CN109563492B

CN109563492B - 突变的病毒、其制备方法和应用

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Publication number: CN109563492B
Application number: CN201680076047.3A
Authority: CN
Inventors: 周德敏; 司龙龙; 周雪莹; 张子威; 徐欢; 田振宇; 张传领; 肖苏龙; 夏青; 张礼和
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2016-08-02
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2036-08-02
Also published as: AU2016383201A1; IL260258A; JP2019500051A; EP3399029A4; US11510974B2; WO2017113786A1; BR112018013168A2; US20200268870A1; CN109563492A; ZA201804362B; CN106929482A; CA3010015A1; CO2018006706A2; EP3399029A1

Abstract

提供一种人源的或其它动物的突变病毒及其制备方法，优选流感病毒。该方法包括使用反向遗传技术在病毒基因组的一个或多个基因的自身终止密码子上游引入密码子UAG。还提供了该突变病毒的应用，如作为减毒活疫苗、复制可控的安全病毒模型等的用途。

Description

突变的病毒、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及突变的病毒，特别是在其一个或多个蛋白中包含非天然氨基酸的突变病毒，例如流感病毒。本发明还涉及制备突变病毒的方法。本发明进一步涉及突变病毒的应用，如作为病毒活疫苗、病毒强毒的安全模型等的用途。

背景技术

流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病，可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型，其中以A型（又称甲型）流感病毒的暴发最为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科，其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成，编码10种蛋白：血凝素蛋白（HA）；基质蛋白（M），包括M1和M2；神经氨酸酶（NA）；核壳蛋白（NP）；非结构蛋白（NS），包括NS1和NEP；PB1，PB2和PA三种聚合酶。这些蛋白对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型，目前已发现了18种亚型的HA蛋白和11种亚型的NA蛋白。A型流感病毒大规模流行可引起极高的发病率和死亡率，严重威胁着人类的健康(W.H.O. 2003; Coleman 2007)。A型流感病毒在二十世纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2，共造成约5000万人死亡(Kilbourne 2006; Taubenberger， Hultin et al. 2007)。2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(Dawood， Jain et al. 2009; Zimmer andBurke 2009)，其传播之迅速，引起了世界的关注。据统计，全世界平均每年有30-50万人死于流感 (Fiore， Shay et al. 2007)。

自流感发现以来，科学家们一直致力于对于流感病毒的防控，接种疫苗目前是最有利于预防流感，控制流感传播的手段。20世纪30年代末流感病毒疫苗开始在人类中使用，目前的流感病毒疫苗分为以下几种：灭活病毒疫苗和减毒病毒疫苗，DNA疫苗，亚单位疫苗，重组病毒载体疫苗，类病毒颗粒疫苗。

目前应用的灭活流感疫苗为三价疫苗，包括H1N1、H3N2和B型流感病毒疫苗，多年的临床应用表明流感灭活疫苗具有很好的免疫效果和安全性，接种后可刺激机体产生相应的抗体，但缺点是不能刺激产生分泌型免疫球蛋白(sIgA)。另外，流感病毒在鸡胚上传代会发生抗原变异，且大部分鸡体内携带有多种病毒，疫苗有被这些病毒污染的可能。由于新流行的抗原变异株必须要能在鸡胚中高效复制，才有可能生产大量疫苗。随着制备疫苗所用的野生型病毒在鸡蛋中生长，其免疫原性在一定程度上被改变或降低。如果生产的疫苗株与当前流行株不匹配，就会失去免疫保护效果。近年来，一个重大进展就是利用哺乳动物细胞代替鸡胚培养，哺乳动物细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞，具有无外源因子污染、易于规模化生产、抗原稳定等优点，哺乳动物细胞培养的流感疫苗具有较好的免疫原性，接种后不良反应轻，较安全。研究阶段取得了很好的实验结果。但还有一些问题未能解决，临床尚未见到使用。

减毒活疫苗主要包括温度敏感型疫苗、重配疫苗、冷适应减毒流感活疫苗、反向遗传技术疫苗和复制缺陷流感疫苗5种类型。现在研制成功的是冷适应减毒流感活疫苗。该疫苗是一种降低了毒力并能在最佳适应温度下生长的流感病毒株。这种病毒只能在25℃左右复制，不能在37℃下传代，因此其感染只局限于上呼吸道，临床上无明显的流感症状。利用弱毒株与当前的流行毒株进行基因重组，得到带有弱毒株和流行株的HA和NA基因的重组病毒。多项研究证实，冷适应毒株生物学性质有很好的稳定性。弱毒流感疫苗与灭活疫苗的免疫后抗体阳转率都在50%～70%，能有效控制流感的流行。冷适应减毒活疫苗已在俄罗斯使用，美国也将被批准使用，其在接种途径、免疫效果方面比灭活疫苗有一定的优势，如可通过鼻内喷雾或者点滴方式来免疫。冷适应减毒活疫苗在上呼吸道复制，可诱导黏膜的sIgA和全身的体液及细胞免疫反应，产生比灭活疫苗更广泛更持久的保护。但冷适应减毒活疫苗可与其他流感病毒发生基因重配，产生有毒的重配株病毒，并且在二价或三价冷适应减毒活疫苗中可能会出现干扰现象。

