KR101970428B1 - 재조합 볼거리 바이러스 제릴린2계 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역원성이 큰 rMuVJL2(재조합 볼거리 바이러스 제릴린2계)로 이루어지는 볼거리에 대한 신규한 백신을 제공한다. 또한, 상기 면역원성 조성물의 개발 방법이 본 발명에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 백신은 안전하며, 비용이 효율적이고, 매우 효과적이며, 생산성의 관점에서 안정적이고, 일관적이다.

Description

재조합 볼거리 바이러스 제릴린2계 백신
본 발명은 면역원성이 큰 rMuVJL2(recombinant mumps virus Jeryl Lynn2 based; 재조합 볼거리 바이러스 제릴린2계)로 구성되는 볼거리에 대한 신규한 백신을 제공한다. 또한, 상기 면역원성 조성물의 개발 방법이 본 발명에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 백신은 안전하며, 비용이 효율적이고, 매우 효과적이며, 생산성의 관점에서 안정적이고, 일관적이다.
볼거리는 귀밑선(들)의 발열 및 부종을 특징으로 하는 급성 바이러스성 질환으로서, 전형적으로는 어린 아이들에게 영향을 미치며, 고환염(orchitis), 난소염(oophoritis), 췌장염(pancreatitis), 및 뇌수막염(meningo-encephalitis)과 같은 합병증을 야기할 수 있다. 그러나, 대략 절반의 감염된 개체들은 전형적인 질병으로 발전한다. 볼거리 바이러스(MuV)는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 과, 파라믹소비리내(Paramyxovirinae) 아과 및 루불라 바이러스(Rubulavirus) 속이며, 사람만 감염시킨다[Hviid 외, 2008]. MuV는 15,384개의 뉴클레오티드로 구성된 외가닥, 네가티브 센스 RNA 게놈을 갖는다. 게놈은 2개의 표면 당 단백질; 융합물(F) 및 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN), 4개의 코어 단백질; 핵 단백질(NP), 포스포(P), 매트릭스(M) 및 대형 단백질(L), 및 막 결합 소형 소수성(SH) 단백질을 부호화한다.
역사적으로, 볼거리는 소아기(childhood)의 질병으로 간주되었지만, 지난 20년간, 볼거리 예방접종이 통상적으로 이용된 국가에서는 청소년(older children) 및 성인에게 영향을 미쳤다. 높은 예방접종 보급률에도 불구하고, 볼거리의 재발은 미국, 영국, 캐나다, 몰도바 및 네덜란드를 포함한 많은 국가에서 보고되어 있다[Bernard 외, 2008; Brockhoff 외, 2010; CDC, 2010; Whelan 외, 2010; Yung 외, 2010]. 인도에서는, 볼거리의 역학, 그 발생률 및 항체 유병률에 관한 데이터가 부족하다. 케랄라주 및 마하라슈트라주로부터 약간의 볼거리 발생이 보고되어 있다[Geeta 및 Kumar, 2004; John, 2004; Ghatage 및 Kakade, 2007]. 볼거리 백신은 12개월 또는 그 이후에 홍역 및 풍진 백신과 함께 아이에게 접종된다. 2개의 균주의 생약독화(live attenuated) 볼거리 바이러스, 즉 달걀 양막의 계대(passage)에 의한 야생형 일본 격리 집단으로부터 유래된 우라베 균주(Urabe strain) 및 야생형 미국 격리 집단의 조직 배양 계대에 의해 유래된 제릴린 균주(Jeryl Lynn strain)가 영국의 백신에 이용되고 있다. 생약독화 바이러스 균주에 기초한 백신 이외의 것은 볼거리에 이용할 수 없다.
제릴린(JL) 볼거리 바이러스(MuV) 백신은 뉴클레오티드 서열이 상당히 상이한, 2개의 상이한 구성 균주, MuVJL5와 MuVJL2를 함유한다(Amexis 외, 2002).
MuVJL 백신은 비인간 숙주 세포에서 바이러스의 계대에 의해 생약독화 백신으로 전환된 단일 임상 격리 집단으로부터 유래된 것으로 보고되어 있다(Afzal 외, 1993). MuVJL5 및 MuVJL2의 완전한 뉴클레오티드 서열이 보고되어 있으며(Clarke 외, 2000; Amexis 외, 2002), MuVJL5와 MuVJL2 사이에서 87개의 아미노산 변화를 야기하는, 414개의 뉴클레오티드 변화를 나타낸다. 이러한 변이의 레벨은 MuV의 유전자형 사이의 차이와 동일한 레벨이다. MuVJL5와 MuVJL2 사이에는 생물학적 차이가 있다. 예를 들어, MuVJL2는 MuVJL5보다 발육란에서 더 잘 성장한다(Amexis 외, 2002). MuVJL5 및 MuVJL2는 모두 쥐 신경독성(neurovirulence) 시험에서 비신경독성이다(Rubin 외, 1999, 2000, 2003).
MuV 성장은 균주뿐만 아니라, 숙주 세포 의존적인 것으로 알려져 있다[Afzal 외, 1990].
또한, Vero 세포 배양과 특이적으로 상호작용하는 MuV 균주의 강한 내인성은 매우 상이한 형태의 세포 병변 효과(cytopathic effect; CPE)를 야기하는 것이 보고되어 있다. 세포의 바이러스 감염 시에, 바이러스 복제 주기는 세포 내에서 다수의 생화학적 및 형태학적 변화를 수반하며, 이는 일반적으로 세포사로 끝이 난다. 이러한 형태학적 변화를 바이러스 세포 병변 효과(CPE)라 한다. CPE는, 예를 들어 융합체 형성(syncytia formation), 세포의 구형화(cell rounding), 방향 감각 상실, 부종 또는 위축(shrinking), 표면으로부터의 분리, 전체 세포 용해 등의 여러 형태를 취할 수 있다. CPE의 형태는 바이러스와 그것이 성장한 세포 모두에 의존적이다[Vaccine 28 (2010) 1887-1892].
MAPREC(각종 제릴린 제조에 있어서의 제릴린의 비율 아주(sub strain)를 구하기 위한 분자법) 데이터가 클로닝 실험으로부터의 결과를 확인했으며, 이는 Vero 세포에서 Merck MVL의 제 1 계대에 의해, JL2의 비율이 20 내지 2% 감소하고, 이후의 계대에서는 검출되지 않은 반면, 닭 배양란(embryonated chicken egg; ECE)에서의 제릴린 균주의 계대는 급속한 JL2의 축적(90% 초과)과 JL1의 손실을 야기했으며, 이는 JL2가 ECE에서 강력한 선택 이점을 갖는 것을 시사하는 것이 Amexis 외, 2002에서 언급되어 있다.
클로닝 및 MAPREC에 의해 검출되는, Vero 및 CEF 세포에서의 바이러스 계대배양 시의 JL2의 급속한 소실은 JL2가 Vero 및 CEF 세포 배양에 있어서 불충분하게 복제되거나 헬퍼로서 JL1의 존재를 필요로 할 수 있음을 시사하는 것 또한 저자에 의해 결론지어진다.
상기 개시로부터, 숙주 세포로서 Vero 세포 또는 CEF에 접근함으로써 JL2 균주의 구조(rescue) 모델 개발이 백신의 추가 개발에 대해 어렵다는 것을 잘 이해할 수 있다. 제릴린 볼거리 바이러스에 대한 면역원성 조성물의 개발의 경우에 세포 병변 효과, 숙주 세포, 바이러스 균주, 바이러스 균주와 숙주 세포의 조합과 같은 여러 요인이 영향을 미친다.
