polimerasa está presente para impulsar la transcripción del ARN de una sola hebra antigenómico (o genómico) a partir del vector de la transcripción que contiene el ADNc genómico viral. Ya sea cotranscripcionalmente o brevemente después de esto, esta transcripción del ARN del antigenoma (o genoma) viral es encapsidada en los moldes funcionales por la proteína de la nucleocápsida y acoplada por los componentes de la polimerasa requeridos producidos concurrentemente a partir de los plásmidos de la expresión cotransfectados que codifican las proteínas de actuación trans específicas para el virus requerido. Estos eventos y procesos conducen a la transcripción de pre-requisito de los ARNms virales, la replicación y la amplificación de los nuevos genomas y, por medio de esto, a la producción de una progenie viral novedosa, es decir, de recuperación. En el método de recuperación de esta invención, la T7 ARN polimerasa puede ser provista por el virus de vaccinia recombinante. Sin embargo, este sistema requiere que el virus rescatado sea separado del virus de vaccinia por medios físicos o bioquímicos o por el paso repetido en las células o tejidos que no son un buen huésped para el virus de vaccinia. 1-FíXf-j.ft.állArllíxMa -Í - -jy,?? f..f- .. . r,..JMgtojfaA-- -L.HH-. i^ a^^rA«Fíitíf.'%Arjkf?»Aii Á,?.FÍlMif->^ Este requerimiento es evitado utilizando como una célula hospedera la cepa restringida del virus de vaccinia (por ejemplo MVA-T7) el cual no prolifera en las células de mamífero. Dos MVAs recombinantes que expresan la T7 ARN polimerasa del bacteriófago han sido reportados. Los virus recombinantes de MVA/T7 contienen una copia integrada de la T7 ARN polimerasa bajo la regulación de ya sea el promotor inicial/final débil de 7.5K (Sutter et al., 1995) o el promotor final fuerte de 11K (Wyatt et al., 1995). La célula hospedera, o la línea celular, que es empleada en la transfección de la composición de recuperación puede variar ampliamente con base en las condiciones seleccionadas para la recuperación. Las células hospederas son cultivadas bajo condiciones que permiten la coexpresión de los vectores de la composición de recuperación para producir el virus de la parotiditis recombinante deseado. Tales células hospederas pueden ser seleccionadas de una amplia variedad de células, incluyendo las células eucarióticas, y preferentemente las células de los vertebrados. Se pueden utilizar las células de aves, pero las células hospederas preferidas son derivadas de una célula humana, tal como una célula del riñon embriónico humano. Las células hospederas ejemplares son las células 293 humanas, las células A549 y las células Hep2. Las células Vero así como muchos otros tipos de células también pueden ser utilizados como las células hospederas. Otros ejemplos de células hospederas adecuadas son: (1) Las Líneas Celulares Primarias Diploides Humanas: por ejemplo las células WI-38 y MRC5; (2) la Línea Celular Diploide del Mono: por ejemplo las células del Pulmón de Rhesus Fetal - FRhL; (3) la Línea Celular Continua Casi-Primaria: por ejemplo las células del riñon del mono verde africano AGMK: : (4) otras líneas celulares potenciales, tales como, CHO, MDCK (del Riñon del Canino de Madin-Darby) , y los fibroblastos del embrión del pollo primario (CEF) . Algunas líneas celulares eucarióticas son más adecuadas que otras para la propagación de los virus y algunas líneas celulares no trabajan en su totalidad para algunos virus. Una línea celular es empleada la cual produce un efecto citopático detectable para que la recuperación del virus viable pueda ser detectado fácilmente. En el caso de la parotiditis, las células transfectadas pueden ser cocultivadas sobre las células Vero a causa de que el virus se dispersa rápidamente sobre las células Vero y hace fácilmente detectables a las placas. En general, se emplea una célula hospedera la cual es permisiva para el crecimiento del virus seleccionado. En las modalidades preferidas alternativamente, un reactivo que facilita la transfección puede ser agregado para A----t_-.t -A4-! . incrementar la absorción del ADN por las células. Muchos de estos reactivos ya son conocidos en el arte. LIPOFECTACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y EFFECTENE (Qiagen, Valencia, CA) son ejemplos comunes. Lipofectace y Effectene son ambos lípidos catiónicos. Los mismos tanto recubren el ADN como mejoran la absorción del ADN por las células. La lipofectace forma un liposoma que rodea el ADN mientras que el Effectene recubre el ADN pero no forma un liposoma. El vector de la transcripción y el vector de la expresión pueden ser vectores del plásmido diseñados para la expresión en la célula hospedera. El vector de la expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación pueden expresar estas proteínas a partir del mismo vector de la expresión o de al menos dos vectores diferentes. Estos vectores son conocidos generalmente de los métodos de recuperación básicos, y los mismos no necesitan ser alterados para su uso en los métodos mejorados de esta invención. En el método de la presente invención, un intervalo de temperatura estándar (aproximadamente 32 °C hasta aproximadamente 37 °C) para la recuperación puede ser empleado; sin embargo, la recuperación a una temperatura elevada se ha mostrado que mejora la recuperación del virus de ARN recombinante. La temperatura elevada es referida como una temperatura de choque térmico (Véase la Solicitud de Patente Internacional Publicada Número WO 99/63064, la cual es incorporada aquí para referencia) . Una temperatura de choque térmico efectiva es una temperatura arriba de la temperatura estándar sugerida para efectuar la recuperación de un virus recombinante en el cual el nivel de recuperación del virus recombinante es mejorado. Una lista ejemplar de los intervalos de temperatura es como sigue: desde 38 °C hasta aproximadamente 47 °C, con desde aproximadamente 42 °C hasta aproximadamente 46 °C que es el más preferido. Alternativamente, se señaló que las temperaturas de choque térmico de 43 °C, 44 °C, y 45 °C son preferidas particularmente. Se emplean medios numerosos para determinar el nivel de recuperación del virus de la parotiditis recombinante deseado. Como se señaló en los ejemplos aquí, un gen reportero de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) es utilizado para verificar y optimizar las condiciones para la recuperación del virus recombinante. La actividad correspondiente del gen reportero establece la línea base y el nivel de prueba de la expresión del virus recombinante. Otros métodos incluyen la detección del número de placas del t.-iit-^^_^iiai-Í-í---.---i-----^t?»i virus recombinante obtenido y la verificación de la producción del virus rescatado por secuenciación. En las modalidades preferidas, la composición de recuperación transfectada, cuando está presente en las células hospederas, es sometida a un paso de expansión de la placa (es decir un paso de amplificación) . La composición de recuperación transfectada es transferida sobre al menos una capa de las células de expansión de la placa (células PE) . La recuperación del virus recombinante a partir de las células transfectadas es mejorada por la selección de una célula de expansión de la placa en la cual el virus de la parotiditis o el virus de la parotiditis recombinante exhiben un crecimiento mejorado. Preferentemente, las células transfectadas que contienen la composición de recuperación son transferidas sobre una monocapa de células PE substancialmente confluentes. Las diversas modificaciones para las técnicas de recuperación, incluyendo la expansión de la placa, también son descritas en la Solicitud de Patente Internacional Publicada Número WO 99/63064. Los virus de la parotiditis recombinantes preparados a partir de los métodos de la presente invención son empleados para aplicaciones de diagnóstico, profilácticas y terapéuticas. Preferentemente, los virus recombinantes preparados a partir de los métodos de la presente invención - ----»!-----,, son atenuados. El virus recombinante atenuado debe exhibir una reducción substancial de la virulencia comparado con el virus del tipo silvestre el cual infecta a los huéspedes humanos y animales. La extensión de la atenuación es tal que los síntomas de la infección no surgirán en la mayoría de los individuos, sino que el virus retendrá una competencia de replicación suficiente para que sea infeccioso y produzca el perfil de respuesta inmune deseado para las vacunas. El virus recombinante atenuado puede ser utilizado solo o en conjunción con substancias farmacéuticas, antígenos, agentes de inmunización o auxiliares, como vacunas en la prevención o mejora de la enfermedad. Estos agentes activos pueden ser formulados y suministrados por medios convencionales, es decir por el uso de un diluyente o portador aceptable farmacéuticamente. En consecuencia, en las modalidades adicionales de esta invención el virus de la parotiditis producido recombinantemente, atenuado, es empleado en las composiciones inmunogénicas que comprenden (i) al menos un virus de la parotiditis atenuado producido recombinantemente y (ii) al menos uno del amortiguador o diluyente, auxiliar o portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, estas composiciones tienen aplicaciones terapéuticas y profilácticas como composiciones inmunogénicas en la * 1 prevención y/o mejora de la infección de la parotiditis. En tales aplicaciones, una cantidad efectiva inmunológicamente de al menos un virus de la parotiditis recombinante atenuado de esta invención es empleado en tal cantidad que provoca una reducción substancial en el curso de la infección de la parotiditis normal. La formulación de tales composiciones inmunogénicas es bien conocida por las personas expertas en este campo. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender componentes antígenicos adicionales (por ejemplo, polipéptidos o fragmentos de los mismos o ácidos nucleicos que codifican un antígeno o un fragmento del mismo) y, preferentemente, incluyen un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, adecuados, incluyen cualquiera y la totalidad de los solventes, medios de dispersión, rellenadores, portadores sólidos, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungosos, agentes isotónicos y para el retardo de la absorción, convencionales, y semejantes. El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador que no provoca una reacción alérgica u otro efecto no deseado en los pacientes en quienes el mismo es administrado. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, salmuera, salmuera amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y semejantes, así como combinaciones de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de substancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, preservativos o amortiguadores, los cuales mejoran la duración en almacenamiento o la efectividad del antígeno. El uso de tales medios y agentes para las substancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto por supuesto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, el uso del mismo en las composiciones de la presente invención está contemplado. La administración de tales composiciones inmunogénicas puede ser por cualquier forma efectiva convencional, tal como en forma intranasal, parenteral, oral, o tópica, aplicada a la superficie de las mucosas tales como las superficies intranasal, oral, de los ojos, de los pulmones, vaginal, o rectal, tal como por rociado con aerosol. Los medios preferidos de la administración son parenteral o intranasal. Las formulaciones orales incluyen los excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, los grados farmacéuticos del manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sodio, celulosa, carbonato de magnesio, y semejantes. Las composiciones de vacuna de la invención pueden incluir un auxiliar, incluyendo, pero sin estar limitado al hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio; Stimulon™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA) ; MPL™ (monofosforil lípido A 3-0-desacilado) ; RIBI ImmunoChem Research, Hamilton, MT) , IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) ; N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) ; N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP) ; N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifos-foriloxi) -etilamina (CGP 19835A, referido como un MTP-PE); y la toxina del cólera. Otras composiciones las cuales pueden ser utilizadas son los derivados no tóxicos de la toxina del cólera, incluyendo su subunidad B (por ejemplo, en donde el ácido glutámico en la posición 29 de los aminoácidos es reemplazada por otro aminoácido, preferentemente, una histidina de acuerdo con la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 00/18434, la cual es incorporada aquí), y/o los conjugados o fusiones diseñadas genéticamente de los polipéptidos diferentes de la parotiditis con la toxina del cólera o su subunidad B, el procoleragenoide, los polisacáridos fungosos.