理想的疫苗应具备下列条件：①免疫原性强，②毒性反应小，③遗传学上稳定，④在流行期能快速获得与流行株一致的抗原性。鉴于活疫苗相对于灭活疫苗的优势及活疫苗的安全考虑，使用哺乳动物细胞生产复制可控、遗传稳定、安全有效的新型流感病毒活疫苗，提高疫苗的安全性和有效性，将会促进流感疫苗快速发展。

遗传密码扩展技术

经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码扩展的技术—利用琥珀终止密码子（TAG）来编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将数种非天然氨基酸成功地在活细胞的目标蛋白质中进行了定点表达，为这些蛋白质赋予了新颖的物理、化学和生理性质。使用这一方法，可以将非天然氨基酸（包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸）引入蛋白质中（L. Wang 等人，（2001），SCIENCE 292:498-500; J.W. Chin 等，2002， Journal of the American ChemicalSociety 124:9026-9027; J. W. Chin，＆P. G. Schultz， 2002， ChemBioChem 11:1135-1137）。这些研究表明，有可能选择性地且常规地引入化学官能基团到蛋白质中，例如，羰基、炔基、和叠氮基团等特殊化学基团，这些基团一般能够有效且选择性地形成稳定的共价键，更加有利于蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。这一技术不仅可以用于蛋白质的定点修饰上，还被用在了活体生物体（如病毒、细菌等）的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面。这种在基因组中引入了TAG终止密码子的生物体的增殖、蛋白表达依赖于相应的外源非天然氨基酸生物正交系统。

发明内容

发明人通过将琥珀终止密码子（TAG）引入到流感病毒的基因组中，并利用古甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到相应的蛋白的相应位点上，从而得到了定点突变的流感病毒。这类流感病毒的复制、蛋白表达等一系列的生命过程依赖于非天然氨基酸生物正交系统，即该类病毒可以在特别的非天然氨基酸生物正交系统中进行包装、繁殖、制备，而一旦脱离了该非天然氨基酸生物正交系统，病毒就不能进行复制、蛋白表达等生命活动。因此，利用对非天然氨基酸依赖性制备的流感病毒，具有很高的安全性。此外，该定点突变的流感病毒可以进一步修饰，进而得到定点修饰的流感病毒，所述的定点修饰包括例如将一些免疫增强剂定点引入到流感病毒蛋白的特定氨基酸，从而得到性能改善的流感病毒，如得到免疫原性增强的修饰产物。

本发明最重要的突破是在流感病毒基因组中引入了琥珀终止密码子（UAG），使得流感病毒只有在非天然氨基酸生物正交系统中才可以复制。利用流感病毒对该非天然氨基酸生物正交系统的依赖性，我们可以在该系统中进行流感病毒的大量制备，由于动物和人体中并没有该生物正交系统，因此制备出来的流感病毒在动物和人体中不能进行复制繁殖，增加了病毒的安全性，使得该流感病毒成了名副其实的流感病毒活疫苗。此外，由于人工合成的非天然氨基酸可以修饰有不同功能的官能团，可以为后续定点修饰的特异性提供保证，例如Click反应仅仅能够发生在所述的非天然氨基酸上，而不会在病毒蛋白的其他位点，这对于定点修饰的流感病毒均质性及免疫原性的保留至关重要。

该突变系统的原理在于：突变型的tRNAPyl，PylRS满足下列关系：（1）：tRNAPyl 不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA酶，只能被突变型的PylRS 酰化；（2）：突变型的PylRS只能酰化tRNAPyl，不能酰化其它tRNA，因此，突变性tRNAPyl 和PylRS 之间的关系是正交性的。这种正交性的酶能够、并且只有这种酶能够把非天然氨基酸酰化到这种正交的tRNA上，并且只能酰化这种tRNA，而不能酰化其它的tRNA。获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA 系统使非20种常见氨基酸的Lys-diazirine 或Lys-azido等与琥珀密码子TAG相对应，从而将非天然氨基酸定点引入到流感病毒的各个蛋白中。由于动物和人体中并没有该生物正交系统，因此制备出来的流感病毒在动物和人体细胞中不能进行复制繁殖，增加了病毒的安全性。因此，本发明一方面涉及引入了非天然氨基酸的流感病毒，其特征在于其中PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M蛋白中至少一种蛋白的至少一个位点处的氨基酸被突变为非天然氨基酸；优选地，所述非天然氨基酸选自：

（I）所示的Lys-diazirine，

（II）所示的Lys- azido，或

其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种。

本发明另一方面涉及一种制备引入了非天然氨基酸的流感病毒的方法，其中包括：

（1）构建含有编码流感病毒各个蛋白的基因的质粒，其中编码所述蛋白的一个或多个基因在其终止密码子上游一个或多个位点处具有TAG突变；

（2）将（1）中所述质粒转染表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶的动物细胞中，或者将（1）中所述质粒与表达特异识别非天然氨基酸例如Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶的质粒一起共转染动物细胞；和(3) 在添加了需要的非天然氨基酸的培养基中培养被转染的细胞，获得在基因组中引入了TAG终止密码子、从而在对应的蛋白中引入了非天然氨基酸的流感病毒。所述动物细胞可以是例如哺乳动物细胞、鸟类细胞等，如293T细胞。

在一个实施方案中，所述表达特异识别非天然氨基酸例如Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶的质粒是pACYC-tRNA / PylRS 质粒，该质粒已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日为2011年6月14日。其在中国专利号为201210214451.6的专利中已经公开。保藏号为CGMCC No：4951的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）的细菌细胞含有质粒pACYC-tRNA / PylRS，该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。