본 발명에서, 발명자들은 백신 접종을 목적으로 적합한 안정제와 함께 추가로 제형화될 수 있는, JL2 균주계 면역원성 조성물을 개발했다. 본 발명에 따른 이러한 면역원성 조성물은 외인성 단백질 및 기타 약제가 없는, 보다 큰 면역원성을 갖고, 최종적으로 볼거리에 대한 백신의 개발을 위한 좋은 후보이다. 또한, 이러한 백신은 아마도 균주의 보다 높은 유전적 균질성으로 인해 종래의 백신보다 안정적이다.
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 숙주 세포로서 Vero 세포를 사용함으로써 상기 안정적인 면역원성 조성물을 개발할 수 있다. 비록, Vero 세포가 JL2 균주 개발에 좋은 후보는 아니지만, 놀랍게도 본 발명의 발명자들은 Vero 세포 또는 MRC-5 세포 또는 HEK 293T 세포 등의 포유류 세포를 사용한 볼거리 바이러스에 대한 신규한 면역원성 조성물을 개발했다.
본 발명의 제 1 양태는 볼거리에 대한 백신을 제조하는데 사용할 수 있는 안정적인 제릴린2(이하에서는 JL2) 균주를 제공한다.
바람직한 양태에서는, 분리된 JL2 균주의 전장(full length) 게놈을 함유하는 벡터를 설명한다.
제 2 양태에서, 본 발명은 JL2 균주가 상이한 숙주 세포에서 증식하는 JL2 균주의 구조 방법을 제공한다. 여기서, 숙주 세포는 품질 및 생산성의 관점에서 안정적이고 일관된, 적합한 포유류 세포일 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 재조합 볼거리 바이러스 JL2 균주에 대한 구조 조성물(rescue composition)을 제공한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 고수율로 포유류 세포에서 증식하는 JL2 균주를 제공한다. 이러한 포유류 세포는 Vero 세포, MRC-5 세포, HEK 293T 세포 등일 수 있다.
본 양태 중 어느 하나에서, 본 발명은 볼거리 바이러스로부터 보호하는 신규한 면역원성 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 제릴린 균주로부터 유래된 유전적으로 균질한 볼거리 바이러스를 함유한다.
제 5 양태에서, 본 발명은 볼거리 바이러스로부터 보호하는 상기 면역원성 조성물을 포함하는 안정적인 백신을 제공한다.
이러한 백신은 홍역, 풍진 및/또는 수두 백신 성분과 결합되어 결합 백신을 제조할 수 있다.
제 6 양태에서, 본 발명은 상기 면역원성 조성물의 개발 방법을 제공한다.
본 발명은 볼거리 바이러스로부터 보호할 수 있는 제릴린2 균주로부터 유래된 안정적인 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 면역원성 조성물은 역 유전학적 방법론(reverse genetics methodology)을 사용함으로써 유도된다.
이러한 면역원성 조성물은 각종 포유류 세포를 숙주로서 사용함으로써 제조되어 볼거리 바이러스에 대한 안정적인 백신을 개발한다.
또한, 본 발명은 상기 면역원성이 크고 안정적인 조성물의 개발 방법을 제공한다.
도 1은 아가로오스 겔에서 분해된 볼거리 바이러스 제릴린 균주의 게놈의 화학적으로 합성된 단편을 묘사한다. 볼거리 바이러스 약독화 JL2 균주의 게놈의 전장을 덮는 6개의 단편이 있다. 여기서는, 1+2, 3+4 및 5+6 단편의 조합을 나타낸다. 이는 단편이 대략 제한 효소 처리(restriction digestion) 후에 얻어지는 것을 나타낸다.
도 2는 pMuVJL2의 제한 효소 지도를 묘사한다.
도 3은 P0 계대 후의 Vero 세포에서의 융합체 형성을 묘사한다.
도 4는 a) 감염되지 않은 MRC5 세포(대조군) b) rMuVJL2FL로 감염된 MRC5 세포를 묘사한다.
도 5는 크리스탈 바이올렛에 의해 착색된 UV광 하에서 TCA 염색에 의해 고정된 Vero 세포를 묘사하며, 여기서 A 및 B는 rMuVJL2 융합체를 나타낸다.
[서열의 요약]
서열 1은 제한 부위 NotI 및 RsrII를 사용하여 제한 효소 처리에 의해 얻어지는 제 1 단편의 뉴클레오티드 서열이다. 상기 처리로부터 얻어진 단편 1은 전장 DNA 게놈의 1 - 3576 뉴클레오티드 위치를 갖는다. (서열 번호 1)
서열 2는 제한 부위 RsrII 및 AvrII를 사용하여 제한 효소 처리에 의해 얻어지는 제 1 단편의 뉴클레오티드 서열이다. 상기 처리로부터 얻어진 단편 2는 전장 DNA 게놈의 3576 - 6258 뉴클레오티드 위치를 갖는다. (서열 번호 2)
서열 3은 제한 부위 AvrII 및 XhoI을 사용하여 제한 효소 처리에 의해 얻어지는 제 1 단편의 뉴클레오티드 서열이다. 상기 처리로부터 얻어진 단편 3은 전장 DNA 게놈의 6258 - 8438 뉴클레오티드 위치를 갖는다. (서열 번호 3)
서열 4는 제한 부위 XhoI 및 KpnI을 사용하여 제한 효소 처리에 의해 얻어지는 제 1 단편의 뉴클레오티드 서열이다. 상기 처리로부터 얻어진 단편 4는 전장 DNA 게놈의 8438 - 10498 뉴클레오티드 위치를 갖는다. (서열 번호 4)
서열 5는 제한 부위 KpnI 및 XmaI을 사용하여 제한 효소 처리에 의해 얻어지는 제 1 단편의 뉴클레오티드 서열이다. 상기 처리로부터 얻어진 단편 5는 전장 DNA 게놈의 10498 - 13950 뉴클레오티드 위치를 갖는다. (서열 번호 5)
서열 6은 제한 부위 XmaI 및 NarI을 사용하여 제한 효소 처리에 의해 얻어지는 제 1 단편의 뉴클레오티드 서열이다. 상기 처리로부터 얻어진 단편 6은 전장 DNA 게놈의 13950 - 15440 뉴클레오티드 위치를 갖는다. (서열 번호 6)
서열 7은 벡터 pMuVJL2의 완전한 뉴클레오티드 서열이다. (서열 번호 7)
서열 8은 구조된 재조합 볼거리 바이러스 rMuVJL2FL의 완전한 뉴클레오티드 서열이다. (서열 번호 8)
서열 9는 볼거리 바이러스의 핵 단백질(NP)을 부호화하는 뉴클레오티드 서열이다. (서열 번호 9)
서열 10은 볼거리 바이러스의 인 단백질(P)을 부호화하는 뉴클레오티드 서열이다. (서열 번호 10)
서열 11은 볼거리 바이러스의 대형 단백질(L)을 부호화하는 뉴클레오티드 서열이다. (서열 번호 11)
서열 12는 볼거리 바이러스의 핵 단백질(NP)의 아미노산 서열이다. (서열 번호 12)
서열 13은 볼거리 바이러스의 인 단백질(P)의 아미노산 서열이다. (서열 번호 13)
서열 14는 볼거리 바이러스의 대형 단백질(L)의 아미노산 서열이다. (서열 번호 14)
서열 15는 T7 RNA 폴리메라아제를 부호화하는 pSC6-T7의 뉴클레오티드 서열이다. (서열 번호 15)
실시형태 중 하나에 있어서, 본 발명은 볼거리에 대한 백신을 제조하는데 사용될 수 있는 안정적인 JL2 균주계 면역원성 조성물을 제공한다. 분리된 JL2 균주는 유전적으로 균질하고, 매우 면역원성이다. 본 명세서에 개시된 분리된 JL2 균주는 볼거리 바이러스에 대한 항체 생성의 관점에서 안전하고 효율적이다.