El virus de la parotiditis atenuado producido recombinantemente de la presente invención puede ser administrado como el único inmunógeno activo en una composición inmunogénica. Alternativamente, sin embargo, la composición inmunogénica puede incluir otros inmunógenos activos, incluyendo otros antígenos activos inmunológicamente contra otras especies patógenas. Los otros antígenos activos inmunológicamente pueden ser agentes replicantes o agentes no replicantes. Los agentes replicantes incluyen, por ejemplo, las formas atenuadas del virus del sarampión, el virus de la rubéola, el virus de la variscella zooster (VZV) , el virus de la Parainfluenza (PIV) , y el Virus Sincitial Respiratorio (RSV) . Uno de los aspectos importantes de esta invención se refiere a un método para inducir las respuestas inmune en un mamífero que comprende el paso de proporcionar al mamífero una composición inmunogénica de esta invención. La composición inmunogénica es una composición la cual es inmunogénica en el animal o ser humano tratado de tal modo que la cantidad efectiva inmunológicamente del (de los) polipéptido (s) contenido (s) en tal composición ocasione la respuesta deseada contra la infección de la parotiditis. Las modalidades preferidas se refieren a un método para el tratamiento, incluyendo la mejora, o la prevención de la infección de la parotiditis en un ser humano que comprende la administración a un ser humano de una cantidad efectiva inmunológicamente de la composición inmunogénica. La cantidad de la dosificación puede variar dependiendo de las condiciones específicas del individuo. Esta cantidad puede ser determinada en los ensayos de rutina por los medios conocidos para aquellas personas expertas en el arte. Ciertamente, las secuencias de aminoácidos aislados para las proteínas del virus de la parotiditis pueden ser utilizadas en la formación de las vacunas de subunidades. Las mismas pueden ser utilizadas como antígenos para elevar los anticuerpos policlonales o monoclonales y en los inmunoensayos para la detección de los anticuerpos reactivos con la proteína del virus anti-parotiditis . Los inmunoensayos abarcados por la presente invención incluyen, pero no están limitados aquellos descritos en la Patente U.S. No. 4,367,110 (ensayo de emparedado del anticuerpo monoclonal doble) y la Patente U.S. No. 4,452,901 (western blot), tales Patentes U.S. son incorporadas aquí para referencia. Otros ensayos incluyen la inmunoprecipitación de los ligandos etiquetados y la inmunocitoquímica, tanto in vitro como in vivo. Esta invención también proporciona un método para el diagnóstico de una infección de la parotiditis, o la identificación de una cepa de la vacuna de la parotiditis que ha sido administrada, que comprende el paso de la determinación de la presencia, en una muestra, de una secuencia de aminoácidos de las SEC ID NOS 2-10. Cualquier método de diagnóstico convencional puede ser utilizado. Estos métodos de diagnóstico pueden estar basados fácilmente en la presencia de una secuencia de aminoácidos o polipéptido. Preferentemente, tal método de diagnóstico corresponde a un polipéptido que tiene al menos 10, y preferentemente al menos 20, aminoácidos los cuales son comunes para las secuencias de aminoácidos de esta invención. Las secuencias de ácidos nucleicos descritas aquí también pueden ser utilizadas para una variedad de aplicaciones de diagnóstico. Estas secuencias de ácidos nucleicos pueden ser utilizadas para preparar las secuencias de ADN y ARN relativamente cortas que tienen la capacidad para hibridizarse específicamente a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas del virus de la parotiditis. Las sondas de los ácidos nucleicos son seleccionadas para la longitud deseada en vista de los parámetros seleccionados de la especificidad del ensayo de diagnóstico. Las sondas pueden ser utilizadas en los ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de los organismos patógenos, o en la identificación de una vacuna contra la parotiditis que ha sido administrada, en una muestra dada.
Con las tecnologías avanzadas comunes para la expresión recombinante, las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser insertadas en una construcción de la expresión para el propósito de selección de los oligopéptidos y polipéptidos correspondientes para la reactividad con los anticuerpos existentes o para la capacidad de generar reactivos de diagnóstico o terapéuticos. Las secuencias de control de la expresión adecuadas y las combinaciones del vehículo de clonación/célula hospedera son bien conocidas en el arte, y son descritas a manera de ejemplo, en Sambrook et al. (1989) . En las modalidades preferidas, las secuencias de ácidos nucleicos empleadas para los estudios o ensayos de hibridación incluyen las secuencias que son complementarias con un estiramiento del nucleótido de al menos aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 nucleótidos, aunque al menos aproximadamente 10 a 30, o aproximadamente 30 a 60 nucleótidos pueden ser utilizados. Una variedad de técnicas y sistemas de hibridación conocidos pueden ser empleados para la práctica de los aspectos de hibridación de esta invención, incluyendo los ensayos de diagnóstico tales como aquellos descritos en Falkow et al., Patente US No. 4,358,535. En general, se contempla que las sondas de hibridación descritas aquí serán útiles tanto como reactivos en las hibridaciones en solución así como en las modalidades que emplean una fase sólida. En las modalidades que involucran una fase sólida, el ADN (o ARN) de prueba de las muestras clínicas sospechosas, tales como los exudados, los fluidos corporales (por ejemplo, el fluido amniótico, la efusión de las orejas media, el fluido de lavado broncoalveolar) o aún los tejidos, es absorbido o fijado de otra manera a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico de una sola hebra, fijo, es sometido entonces a hibridación específica con las sondas seleccionadas bajo las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares basadas en los criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, de los contenidos de G + C, el tipo del ácido nucleico de blanco, la fuente del ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc.). A continuación del lavado de la superficie hibridizada para remover las moléculas de la sonda unida no específicamente, la hibridación específica es detectada, o aún cuantificada, por medio de la etiqueta. Las secuencias del ácido nucleico que codifican las proteínas del virus de la parotiditis de la invención, o sus variantes, pueden ser útiles en conjunción con la tecnología de PCR™, como se describe, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4,603,102. Una manera de utilizar varias porciones de las secuencias del virus de la parotiditis de esta invención como las sondas de oligonucleótidos para la amplificación por PCR™ de una porción definida del gen del virus de la parotiditis, o el nucleótido del virus de la parotiditis, tal secuencia puede ser detectada entonces por la hibridación con una sonda de hibridación que contiene una secuencia complementaria. De esta manera, las concentraciones extremadamente pequeñas del ácido nucleico de la parotiditis pueden ser detectadas en una muestra que utiliza las secuencias de los nucleótidos de esta invención. Los siguientes ejemplos son incluidos para ilustrar ciertas modalidades de la invención. Sin embargo, aquellas personas con experiencia en el arte, tomando en cuenta la presente descripción, deben apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas las cuales son descritas y todavía obtener un resultado semejante o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Los siguientes ejemplos son provistas a manera de ilustración, y no deben ser interpretados como limitativos de la invención como se describió aquí anteriormente.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Materiales y Métodos 5 Células y virus. Las células de los fibroblastos del embrión del pollo primario (CEF) fueron obtenidas de SPAFAS Inc., Preston, CT) , y se cultivaron en el Medio Basal de Eagle (BME) suplementado con suero de bovino fetal al 5%. Las 0 células Hep 2, las células 293, A549, y las células Vero fueron obtenidas del American Type Culture Collection (ATCC) y se hicieron crecer en el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de bovino fetal al 10%. La cepa de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis fue 5 cultivado directamente sobre las células de CEF a partir de un frasco pequeño de Mumpsvax®, Números de Lote 0089E, 0656 J, y 1159H (Merck and Co . , Inc., West Point, PA) . El virus Ankara de vaccinia recombinante (MVA-T7), que expresa la T7 ARN polimerasa del bacteriófago se obtuvo del Dr. B. Moss 0 [ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) , véase Wyatt et al., 1995] . l.A. Generación de la secuencia de consenso de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis Crecimiento del material almacenado de la cepa de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis. La cepa de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis fue cultivada directamente a partir de los frascos pequeños de Mumpsvax (lote # 1159H, Merck and CO., Inc.) sobre los fibroblastos de los embriones del pollo primarios (CEFs, Spafas, Inc.) en el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de bovino fetal al 5% o en el Medio Basal de Eagle (BME) suplementado con suero de bovino fetal al 5%. Los CEFs colocados en placas sobre frascos T-25 fueron infectados con Mumpsvax resuspendido a una multiplicidad aproximada de la infección (moi) de 0.002 durante 2 horas a temperatura ambiente. El inoculo fue removido de las células y reemplazado con el medio fresco. Las células fueron incubadas a 37 °C durante 4 días, tiempo en el cual se observó una citopatología y sincitios extensos en el tiempo. El virus fue colectado raspando las células en el medio de cultivo, seguido por el congelamiento-licuado dos veces en un baño de etanol/hielo seco seguido por incubación a 37 °C. Los desechos celulares fueron removidos por centrifugación a 2,500 rpm en una máquina centrífuga Beckman GS-6KR (Beckman *..~--*iiéifc---Instruments, Inc., Palo Alto, CA) . El virus fue almacenado a -80 °C.
Aislamiento del ARN viral, amplificación y secuenciamiento . El ARN viral de la parotiditis fue aislado de las alícuotas congeladas del virus utilizando el Reactivo Trizol LS de acuerdo con el fabricante (GibcoBRL, Grand Island, NY) . La transcripción inversa seguido por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) se llevó a cabo utilizando el ARN viral aislado como un molde y utilizando el Sistema Titán One -Tube RT-PCR (Boehringer Mannheim, Indiananpolis, IN) . El genoma de la parotiditis fue amplificado en cuatro fragmentos separados, utilizando los siguiente pares de cebadores: 5'- ?ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG23 (SEC ID NO. 95) y 5'- 3875CTGAACTGCTCTTACTAATCTGGAC385i (SEC ID NO. 82) (producto de 3.9 kb) ; 5 * -3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3798 (SEC ID NO. 21) y 5'- 7783TGTAACTAGGATCTGATTCCAAGC7760 (SEC ID NO. 72) (producto de 4 kb) ; 5'- 7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG77o? (SEC ID NO. 32) y 5'- iieesCCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCGiiee? (SEC ID NO. 62) (producto de 4 kb) ; 5'- ?i529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG?i552 (SEC ID NO. 42) y 5'- ?5384ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATCi5363 (SEC ID NO. 53) (producto de 3.9 kb) . El protocolo sugerido del fabricante (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, catálogo # 1855476) fue seguido para las condiciones de RT y PCR. Los productos de PCR fueron purificados sobre un gel de agarosa al 1%. Los productos de PCR fueron secuenciados utilizando un Secuenciador 377 de Applied Biosystems (ABI) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . Para los propósitos de secuenciamiento, una serie de cebadores fue diseñado para extenderse sobre el genoma de la parotiditis completo como se muestra en la Tabla 4 posterior. Estas secuencias cebadoras estuvieron basadas en la información de la secuencia de los nucleótidos obtenida de Genbank para una combinación variable de cepas del virus de la parotiditis secuenciadas de manera incompleta. Utilizando las secuencias publicadas, una secuencia del genoma del virus de la parotiditis hipotético fue contemplada, la cual codifica sus proteína y luego los cebadores fueron generados a partir de la misma. Para determinar apropiadamente las secuencias en los extremos 5' y 3' del genoma de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis, el ARN del genoma viral fue ligado en sus extremos y el ADNc fue amplificados entonces por PCR a través de la región ligada. Para cada reacción, 3.5µg del ARN viral fueron incubados en DMSO al 10%, 5X del amortiguador de unión Íg .a afcá -----»--»-.-fc--ft---J---...~ ,.j*-a--i<t«y ttií.-. s -MS-fatefe-i-. ,-fofcJ y agua desionizada a 83 °C durante 3 minutos para desnaturalizar cualesquiera estructuras secundarias, y luego se colocaron inmediatamente sobre hielo. La T4 ARN ligasa (20 Unidades, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) y 40 Unidades de RNasin (Promega) fueron agregados para dar una mezcla de unión final de 20 µl la cual fue incubada toda la noche a 16 °C. Los productos de unión fueron extraídos con fenol/cloroformo y se sometieron a RT-PCR utilizando el siguiente par de cebadores los cuales se extendieron sobre la región unida o ligada del genoma: 5 * -i5i66GCGCATTGATATTGACAATGi5i85 (SEC ID NO. 52) y 5'- 216CCCTCCTCACCCCTGTCTTGi97 (SEC ID NO. 92). Los productos de PCR fueron sometidos a una segunda ronda de PCR utilizando los siguientes cebadores en serie: 5'- 15227GAATAAAGACTCTTCTGGC?5245 (SEC ID NO. 93) y 5'- ?38GGTAGTGTCAAAATGCCCCCn9 (SEC ID NO. 94) . Los productos de PCR finales fueron purificados en gel y secuenciados .