在另一个实施方案中，所述稳定表达tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的动物细胞系是HEK293-PYL，该细胞系已被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日为2015年11月17日，保藏号为CGMCC No：11592 ，其分类命名为人HEK293T细胞。用于本发明的动物细胞系还可以通过用表达特异识别非天然氨基酸例如Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶的质粒进行转染来制备。细胞转染的方法是本领域中熟知的。

本领域普通技术人员可通过多种方法确定流感病毒各个蛋白的编码基因中适于引入TAG突变的位点，例如通过生物信息学手段，分析流感病毒相应蛋白中氨基酸的保守性，再确定引入TAG的位点。

在本发明的一个具体的实施方案中，通过将带有琥珀密码子TAG的流感病毒基因插入到载体（例如pHH21质粒）中，将所述的质粒与pACYC-tRNA / PylRS 一起转染宿主细胞例如293T细胞，即可通过在培养液中添加非天然氨基酸例如Lys-diazirine 或Lys-azido获得定点突变的流感病毒。

在本发明的一个实施方案中，在流感病毒的PA、PB1、PB2、NP基因片段上分别引入TAG，然后将Lys-azido定点修饰到流感病毒的PA、PB1、PB2、NP蛋白相应的位点，经中空纤维柱和凝胶层析方法或者蔗糖梯度密度离心方法，即可得到纯化后的突变型流感病毒。经体内外实验初步证明，突变型的流感病毒具有非常高的安全性和遗传稳定性，并且与灭活病毒相比具有更好的免疫效果。

在本发明的一个实施方案中，为了提高流感病毒的产出效率，以及将来的工业化生产，发明人建立了可以稳定表达tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL。该哺乳动物稳定细胞系还解决了传统使用鸡胚繁殖病毒易引起人体过敏等不良反应的缺点。本发明中提供了一种可在哺乳动物细胞中制备、在基因组和相应蛋白中分别引入琥珀终止密码子UAG和非天然氨基酸的突变流感病毒。该病毒也可以由稳定表达tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的哺乳动物稳定细胞系（如293T细胞）来制备。制备的突变流感病毒具有很好的安全性和免疫活性。

国际上尚缺乏稳定表达tRNA的理想方法。为了提高突变型流感病毒的拯救效率，经过反复摸索，发明人建立了一套双慢病毒转导和质粒稳定转染结合的三轮筛选方法，建立了稳定表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的特殊细胞系，即可以稳定表达tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL（图11A）。发明人还构建了分别带有puromycin和hygromycin抗性的2个慢病毒过表达载体，两者分别携带氨酰tRNA合成酶和带有39位TAG突变的报告基因GFP，通过两轮病毒转导HEK-293T细胞和puromycin/hygromycin筛选，得到稳定细胞株pylRS/GFP39TAG。之后，我们构建了携带12个拷贝数tRNA和zeomycin抗性的bjmu-zeo-12tRNA载体，质粒线性化转染细胞株pylRS/GFP39TAG，后经UAA存在下zeomycin筛选，最后分离出GFP阳性细胞（UAA存在下细胞呈绿色，去除UAA细胞呈无色），从而得到了表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系HEK293-PYL。

在本发明的一个实施方案中，利用反向遗传技术，发明人可以将现用的流感病毒模型的任意基因替换成其他亚型或者毒株的基因，从而制备出其他亚型或者毒株的流感病毒，使得该方法可以应用于任意亚型或毒株的流感病毒，而且制备出的病毒对非天然氨基酸生物正交系统具有严格的依赖性。此外，利用反向遗传技术和基因密码子技术，还可以制备多价流感病毒，如含有H1N1、H3N2、B型流感病毒表面抗原的多价流感病毒。更重要的是，制备出的突变型强毒和多价病毒具有非常高的安全性和有效性。

本发明提供了：

1. 一种突变的病毒，其特征在于所述病毒的至少一种蛋白的编码核酸在终止密码子上游的一个或多个密码子处包含一个或多个UAG密码子。

所述“包含”是指在所述密码子处，UAG密码子替换所述密码子、插入UAG密码子或同时用UAG密码子替换所述密码子和插入UAG密码子。

2. 项目1所述的突变的病毒，其选自下述组中：手足口病毒、柯萨奇病毒、丙肝病毒HCV、乙肝病毒HBV、甲肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒HPV、单纯疱疹病毒HSV、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、水泡性口炎病毒、呼吸道合胞病毒RSV、登革病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒Zika、SARS、中东呼吸综合征病毒、轮状病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、腺病毒、艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、汉坦病毒、新型肠道病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、蓝耳病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、细小病毒。

3. 项目1所述的突变的病毒，其是流感病毒，并且述流感病毒中选自PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M蛋白的至少一种蛋白的编码核酸在终止密码子上游的一个或多个密码子处包含一个或多个UAG密码子。

4. 项目3所述的突变的流感病毒，其中选自PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M蛋白的至少两种、三种或四种蛋白的编码核酸在终止密码子上游的一个或多个密码子处包含一个或多个UAG密码子。

5. 项目3所述的突变的流感病毒，其中所述PA、PB1、PB2和NP蛋白中两种、三种或四种蛋白的编码核酸在终止密码子上游的一个或多个密码子处包含一个或多个UAG密码子。

6. 项目3所述的突变的流感病毒，其中所述流感病毒在选自说明书表2a)、2b)、2c)、2d)、2e)、2f)、2g)、2h)和2i)中所列举的一个或多个基因位点处包含UAG密码子。