추가 실시형태에 있어서, 본 발명은 JL2 균주의 역전사된 m-RNA로부터 개발된 JL2 균주의 전장 게놈을 제공한다. 전장 JL2 게놈은 볼거리 바이러스의 총 게놈 길이(15,384bp)를 커버하기 위해 6개의 상이한 단편에서 화학적으로 합성되었다. 이러한 화학적으로 합성된 게놈 단편은 적합한 플라스미드 벡터(중간 벡터)를 사용하여 증폭될 수 있다. 전장 게놈은 제한 효소 처리법을 사용하여 본 명세서에서 나타낸 6개 미만 또는 6개 초과의 단편에서 합성될 수 있다.
실시형태 중 하나에 있어서, 본 발명은 적합한 벡터에서 JL2 게놈의 화학적으로 합성된 단편의 클로닝 방법을 제공한다. 볼거리 바이러스의 유전자를 부호화하는 트랜스 작용(trans-acting) 바이러스성 단백질 NP(핵 단백질), P(인 단백질) 및 L(대형 단백질) 및 T7 RNA 폴리메라아제를 부호화하는 유전자는 헬퍼 플라스미드로 클로닝된다.
트랜스 작용 바이러스성 단백질은 바이러스의 캡슐화, 전사 및 번역에 필수적으로 요구되는 바이러스성 단백질로서 정의될 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 트랜스 작용 바이러스성 단백질은 서열 번호 9 내지 11에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
보다 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 트랜스 작용 바이러스성 단백질은 서열 번호 12 내지 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
추가 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 T7 RNA 폴리메라아제는 서열 번호 15에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 벡터는 pBluescript, pBluescript II, pBluescript II SK (+), pUC19, pCA, pSC6 등으로부터 선택될 수 있다. 이들 벡터는 시판의 것을 이용할 수 있으며, 당업자에게 공지되어 있다.
제 2 실시형태에 있어서는, 분리된 JL2 균주의 전장 게놈을 포함하는 벡터를 설명한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은 최종 전사 벡터로서 pBluescript II SK(+)를 사용하여 JL2 게놈의 화학적으로 합성된 단편을 단계적으로 클로닝함으로써 JL2(pMuVJL2)의 전장 게놈을 포함하는 플라스미드를 구성하는 방법을 제공한다.
전사 벡터는 유전 요소 또는 발현에 있어서 조절 역할을 하는 요소의 집합을 포함하는 작동 가능하게 연결된 전사 단위, 예를 들어 볼거리 RNA로 전사되는 촉진제, 구조 유전자 또는 부호화 서열, 및 적절한 전사 개시 및 종결 서열을 포함한다. 본 발명의 모든 클로닝 절차는 기본적으로 Sambrook 및 Russel(2001)에 기재된 바와 같다.
제 3 실시형태에 있어서, 본 발명은 JL2 균주가 적합한 숙조 세포(들)에서 증식하는 JL2 균주의 구조 방법을 제공한다. 여기서, 숙주 세포는 품질 및 생산성의 관점에서 안정적이고 일관적인, 적합한 포유류 세포 또는 비포유류 세포일 수 있다. 닭 발육란(ECE)에서의 제릴린 균주의 계대배양은 급속한 JL2의 축적(90% 초과) 및 JL1의 손실을 야기했고, 이는 ECE에서 JL2가 강력한 선택 이점을 갖는 것을 시사하는 것이 이미 알려져 있다. 하지만, ECE 세포는 일관적이지 않고, 재현성이 없는 1차 세포이다. 그래서, 이러한 1차 세포를 사용하여 원하는 역가의 JL2 균주를 유지하는 것이 어려워진다.
추가 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유류 세포만을 사용한 면역원성 조성물의 제조를 제공한다. 이러한 포유류 세포는 Vero 세포, MRC-5 세포, HEK 293T 세포 및 기타 유사한 2차 또는 3차 세포계로부터 선택될 수 있고, 대장균, 효모 세포 등과 같은 비포유류 세포를 사용할 수 있다. 제조 레벨에서 안정적이고 충분한 면역원성인 면역원성 조성물은 당해 기술분야에서 이용 불가하다. 따라서, 볼거리 바이러스에 대한 백신 제조에 사용할 수 있는 상술한 숙주를 사용한 면역원성 조성물은 시판되어 있지 않다. 본 발명은 현재의 요구를 만족시킬 것으로 예상된다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은 전장 볼거리 JL2 게놈(pMuVJL2)을 포함하는 플라스미드, 및 트랜스 작용 바이러스성 단백질 NP, P, L, 및 T7 폴리메라아제 유전자를 포함하는 플라스미드를 부호화하는 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드를 사용하여, 적합한 포유류 숙주 세포의 형질주입을 제공한다. 형질주입된 세포는 배양되어 융합체 형성을 허용한다.
보다 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따르면, p_NJL2로 표시되는 핵 단백질(NP), p_PJL2로 표시되는 인 단백질(P), p_LJL2로 표시되는 대형 단백질(L)을 부호화하는 헬퍼 플라스미드, 및 pSC6-T7(서열 번호 15)로 표시되는 T7 폴리메라아제를 부호화하는 플라스미드가 사용된다.
pMuVJL2와 함께 숙주 세포를 동시 형질주입(co-transfection)하는데 사용되는, 트랜스 작용 바이러스성 단백질 및 T7 폴리메라아제를 발현하는 플라스미드를 헬퍼 플라스미드로서 정의할 수 있다. 이들은 바이러스 캡슐화, 전사 및 번역에 필수적이다.
융합체는 감염된 세포와 바이러스성 단백질의 발현에 의해 매개되는 이웃 세포의 융합으로부터 야기되는 다핵으로 확대된 세포로 정의할 수 있다.
이러한 융합체를 사용하여 바이러스 증식(계대 P0)에 대해 상이한 포유류 숙주 세포를 감염시킨다. 바이러스의 후대는 P0 계대(rMuVJL2FL) 이후에 구조된다. 계대는 숙주 세포에서 구조된 바이러스의 계대배양(sub culturing)으로 정의할 수 있다. 제 1 계대 후, 신선한 포유류 세포가 후속 계대(P1 및 P2)에 대해 계대 P0으로 감염된다. 최종 계대 후, 구조된 바이러스는 바이러스주(viral stock)(종균)로서 저장된다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 이하의 요소:
a. JL2 균주의 전장 게놈을 포함하는 전사 벡터.
b. 트랜스 작용 단백질(들)을 부호화하는 분리된 유전자(들)을 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 트랜스 작용 단백질은 NP 단백질, P 단백질, L 단백질 및 이들의 결합물로부터 선택되는, 발현 벡터.
c. JL2 균주의 전장 게놈의 적합한 전사를 위한 RNA 폴리메라아제를 포함하는 구조 조성물을 제공한다.