Tabla 4 Los cebadores para el scuenciamiento del genoma de MUV ! ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG 23 (SEC ID NO: 95) 385 CTCAGCAGGCATGCAAAATC 4o4 (SEC ID NO: 96) 765 CAAGATACATGCTGCAGCCG 784 (SEC ID NO: 13) U69 GTCCTAGATGTCCAAATGCG ?188 (SEC ID NO: 14) 1544 GACTTTAGAGCACAGCCTTT 1563 (SEC ID NO: 15) ?841 CAATCTAGCCACAGCTAACT ?86? (SEC ID NO: 16) 2?o7 CGTTGCACCAGTACTCATTG 2?26 (SEC ID NO: 17) 2484 GGCATAGACGGGAATGGAGC 2503 (SEC ID NO: 18) 3072 TTCGAGCAACGATTGGCAAAGGC 3094 (SEC ID NO: 19) 37i2 CCAGCTCCGATAAATATGTC 373? (SEC ID NO: 20) 3773 CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG 3798 (SEC ID NO: 21) 4062 CTGACAGTCAGCATAGGAGA 408i (SEC ID NO: 22) 4364 GAAGTCTGCCTCAATGAGAA 4393 (SEC ID NO: 23) 4716 CCAACCCACTGATAACAGCT 4735 (SEC ID NO: 24) 5i85 CCAGCATTGTCACCGATTAG 5204 (SEC ID NO: 25) 5545 CAATACAATGAGGCAGAGAG 556 (SEC ID NO: 26) 6223 TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC 6246 (SEC ID NO: 27) 5952 GAGCAACCATCAGCTCCAAT 597? (SEC ID NO: 28) 6330 CATAACCCTGTATGTCTGGAC 6350 (SEC ID NO: 29) 6783 GGATGATCAATGATCAAGGC 6802 (SEC ID NO: 30) 7172 'ÓGTAAGACACACTGGTGCTA 7191 (SEC ID NO: 31) 7678 AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG 7701 (SEC ID NO: 32) 7887 GCTGGTGGCCGTATGAACTCC -907 (SEC ID NO: 33) 83 4 CAGATTGACCATCACTTGAG 8363 (SEC ID NO: 34) 8660 CCTAGTCTCCGGTGGACCCG 8679 (SEC ID NO: 35) 9166 CACTGATATGTTAGAGGGAC 9?85 (SEC ID NO: 36) 9583 CCGAGAGTCCATGTGTGCTC 9602 (SEC ID NO: 37) 10000 AGAGGATGACAGATTCGATC 10019 (SEC ID NO: 38) 10415 GAGATAGCAGCCTGCTTTCT 10434 (SEC ID NO: 39) 10813 GCTCAGTCATTCCGAGAAGA ?0832 (SEC ID NO: 40) 11193 GTCAGGACATCACTAATGCT 112?2 (SEC ID NO: 41) 11529 GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG 11552 (SEC ID NO: 42) 12006 GCAGTAGTGGTGATGACAAG 12025 (SEC ID NO: 43) ?2375 CTCCTATGCATTCTCTAGCT ?2395 (SEC ID NO: 44) 12793 GCAGATGGTAAATAGCATCA 128?2 (SEC ID NO: 45) 13219 CGATTATGAGATAGTTGTTC ?3238 (SEC ID NO: 46) i3623 GTTCATCCGAATCAGCATCC ?36 2 (SEC ID NO: 47) 14036 CAAGCAGGTATAGCAGCAGG 14055 (SEC ID NO: 48) 14388 CCGACCCGAATAATCACGAG 1407 (SEC ID NO: 49) 14775 CATCAGATCATGACACCCTA 14794 (SEC ID NO: 50) 14963 GTGATAACACCCATGGAGATTC ?4984 (SEC ID NO: 51) 15166 GCGCATTGATATTGACAATG ?51ß5 (SEC ID NO: 52) 15384 ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC 15363 (SEC ID NO: 53) 14977 CATGGGTGTTATCACGTCTC ?4958 (SEC ID NO: 54) 5¿.--.'*-d--ii&--?- -.-'..»-«. -.'-Áa A,-. ' .Áa,ife.'.-,?...-^Mu^iiÍ---t^---tt------i--^----»«-»i»«l 14549 CAACACGCCTCCTCCAGTAC 14530 (SEC ID NO: 55) 14201 GTACACCCTCCAGATCCACA 14?82 (SEC ID NO: 56) ?3807 CCATGATGTGGATGATAAAC ?3788 (SEC ID NO: 57) 13412 CATATTCGACAGTTTGGAGT 13393 (SEC ID NO: 58) 13021 CAAGGTCATATACACATAGT ?3002 (SEC ID NO: 59) ?2602 CTACACAAGACTCGACAGGT ?2583 (SEC ID NO: 60) 12197 CTCCCGCTAATCTGAGTGCT ?2i78 (SEC ID NO: 61) uses CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG u662 (SEC ID NO: 62) H382 CAGATATCTAGACAGCCAGC n363 (SEC ID NO: 63) no GCACATCTTGCTCACGTTCT 10999 (SEC ID NO: 64) 10610 GGGTAGGATCTGATGGAGGA 10591 (SEC ID NO: 65) 10122 CGACCTGTAGCCTTTATCTC 10103 (SEC ID NO: 66) 9753 TCATGCCGCATCTCAATGAG 9734 (SEC ID NO: 67) 9356 CACCATACTGTAATTGGGCG 9337 (SEC ID NO: 68) 8969 ACCCACTCCACTCATTGTTGAACC 8946 (SEC ID NO: 69) 8602 TTCAGCTCGAATTGCCTTCC eses (SEC ID NO: 70) S46i GAGTATCTCATTTAGGCCCG 8442 (SEC ID NO: 71) 7783 TGTAACTAGGATCTGATTCCAAGC 77eo (SEC ID NO: 72) 7756 GACAAGAAATGCACTCTGTA 7737 (SEC ID NO: 73) 7325 CATCACTGAGATATTGGATC 7306 (SEC ID NO: 74) 6909 GATACCGTTACTCCGTGAAT 698o (SEC ID NO: 75) 6547 CAGACATACAGGGTTATGATGAG 6525 (SEC ID NO: 76) 5755 GTGACTGCATGATGGTCAGG 5754 (SEC ID NO: 77) 5352 CATCTGCATCTCATCTAGCA 5333 (SEC ID NO: 78) íiim^?fáí?:^?^^r^^^^^^ífr>Cr^íSláíM..-'j..^mi, .-y.-,- >----«-.-i.».-.,t_-?.:..t-Í.---»-.i-.---- 495i CACGTGCATTCGTCTGTGCT 4932 (SEC ID NO: 79) 4589 GAAAAGATTGCATAGCCCAAGC 4568 (SEC ID NO: 80) 4256 CTGGAGAATAGCACTGGCAG 4237 (SEC ID NO: 81) 3875 CTGAACTGCTCTTACTAATCTGGAC 385? (SEC ID NO: 82) 3530 GCACGCTGTCACTACAGGAG 3511 (SEC ID NO: 83) 3158 GTGAGTTCATATGGCGCTTC 3159 (SEC ID NO: 84) 2767 GCTAGTGTTGTCTTTACTGT 27e (SEC ID NO: 85) 2507 TGAGGCTCCATTCCCGTCTATG 2486 (SEC ID NO: 86) 2554 GTTGGTTGGATAGTTGGATC 23?s (SEC ID NO: 87) 1780 GCCCACTTGCGACTGTGCGT 176? (SEC ID NO: 88) 1458 CTCATATGCGGCAGCAGGTT 1419 (SEC ID NO: 89) 1059 GGATCGGAGCTTAGTGAGTT ?02o (SEC ID NO: 90) ese GTACACTGTAACACCGATCC 637 (SEC ID NO: 91) 216 CCCTCCTCACCCCTGTCTTG 197 (SEC ID NO: 92) El trabajo previo ha mostrado que la cepa de la vacuna de Jeryl Lynn contuvo una mezcla de dos poblaciones de virus distintas (Afzal et al., 1993). Por lo tanto para minimizar el potencial para las interacciones de proteína- proteína sub-óptimas (empalmando conjuntamente los fragmentos de ADNc derivados de las diferentes poblaciones del virus en el ADNc del genoma) durante el proceso de recuperación, una placa bien aislada de la preparación de la vacuna de Jeryl Lynn (designada como el aislado 4 de la placa, Pl 4) fue seleccionada y amplificada para la derivación del ADNc del genoma de longitud completa, y los plásmidos de expresión de NP, P y L.