7. 项目3所述的突变的流感病毒，其中所述流感病毒在PA蛋白的R266、PB1蛋白的R52、PB2蛋白的K33和/或NP蛋白的D101的编码核酸密码子处含有UAG密码子。

8. 项目1－7中任一项所述的突变的病毒，其特征在于，所述病毒中，所述蛋白在所述UAG密码子对应处包含非天然氨基酸；优选地，所述非天然氨基酸选自：

（I）所示的Lys-diazirine，

（II）所示的Lys- azido，或

其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种。

9. 如项目8所述的突变的病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第n位的Lys-diazirine，其在病毒蛋白中的连接方式如下式所示：

其中，由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第n位可以是流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M蛋白中任何一种蛋白质氨基酸序列内的任意位置，相应地，R₁为第1至第n-1位氨基酸残基，R₂为第n＋1位至C末端的氨基酸残基，

R₃为

，

优选地，n是该蛋白起始密码子下游第p－1位到天然终止密码子上游第q位内的任意位置，其中p和q独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700或者直到其全长氨基酸序列长度减去1。

10. 如项目8所述的突变的病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第n位的Lys-azido，其在病毒蛋白中的连接方式如下式所示：

其中，由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第n位可以是病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M蛋白中任何一种蛋白质的氨基酸序列内的任意位置，相应地，R₁为第1至第n-1位氨基酸残基，R₂为第n＋1位至C末端的氨基酸残基，

R₄为

,

11. 项目8－10中任一项的突变的病毒，其在所述蛋白质的多个位点处包含非天然氨基酸。

12. 如项目11所述的突变的病毒，其是流感病毒，并且在其中PA上的R266、PB1上的R52、PB2上的K33、NP上的D101处包含非天然氨基酸。

13. 如项目1－12中任一项所述的病毒，其中所述病毒的蛋白质编码序列中的正常终止密码子如果是UAG的话，已被突变成UAA。

14. 如项目3－13中任一项所述的突变的病毒，其是流感病毒，并且，

未经突变的PB2的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的PB1的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的PA的氨基酸序列与SEQ ID NO: 4所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的HA的氨基酸序列与SEQ ID NO: 5所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的NP的氨基酸序列与SEQ ID NO: 6所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的NA的氨基酸序列与SEQ ID NO: 7所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的M 的氨基酸序列与SEQ ID NO: 8所示的核酸编码的氨基酸序列相同，或

未经突变的NS的氨基酸序列与SEQ ID NO: 9所示的核酸编码的氨基酸序列相同。

15. 根据项目14所述的突变的病毒，其是WSN-RNP-TAG，在PA蛋白的R266、PB1蛋白的R52、PB2蛋白的K33和NP蛋白的D101的编码密码子处含有UAG密码子。

16. 项目3所述的突变的病毒，其是人源的或其它动物源的流感病毒，优选为A、B或C型流感病毒。

17. 项目3所述的突变的病毒，其中包含有说明书表2a-表2i和表4中所列举的一个或多个突变。

18. 一种编码如项目1-17中任一项所述的突变的病毒或其经突变的蛋白的核酸分子，其特征在于在天然终止密码子之外，还包含人为引入的密码子UAG。

19. 制备项目1－17中任一项所述突变的病毒的方法，包括如下步骤：

（1）将包含所述一个或多个被突变基因与合适的载体可操作地连接的突变核酸表达载体和包含其它未被突变基因的一个或多个核酸表达载体转染稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的动物细胞系，或者与表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的质粒共同转染动物细胞系其它未被突变基因的一个或多个核酸表达载体；

（2）将被转染的细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养；和

（3）回收所述突变病毒。

20. 项目19所述的方法，其中步骤（1）中所述质粒是保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA / PylRS中的质粒pACYC-tRNA /PylRS。

21. 项目19所述的方法，其中所述动物细胞系选自哺乳动物细胞系、禽类动物细胞系、仓鼠细胞系等，优选选自293细胞、293T细胞、Vero细胞、A549细胞、Hela细胞、CHO细胞、MDCK细胞、sf9细胞等。

22. 项目19所述的方法，其中所述稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的动物细胞系是以保藏号CGMCC No：11592于2015年11月17日被保藏在CGMCC的HEK293-PYL。

23. 筛选减毒病毒的方法，包括步骤：

（1）基因突变：通过基因工程方法将病毒基因组中一个或多个基因的一个或多个选定的密码子突变为TAG密码子，得到一个或多个被突变的基因；

（2）表达载体构建：将（1）得到的一个或多个被突变的基因与合适的载体可操作地连接，得到突变基因表达载体；

（3）将步骤（2）中得到的突变基因表达载体和包含其它未被突变基因的一个或多个基因表达载体转染稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的动物细胞系，或者与表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的质粒共同转染动物细胞系；

（4）将被转染的细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养，收集培养基上清液，采用包含Lys-diazirine或者Lys-azido的培养板对上清液进行病毒克隆的非天然氨基酸依赖性的检测；和

（5）将维持了对Lys-diazirine或者Lys-azido非天然氨基酸依赖性的突变体鉴定为减毒的病毒。

24. 项目23的方法，其在步骤（5）之后还包括：

（6）将（5）中定点突变成功的候选物的突变位点进行组合，再次包装病毒，使得包装出的病毒在多个基因片段上均引入了UAG，在对应的多个蛋白上均引入了非天然氨基酸，然后再次考察包装产物对非天然氨基酸的依赖性，保留经过长期传代仍旧维持着对非天然氨基酸依赖性的组合突变体设定为最优的定点突变成功候选物。