여기서, 본 발명에 따르면, RNA 폴리메라아제는 바람직하게는 T7 RNA 폴리메라아제이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서, 구조된 바이러스는 당업계에 공지된 시퀀싱 방법, 보다 바람직하게는 프라이머 이동 시퀀싱 방법을 특징으로 한다.
제 4 실시형태에 있어서, 본 발명은 볼거리 바이러스에 대한 백신의 개발에 사용할 수 있는 분리된 JL2 균주를 포함하는 신규하고, 안정적이며, 면역원성이 큰 조성물을 제공한다.
이러한 면역원성 조성물은 유전학적으로 균질한 JL2 균주를 포함한다. 본 발명에 따른 안정적인 면역원성 조성물은 볼거리 바이러스에 대한 종래의 백신의 일부인 MuVJL5 성분 균주가 없다. 따라서, 본 발명은 JL2와 JL5 균주의 조합을 사용하여 통상적으로 보호되는 볼거리 바이러스 항원에 대해 보호할 수 있는 안정적이고 순수하며 면역원성이 큰 조성물을 제공한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 Vero 세포 및 MRC-5 세포로부터 선택된다.
앞서 개시된 바와 같이, 종래의 JL2 균주는 1차 닭 발육 유래 세포에서 잘 성장하는 것으로 알려져 있다. 발육란 세포를 사용하는 단점은 잔여 달걀 유래 단백질 및 다른 바이러스를 포함하는 다른 비공지의 외부 약제의 위험에 놓이는 것이다. 이러한 잔여 달걀 유래 단백질은 백신 접종된 개체에서 바람직하지 않은 알레르기성 반응을 일으킬 수 있다. 또한, 비공지의 다른 바이러스의 존재는 백신에 대한 추가적인 위험성을 포함할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 볼거리 바이러스에 대한 안정적인 백신의 개발에 사용할 수 있는 Vero 세포 및 MRC-5 세포를 사용하여 안정적이고, 균질하며, 순수한 분리된 JL2 균주 및 이것을 포함하는 조성물을 개발했다.
제 5 실시형태에 있어서, 본 발명은 유전적으로 균질하고 열 안정적인 JL2 균주를 포함하는 안정적인 백신을 제공한다.
추가 실시형태에 있어서, 본 발명의 백신은 본 발명의 제릴린 백신과 함께 홍역, 풍진, 수두 및 기타 생 바이러스 백신 균주를 포함하는 조합 백신을 제공한다.
제 6 실시형태에 있어서, 본 발명은 종래의 역 유전학적 방법론을 사용한 상기 면역원성 조성물의 개발 방법을 제공한다. 이는 볼거리 바이러스의 JL2 균주의 전장 게놈의 개발을 위한 클로닝 방법을 포함한다. 이러한 JL2 균주의 전장 게놈은 분리된 제릴린 균주의 본래 m-RNA로부터 역전사된다. 안정적인 융합체 형성은 본 발명의 역전사된 JL2 균주로부터 얻어진 세포 병변 효과로서 일어날 것이다. 본 발명의 분리된 JL2 균주로부터 얻어지는 이러한 융합체는 유전적으로 균질하고 면역원성이 크다. 이러한 면역원성 백신 균주는 상이한 포유류 세포계를 사용한 제조 세포 배양에서 성장될 수 있다. 본 발명자들은 Vero 세포, MRC-5 세포 또는 HEK 293T 세포와 같은 세포 기질이, 고전적인 제릴린 백신에서 사용되는 CEF 1차 세포에 비해, 더 낮은 제조 비용으로 여러 계대에서 세포 증식이 보다 양호한 것을 발견했다.
상술한 포유류 세포계를 사용하여 얻어진 면역원성 조성물은 JL2 균주의 원하는 역가를 제조하는 품질 및 감수성의 관점에서 일관적이지만, CEF 1차 세포의 경우에는 재현성이 없다.
또한, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 임의의 1차 세포의 경우가 아닌 적합하고 안정적인 2차 세포를 사용함으로써 세포 기질로부터 새로운 우발성 약제의 오염의 위험을 피하는 것을 돕는다. 이는 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물이 상업적으로 실행 가능한 것을 의미한다.
적합한 숙주 세포를 형질주입하기 위한 적합한 벡터의 사용을 포함하는 클로닝 방법을 포함하는 본 발명에 따른 상기 면역원성 조성물의 개발 방법.
실시형태 중 하나에 있어서, 본 발명은 이하의 단계:
a. 볼거리 바이러스 약독화 JL2의 게놈 서열 단편의 화학적 합성 단계;
b. 각각의 얻어진 유전자 단편을 그것의 증폭을 위해 중간 벡터로 클로닝하는 단계;
c. 단일 벡터로의 각각의 유전자 단편의 결찰을 통해 pMuVJL2 벡터를 얻기 위한 볼거리 바이러스 약독화 JL2 균주의 전장 DNA 게놈의 클론의 구성 단계;
d. pMuVJL2 및 트랜스 작용 단백질을 부호화하는 분리된 유전자를 포함하는 발현 벡터와 숙주 세포의 동시 형질주입 단계로서, 여기서 트랜스 작용 단백질은 NP 단백질, P 단백질 및 L 단백질로부터 선택되어 볼거리 바이러스의 음성 가닥을 구조하는, 단계;
e. 선택적으로, 구조된 볼거리 바이러스의 발현을 위한 숙주 세포로의 계대배양 단계를 포함하는 재조합 볼거리 바이러스의 제조 방법을 제공한다.
추가 실시형태에 있어서, 본 발명은 적합한, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 갖는 면역원성 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
실시형태 중 하나에 있어서, 본 발명은 적합한 완충제, 안정제, 강장제(tonicity agent), 계면활성제 및 동결보호제를 갖는 면역원성 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
실시형태 중 하나에 있어서, 완충제는 인산 완충제, 히스티딘 완충제, 시트르산 완충제, 숙신산 완충제, 아세트산 완충제, 아르기닌 완충제, 인산 완충 생리식염수, 트로메타민 완충제 등으로부터 선택할 수 있고, 바람직하게는 인산 완충제이다.
실시형태 중 하나에 있어서, 안정제는 아미노산(류), 당(류), 폴리올(류) 및 이것들의 결합물로부터 선택할 수 있다.
실시형태 중 하나에 있어서, 아미노산류는 아르기닌, 글리신, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린, 시스테인/시스틴 및 이것들의 적합한 결합물로부터 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, 당류는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 소르보오스, 리보오스, 데옥시리보오스, 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 말토오스, 라피노오스 및 이것들의 적합한 혼합물, 바람직하게는 트레할로오스 또는 소르비톨 또는 만니톨로부터 선택할 수 있다.
또한, 폴리올은 만니톨, 소르비톨, 덱스트란, 글리세롤, 아라비톨, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이것들의 적합한 결합물로부터 선택할 수 있고, 바람직하게는 소르비톨이다.
실시형태 중 하나에 있어서, 적합한 강장제는 당(류), 염(류) 및 상기 약제학적 조성물에 대한 이것들의 결합물로부터 선택할 수 있다.
실시형태 중 하나에 있어서, 적합한 염류는 NaCl 또는 KCl 등과 같은 강장제로부터 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산 에스테르류(트윈), 폴리옥시에틸렌알킬에테르류, 알킬페닐폴리옥시에틸렌에테르류, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 및 도데실황산나트륨(SDS), 또는 이것들의 결합물로부터 선택할 수 있다.