I.B Construcción de los plásmidos de expresión para las proteínas NP, P y L de MUV. Los plásmidos de expresión para las proteínas NP, P y L de MUV (pMUVNP, pMUVP, pMUVL) fueron construidos empalmando el ADNc para cada ORF entre el promotor de la T7 ARN polimerasa y la secuencia de terminación de la transcripción de la T7 ARN polimerasa de un vector pEMC del plásmido modificado (Moss et al., 1960) el cual contuvo el mejorador de la traducción independiente de la tapa (CITE) del virus de la encefalomiocarditis (EMC) . Los cebadores utilizados para la amplificación por RT-PCR de la proteína ORF de MUV NP, del ARN de la célula infectada por MUV total (CEF), fueron 5' CGTCTC CCATGTTGTCTGTGCTCAAAGC (SEC ID NO 99) y 5' ATCATTCTCGAG TTGCGATTGGGGTTAGTTTG (SEC ID NO 100) ; el fragmento del ADNc resultante se purificó en un gel, se recortó con BsmBI y Xhol, y luego se ligó en el pEMC cortado en Ncol/Xhol, de tal modo que el AUG del ORF de la proteína de NP estuvo adyacente al CITE. Los cebadores para la amplificación del ORF de MUV P fueron 5' TTCCGGGCAAGCCATGGATC (SEC ID NO 101) y 5' ATCATTCTC GAGAGGGAATCATTGTGGCTCTC (SEC ID NO 102) . El ADNc de P ORF (modificado por la mutagénesis dirigida al sitio para incluir •i* -,¿lr*.Fj>¿u*-f>.-..f.-^¡n&.,fF..?a los dos nucleótidos G los cuales fueron insertados co- transcripcionalmente por la polimerasa viral para generar el ARNm de P) también fue clonado en los sitios Ncol/Xhol de pEMC. A causa de su tamaño grande el ORF de la proteína L fue ensamblado o unido en dos pasos; los cebadores 5' ATCATTCGTCTCCCATGGCGGGCCTAAATGAGATACTC (SEC ID NO 103) y 5' CTTCGTTCA TCTGTTTTGGATCCG (SEC ID NO: 104) fueron utilizados en el primer paso para producir un fragmento de ADNc el cual fue recortado con BsmBI y BamHI, luego se clonaron en los sitios NcoI/BamHI de pEMC. En el segundo paso los cebadores 5' CAGAGT ACCTTATATCGGATCC (SEC ID NO: 105) y 5' ATCATTCTGCAGGAATTTGGAT GTTAGTTCGGCAC (SEC ID NO: 106) fueron utilizados para amplificar un fragmento de ADNc el cual fue clonado en los sitios BamHI/Pstl del plásmido del paso uno anterior, para completar el ORF de la proteína L. Cuatro clones de ADNc para cada uno de los tres ORFs fueron secuenciados y el ORF con el nivel más elevado de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos/nucleótidos de consenso de Jeryl Lynn fue elegido en cada caso para su uso en los experimentos de recuperación. l.C. Construcción de un minirreplicón de MUV sintético. Refiriéndose a la Figura 1, la secuencia del promotor de la T7 ARN polimerasa fue designada para iniciar la transcripción con el nucleótido de la terminal 5' de MUV, y una secuencia del ribozima de HDV (Been et al.) fue colocada para generar el nucleótido de la terminal 3' de MUV en los transcritos del ARN del minirreplicón. Las señales de terminación de la T7 ARN polimerasa duplicadas fueron incluidas después de la secuencia del ribozima de HDV. El ORF de la cloranfenicol acetil transferasa bacteriana (CAT) reemplaza a la totalidad de la secuencia de codificación e intercistrónica del genoma de MUV; la secuencia específica de MUV esencial restante comprende el elemento Delantero 3' MUV (55 nt) con la región no traducida del gen de NP de 90 nt (UTR) , y el elemento trasero de 5' MUV (24 nt) adyacente al UTR del gen L de 137 nt . El minirreplicón de MUV sintético (MUVCAT) fue reunido o ensamblado a partir del ADNc que representa un genoma de MUV modificado, en donde todas las regiones de codificación e intercistrónicas fueron reemplazadas por el CAT ORF. El ADNc para los extremos 3' y 5' de MUV fue amplificado por RT/PCR a partir del ARN de la célula infectada (CEF) total, utilizando los pares de cebadores 5' ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG (SEC ID NO 107)/ 5' ATCATTCGTCTCTTTTCCAGGTAGTGTCAAAATGCC (SEC ID NO 108), y 5' ACCAAGGGGAGAA AGTAAAATC (SEC ID NO: 109)/ 5' ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC (SEC ID NO: 110) respectivamente. En una segunda ronda de la amplificación por PCR los cebadores en serie fueron utilizados para la adición del promotor de la T7 ARN polimerasa y el 5' a la porción de NarI de la secuencia del ribozima del virus delta de la hepatitis (HDV) a los extremos 5' y 3' de MUV respectivamente; estos pares de cebadores fueron: 5' AAGCTCGGCGGCCGCTTGTAA TACGACTCACTATAACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC (SEC ID NO: 111)/ 5' ATCATT CGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC (SEC ID NO: 112); para la adición del promotor de la T7 ARN polimerasa, y 5' ATCATTGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAAGG GGAGAATGAATATGGG (SEC ID NO: 113)/ 5' ATCATTCGTCTCTTTTCCAGGTAGTGTCAAAATGCC (SEC ID NO: 114) para la adición del componente de ribozima. El ADNc de ORF de CAT fue amplificado utilizando los cebadores 5' TCATTCGTCTCGGAAAATGGAGAAAAAAAT CACTGGATATACC (SEC ID NO: 115) y 5'ATCATTCGTCTCTCGATTTA CGCCCCGCCCTGCCACTC (SEC ID NO: 116) . Todos los tres componentes fueron purificados en un gel, recortados con BsmBI, unidos conjuntamente en una ligación de cuatro vías y clonados en los sitios de Notl/NarI de pBSK S (+) modificado (Sidhu et al., 1995) para producir el plásmido del minirreplicón completo, pMUVCAT. é---Í-AJ_-A--A-&-aa8 ¿iá l.D Construcción de un ADNc del genoma de longitud total para el MUV. El ADNc del genoma de longitud total de MUV (pMUVFL) se unió o ensambló extremo 5' con extremo 3' por la clonación sucesiva de los fragmentos de ADNc contiguos en el mismo esqueleto del plásmido que fue utilizado para la construcción de pMUVCAT (Véase la Figura 2) . Cada fragmento de ADNc fue amplificado del ARN de las células infectadas totales por RT-PCT utilizando los pares de cebadores los cuales contuvieron adecuadamente los sitios de restricción únicos; en cada caso el cebador de sentido positivo contuvo un sitio de Notl próximo a 5' además del sitio de endonucleasa específico del virus, para facilitar la estrategia de clonación por pasos. Previo a la adición al clon de longitud total en crecimiento, el fragmento de ADNc que se extiende sobre el extremo 3' del virus hasta el sitio BssHII fue unido o ensamblado separadamente en pBluescript II SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) . En el primer paso el fragmento del ADNc de BssHII/Clal fue clonado en los sitios de Clal/Hohl de pBluescript utilizando un cebador extendido 5' para generar un sitio Xohl adyacente al sitio de BssHII específico del virus. En el segundo paso el extremo 3' del virus para el fragmento del ADNc de Clal fue clonado en los sitios de Notl/Clal del plásmido a partir del primer paso para completar el extremo 3* del virus a la secuencia de íí . Arg <*»-. <?, J&fca. ?IÍ? BssHII. La secuencia del promotor de la T7 ARN polimerasa fue agregada al extremo 3' del virus por la incorporación en el cebador de RT/PCR de sentido (+) utilizado para generar el fragmento terminal de Clal/extremo 3' del virus. El fragmento 5' terminal (BamHI/NarI) del ADNc del genoma fue modificado separadamente en una segunda ronda de amplificación por PCR para agregar el extremo 5' a la porción NarI de la secuencia del ribozima de HDV. Un total de cuatro ciclos de clonación fueron empleados para la unión o montaje del pMUVFL; después de cada ronda, cuatro clones fueron secuenciados en la región del ADNc agregado recientemente y se compararon con la secuencia de consenso de MUV. El clon de ADNc que contiene el menor número de mutaciones fue seleccionado entonces para la adición del siguiente fragmento de ADNc. El clon del ADNc ensamblado totalmente se volvió a secuenciar para verificar la estabilidad durante la amplificación bacteriana. Las células SURE electrocompetentes (Stratagene, La Jolla, CA) y las células DH5alpha (GibcoBRL, Grand Island, NY) fueron utilizadas como huéspedes bacterianos para la clonación del ADNc de MUV. l.E Recuperación de la actividad de CAT de las células transfectadas. Para la recuperación de la actividad de CAT, las células fueron ya sea infectadas con MUV y transfectadas con el ARN del minirreplicón de MUVCAT transcrito in vitro o infectadas con MVA-T7 y transfectadas con pMUVCAT en compañía de los plásmidos de expresión pMUVNP, pMUVP y pMUVL. Las transcripciones in vitro se llevaron a cabo con 4 µg de pMUVCAT como el molde para la T7 ARN polimerasa en 20 µl de volumen final de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega, Madison, Wl) ; el ADN del molde fue diluido entonces con la RQ-1 DNasa. Los cultivos toda la noche de las células 293 se hicieron crecer hasta una confluencia del 80% aproximadamente en discos de seis cavidades, fueron infectadas con MUV a un moi de 1-2; a 1 hora después de la infección (hpi) de una mezcla que contiene 5-10 µl de la reacción de transcripción in vitro (aproximadamente 5-10 µg de ARN) y 10-12 µl de LipofectACE (GibcoBRL) se agregaron a cada cavidad, de acuerdo con el protocolo del fabricante. A 48hpi las células fueron retiradas por raspado de la suspensión, colectadas por centrifugación, suspendidas en 100 µl del amortiguador de tris 0.25M de pH 7.8, y se somete a tres rondas de congelamiento-licuado. Los extractos celulares aclarados fueron evaluados entonces para verificar la actividad de CAT utilizando ya sea el cloranfenicol etiquetado con 1C (Sidhu et al, 1995) o cloranfenicol etiquetado con fluoresceína como el substrato (Molecular Probes, Eugene, Ore) , seguido por el análisis de los productos de la reacción sobre un Cromatograma de Capa Delgada. Para la recuperación de la actividad de CAT en la ausencia del virus auxiliador de MUV, las células 293, Hep2 y A549 se hicieron crecer toda la noche en discos de seis cavidades hasta una confluencia de aproximadamente 80%, se infectaron con MVA-T7 a una moi de 10 y se transfectaron lhpi con una mezcla que contiene 200ng de pMUVCAT, 300ng de pMUVNP, 50ng de pMUVP, 200 ng de pMUVL, y 10-12 µl de LipofectACE. A 24hpi la mezcla de la transfección se reemplazó con 2 ml del medio de crecimiento fresco y las células se incubaron durante unas 24 h adicionales, seguido por la preparación de los extractos celulares y el ensayo de CAT como se describió anteriormente. l.F Recuperación del MUV de longitud total infeccioso a partir de las células transfectadas. Para la recuperación del MUV infeccioso a partir del ADNc, las células A549 que se hicieron crecer toda la noche hasta aproximadamente 90% de confluencia en discos de seis cavidades, se infectaron con MVA-T7 a una moi de 4; en lhpi las células fueron transfectadas con una mezcla que contiene 3-7ug de pMUVFL, 300ng de pMUVNP, 50ng de pMUVP, 200 ng de pMUVL, y 14 µl de Lipofectace. A 24hpi la mezcla de la transfección se reemplazó con el medio de crecimiento (DMEM que contiene 10% de suero de bovino fetal), y las células se incubaron a 37 °C durante unas 48 horas adicionales; ya sea los sobrenadantes (Pl) o las monocapas de las células transfectadas totales retiradas por raspado en la suspensión fueron transferidas entonces directamente sobre las monocapas de las células A549 confluentes, las cuales fueron incubadas a 37 °C durante cuatro días y luego se prepararon para el ELISA de células completas (véase posteriormente) para detectar los focos infecciosos de MUV. Los sobrenadantes (P2) de estas células indicadoras de A549 se hicieron pasar adicionalmente sobre las monocapas de las células Vero confluentes y se incubaron a 37 °C durante 3-4 días para observar los sincitios inducidos por MUV. l.G Identificación y autenticación del MUV rescatado.