25. 项目24的方法，其中在步骤（6）之后还进一步包括：

（7）对（6）中获得的突变型病毒进行安全性，鉴定出安全的病毒。

26. 项目23所述的方法，其中所述病毒选自下述组中：手足口病毒、柯萨奇病毒、丙肝病毒HCV、乙肝病毒HBV、甲肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒HPV、单纯疱疹病毒HSV、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、水泡性口炎病毒、呼吸道合胞病毒RSV、登革病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒Zika、SARS、中东呼吸综合征病毒、轮状病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、腺病毒、艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、汉坦病毒、新型肠道病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、蓝耳病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、细小病毒。

27. 项目23所述的方法，其中所述一个或多个选定的密码子独立地位于编码序列第n位， n是该蛋白起始密码子下游第p-1位到天然终止密码子上游第q位内的任意位置，其中p和q独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700或者直到其全长氨基酸序列长度减去1。

28. 项目23所述的方法，其是流感病毒。

29. 项目23所述的方法，其中步骤（3）中所述质粒是保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA / PylRS中的质粒pACYC-tRNA /PylRS。

30. 项目23所述的方法，其中所述动物细胞系选自哺乳动物细胞系、禽类动物细胞系、仓鼠细胞系等，优选选自293细胞、293T细胞、Vero细胞、A549细胞、Hela细胞、CHO细胞、MDCK细胞、sf9细胞等。

31. 项目23所述的方法，其中所述稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的动物细胞系是以保藏号CGMCC No：11592于2015年11月17日被保藏在CGMCC的HEK293-PYL。

32. 项目23所述的方法，其特征在于重复突变、包装和筛选步骤。

33. 项目23－32中任一项所述的方法，其中所述流感病毒是A型、B型或C型流感病毒。

34. 含有有效量的项目1-17中任一项所述的突变的流感病毒的组合物。

35. 含有有效量的项目1-17中任一项所述的突变的流感病毒的疫苗。

36. 药物组合物，其中含有有效量的项目1-17中任一项所述的突变的流感病毒，以及药学上可以接受的赋形剂。

37. 项目1-17中任一项所述的突变的流感病毒在制备减毒活疫苗或者制备预防或治疗流感病毒感染相关药物中的用途。

38. 项目1-17中任一项所述的突变的流感病毒在预防和治疗流感病毒感染中的用途。

39. 可稳定表达tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的哺乳动物稳定细胞系，其为HEK293-PYL，保藏日为2015年11月17日，其保藏号为CGMCC No：11592。

上述的组合物、药物组合物和疫苗可以在本发明制备定点突变的流感病毒的基础上采用本领域常规技术制备；它们可以用于预防或治疗流感病毒感染，包括人和动物的流感病毒感染。

附图说明：

图1.用生物信息学工具Consurf计算流感病毒各个蛋白氨基酸序列保守性的工作流程。

图2.流感病毒各个蛋白上进行点突变后，拯救流感病毒的效果。位点仅作为代表，不局限于所示位点。

图2A.流感病毒NP蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图2B.流感病毒PA蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图2C. 流感病毒PB2蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图2D.流感病毒PB1蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图2E.流感病毒HA蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图2F.流感病毒NA蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图2G.流感病毒NS蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图2H.流感病毒M1蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。

图3.在流感病毒NP、PA、PB1、PB2上同时引入点突变后，拯救流感病毒的效果。即选择流感病毒的NP-S3、PA-S1、PB1-S4、PB2-S4这四个位点，进行组合，同时突变这四个位点，使用所得的质粒，拯救流感病毒。将所得到的流感病毒命名为WSN-RNP-TAG。

图4.对制备出的WSN-RNP-TAG的遗传稳定性进行考察，说明制备出的突变型流感病毒在多次传代后，仍旧是稳定的。在实验过程中，对该病毒连续传代时间长达4个月，制备的病毒一直维持着对非天然氨基酸的依赖性。

图5.通过qRT-PCR说明，使用我们发明的方法制备的流感病毒的产量很高，接近野生型流感病毒的产量。

图6.通过测定野生型和突变型WSN-RNP-TAG的病毒的抗原红细胞凝集效价，说明突变型流感病毒和野生型病毒而的抗原红细胞凝集效价是基本一致的，进一步说明，制备出的突变型流感病毒的产量很高。

图7.为了检测突变型病毒WSN-RNP-TAG的安全性和免疫原性，设计了如下的动物实验方案。其中病毒的接种方式是鼻腔接种，取血方式是眼眶取血。

图8. 突变型病毒WSN-RNP-TAG的动物水平安全性考察结果(每组小鼠数量为10只)。(A)当接种野生型流感病毒时，所有的小鼠体重均明显下降，当接种突变型WSN-RNP-TAG或者灭活的流感病毒WSN-positive control时，所有的小鼠体重均没有明显下降。（B）当接种野生型流感病毒时，小鼠在接种后第10天全部死亡。当接种突变型WSN-RNP-TAG或者灭活的流感病毒WSN-positive control时，观察期间所有的小鼠均存活。说明，突变型WSN-RNP-TAG在动物水平具有很好的安全性。