또한, 동결보호제는 당류 등으로부터 선택할 수 있다.
추가 실시형태에 있어서, 본 발명은 적합한 보조제를 갖는 재조합 JL2(rMuVJL2FL)를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
보조제는 백신에 대한 신체의 면역 반응을 증가시키기 위해 백신에 첨가되는 물질로서 정의할 수 있다.
본 발명에 따른 보조제는 알루미늄의 염, GLA(글루코피라노실 지질 보조제)와 같은 모노포스포릴 지질 유사체, 모나티드(monatide), 시토카인 유도제 및 스쿠알렌계 보조제, 친유성 보조제 등으로부터 선택할 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은 제릴린에 대한 본 발명의 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공한다. 이러한 백신은 종래의 경로 및 복용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 분석 방법
1. RT-PCR: 역전사 폴리메라아제 연쇄 반응(RT-PCR)은 RNA를 역전사함으로써 상보적 DNA를 합성 및 증폭시키는데 사용되는 방법이다. RT-PCR은 역전사 효소 및 프라이머를 사용하여 원하는 RNA 서열을 어닐링 및 연장한다. RNA가 존재하면, 역전사 효소 및 프라이머는 RNA 서열에 대해 어닐링하고, DNA(cDNA)의 상보적 가닥을 전사할 것이다. 그 후에 이 가닥은 프라이머 및 Taq 폴리메라아제로 복제하며, 표준 PCR 프로토콜이 뒤따른다. 이 프로토콜은 상당한 양의 DNA를 제조하기 위해 짧은 시간에 단일 가닥의 DNA를 수백만번 복제한다. 그 후에 PCR 생성물(cDNA 가닥)을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리한다.
2. 아가로오스 겔 전기영동: 아가로오스 겔 전기영동은 아가로오스의 매트릭스에서 DNA 또는 단백질의 혼합 개체군을 분리하기 위해 생화학, 분자 생물학, 유전학, 및 임상 화학에서 사용되는 겔 전기영동법이다.
3. 프라이머 이동 시퀀싱 방법(primer walking sequencing method): 프라이머 이동은 대형 DNA 단편을 시퀀싱하기 위해 선택되는 시퀀싱 방법이다. 단일 서열에서 시퀀싱되기에 너무 긴 단편은 연쇄 종결법을 사용하여 판독하며, 이 방법은 긴 서열을 몇개의 연속된 짧은 서열로 분할함으로써 작용한다. 용어 "프라이머 이동"은 게놈을 시퀀싱하는 것이 주된 목적인 경우에 사용된다.
4. 다중 서열 분석: 다중 서열 분석은 분석을 위해 정렬된 서열 사이의 유사점 및 상이점의 영역을 결정하기 위한 생물학적 서열의 분석에 사용되는 방법이다.
실시예
이하의 비제한적 실시예는 적합한 포유류 세포에 대한 게놈 및 구조적 플라스미드 동시 형질주입으로부터의 JL2의 구조를 설명한다. 또한, 한계 희석법을 사용한, 순수하고 유전적으로 균질한 JL2 균주의 분리를 이하에서 설명한다. 상이한 숙주 세포를 갖는 다른 면역원성 조성물을 제조할 수 있고, 이러한 면역원성 조성물은 당업자의 범위 내에 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함되어야 하는 것을 이해할 것이다.
실시예 1: 볼거리 바이러스 약독화 JL2 균주의 전장 DNA 게놈의 클론의 구성
볼거리 JL2의 전장 cDNA의 생성
볼거리 바이러스의 총 게놈 길이(15,384bp)를 커버하기 위해 6개의 게놈 서열 단편을 화학적으로 합성했다(GeneArt-Thermo Fisher Scientific). 이어서, 각각의 게놈 단편 및 벡터를 특정 제한 효소(restriction endonuclease)에 의해 절단하고, 중간 벡터에서 클로닝했다. 각각의 단편은 도 1에 나타낸 바와 같이 아가로오스 겔 상에서 이것들을 분해함으로써 확인했다. 제한 효소 처리 후에 얻어진 단편을 후술했다:
단편 1: pos. 1 - 3576 NotI-RsrII (서열 번호 1);
단편 2: pos. 3576 - 6258 RsrII-AvrII (서열 번호 2);
단편 3: pos. 6258 - 8438 AvrII-XhoI (서열 번호 3);
단편 4: pos. 8438 - 10498 XhoI-KpnI (서열 번호 4);
단편 5: pos. 10498 - 13950 KpnI-XmaI (서열 번호 5);
단편 6: pos. 13950 - 15440 XmaI-NarI (서열 번호 6)
본 실시예에서 언급된 제한 부위는 당업자에게 잘 알려져 있다. 당업자는 원한다면 대체 제한 부위를 사용할 수 있다.
얻어진 단편의 전사 벡터로의 클로닝 및 단편의 결찰
화학적으로 합성되고 제한 효소 처리된 단편을, 최종 벡터로서 변형 pBluescript II SK (+)를 사용하여, 단계적 클로닝 절차에 의해 플라스미드에 혼입시켰다. 양립성 점착 말단(compatible cohesive ends)을 통한 서로에 대한 단편의 점진적 결찰은 최종 pMuVJL2 플라스미드를 야기한다. pMuVJL2 플라스미드의 벡터 지도는 도 2에서 묘사한다. 플라스미드 pMuVJL2는 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 볼거리 바이러스의 구조 단백질에 대한 유전자를 함유하는 헬퍼 플라스미드 및 T7 RNA 폴리메라아제 유전자를 함유하는 플라스미드는 적합한 벡터에서 클로닝에 의해 생성되었다. 여기서, pSC6 벡터는 트랜스 작용 단백질 및 T7 RNA 폴리메라아제를 부호화하는 유전자의 클로닝에 사용되었다. 본 출원에 기재된 클로닝은 Sambrook 및 Russel(2001)에 기재된 바와 같이 행했다.
실시예 2: 약독화 볼거리 제릴린2 바이러스의 구조
시판되어 있는 HEK 293T 세포를 헬퍼 플라스미드 p_NJL2, p_PJL2, p_LJL2 및 pSC6-T7과 함께 pMuVJL2 에 의해 형질주입시켰다. HEK 293T 세포를 35mm 웰에 심어 형질주입시켰을 때 ~50-70%의 합류 지점에 도달했다. 합류 지점은 배양 접시 또는 플라스크의 접착 세포수의 추정값으로서 일반적으로 사용되는 용어이며, 세포 단층에 의해 커버된 표면의 비율을 나타낸다. 형질주입 4시간 전에, 10% FCS를 함유하는 3ml DMEM으로 배지를 대체했다. 모든 재조합 플라스미드는 QIAGEN 플라스미드 제조 키트에 따라 제조했다. DNA의 Ca2 + 인산염 공동 침전을 위한 키트는 Invitrogen으로부터 입수했다.