La identificación inicial del MUV rescatado (rMUV) se llevó a cabo utilizando un ELISA de las células completas; las células A549 infectadas con los sobrenadantes de la transfección (véase anteriormente) fueron fijados con formaldehído al 10% en salmuera amortiguada con fosfato IX (PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente; las células fueron enjuagadas entonces una vez con PBS y una vez con la £« %. *-.--&^-- ¿-.¿fe- --& - solución de bloqueo (leche al 5% (p/v) en xl PBS) , seguido por incubación toda la noche a 4 °C en la solución bloqueadora. La solución bloqueadora toda la noche fue removida entonces y las células fueron incubadas a temperatura ambiente durante 2-3h con el antisuero de conejo policlonal de MUV (Access Biomedical, San Diego) diluido 1/400 en la solución bloqueadora fresca. El antisuero policlonal fue removido entonces; las células fueron enjuagadas 5X con la solución bloqueadora y se incubaron entonces a temperatura ambiente durante 2-3h con suero de anti-conejo cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (DAKO Corporation, Carpintería, CA) , diluida 1/1000 en la solución bloqueadora. El suero de cabra fue removido entonces; las células fueron lavadas 5X con la solución bloqueadora y IX con PBS, seguido por la adición de suficiente substrato de AEC (DAKO Corporation) para cubrir las monocapas de las células, las cuales fueron incubadas entonces a 37 °C durante 15-20 minutos para facilitar el desarrollo del teñido. Las etiquetas de nucleótidos presentes solamente en pMUVFL (no presentes en ningún laboratorio que hicieron crecer el MUV de Jeryl Lynn) se verificaron en rMUV por el análisis de la secuencia de los fragmentos de ADNc amplificados por RT/PCR a partir de las células Vero infectadas con (P2) rMUV. El ARN fue preparado a partir de las células infectadas en un disco de seis cavidades por la extracción con Trizol (GibcoBRL) de acuerdo con el protocolo del fabricante; un quinta parte del ARN total de cada cavidad fue utilizado como el molde para la amplificación por RT/PCR de acuerdo con las indicaciones para el Conjunto Titán (Boheringer Mannheim, Indianapolis, IN) , con los pares de cebadores que flanquean cada una de las tres etiquetas de nucleótidos separadas. Los fragmentos de RT/PCR resultantes se purificaron a partir de un gel de agarosa al 1% por electroelución, y se secuenciaron utilizando un secuenciador 377 de Applied Biosystems (ABI) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
Ejemplo 2 Recuperación de la actividad del gen reportero a partir de las células transfectadas. Para ayudar a definir un sistema el cual podría permitir la recuperación del virus de la parotiditis infeccioso del ADNc, el minirreplicón del virus de la parotiditis que contiene el gen reportero de CAT fue unido o ensamblado. La construcción fue diseñada para permitir la síntesis de un minigenoma de ARN de polaridad negativa bajo el control del promotor de la T7 ARN polimerasa. Los tres residuos de G terminales del promotor T7 fueron omitidos durante la construcción del minirreplicón para proporcionar un sitio de partida transcripcional el cual empezó con el nucleótido 5' preciso del genoma de MUV. La inclusión del ribozima de HDV en la construcción del minirreplicón permitió la segmentación de la transcripción de la T7 ARN polimerasa para producir el extremo 3' específico de MUV auténtico. El número total de nucleótidos (966) en el ARN del minirreplicón de MUVCAT fue divisible entre seis, de acuerdo con la Regla de Seis (Calain y Roux, 1993) , la cual establece que a menos que la longitud del genoma sea un múltiplo de seis, la replicación eficiente no ocurrirá. La expresión del gen CAT fue bajo el control de un promotor específico de MUV, y podría ocurrir solamente si el ARN del minirreplicón llegara a ser encapsidado con la proteína de NP y luego se hicieron interactuar con las proteínas de la ARN polimerasa específicas para MUV funcionales. La recuperación de la actividad de CAT fue observada aquí utilizando dos sistemas de rescate diferentes. En el primer procedimiento el ARN de MUVCAT transcrito in vitro fue transfectada en las células 293 las cuales han sido infectadas previamente con MUV. Bajo estas condiciones la actividad de CAT rescatada usualmente fue relativamente baja, pero fue reproducible y siempre estuvo arriba de los niveles aá_(l?.i»-- hgy^^^^^^|J*¡gJ^^1^-^^¡a^^^^l^^^^^^^^^^^^^-^^^^^^-^^¿¿^=^^ sMuSí AÁ¿M base (Véase la Figura 3A) . Los paneles Al, A2 y A3 muestran los resultados de tres experimentos de rescate separados; panel Al, la faja 1 muestra la actividad de CAT en las células infectadas con MUV transfectadas sin el ARN de pMUVCAT transcrito in vitro, la faja 2 muestra la actividad de CAT en las células infectadas con MUV transfectadas con el ARN transcrito in vitro desde el pMUVCAT; la faja 3 muestra la actividad de CAT en las células infectadas con MUV transfectadas con el ARN transcrito in vitro a partir de pMUVCAT-GG; la faja 4 muestra la actividad de CAT en las células no infectadas transfectadas con el ARN transcrito in vitro a partir del pMUVCAT. Cada ensayo de CAT mostrado en el panel Al se llevó a cabo a 37 °C durante 3-4 horas con 20% del extracto de aproximadamente 106 células transfectadas. La faja 1 del panel A2 muestra las células infectadas con MUV transfectadas con el ARN transcrito in vitro desde el pMUVCAT; la faja 2 muestra las células no infectadas transfectadas con el ARN transcrito in vitro a partir del pMUVCAT. Cada ensayo de CAT mostrado en el panel A2 se llevó a cabo a 37 °C durante 5h utilizando 50% del extracto de aproximadamente 106 células transfectadas. La faja 1 del Panel A3 muestra las células infectadas con MUV transfectadas con el ARN transcrito in vitro desde el pMUVCAT; la faja 2 muestra las células infectadas con MUV transfectadas sin el ARN de pMUVCAT transcrito in vitro; la faja 3 muestra las células no infectadas transfectadas con el ARN transcrito in vitro del pMUVCAT. Cada ensayo de CAT mostrado en el panel A3 se llevó a cabo a 37 °C durante 4 horas utilizando 50% del extracto de aproximadamente 106 células transfectadas. La actividad de CAT no podría ser rescatada de una construcción de MUVCAT (pMUVCAT-GG) la cual contuvo 2 de los 3 residuos G adicionales normalmente presentes en el promotor de la T7ARN polimerasa. Sin embargo, dos mutaciones presentes en la región trasera de MUV de la misma construcción de MUVCAT previnieron la interpretación conclusiva de esta observación. Los resultados de estos experimentos indicaron que nt-145 y ntl5223-15384 del genoma de MUV contuvieron las secuencias necesarias para la encapsidación, la transcripción y presumiblemente la replicación del genoma. Habiéndose definido una secuencia de minirreplicón la cual permitió el rescate de la actividad de CAT en la presencia de las proteínas auxiliadoras expresadas por MUV, un segundo sistema fue diseñado para llevar a cabo el rescate de la actividad de CAT del ADN transfectado, incluyendo pMUVCAT, pMUVNP, pMUVP, y pMUVL. En este sistema las proteínas NP, P y L de MUV y las transcripciones del ARN del minirreplicón de MUVCAT fueron coexpresadas dentro de las células 293, Hep2, y A549, bajo el control de la T7ARN polimerasa inducida por MVA-T7. Los experimentos iniciales llevados a cabo en las células 293 indicaron que el rescate de CAT fue eficiente y reproducible. La eficiencia incrementada del rescate de CAT se observó en las células de Hep2 con relación a las células 293, y una serie de concentraciones del plásmido fueron efectuadas para optimizar las cantidades relativas de cada plásmido en la mezcla de transfección. El incremento adicional en la eficiencia del rescate fue observada en las células A549 con relación a las células de Hep2, con una conversión casi del 100% del substrato en un ensayo de CAT de 3h, utilizando 20% del lisado celular de A549 de una cavidad de un disco de seis cavidades. (Figura 3B) . Estos resultados demostraron que las proteínas auxiliadores de MUV expresadas a partir de pMUVNP, pMUVP y pMUVL fueron suficientes para promover la encapsidación, replicación y transcripción de los minigenomas de ARN antisentido de MUVCAT. Adicionalmente, las condiciones óptimas observadas para el rescate de CAT proporcionaron un punto de partida para el rescate del MUV infeccioso completamente a partir del ADNc.
Ejemplo 3 Recuperación del virus de la parotiditis de longitud total a partir de las células transfectadas. El ADNc de MUV de longitud total fue unido o ensamblado de una manera tal que se permita la síntesis de una copia de ARN de sentido positivo de 15,384nt precisa del genoma del virus bajo el control del promotor de la T7 ARN polimerasa. Como con el minirreplicón de MUVCAT, la secuencia del promotor de la T7 ARN polimerasa fue modificada para omitir los tres residuos G terminales, proporcionando un sitio de partida transcripcional que empieza en el nucleótido terminal de MUV exacto. El ribozima de HDV fue empleado para generar el nucleótido terminal MUV 3' exacto de las transcripciones del genoma de sentido positivo. Para recuperar el MUV a partir del ADNc, las células A549 fueron infectadas con MVA-T7 las cuales expresan la T7 ARN polimerasa, y luego se transfectaron con pMUVFL, y los plásmidos que expresan las proteínas NP, P y L de MUV. Los resultados para el rescate de la actividad del gen reportero a partir del minirreplicón de MUVCAT en compañía de los resultados de un trabajo similar sobre el rubulavirus SV5 relacionado (He et al, 1997; Murphy y Parks, 1997) indicaron que las proteínas NP, P y L de MUV podrían ser suficientes para encapsidar, replicar y luego transcribir la T7 ARN polimerasa generada por las transcripciones del ARN del genoma de sentido positivo, siempre que la totalidad de los componentes interactivos estuvieran presentes a niveles y relaciones operativas. Las células A549 fueron elegidas para táA-Í.--.----------*------l.--L---L-------ka-._, t -------, - ^--. - ^ fej.-. - ?- .- -^*--^fc---- a---*-1-M--É- i-feiifel los experimentos de rescate de MUV a causa de que las mismas soportaron la replicación de MUV y la actividad de rescate de CAT eficiente que otras líneas celulares probadas (potencialmente a través de una transfección más eficiente) , y las mismas también fueron más resistentes a la citopatología inducida por MVA-T7. En el primer experimento de rescate exitoso, el medio sobrenadante (sin aclaración) de las células transfectadas fue transferido a las células indicadoras A549 frescas. Tres sitios de infección fueron observados por el ELISA de células completas en una de cinco cavidades de las células indicadoras (Figura 4) . A continuación del paso de los sobrenadantes desde estas células sobre la monocapa de las células Vero frescas, se observaron tres sincitios bajo el microscopio. Uno de estos sincitios fue aspirado en el medio como una cosecha de la placa líquida, y se utilizó para infectar las células Vero frescas; numerosos sincitios fueron observados entonces sobre esta monocapa celular (Figura 5) , y el ARN celular-infectado total fue extraído para la identificación del virus rescatado. En un segundo experimento de rescate al menos 10- 20 sitios infecciosos fueron obtenidos de cada cavidad de las células transfectadas como se observa sobre las células indicadoras teñidas por el ELISA de células completas (Figura 5) . En este experimento todas las células, excepto en donde el pMUVL fue omitido de la mezcla de transfección, contuvieron el virus rescatado, indicando que el proceso de rescate fue muy reproducible. El nivel óptimo de cada plásmido así determinado para el rescate del MUV a partir del 5 ADNc es de 300ng de pMUVNP, 50ng de pMUVP, 200 ng de pMUVL, y 3-7µg del pMUVFL.
Ejemplo 4 Identificación del MUV rescatado. Fue importante 10 demostrar que el rMUV fue derivado del pMUVFL. Esto se hizo posible por la presencia de las tres etiquetas de los nucleótidos en pMUVFL, introducidas por la incorporación errónea de RT/PCR durante el montaje del ADNc del genoma de longitud total. Estas etiquetas diferenciaron al pMUVFL de 15 las secuencias de consenso del virus de la vacuna de Jeryl Lynn, como de un aislado de la placa pasada de la preparación de la vacuna de Jeryl Lynn a partir de la cual se derivó el pMUVFL. Dos de las etiquetas representaron cambios silenciosos en los nucleótidos 6081 y 11731 de los genes F y 20 L respectivamente; una tercera etiqueta condujo a una substitución de Lys a Arg en el aminoácido 22 de la proteína L (que corresponde a la posición 8502 de los nucleótidos) de pMUVFL. Para mostrar que el rMUV fue generado a partir del pMUVFL y no de alguno de las otras dos poblaciones de MUV que X : se hicieron crecer en el laboratorio, los productos de RT/PCR, preparados a partir del ARN de las células infectadas con rMUV, que se extienden cada una sobre las tres etiquetas de los nucleótidos, se secuenciaron en la(s) posición (es) relevante (s) . Para demostrar que estos productos de RT/PCR fueron derivados solamente del ARN celular infectado, y no del transporte de las cantidades de traza del ADN del plásmido transfectante, una reacción se llevó a cabo con el ARN de las células infectadas por rMUV como el molde para la amplificación por PCR sin la transcripción inversa previa. Los resultados de las amplificaciones de RT/PCR, y el análisis de secuenciamiento subsiguiente de los productos de TR/PCR son mostrados en la Figura 6. El ARN total fue preparado a partir de las monocapas de las células Vero infectadas con el virus P2 rMUV a partir de las células transfectadas. Las reacciones de RT/PCR se establecieron para generar los productos de ADNc que se extienden sobre los 3 sitios de la etiqueta del nucleótido separadas solamente en pMUVFL y rMUV. La faja 1 muestra la escalera de lkb del marcador (Gibco/BRL) ; las fajas 2, 3 y 4 muestran los productos de RT/PCR que se extienden sobre las posiciones 6081, 8502 y 11731 de la etiqueta del nucleótido respectivamente. Para demostrar que estos productos de RT/PCR no fueron derivados de la contaminación de los ADNs del plásmido, se llevó a cabo una reacción idéntica a aquella utilizada para la generación del ADNc mostrado en la faja 4 sin RT; el (los) producto (s) de esta reacción son mostrados en la faja 5. Para demostrar que ningún rMUV pudiera ser recubierto cuando el pMUVL fue omitido de las mezclas de transfección, una reacción de RT/PCR idéntica a aquella utilizada para generar los productos de ADNc mostrada en la faja 4 fue establecida utilizando el ARN de las células Vero derivadas de las transfecciones llevadas a cabo sin el pMUVL; los productos de esta reacción son mostrados en la faja 6. Los datos de la secuencia de consenso generados a partir de los productos de RT/PCR mostrados en la Figura 6 demuestran claramente que el MUV rescatado contuvo la misma etiqueta del nucleótido presente solamente en el ADNc del genoma de longitud total del MUV (Figura 7) . Véase la Tabla 1 de la Figura 8 para un listado de las diferencias de los nucleótidos y los aminoácidos entre el clon de ADNc de longitud total y el aislado 4 de la placa (Pl 4) y la secuencia de consenso para la cepa de Jeryl Lynn (SEC ID NO: 1) . En vista de los ejemplos anteriores, se concluye que el virus de la parotiditis infeccioso ha sido producido partir de una copia del ADN del genoma del virus. Este procedimiento requirió la cotransfección de las células de fet,»»--!*--^-----!..-.! --------*«»*-&- », A549 infectadas con MVA-T7, con los plásmidos que codifican las proteínas NP, P y L de MUV, en compañía de un plásmido que contiene el ADNc del genoma completo del virus de la parotiditis. El éxito de este proceso fue dependiente del desarrollo de una secuencia de consenso para el genoma del virus de la parotiditis completo (cepa de Jeryl Lynn) y el desarrollo novedoso de un sistema de rescate del minirreplicón del virus de la parotiditis . Nota: Una substitución de Lys a Arg en el aminoácido 22 de la proteína L en la construcción de longitud total no altera la obtención del virus de la parotiditis rescatado.