图9突变型WSN-RNP-TAG在动物水平的有效性考察。

图9A.按照图7的实验方案，取各组小鼠肺组织，通过qRT-PCR的方式检测肺组织中病毒的相对含量。结果如图所示，当用灭活病毒或者突变型WSN-RNP-TAG对小鼠免疫后，小鼠肺组织中的病毒含量下降，并呈现免疫剂量依赖性。此外，突变型WSN-RNP-TAG的免疫效果优于灭活病毒的免疫效果。

图9B.通过Elisa实验检测免疫前后的各组小鼠体内抗HA抗体的含量。结果说明免疫后14天和免疫后21天小鼠体内的抗体含量均增加，且21天的抗体含量高于14天时的抗体含量。

图9C. 按照图7的实验方案，对各组小鼠分别进行免疫之后，用100LD50的WSN进行攻毒。并进行了小鼠体重的考察，发现我们制备的突变型病毒WSN-RNP-tag可以很好地保护动物不受病毒的感染。并且，1倍剂量的突变型WSN-RNP-tag对小鼠的保护效果甚至和10倍剂量的灭活WSN的保护效果相当。这充分显示了我们制备的减毒流感疫苗相对于灭活疫苗具有更好的优势。

图9D. 按照图7的实验方案，对各组小鼠分别进行免疫之后，用100LD50的WSN进行攻毒。并进行了小鼠死亡率的考察，发现我们制备的突变型病毒WSN-RNP-tag可以很好地保护动物不受病毒的感染。并且，1倍剂量的突变型WSN-RNP-tag对小鼠的保护效果甚至和10倍剂量的灭活WSN的保护效果相当。这充分显示了我们制备的减毒流感疫苗相对于灭活疫苗具有更好的优势。

图10.比较使用普通哺乳动物细胞293T和稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL拯救突变型流感病毒的效率。结果说明，使用HEK293-PYL细胞系拯救突变型流感病毒的效率远远高于使用普通293T细胞。

图11A. 正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系HEK293-PYL筛选方法的建立。

图11B. 双病毒过表达体系的构建。

图11C. bjmu-12t-zeo载体的构建。

图 12 接种流感病毒疫苗后的小鼠体内抗NA和NP蛋白的抗体含量测定，WSN-RNP-tag可以诱导小鼠产生NA特异性抗体和NP的特异性抗体。

图 13 WSN-RNP-tag对小鼠肺内病毒特异性抗体IgA的诱导作用。相对于灭活的WSN，WSN-RNP-tag可以诱导高水平的IgA。

图 14 WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量。灭活的WSN几乎不能影响NP特异性的CD8+T细胞的含量，而WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量明显增加。

图15显示了发明人制备的含UAG的突变型流感病毒可以抑制野生型流感病毒的复制和毒力。（A）基因组中含有4个UAG的突变型病毒抑制了野生型病毒的噬斑形成。Wildtype为野生型病毒；CAIV是冷适应减毒流感疫苗。（B）含有UAG的突变型病毒抑制了野生型病毒的噬斑形成，抑制活性随着UAG数量的增加而增强。（C）在动物水平上，含有UAG的突变型病毒降低了野生型病毒感染造成的动物死亡率。（D）在动物水平上，含有UAG的突变型病毒降低了野生型病毒感染造成的动物体重丢失。（E）在动物水平上，含有UAG的突变型病毒降低了野生型病毒感染造成的动物降低了动物肺组织中病毒的滴度。★, P < 0.05; ★★, P < 0.01; ★★★, P < 0.001。

为了更好地理解本发明，发明人用实施例对具体试验进行阐述和说明，其中所述实施例仅用于说明，并不限定本发明的保护范围。任何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。

实施例1：包含定点突变的流感病毒WSN的基因载体的构建

(1)辅助质粒的获得

从保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA / PylRS的（中国普通微生物菌种保藏管理中心，北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日为2011年6月14日，分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），其中含有质粒pACYC-tRNA / PylRS）中获取质粒pACYC-tRNA / PylRS（以下简称该质粒为辅助质粒），该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。

(2)拯救野生型流感病毒WSN的质粒的获得

根据pubmed公布的流感病毒A/WSN/1933的基因序列，经全基因合成，获得该流感病毒各个基因片段的基因。流感病毒各基因序列分别如SEQ ID NO: 2-9所示。然后将其分别连接在pHH21、pCDNA 3 （neo）、pcAAGGS/MCS载体上，获得拯救野生型流感病毒WSN的质粒。获得的质粒的命名及构成如表1所示。

简称	质粒名称	关键基因	酶切位点	构建好的质粒结构	关键基因对应的序列号
						Ben1	pHH21	PB2	BsmBI	pPolI-WSN-PB2	SEQ ID NO: 2
Ben2	pHH21	PB1	BsmBI	pPolI-WSN-PB1	SEQ ID NO: 3
						Ben3	pHH21	PA	BsmBI	pPolI-WSN-PA	SEQ ID NO: 4
Ben4	pHH21	HA	BsmBI	pPolI-WSN-HA	SEQ ID NO: 5
						Ben5	pHH21	NP	BsmBI	pPolI-WSN-NP	SEQ ID NO: 6
Ben6	pHH21	NA	BsmBI	pPolI-WSN-NA	SEQ ID NO: 7
						Ben7	pHH21	M	BsmBI	pPolI-WSN-M	SEQ ID NO: 8
Ben8	pHH21	NS	BsmBI	pPolI-WSN-NS	SEQ ID NO: 9
						Ben9	pcDNA3（neo）	PB2	EcoRI	pcDNA3(neo)-PB2	SEQ ID NO: 2
Ben10	pcDNA3（neo）	PB1	EcoRI	pcDNA3(neo)-PB1	SEQ ID NO: 3
						Ben11	pcDNA3（neo）	PA	EcoRI	pcDNA3(neo)-PA	SEQ ID NO: 4
Ben13	pcAGGS/MCS	NP	EcoRI	pcAGGS/MCS-NP	SEQ ID NO: 6