세포를 이하의 최종 농도에서 플라스미드와 동시 형질주입했다:
p_NJL2 0.5μg,
p_PJL2 0.1μg,
p_LJL2 0.5μg,
pSC6-T7 1.0μg,
pMuVJL2 5.0μg
H2O로 희석된 상술한 플라스미드를 2M CaCl2를 함유하는 에펜도르프관(Eppendorf tube)에 첨가하고, 혼합물을 진탕 조건 하에서 HEPES 완충제를 함유하는 다른 에펜도르프관에 첨가하고, 실온(RT)에서 30분 배양했다. 공동 침전물을 배양액에 적하 첨가하고, 형질주입을 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 행했다. 이어서, 형질감염 배지를 FCS가 없는 3.0ml의 DMEM으로 대체했다. T7 폴리메라아제의 일시적인 발현은 T7 촉진 유전자의 효율적인 단백질 발현을 가능하게 하고, 최종적으로 볼거리 바이러스 구조의 음성 가닥을 야기한다. 형질주입된 세포를 융합체가 형성될 때까지 약 15일 동안 모니터링했다. 단일 플라크(plaque)로부터의 융합체 형성을 도 3에 나타냈다. WHO가 승인한 Vero 세포에 감염되어 바이러스의 계대 0(P0)을 설정하기 위해 단일 융합체를 수집했다.
구조된 재조합 약독화 바이러스는 rMuV JL2 FL이라 명명한다. rMuVJL2FL의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 8에 제시된 바와 같다.
구조된 볼거리 바이러스의 분석 시퀀싱
형질주입 후 약 15일 후에, 제 1 융합체가 나타나자마자, 단일 클론을 현미경 아래에서 뽑아내고, 이어서 특성 해석(characterization)에 사용했다. 특성 해석은 구조된 rMuVJL2FL 바이러스 게놈의 시퀀싱에 의해 행했다. rMuVJL2FL에 감염된 Vero 세포로부터의 바이러스성 RNA는 Qiagen RNeasy Mini 키트에 따라 제조했다. 추출된 바이러스성 RNA 2.0μl부터 시작해, Qiagen OneStep RT-PCR 키트 지침에 따라, 역전사 및 증폭을 순차적으로 행했다.
전장 게놈 서열(15,384bp)을 커버하는 34쌍의 프라이머는 중첩 PCR 단편을 증폭하기 위해 설계되었다. 정제된 PCR은 프라이머 이동 시퀀싱 절차에 따라 시퀀싱되었다.
전체 rMuVJL2FL 바이러스성 게놈을 커버하는 값 판독 서열이 집합되었다. 원래의 플라스미드 pMuVJL2의 서열에 대해 구조된 rMuVJL2FL의 L 유전자에서 6개 지점의 돌연변이가 검출되었고, 다중 서열 분석에 의해 확인했다.
Figure 112017106586200-pct00001
표-1: 구조된 rMuVJL2FL의 L 유전자에서의 돌연변이 지점 및 아미노산 변화
실시예 3: 구조된 볼거리 JL2 바이러스의 팽창
구조된 rMuVJL2FL 바이러스의 P0 계대는 WHO가 승인한 Vero 세포에서 번식되었다. Vero 세포는 5% FBS가 보충된 DMEM에서 단층으로 유지되었고, 합류 지점이 70-80%에서 도달했을 때, Vero 세포는 OPTIMEM의 총 부피 5.0mL에서, 구조된 바이러스 0.5-1.0mL을 사용하여, 구조된 rMuVJL2FL 바이러스의 P0 계대에 의해 감염되었다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 배양했다. 배양 후, 접종물을 DMEM + 5% FBS에 의해 대체했다. 감염된 세포는 2일 후에 분열되었고, 5-dpi 후에 90-100% 융합체 형성이 관찰되었다. 수집된 무세포 분획(cell-free fractions; CF)에서의 1 x 104 pfu/mL와 수집된 세포 결합성 분획(cell-associated fractions; CA)에서의 1 x 106 pfu/mL 사이의 역가에 도달하는 실험실 규모의 바이러스주를 얻기 위해서 무세포(CF) 및 세포 결합성(CA) 분획을 수집했다.
실시예 4: 구조된 볼거리 JL2 바이러스의 마스터 세포 은행(master cell bank)의 제조 및 단일 바이러스 채취물(harvest)의 생성
P0 계대로부터 구조된 볼거리 바이러스를 Vero 세포에서 계대 2(P2)까지 더 계대배양하여 충분한 종균을 얻었다.
Vero 세포에서의 각각의 계대 후에 얻어진 역가를 하기에 나타낸다:
P0 계대: 1 x 103 pfu/mL(CF, 무세포 분획)와 1 x 104 pfu/mL(CA, 세포 결합성 분획) 사이의 역가.
P1 계대: 1 x 104 pfu/mL(CF, 무세포 분획)와 5 x 104 pfu/mL(CA, 세포 결합성 분획) 사이의 역가.
P2 계대: 1 x 104 pfu/mL(CF, 무세포 분획)와 1 x 106 pfu/mL(CA, 세포 결합성 분획) 사이의 역가.
이러한 종균은 -150℃ 내지 -196℃의 온도에서 보관된다. 이 종균은 사람에게 사용하기 위한 상업용 백신의 제조를 위한 작용 종자를 제조하는데 사용된다. 종균으로부터 얻어진 작용 종자는 Vero 세포의 단일 바이러스 채취물의 제조에 사용된다. 종균으로부터 얻어진 작용 종자는 MRC5 세포의 단일 바이러스 채취물의 생성에 사용할 수 있다. MRC5 세포의 단일 바이러스 채취물의 생성도 하기에 나타낸다.
MRC5 세포의 단일 바이러스 채취물의 생성
세포의 증식
배지를 제거하고, 세포를 MEM EBS 배지로 세정하고, 1ml/T75 cm2 및 10ml/RB 850 cm2 에서 TrypLE 용액을 첨가하고(트립신 치환), 35±2℃에서 배양했다. 세포를 신선한 배지에서 분리한 후에 재현탁하고, 새로운 배양 플라스크 및 회전병(roller bottles)에 접종했다. 완전한 합류 지점 T75 플라스크를 배치 크기에 따라 후속 계대에서 각각 T 75, T 175 및 RB 850 회전병에서 1:4 내지 1:16의 비율로 분할되었다. 일주일에 한번 충분한 합류 지점을 얻은 후에 세포를 분열시켰다. 이어서, 세포를 바이러스 접종에 사용했다.
단일 바이러스 채취물 생성
단일 바이러스 채취물 - 볼거리는 MRC-5 세포에 작용 바이러스 종자를 감염시키고 바이러스 흡착을 위해 33±2℃에서 60 내지 120분 동안 배양함으로써 생성되었다. 흡착 후, 각각의 감염된 회전병을 250-300mL의 Creek's Minimal Medium(CMM)으로 보충하고, 회전 장치에서 33±2℃에서 0.5rpm으로 40 내지 70시간 동안 배양했다. 배양 종료 후, 모든 회전병을 단층의 투명성 및 분리에 대해 관찰했다. 단층을 평평한 MEM 배지로 세정하고, 100-200mL 평평한 MEM 배지로 보충했다. 병을 회전 장치에서 33±2℃에서 0.5rpm으로 5 내지 13일 동안 다시 배양했다. 배양 종료 시, 모든 회전병을 투명성 및 세포 병변 효과의 존재에 대해 관찰하고, 채취물을 단일 용기 중의 모든 회전병으로부터 수집했다. 사람 혈청 알부민을 수집된 바이러스 채취물에 대한 안정제로서 사용했다. 그 후에 단일 채취물로서 개개의 미리 살균된 PETG병에서 분배했다. 이렇게 얻어진 벌크를 정화하고, 요구되는 농도로 희석하여 볼거리 백신을 제조했다. 감염되지 않은 MRC5 세포(대조군) 및 rMuVJL2FL로 감염된 MRC5 세포를 각각 도 4의 (a) 및 (b)에 나타낸다.