Ejemplo 5 El Virus de la Parotiditis como un Vector de Expresión para Uno o Más de los Genes Heterólogos Los siguientes experimentos establecen el virus de la parotiditis como un vector de expresión. Esta modalidad es demostrada por la recuperación del virus de la parotiditis recombinante infeccioso que expresa uno o más de los genes reporteros.
Construcción del virus de la parotiditis recombinante que contiene ya sea el gen de la Beta-Galactosidasa, el gen de Luciferasa de la Luciérnaga, o el gel de la Luciferasa de la Luciérnaga y el gen de CAT. Para permitir la inserción de los genes heterólogos o la información genética extraña en el genoma del virus de la parotiditis, se generó un sitio de la endonucleasa de restricción de AscI único en el ADNc del genoma de longitud completa, utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. El sitio AscI fue colocado en la región no codificante 5' del gen M (nucleótidos 4451-4458 del genoma), de tal modo que los genes heterólogos adicionales que contienen las secuencias reguladoras del flanqueo apropiadas del virus de la parotiditis y los sitios de AscI terminales, pudieran ser integrados en el genoma de la parotiditis entre los genes M y F del virus, para producir el (los) virus de la parotiditis infeccioso (s) novedoso (s) capaces de expresar el (los) gen (es) extraño (s). Los materiales recombinantes del virus de la parotiditis que contienen ya sea el gen de la beta-galactosidasa o el gen de la luciferasa de la luciérnaga han sido construidos (véase la Figura 11) . Otro virus de la parotiditis recombinante que contiene el virus CITE de EMC adyacente al codón de inicio de la traducción de la luciferasa también fue construido para la comparación con los niveles de la proteína (luciferasa) producidos por el material recombinante que contiene la luciferasa el cual utilizó los elementos reguladores de actuación cis del virus de la parotiditis normales para el inicio de la traducción. El gen de luciferasa de la luciérnaga fue preparado para la inserción en el genoma del virus de la parotiditis por dos rondas de la PCR en serie, utilizando los cebadores los cuales incorporaron las secuencias específicas del virus de la parotiditis (nucleótidos 4459-4538 y 4392-4449 del genoma respectivamente) adyacente al ATG y UUA del gen de la luciferasa. En este proceso el nucleótido 4450 del genoma fue delecionado del fragmento de ADN generado por PCR para mantener la "regla de seis" en el genoma recombinante que contiene la luciferasa final; también, en el mismo fragmento del ADN, los nucléotidos 4539-4545 del genoma fueron reemplazados por los siete nucleótidos encontrados normalmente corriente arriba de la ATG de la luciferasa. Los sitios de AscI terminales presentes en el producto de PCR final facilitaron la adición del gen de luciferasa y el flanqueo de la secuencia específica del virus de la parotiditis en el genoma del virus de la parotiditis. De manera similar, un material recombinante del virus de la parotiditis separado que contiene el gen de la beta-galactosidasa fue construido. El fragmento de ADN generado por PCR que incorpora el gen de la beta-galactosidasa y el que flanquea las secuencias específicas del virus de la parotiditis contuvo la misma deleción del nucleótido 4450 del genoma, como en el fragmento del ADN que contiene la luciferasa. Sin embargo un segundo trinucleótido TAA fue incorporado adyacente al codon de terminación de la traducción TAA normal del gen de Beta-galactosidasa, pare preservar la "regla de seis" en el genoma del virus de la parotiditis recombinante final. También, a diferencia de la construcción que contiene la luciferasa, los siete nucleótidos corriente arriba que flanquean el ATG de la Beta-galactosidasa (nucléotidos 4539-4545 del genoma) fueron específicos para el virus de la parotiditis. Un tercer material recombinante del virus de la parotiditis que contiene el CITE del virus de EMC adyacente al ATG del gen de la luciferasa, también fue construido. Para que el material recombinante contenga solamente el gen de la luciferasa, las reacciones de PCR en serie fueron utilizadas para agregar separadamente la secuencia específica del virus de la parotiditis en el extremo 5' y el extremo 3' del CITE y el gen de la luciferasa, respectivamente. En una unión o ligamiento de tres vías, el extremo 3' del CITE y el extremo 5' del gen de la luciferasa fueron unidos en el sitio de la endonucleasa de restricción de Ncol y se agregaron en el sitio AscI del genoma del virus de la parotiditis. El l¿- Í-----. _---¿a-Í-- l-áI-ll-**«J**jfeg^¡--j-<--.-.-t- ------kfaft- nucleótido 4450 del genoma fue delecionado, y el trinucleótido ACT fue agregado al extremo 5' del CITE durante la PCR para preservar la "regla de seis" en el virus de la parotiditis recombinante resultante. Los materiales recombinantes del virus de la parotiditis fueron construidos, los cuales contuvieron tanto el gen de CAT como el gen de la luciferasa, ya sea como dos unidades transcripcionales separadas, o como una unidad transcripcional única que contiene el EMC CITE como un sitio de entrada ribosómico interno para la traducción del segundo gen (luciferasa) del policistrón (véase la Figura 12) . La PCR en serie fue utilizada para genera dos fragmentos de ADN, uno que contiene el gen de CAT y el otro el gen de la luciferasa, cada uno flanqueado con la secuencia del ADNc intergénico específico para el virus de la parotiditis apropiado. Ambos de estos fragmentos fueron unidos y luego ligados en el ADNc del genoma del virus de la parotiditis por medio del sitio AscI utilizado previamente para la inserción de los genes reporteros únicos. De manera similar, la PCR en serie fue utilizada para generar separadamente los fragmentos de ADN que contienen el gen CAT y el EMC CITE fusionado al gen de la luciferasa, cada uno flanqueado con la secuencia del ADNc intergénica específica para el virus de la parotiditis apropiado. Ambos de los fragmentos del ADN fueron unidos y ligados en el sitio AscI del ADNc del genoma del virus de la parotiditis. El orden de los genes reporteros en ambas construcciones fue 5' CAT-LUC 3' y 5' CAT CITE LUC 3'.
Recuperación de los materiales resombinantes del virus de la parotiditis. Los plásmidos que contienen los genomas del virus de la parotiditis recombinante, en compañía de los plásmidos de soporte que expresan las proteínas NP, P y L del virus de la parotiditis fueron transfectados en las células A549 infectadas con MVA-T7, como se describió previamente arriba en el Ejemplo 3. El virus rescatado total de las células transfectadas fue amplificado primero en las células A549 frescas (Paso 1), y subsiguientemente en las células Vero. En el Paso 3, el virus rescatado fue evaluado para verificar la actividad del gen reporte.
Ensayo de la actividad del gen reportero. La actividad del gen reportero fue medida ya sea en los extractos de las células las cuales han sido infectadas con los materiales recombinantes del virus de la parotiditis o por el teñido citológico de las monocapas de las células infectadas. Los extractos de las células infectadas con los materiales recombinantes del virus de la parotiditis que contienen ya sea el gen de la luciferasa, o el gen de la luciferasa j - A-ii -ff-fa fusionado el virus CITE de EMC, fueron evaluados para verificar la actividad de la luciferasa en un luminómetro (Analytical Luminiscence Laboratory, Monolight 2010) . La preparación de los extractos celulares y los ensayos de la luciferasa fueron efectuados de acuerdo con el protocolo del fabricante para el Conjunto de Ensayo de la Luciferasa Mejorado (Pharmingen, San Diego, CA) . Los extractos de las células infectadas con los materiales recombinantes del virus de la parotiditis que contienen el gen de la beta-galactosidasa por el teñido citológico de acuerdo con el protocolo para el conjunto de teñido beta-gal (Promega, Madison, Wisc). La medición de la actividad de CAT se llevó a cabo sobre los lisados congelados-licuados de las células infectadas, como se describió previamente en los Ejemplos anteriores.
Expresión de la luciferasa de la Luciérnaga por el virus de la parotiditis. Una actividad fuerte de la luciferasa se ha detectado en los extractos de las células los cuales han sido infectados con el virus rescatado. En cada caso, el virus rescatado fue derivado de los ADNcs genómicos del virus de la parotiditis recombinante los cuales contuvieron ya sea el gen de la luciferasa de la luciérnaga solo o tanto el gen de CAT como el gen de la luciferasa en serie. Véase la Figura i a-i -i.ÁttaÍi-i i ta;'"'*"'"-- .- - • - i.it-i-a .. .- ,-- —.».__ j.«-i-n---.-t,- M--?-a«-A-sam>r-i«-iÉ¡-? 14, la cual es un cromatograma de capa delgada que muestra la actividad de CAT presente en los extractos de las células Vero las cuales fueron infectadas con el rMUV que contiene ambos de los genes de CAT y luciferasa. El virus recombinante que contiene los genes de CAT y luciferasa como una unidad transcripcional (rMUVC/C/L) fueron purificados en la placa (IX) desde el virus rescatado total previo al ensayo de CAT. El virus recombinante rescatado que contiene los genes de CAT y luciferasa como unidades de transcripción individuales (rMUVC/L) fue evaluado como una población total sin la purificación de la placa. En donde esté indicado en la Figura 14, la actividad de la luciferasa en los extractos de las células Vero también fue medida para ambos de los materiales recombinantes de los virus rMUVC/C/L y rMUVC/L. Además, la Tabla 5 que se da en seguida muestra las lecturas de las unidades luminosas relativas (RLU) para las poblaciones clónales de los materiales recombinantes del virus de la parotiditis que contienen el gen de la luciferasa (rMUV LUC y rMUV CITE-LUC) , que fueron aislados de las poblaciones del virus rescatadas por tres rondas sucesivas de purificación de la placa. La fuerte expresión de la actividad de la luciferasa por los materiales recombinantes del virus de la parotiditis, como se muestra en la Tabla 5, demuestra claramente el potencial para que el virus de la parotiditis ÍAA íá é?áñkA?é Af.&i *£& *r'-- -¡ -'fjf^ ^^F. -..-.. ,.*« -,* M^ „..-My^^»^^---^^-«a-Mi-^afa-..A---. exprese uno o más genes heterólogos a partir del (de los) genoma (s) recombinante (s) .
Tabla 5. Cuantificación de la Luciferasa producida por rMUVLUC y rMUVCITE-LUC * Promedio de dos infecciones de monocapas normalizadas a 104 pfu de entrada.