(3)定点突变位点的选择

通过生物信息学工具Consurf对流感病毒各个蛋白的氨基酸的保守性进行分析，并根据已被解析的流感病毒蛋白的晶体结构（NP-PDB:2IQH； PA-PDB：4IUJ； PB1-PDB：3A1G、 2ZNL； PB2-PDB： 4ENF； NA-PDB： 3TI6； HA-PDB： 1RVT； M-PDB： 4PUS、 2RLF、3BKD； NS-PDB： 3L4Q）选择保守、相对保守、相对不保守、不保守的氨基酸位点进行突变。在每个蛋白上选择的突变位点分别如表2a)-表2i）所示。

表2a）NP蛋白上被选择的位点及保守性

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						NP-S1	K48	3	NP-S12	K90	8
NP-S2	L49	7	NP-S13	K113p	9
						NP-S3	D101	1	NP-S14	A123	8
NP-S4	G102	1	NP-S15	R150	8
						NP-S5	G126	6	NP-S16	T151	8
NP-S6	D127	1	NP-S17	M163	8
						NP-S7	D128	2	NP-S18	L166	8
NP-S8	Y148	7	NP-S19	G169	9
						NP-S9	S28	9	NP-S20	S170	9
NP-S10	M32	9	NP-S21	L172	8
						NP-S11	K87	8	NP-S22	R175	8

表2b）PB1蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						PB1-S1	K11	4	PB1-S12	I241	9
PB1-S2	A14	1	PB1-S13	A242	9
						PB1-S3	Q15	7	PB1-S14	I262	9
PB1-S4	R52	1	PB1-S15	Y30	7
						PB1-S5	T105	1	PB1-S16	R126	9
PB1-S6	D685	7	PB1-S17	M227	9
						PB1-S7	Y705	3	PB1-S18	K229	9
PB1-S8	K736	1	PB1-S19	D230	9
						PB1-S9	I18	9	PB1-S20	G65	9
PB1-S10	S31	9	PB1-S21	P651	9
						PB1-S11	A140	9	PB1-S22	S375	8

表2c）PA蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						PA-S1	R266	9	PA-S5	K281	7
PA-S2	L270	8	PA-S6	K289	6
						PA-S3	D272	4	PA-S7	K318	5
PA-S4	P274	8	PA-S8	K328	5

表2d）PB2蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						PB2-S1	Q13	7	PB2-S5	T35	8
PB2-S2	T23	7	PB2-S6	S320	3
						PB2-S3	T24	8	PB2-S7	D417	5
PB2-S4	K33	9	PB2-S8	A424	7

表2e）HA蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						HA-S1	F12	1	HA-S12	T35	9
HA-S2	T19	4	HA-S13	V43	9
						HA-S3	A26	8	HA-S14	F160	8
HA-S4	V33	9	HA-S15	G300	8
						HA-S5	K39	3	HA-S16	G317	9
HA-S6	N48	8	HA-S17	C319	9
						HA-S7	K57	2	HA-S18	P320	9
HA-S8	K60	1	HA-S19	L328	9
						HA-S9	D18	8	HA-S20	G333	9
HA-S10	C21	9	HA-S21	N336	9
						HA-S11	G23	8	HA-S22	P338	9

表2f）NA蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						NA-S1	N2	9	NA-S12	A186	9
NA-S2	P3	8	NA-S13	Y192	9
						NA-S3	N4	9	NA-S14	S202	9
NA-S4	Q5	8	NA-S15	I7	8
						NA-S5	K6	6	NA-S16	I8	8
NA-S6	V16	1	NA-S17	G11	8
						NA-S7	N28	7	NA-S18	C14	7
NA-S8	I29	5	NA-S19	C76	8
						NA-S9	L118	9	NA-S20	K86	9
NA-S10	L142	9	NA-S21	K244	5
						NA-S11	S144	9	NA-S22	K331	9

表2g）NS1蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						NS-S1	S8	9	NS-S12	K41	8
NS-S2	Q10	9	NS-S13	K110	9
						NS-S3	S83	9	NS-S14	K131	9
NS-S4	A86	1	NS-S15	M1	1
						NS-S5	H101	4	NS-S16	D2	8
NS-S6	F103	1	NS-S17	P3	6
						NS-S7	A122	9	NS-S18	N4	7
NS-S8	K126	7	NS-S19	V6	3
						NS-S9	T5	9	NS-S20	S7	7
NS-S10	F9	9	NS-S21	L43	9
						NS-S11	R37	9	NS-S22	A132	9

表2h）M1蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						M-S1	P16	7	M-S8	L74	1
M-S2	S17	9	M-S9	S13	9
						M-S3	G18	7	M-S10	V31	9
M-S4	K35	2	M-S11	S53	9
						M-S5	T37	1	M-S12	A96	9
M-S6	I51	9	M-S13	V97	9
						M-S7	R72	3	M-S14	I131	9