제조 볼거리 백신(JL)의 효능을 시험하여, 세포 배양법으로 시험된 CCID50(배양된 세포의 50%를 감염시키는 세포 배양 감염값(Cell Culture Infectious Dose))의 범위가 104.12/ml 내지 104.57/ml인 것을 발견했다.
실시예 5: 플라크 어세이 및 발생 부위의 면역 형광법에 의한 볼거리 JL2 균주의 동정 및 정량
플라크 어세이에 의한 바이러스 적정
OPTIMEM을 사용하여 0.5ml의 최종 부피로 바이러스 제제의 연속 10배 희석을 행했다. 각각의 희석액을 35mm Vero 세포 배양물에 첨가했다. 바이러스 흡착 1시간 후, 접종물을 제거하고, 감염된 세포를 5% FCS 및 1% 저융점 아가로오스(LMP 아가로오스)를 함유하는 2.0ml의 DMEM으로 덮었다. 37℃ 및 5% CO2에서의 배양 5일 후, 배양물을 1ml의 10% TCA로 1시간 동안 고정시킨 후에, UV를 30분 동안 가교시켰다. 아가로오스 피복물의 제거 후, 세포 단층을 4% 에탄올에 용해된 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 물로 세정하고, 플라크를 뒤집은 현미경 아래에서 카운팅했다. 현미경 사진을 도 5에 나타낸다.
발생 부위의 면역 형광법
종균의 각종 10배 희석액은 2% FBS(소태아혈청)를 함유하는 MEM(최소 필수 배지) 배지에서 종균 바이러스로부터 제조했다. 이어서, Vero 세포 현탁액은 0.15-0.20 백만/mL 사이의 농도 범위에서 제조했다. 이 세포 현탁액을 바이러스 희석액 이상으로 96-웰 플레이트에 붓고, 5% CO2로 37℃에서 유지했다. 플레이트를 동일한 조건에서 10일 동안 배양했다. 10일 후, 플레이트로부터의 세포 상청액을 버리고, PBS(인산 완충액 생리식염수)로 세정했다. 플레이트의 세포를 아세톤 메탄올 고정 완충액으로 고정시켰다. FITC(fluorescein　isothiocyanate; 플루오레세인 이소티오시안산염)와 결합된 항볼거리 IgG 항체를 1:50의 작용 희석액에 첨가했다. 바이러스 역가는 스피어맨 카버 식(Spearman Karber formula)을 사용하여 형광 현미경 아래에서 염색된 세포를 카운팅함으로써 구했다.
스피어맨-카버 식:
log10 (희석한도(end-point dilution)) =
Figure 112017106586200-pct00002
x0 = (모든 웰이 양성인 최저 희석액의 log10) d = 희석 단계의 log10, 이 경우에는 1 ni = 복제물수, 이 경우에는 6 ri = 양성 웰수
실시예 6: 면역원성 조성물의 제형화
볼거리 백신의 단일 채취물의 요구량은 1000 CCID50의 목표 역가를 얻도록 산출되었다. 원료(안정제)의 유사 요구량은 완제품의 조성에 따라 원하는 배치 크기의 백신을 제형화하도록 산출되었다. 산출된 양에 따른 안정제 176(젤라틴 소르비톨 및 다른 아미노산의 조합 혼합물)을 멸균된 용기로 옮기고, 계산된 양의 볼거리 백신의 단일 채취물을 첨가 및 혼합했다.
최종 제형화는 하기에 설명하는 바와 같다:
Figure 112017106586200-pct00003
최종 제제물을 0.5ml/바이알에 채우고, 절반을 막고, -60℃로 급속 동결시켜, -40℃에서 1차 건조를 행하고, 37℃에서 2차 건조를 행하는 표준 사이클에 의해 감압하에 동결 건조시켰다. 둥근, 온전한 케이크가 발견되어 1분 미만 내에 재구성되고, 1.6% - 2% 하에서 수분 시험이 행해졌다.
생성된 볼거리 백신(JL) 백신의 효능을 시험하여, 세포 배양법에 의해 시험된 103/투여량 내지 10 3.57/ml CCID50의 범위에 있는 것을 알아냈다.
표준 면역 어세이법에 의해, 구조된 볼거리 바이러스의 면역원성의 측정을 위해 본 발명의 면역원성 조성물을 시험한다. 이러한 면역 어세이법의 예로는 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay; 효소 결합 면역흡착 어세이), 및 볼거리 바이러스의 중화 항체를 결정하는데 사용되는 기타 표준법이 있다. 이러한 어세이는 비영장류 또는 영장류에서 구조된 바이러스의 면역원성을 결정하는데 사용할 수 있다. 이러한 연구는 상기 백신에 대한 최적 투여량 및 투여 요법을 결정하는데 유용할 수 있다. 구조된 볼거리 바이러스를 갖는 본 발명의 면역원성 조성물은 추가의 백신 제조에 적합하다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 구조된 볼거리 바이러스의 제조 방법은 임의의 다른 바이러스성 또는 비바이러스성 병원체로부터의 임의의 성분의 사용을 포함하지 않는다. 따라서, 구조된 볼거리 바이러스는 안정적이고 균질하므로, 볼거리 바이러스 이외의 병원성 입자가 없다. 따라서, 본 발명에 따른 구조된 볼거리 바이러스는 백신 개발에 적합한 후보이다.
SEQUENCE LISTING <110> CADILA HEALTHCARE LIMITED <120> Recombinant mumps virus Jeryl Lynn 2 based vaccine <130> CHL-PCT0729 <140> 1055/MUM/2015 <141> 2016-03-23 <150> 1055/MUM/2015 <151> 2015-03-27 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3595 <212> DNA <213> Mumps Virus <400> 1 atccccggcg gccgcttgta atacgactca ctataaccaa ggggagaaag aagatgggat 60 atcggtagaa caaatagtgt aagaaacagt aagcccggaa gtggtgtttc gcgatttcga 120 ggccggcctc gatcctcacc ttccattgtc actagcgcgc attttgacac tacctggaaa 180 atgtcgtctg tgctcaaagc attcgagcgg ttcacgatag aacaggaact tcaagacagg 240 ggtgaggagg gttcaattcc gccggagact ttaaagtcag cagtcaaagt cttcgttatt 300 aacacaccca atcccaccac acgctatcag atgctaaact tttgcctaag aataatctgc 360 agtcaaaatg ctagggcatc tcacagggta ggtgcattga taacattatt ctcacttccc 420 tcagcaggca tgcaaaatca tattagatta gcagatagat cacctgaagc tcagatagaa 480 cgctgcgaga ttgatggttt tgaacctggt acatataggc tgattccaaa tgcacgcgcc 540 aatcttactg ccaatgaaat tgctgcctat gctttgcttg cagatgacct ccctccaacc 600 ataaataatg gaactcctta cgtacatgca gatgttgaag gacagccatg tgatgagatt 660 gagcaattcc tggatcggtg ttacagtgta ctaatccagg cttgggtaat ggtctgtaaa 720 tgtatgacag cgtacgacca acctgctgga tctgctgatc ggcgatttgc gaaataccag 780 cagcaaggtc gccttgaagc aagatacatg ctgcagccgg aggcccaaag gttgattcaa 840 actgccatca ggaaaagtct tgttgttaga cagtacctta ccttcgaact ccagttggcg 900 agacggcagg ggttgctatc aaacagatac tatgcaatgg tgggtgacat cgggaagtac 960 attgagaatt caggacttac tgccttcttt ctcactctca aatatgcact agggaccaaa 1020 tggagtcctc tatcattggc tgcattcacc ggtgaactca ctaaactccg atccttgatg 1080 atgttatatc gagatctcgg agaacaagcc agataccttg ctctgttaga ggctccccaa 1140 ataatggact ttgcacccgg aggctaccca ttaatattca gttatgctat gggagtcggt 1200 acagtcctgg atgtccaaat gcgaaattac acttatgcaa gacctttcct aaacggttat 1260 tatttccaga ttggggttga gaccgcacga aggcaacaag gcactgttga caacagagta 1320 gcagatgatc tgggcctgac tcctgagcaa agaactgagg ttactcagct tgttgacagg 1380 cttgcaaggg gaagaggtgc tgggatacca ggtgggcctg tgaatccttt tgttcctcca 1440 gttcaacagc aacaacctgc 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ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 7980 ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 8040 gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 8100 agcactttta aagttctgct atgtggc 8127

Claims (23)

  1. 서열 번호 8인 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 볼거리 바이러스 약독화 JL2 균주(mumps virus attenuated JL2 strain)의 분리된 전장 게놈(isolated full-length genome).