Expresión de la beta-galactosidasa por el virus de la parotiditis. El virus de la parotiditis rescatado que contiene la beta-galactosidasa ha sido identificado. El virus rescatado fue derivado del ADNc genómico del virus de la parotiditis recombinante que contiene el gen de la beta- galactosidasa. La actividad de la beta-galactosidasa fue evidente en las células infectadas por el virus de la parotiditis recombinante, a continuación del teñido citológico directo. El teñido azul intenso de la actividad de la beta-galactosidasa estuvo presente solo en las células infectadas por el virus de la parotiditis recombinante el cual contuvo el gen de la beta-galactosidasa. El virus de la parotiditis rescatado el cual no contuvo ninguno de los genes heterólogos adicionales, produjo placas claras en el mismo ensayo de teñido (véase la Figura 15) . La expresión de la actividad de la beta-galactosidasa por el virus de la parotiditis recombinante demostró además la capacidad del virus de la parotiditis para expresar los genes heterólogos relativamente grandes bajo el control del promotor transcripcional del virus de la parotiditis.
Ejemplo 6 Determinación de la secuencia de consenso para JL5 y JL2 La cepa de la vacuna de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis se ha mostrado que consiste de dos variantes individuales, JL5 y JL2 (Afzal et al., 1993). Las dos variantes, llamadas JL5 y JL2, se mostró que existen en una relación de aproximadamente 1 JL2 con respecto a 5 JL5 en la preparación de la vacuna. Puesto que estas variantes poseen diferencias de la secuencia en el genoma cercano a los genes SH y HN, esta diferencia fue utilizada para distinguir las variantes sobre el nivel genético por el aislamiento de las poblaciones puras de cada una y de la secuenciación de sus genomas completos.
Aislamiento de las variantes JL5 y JL2 de la cepa de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis. La cepa de Jeryl Lynn del virus de la parotiditis fue cultivada sobre los fibroblastos del embrión del pollo (CEFs) para una pasada. Este material en almacenamiento del virus fue diluido en serie entonces en incrementos de 10 veces y se utilizó para infectar los CEFs confluentes sobre placas de 6 cavidades (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Las células fueron infectadas por agitación a temperatura ?ife--« ambiente durante 1 1/2 horas. El inoculo sobre cada cavidad fue reemplazado entonces con una capa de agarosa (que contiene 0.9% de agarosa [Seaplaque, FMC Bioproducts, Rockland, ME] , el medio esencial mínimo [MEM] , aminoácidos no esenciales 0.2 mM, 0.2 mg/ml de penicilina/estreptomicina, FBS al 2 %, y bicarbonato de sodio al 0.3375 %) . Después que las capas se solidificaron a temperatura ambiente, las células infectadas fueron incubadas a 37 °C durante 6 a 8 días hasta que las placas fueron visibles a simple vista y por microscopía luminosa. Las placas individuales que contienen los virus fueron aisladas utilizando pipetas de Pasteur estériles (VWR Scientific, New York, NY) para remover un tapón de agarosa sobre cada placa. Las placas aisladas fueron colocadas en 1 ml del medio (MEM suplementado con 2 % de FBS, HEPES 20 M, y 0.1 mg/ml de penicilina/estreptomicina), se agitan en forma de remolino, y se utilizan para infectar una segunda ronda de purificación de la placa. Para los pasos subsiguiente, 10, 50, 75, 100, o 200 µl de cada placa diluida se utilizaron para infectar las células frescas sobre las placas de 6 cavidades. Las infecciones, las capas, y el aislamiento de las placas se efectuaron como se describió anteriormente. Después del aislamiento del virus a partir de la segunda ronda de la formación de placas, el proceso fue repetido una tercera vez. Los virus aislados de las placas de la tercera ronda fueron propagados sobre los CEFs en las placas de 6 cavidades durante 4 a 6 días a 37 °C para preparar los materiales en almacenamiento. Los virus fueron expandidos entonces por la propagación sobre los CEFs en los recipientes T-25. Después de 5 a 7 días, cuando las células infectadas mostraron la citopatología más grande, los virus fueron colectados y almacenados congelados a -80 °C.
RT-PCR y secuenciamiento de las variantes aisladas. El aislamiento del ARN y la RT-PCR fueron efectuados como se describió en la sección de "Aislamiento del ARN viral, amplificación, y secuenciamiento" del ejemplo 1. A. Los siguientes cebadores específicos del gen fueron utilizados para amplificar las porciones de los genes SH y HN: 6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246 (SEC ID NO: 27) y 8969ACCCACTCCACTCATTGTTGAACC8946 (SEC ID NO: 69) . Los productos amplificados fueron purificados en gel sobre agarosa al 1% y se aislaron de las rebanadas del gel utilizando el Conjunto de Purificación por PCR Wizard (Promega, Madison, Wl) . Los productos amplificados fueron secuenciados entonces en la región del gen de SH [utilizando los cebadores 6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246 (SEC ID NO 27), 6783GGATGATCAATGATCAAGGC68o2 (SEC ID NO: 30), 7325CATCACTGAGATATTGGATC7306 (SEC ID NO: 74), 6909GATACCGTTACTCCGTGAAT6980 (SEC ID NO: 75)] para identificarlos como JL5 o JL2. El análisis de la secuencia preliminar en la región del gen de SH fue llevada a cabo para definir cuales virus purificados fueron JL5 y cuales fueron JL2. Inicialmente, todos los virus purificados de placa triple correspondieron a JL5. Para obtener los aislados de JL2, los virus que han sido purificados en la placa una vez y almacenados congelados fueron seleccionados por RT-PCR y la secuenciación en la región del gen de SH para determinar si los mismos fueron JL2 o JL5. Dos aislados identificados de esta manera como las placas que contienen JL2 fueron sometidas a dos rondas consecutivas adicionales de la purificación de la placa. Como anteriormente, estos aislados fueron expandidos dos veces en CEFs seguido por la extracción, amplificación y secuenciamiento del ARN. Después de la definición de cada aislado de la placa ya sea como JL5 o JL2, dos aislados separados de cada variante fueron elegidos para el secuenciamiento del genoma completo. La RT-PCR fue efectuada sobre el ARN aislado utilizando los siguientes pares de cebadores para amplificar los fragmentos que se extienden sobre el genoma completo: i ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG 23 (SEC ID NO: 95) y 2507 TGAGGCTCCATTCCCGTCTATG 2486 (SEC ID NO: 86), 2107 CGTTGCACCAGTACTCATTG 2?26 (SEC ID NO: 17) y 3875 CTGAACTGCTCTTACTAATCTGGAC 385? (SEC ID NO: 82), 3773 CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG 3798 (SEC ID NO: 21) y 6347 CAGACATACAGGGTTATGATGAG 632s (SEC ID NO: 76), 6223 TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC 6246 (SEC ID NO: 27) y 8969 ACCCACTCCACTCATTGTTGAACC 896 (SEC ID NO: 69), 7678 AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG 7701 (SEC ID NO: 32) y 9753 TCATGCCGCATCTCAATGAG 973 (SEC ID NO: 67), 9583 CCGAGAGTCCATGTGTGCTC 9602 (SEC ID NO: 37) y uses CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG 11662 (SEC ID NO: 62), 11529 GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG 11552 (SEC ID NO: 42) y 13412 CATATTCGACAGTTTGGAGT 13393 (SEC ID NO: 58), 13219 CGATTATGAGATAGTTGTTC ?3238 (SEC ID NO: 46) y 15384 ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC 15353 (SEC ID NO: 53) . Los productos amplificados fueron purificados y secuenciados como se describió en la sección "Aislamiento del ARN viral, amplificación y secuenciamiento" del ejemplo l.A. Para determinar las secuencias de las terminales genómicas de cada aislado del virus, las terminales del ARN fueron ligadas, seguido por RT-PCR a través de la unión, y la captura (como se describió en el Ejemplo l.A). Las secuencias fueron alineadas utilizando un programa Sequencher (Genecodes, Ann Arbor, MI) . Las secuencias de JL5 y JL2 representan el consenso determinado comparando ambos aislados de la placa para cada variante. Los virus JL5 y JL2 purificados fueron secuenciados con la misma serie de cebadores como se listaron en la Tabla 4 del Ejemplo l.A. Para ambas variantes, dos aislados de la placa separados fueron secuenciados completamente (Véanse las SEC ID NOS 11 y 12 para las secuencias de consenso respectivas para JL5 y JL2, placa 2 para cada uno. Como se esperaba, se observaron pocas diferencias de la secuencia entre los dos aislados de la placa de JL5 (Véase la tabla 6) y los dos aislados de la placa JL2 (Véase la Tabla 7) . Las secuencias de consenso de las placas 1 y 2 de JL5 difirieron de la secuencia de consenso de Jeryl Lynn en 4 y 3 nucleótidos, respectivamente (Veáse la Tabla 6) . La secuencia de JL2 contiene 413 diferencias de JL5, dispersadas a través del genoma completo, como se resume en la Tabla 8. Cinco de estas diferencias están presentes en las secuencias delanteras 5' y 3'. Un total de 360 diferencias de la secuencia radican dentro de las regiones de codificación de los genes virales; sin embargo, solo 73 de ¡ ^i |fe estas diferencias codifican las diferencias de los aminoácidos. Las restantes 48 diferencias de las secuencias radican dentro de las regiones no codificantes de los genes virales. Es de interés señalar señalar que no existen diferencias en la secuencia en las regiones intergénicas o dentro de cualquiera de las señales de actuación cis internas (es decir las señales de inicio del gen y del final del gen) .
Tabla 6. Diferencias de la secuencia entre los aislados de la placa para JL5. ¡i^^ riJ-J-J.---I- Tabla 7. Diferencias de la secuencia entre los aislados de la placa para JL2.
Tabla 8. Breve Descripción de las diferencias de las secuencias entre las variantes de JL5 y JL2. na = no aplicable te&*te^*^4¿»ijgi^fa«* Ejemplo 7 Determinación de la abundancia relativa de JL5 y JL2 en la vacuna de Jeryl Lynn Para determinar las relaciones relativas de JL5 con respecto a JL2 en un grupo de vacunas de Jeryl Lynn, se desarrolló un ensayo que explotó las diferencias de las secuencias debidas a un polimorfismo de la endonucleasa de restricción entre las dos variantes. El ensayo es llamado el análisis mutacional por PCR y la segmentación de la endonucleasa de restricción (MAPREC) . En la posición 3828 (sentido antigenómico) , existe un sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción BssH II en el genoma de JL5. En JL2, una variación del nucleótido G a A en este sitio conduce a una falta de reconocimiento de BssH II. El ARN de una población mezclada de JL5 y JL2 fue aislado y amplificado utilizando los cebadores que rodean este sitio, conduciendo a un producto de 254 pares base. Los cebadores utilizados fueron los cebadores 37oeCAGGCCAGCGCCGATAAATATG3729 (SEC ID NO: 117) y 3962AATGACACCCTTCTCCATCAGGG3941 (SEC ID NO: 118) . Los cebadores contuvieron secuencias idénticas tanto para JL5 como para JL2; por consiguiente, los fragmentos de cualquier variante se esperaba que se amplificaran a una probabilidad igual. Además, el primer cebador listado anteriormente contuvo la fluoresceína en su extremo 5'. El fragmento de fluoresceína fue segmentado con BssH II, y se separó sobre un gel de acrilamida. Un aparato Fluorlmager fue utilizado para explorar el gel y para cuantificar la abundancia relativa de los productos segmentados y no segmentados, los cuales representan JL5 y JL2, respectivamente. La segmentación con BssH II dejó un producto fluorescente de 120 pares base para JL5 y un producto fluorescente de 254 pares base (es decir no segmentado) para JL2. El ARN fue aislado de diez frascos pequeños de vacuna del Jeryl Lynn del virus de la parotiditis (Mumpsvax lote # 0656J, Merck and Co., Inc., West Point, PA) . El ARN fue amplificado (utilizando los cebadores anteriores) y los productos de PCR fueron digeridos con BssH II, separados sobre un gel y explorados sobre el aparato Fluorlmager. La disolución de la enzima se efectuó agregando 5 unidades de BssH II (Roche Molecular Biology, Indianapolis, IN) hasta una quinta parte de la mezcla de la reacción de PCR y se incuba a 50 °C durante 2 1/2 horas. Los productos segmentados fueron separados entonces sobre un gel de acrilamida al 6 % que fue explorado entonces utilizando un aparato Fluorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . Las imágenes exploradas fueron cuantificadas utilizando el programa ImageQuant (Molecular Dynamics, ,,---?¿l?«",t í.-y.