  2. 청구항 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  3. 청구항 2에 있어서,
    pUC19, pBluescript, pBluescript II, pBluescript II SK (+), pCA 또는 pSC6으로부터 선택되는 벡터.
  4. 청구항 2에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 청구항 4에 있어서,
    포유류 세포 또는 비포유류 세포로부터 선택되는 숙주 세포.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 포유류 세포는 HEK 293T 세포, Vero 세포 또는 MRC-5 세포로부터 선택되고, 비포유류 세포는 세균 세포 또는 효모 세포로부터 선택되는, 숙주 세포.
  7. 청구항 1에 기재된 볼거리 바이러스 약독화 JL2 균주의 전장 게놈을 포함하는 볼거리 바이러스 백신.
  8. 의약품 부형제(pharmaceutical excipients)와 함께, 청구항 1에 기재된 볼거리 바이러스 약독화 JL2 균주의 전장 게놈을 함유하는 면역원성 조성물(immunogenic composition).
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 의약품 부형제는 완충제, 안정제, 강장제(tonicity agent), 계면활성제, 보조제, 동결보호제 또는 이것들의 결합물로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    (a) 완충제는 인산 완충제, 히스티딘 완충제, 시트르산 완충제, 숙신산 완충제, 아세트산 완충제, 아르기닌 완충제, 인산 완충 생리식염수, 트로메타민 완충제 및 이것들의 혼합물로부터 선택되고;
    (b) 안정제는 아미노산, 당, 폴리올 또는 이것들의 결합물로부터 선택되며;
    (c) 강장제는 당, 염 또는 이것들의 결합물로부터 선택되고;
    (d) 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산 에스테르류(트윈), 폴리옥시에틸렌알킬에테르류, 알킬페닐폴리옥시에틸렌에테르류, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 도데실황산나트륨(SDS), 또는 이것들의 결합물로부터 선택되며;
    (e) 보조제는 알루미늄의 염, 글루코피라노실 지질 보조제와 같은 모노포스포릴 지질 유사체, 모나티드(monatide), 시토카인 유도제, 스쿠알렌계 보조제, 친유성 보조제 또는 이것들의 결합물로부터 선택되고;
    (f) 동결보호제는 당인, 면역원성 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    아미노산, 당, 폴리올 또는 이것들의 결합물, 또는 완충제, 또는 염으로부터 선택되는 안정제를 포함하는 면역원성 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서,
    - 완충제는 인산 완충제, 히스티딘 완충제, 시트르산 완충제, 숙신산 완충제, 아세트산 완충제, 아르기닌 완충제, 인산 완충 생리식염수, 트로메타민 완충제 및 이것들의 혼합물로부터 선택되고;
    - 아미노산은 아르기닌, 글리신, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린, 시스테인/시스틴 및 이것들의 결합물로부터 선택되며;
    - 당은 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 소르보오스, 리보오스, 데옥시리보오스, 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 말토오스, 라피노오스 및 이것들의 혼합물로부터 선택되고;
    - 폴리올은 만니톨, 소르비톨, 덱스트란, 글리세롤, 아라비톨, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이것들의 결합물로부터 선택되며;
    - 염은 NaCl 또는 KCl로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
  13. 이하의 성분:
    a. 청구항 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 벡터;
    b. 트랜스 작용(trans-acting) 단백질을 부호화하는 분리된 유전자를 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 트랜스 작용 단백질은 NP 단백질, P 단백질, L 단백질 및 이것들의 결합물로부터 선택되는, 발현 벡터; 및
    c. 청구항 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 위한 RNA 폴리메라아제를 포함하는 조성물.
  14. 이하의 단계:
    a. 볼거리 바이러스 약독화 JL2의 게놈 서열 단편의 화학적 합성 단계로서, 상기 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 6으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드인 단계;
    b. 각각의 얻어진 유전자 단편 및 그 결합물을 증폭을 위해 중간 벡터로 클로닝하는 단계;
    c. 볼거리 바이러스 약독화 JL2 균주의 전장 DNA 게놈의 클론을 제작하는 단계로서, 단계 b.에서 얻어진 각각의 유전자 단편을 단일 전사 벡터로 결찰하는 것을 통해 pMuVJL2 벡터를 얻는 단계; 및
    d. pMuVJL2 및 트랜스 작용 단백질을 부호화하는 분리된 유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포로 동시 형질주입(co-transfection)시키는 단계로서, 상기 트랜스 작용 단백질은 NP 단백질, P 단백질, L 단백질, 및 RNA 폴리메라아제로부터 선택되어 볼거리 바이러스의 음성 가닥(negative strand)을 얻는 단계를 포함하는, 청구항 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 재조합 볼거리 바이러스의 생성 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 방법은 e. 얻어진 볼거리 바이러스의 증식을 위한 숙주 세포로의 계대배양(passaging) 단계를 더 포함하는, 재조합 볼거리 바이러스의 생성 방법.
  16. 청구항 13에 있어서,
    상기 NP 단백질을 부호화하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 9인, 조성물.
  17. 청구항 13에 있어서,
    상기 P 단백질을 부호화하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10인, 조성물.
  18. 청구항 13에 있어서,
    상기 L 단백질을 부호화하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11인, 조성물.
  19. 청구항 13에 있어서,
    상기 NP 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 12인, 조성물.
  20. 청구항 13에 있어서,
    상기 P 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 13인, 조성물.
  21. 청구항 13에 있어서,
    상기 L 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 14인, 조성물.
  22. 청구항 14에 있어서, 상기 RNA 폴리메라아제를 부호화하는 벡터는 서열 번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 볼거리 바이러스의 생성 방법.
  23. 청구항 14에 있어서,
    - 전사 벡터 또는 중간 벡터는 pUC19, pBluescript, pBluescript II, pBluescript II SK(+), pCA 또는 pSC6으로부터 선택되고;
    - 숙주 세포는 HEK 293T 세포, Vero 세포 또는 MRC-5 세포로부터 선택되는 포유류 세포이거나, 또는 대장균 또는 효모 세포로부터 선택되는 비포유류 세포인, 재조합 볼거리 바이러스의 생성 방법.
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