Sunnyvale, CA) . Una serie de controles fueron utilizados como estándares; estas muestras consistieron de los virus JL5 y JL2 mezclados en las siguientes relaciones basadas en las concentraciones: 99 % JL5/ 1 % JL2, 95 % JL5/ 5 % JL2, 85 % JL5/ 15 % JL2, y 75 % JL5/ 25 % JL2. El ARN fue aislado de los virus mezclados y utilizado en el procedimiento MAPREC. Los resultados de estos controles fueron utilizados para generar una curva estándar para el ensayo, el cual fue utilizado para determinar los porcentajes relativos de JL5 y JL2 en las mezclas de la vacuna. Además, una serie de diluciones duplicadas del producto de PCR de JL5 no diluido se utilizaron para determinar el intervalo lineal de los resultados medidos sobre el aparato Fluorlmager. Además, el ARN viral de JL2 fue utilizado como un control negativo y el ARN viral de JL5 puro fue utilizado como un control positivo. La muestra de JL5 pura también sirvió como un control para determinar la eficiencia de la enzima de BssH II. El ensayo de MAPREC y la cuantificación fueron repetidos tres veces para verificar la reproducibilidad. Los resultados fueron promediados sobre los tres experimentos. La Figura 13 muestra una imagen de gel explorada representativa. Los productos segmentados y no segmentados son marcados con flechas. El producto no segmentado, el cual corresponde a JL2, es de 254 pares base de longitud, mientras que el producto segmentado, i-kaAáfct- --t---j<»-----.,-t----a. ¿---- íál-il---el cual corresponde a JL5, es de 120 pares base de longitud. Para cuantificar la abundancia relativa para cada gel explorado, los valores fueron corregidos primero para verificar la fluorescencia del fondo y la cantidad del ADN no diluido en una muestra de control de JL5 pura. Los valores del % de JL5 fueron determinados dividiendo la cantidad del ADN diluido entre el total del ADN diluido y no diluido, y multiplicando este valor por 100 %. Para cada experimento, el ARN de un conjunto de virus de JL5 y JL2 mezclados fueron utilizados para generar una curva estándar. Los resultados de los cálculos descritos para las muestras de la vacuna fueron graficados sobre las curvas estándares para obtener los valores mostrados en la Tabla 9. En la columna final, los promedios para cada muestra de la vacuna son provistos para los tres experimentos. Un promedio total para las diez muestras de la vacuna, el cual fue generado promediando los resultados en la última columna, es mostrado en el fondo de la tabla. La tabla 9 resume los resultados para los diez frascos pequeños de la vacuna de Mumpsvax utilizados en este ensayo. La abundancia relativa de las dos variantes dentro de la vacuna para estas muestras estuvo en el intervalo de 73.1 % JL5/ 26.9 % JL2 hasta 76.1 % JL5/ 23.9 % JL2. El promedio total para todas las diez muestras de la vacuna para la totalidad de los tres experimentos fue de 73.9 % JL5/ 26.1 % JL2 . «-.-11 áJlf^?.^?^MÁ Tabla 9. Abundancia relativa de JL5 y JL2 en las muestras de Mumpsvax Provista en seguida se encuentra una lista de referencias las cuales son incorporadas aquí. REFERENCIAS Afeal, M. A., Pickford, A. R., Forsey, T., Heath , A. B., and Minor P. D. (1993). The Jeryl Lynn vaccine strain of miunps virus is a mixture of two distinct isolates. J Gen Virol. 74; 917-920.
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etactccaga ctgtcgaata tgttgagtac attcagagtg aaaagacaaa 13440 catcaggagg atgattattg aaccaaaatt aactgcctac cctagtaatt tgttttatct 13500 ctctcgaaag ctgcttaatg ctattcgaga ctctgaagaa ggacaattcc tgattgcatc 13560 ctattataac agttttggat atctggaacc gatattaatg gaatctaaag tattcaatct 13620 aagttcatcc gaatcagcat ctcttacaga attcgatttc atcctcaact tggaattgtc 13680 cgacgccaga cttgagaaat actctetcce aagtttgctt atgacggctg agaatatgga 13740 taacccattt cc caacccc cacttcatca cgttctcaga ccactaggtt tgtcatccac 13800 ctcatggtat aaaacaatca gtgttttgaa ttatattagc catatgaaga tatctgacgg 13860 tgcccatcta tacttggcag agggaagtgg agcctctatg tcacttatag agactttctt 13920 gcccggggaa accatatggt acaacagcct gttcaatagt ?gtgagaatc cccctcaacg 13980 taatttcgcc cctttgccca cccagtttat tgaaagt'gtc ccctatagat tgattcaagc 14040 aggtatagca gcaggaaatg gtatagtgca aagtttctat ccactctgga acggaaacag 14100 cgatataaet gacttaagca ctaaaactag tgttgaatac attatccaca aggtaggagc 14160 tgatacttgt gcattagttc atgtggattt ggaaggtgtc cctggctcaa tgaacageat 14220 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tgggagaaac 15060 atctgacata ttgttaaacc gagettatca gaagagaatt tggaaagcca ttgggtgtgt 15120 aatctattgc tttggtttgc tcaccccgga tgttgaagat tctgagcgca ttgatattga 15180 caatgacata cecgattatg atatteaegg ggacataatt taaatcgaat aaagactctt 15240 ctggcattac acateaccaa~aaagtgceaa actagcatcc aaattcttct aaaccgccca 15300 cgacctcgaa caatcataac cacatcagta ttaaatccag aagatccttt taagaaaaaa 15360 ttgattctac tttctcccct tggt 15384 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para producir un virus de las paperas recombinante, caracterizado porque comprende; en al menos una célula hospedera, llevar a cabo la transfección o transformación, en el medio, de una composición de recuperación la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácidos nucleicos aislados la cual comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas, o una secuencia de polinucleótidos variantes de la misma, y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende una o más molécula (s) de ácidos nucleicos aislado (s) que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica las proteinas de actuación trans (NP, P y L) necesarias para la encapsidación, transcripción y replicación/ bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de los vectores y la producción del virus recombinante.
  2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende colectar el virus recombinante . ..?Á?Í
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos aislados que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas es una quimera de más de una fuente de genoma o antigenoma.
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos aislados que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas comprende la secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS. 1, 11 y 12.
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos aislados, que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas, codifica un virus atenuado o una forma infecciosa del virus.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos aislados, que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas, codifica una forma infecciosa del virus.
  7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos aislados, que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas, codifica un virus atenuado.
  8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos aislados, que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas, codifica un virus atenuado, infeccioso.
  9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedera es una célula eucariótica.
  10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedera es una célula de vertebrado.
  11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedera es una célula de ave.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedera es derivada de una célula humana.
  13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula hospedera es derivada de una célula embriónica humana.
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la célula hospedera es derivada de una célula del riñon e briónico del ser humano. I--, ai ».A.fa-¿iá»-.-:--.j»-a--.,-. .»,i--:i..¿t.1.
  15. 15. Un virus de las paperas recombinante, caracterizado porque se prepara a partir del método de conformidad con la reivindicación 1.
  16. 16. Una composición, caracterizada porque comprende: (i) un virus de las paperas recombinante preparado a partir del método de conformidad con la reivindicación 1 y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector de la transcripción comprende además un gen de la T7 ARN polimerasa.
  18. 18. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende un virus de las paperas atenuado, producido recombinantemente, aislado y un portador aceptable fisiológicamente .
  19. 19. Un método para inmunizar a un individuo para inducir la protección contra el virus de las paperas, caracterizado porque comprende administrar al individuo la composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 18.
  20. 20. Una molécula de ácidos nucleicos, caracterizada porque comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas.
  21. 21. La molécula de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque comprende una secuencia del virus de las paperas en el sentido del mensaje antigenómico, de hebra positiva, seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO 1, la SEC ID NO 11 y la SEC ID NO 12.
  22. 22. Una molécula de ácidos nucleicos, caracterizada porque comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una o más proteinas del virus de las paperas.
  23. 23. La molécula de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la secuencia de polinucleótidos comprende además una o más de las secuencias de nucleótidos heterólogos o uno o más de los genes heterólogos.
  24. 24. La molécula de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la secuencia de polinucleótidos comprende además una o más de las secuencia de nucleótidos heterólogos o uno o más de los genes heterólogos.
  25. 25. Un plásmido, caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de las paperas. t tt- 'lri' f f?t f ?fü»w?- ¡B- -aa-n
  26. 26. Un plásmido, caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una o más proteínas del virus de las paperas.
  27. 27. El plásmido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de polinucleótidos comprende además una o más secuencias de nucleótidos heterólogos o uno o más de los genes heterólogos.
  28. 28. El plásmido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la secuencia de polinucleótidos comprende además una o más secuencias de nucleótidos heterólogos o uno o más genes heterólogos.
  29. 29. Una célula hospedera, caracterizada porque es transformada con al menos un plásmido de conformidad con la reivindicación 25.
  30. 30. Una célula hospedera, caracterizada porque es transformada con al menos un plásmido de conformidad con la reivindicación 26.
  31. 31. Una célula hospedera, caracterizada porque es transformada con al menos un plásmido de conformidad con la reivindicación 27.
  32. 32. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque además comprende al menos un antigeno para un patógeno diferente del virus de las paperas. -- ?.i.á-t-i-i *---*.---------<-.
  33. 33. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque al menos un antigeno es un virus de ARN atenuado.
  34. 34. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque al menos un antigeno es un virus atenuado que es seleccionado del virus del sarampión, el virus de la rubéola, el virus de varicella zoster (VZV) , el virus de Parainfluenza (PIV) , y el virus Sincitial Respiratorio (RSV) .
  35. 35. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque al menos un antigeno es producido recombinantemente.
  36. 36. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque al menos un antigeno es producido recombinantemente.
  37. 37. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque al menos un antigeno, de un patógeno diferente del virus de las paperas, es expresado a partir del virus de las paperas atenuado producido recombinantemente.
  38. 38. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque al menos un antigeno, de un patógeno diferente del virus de las paperas, el virus del sarampión, el virus de la rubéola, el virus de varicella zoster (VZV) , el virus de Parainfluenza (PIV) , y el virus Sincitial Respiratorio (RSV) , es expresado a partir del virus de las paperas atenuado producido recombinantemente.
  39. 39. El plásmido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos heteróloga es insertada dentro de la secuencia del genoma del virus de las paperas como una unidad transcripcional única.
  40. 40. El plásmido de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos heteróloga es insertada dentro de la secuencia del genoma del virus de las paperas como una o más unidades transcripcionales monocistrónicas .
  41. 41. El plásmido de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos heteróloga es insertada dentro de la secuencia del genoma del virus de las paperas como al menos una unidad transcripcional policistrónica, la cual puede contener uno o más sitios de entrada ribosómicos.
  42. 42. El plásmido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una poliproteina y un número suficiente de proteasas que segmentan la poliproteina para generar los polipéptidos individuales. Ííl,írí.Aár .l^áiJt?.¿. Ét?
  43. 43. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un virus de las paperas atenuado, producido recombinantemente, aislado, producido por una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 27, y un portador aceptable fisiológicamente.
  44. 44. Una secuencia de nucleótidos, caracterizada porque comprende la secuencia de un clon de ADNc de un virus de las paperas recombinante.
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