表2 i）M2蛋白上被选择的位点及保守性：

名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）	名称	氨基酸位点	保守性（分值范围1-9，数值越大，越保守）
						M2-S1	S22	9	M2-S5	W41	7
M2-S2	S23	9	M2-S6	K49	9
						M2-S3	D24	9	M2-S7	K56	9
M2-S4	H37	9	M2-S8	K60	9

（4）定点突变的引物设计以及突变载体构建

以Ben1 pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben3 pPolI-WSN-PA；Ben4 pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS作为模板质粒，利用定点突变试剂盒（QuikChange® Lightning Site-DirectedMutagenesis Kits，Catalog #210518），根据常规的引物设计原则设计引物，按说明书操作表2a）-表2i）中列出的氨基酸位点对应的编码核苷酸突变为琥珀终止密码子TAG，经测序验证突变成功。

一些蛋白上被选择位点的突变采用如表3所示的序列来进行。

表3

其他突变可以利用被突变位点上下游的核苷酸序列、根据常规知识设计的突变引物来引入。

（5）可稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL的建立。

构建了分别带有puromycin和hygromycin抗性的2个慢病毒过表达载体，两者分别携带氨酰tRNA合成酶和在第39位编码密码子处携带TAG突变的报告基因GFP，通过两轮病毒转导HEK-293T细胞和puromycin/hygromycin筛选，得到稳定细胞株pylRS/GFP^39TAG。之后，构建了携带12个拷贝数tRNA和zeomycin抗性的bjmu-zeo-12tRNA载体，质粒线性化转染细胞株pylRS/GFP^39TAG，后经非天然氨基酸（UAA）存在下zeomycin筛选，最后分离出GFP阳性细胞（UAA存在下细胞呈绿色，去除UAA细胞呈无色），从而得到了表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系HEK293-PYL（图11A）。

a. 载体的构建

从psd31载体出发，先通过BamHI/xbal酶切位点将sv40-puro^R基因分别替换成IRES-puro^R和IRES-hygro^R基因，这样就得到了2个不同抗性的病毒载体psd31-IRES-puro^R和psd31-IRES-hygro^R。其中，IRES为内部核糖体进入序列（internal ribosome entrysite），IRES序列常用于多顺反子基因表达。例如，在目的基因之后插入IRES序列，后面是选择标记基因，这样转录出来的mRNA就可以同时表达两种蛋白。利用IRES系统过表达目的基因有2个优势：1.目的基因与标记基因共用一个启动子，避免了假阳性的出现；2. IRES翻译效率低于传统翻译起始位点，使得目的基因表达量高于标记基因。所以，我们在IRES位点的前面通过BamHI酶切位点分别引入CMV-pylRS序列和CMV-GFP^39TAG序列，就得到了能同时过表达两个目的蛋白的双病毒体系psd31-CMV-pylRS -IRES-puro^R/psd31-CMV-GFP^39TAG- IRES-hygro^R。

发明人用质粒稳定转染的方法过表达tRNA。为了保证tRNA的表达量，发明人构建得到了载体bjmu-12t-zeo，其序列如SEQ ID NO: 1所示。（图11C）。

慢病毒的包装和转导

先包装psd31-CMV-pylRS-IRES-puro^R病毒，转导HEK293T细胞，puromycin筛选浓度为0.6ug/ml，得到稳定细胞系1号后，再加入psd31-CMV-GFP^39TAG-IRES-hygro^R病毒，hygromycin筛选浓度为200ug/ml，得到稳定细胞系2号。

质粒的稳定转染

发明人通过质粒稳定转染，进行了第三轮筛选，最后得到了稳定表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的特殊细胞系，步骤如下：

A. 将bjmu-12t-zeo载体酶切线性化后，转染表达pylRS和GFP^39TAG蛋白的稳定细胞系2号（10cm培养皿，每皿10ug质粒，转染时不能有抗生素的存在）。

B. 转染6小时后换液，加入非天然氨基酸。

C. 转染48小时后，观察绿色荧光，换液，加入400ug/ml的zeomycin。

D. 每3天换液，直到blank组全部死亡，转染组形成克隆。

E. 分离纯化GFP阳性克隆，继续用剂量减半的zeomycin扩大培养，得到12t-zeo稳定细胞系HEK293-PYL。

（6）定点突变后的流感病毒的拯救

按照Neumann， G.; et al. Proc Natl Acad Sci U S A1999， 96， 9345-50中公开的正常的拯救流感病毒方法，将拯救流感病毒所用的12个质粒共转染稳定细胞系，只是用定点突变的质粒替换这12个质粒中相应的质粒。对应于六孔板的每个孔，每种质粒加0.1ug。转染后，观察细胞的病变情况，筛选出可以拯救出病毒并且对非天然氨基酸具有依赖性的突变位点。筛选出的位点根据蛋白及突变的位点进行命名。示例说明，将Ben3pPolI-WSN-PA质粒上进行突变，突变成功后，将该质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben1pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben4 pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA 3 (neo)-PB2； Ben10pcDNA 3 (neo)-PB1；Ben11 pcDNA 3 (neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染（5）建立的稳定细胞系，从而拯救出在流感病毒PA基因片段的S1位点上引入密码子TAG的突变型流感病毒，命名为PA-S1，命名对应于表2a)-表2i）中示出的突变位点。

依照同样的方法，可获取其他位点引入密码子TAG的突变型流感病毒，并根据突变位点进行命名。

表4 突变型病毒的包装效率和逃逸频率：

发明人从上述突变位点中，选择了拯救流感病毒效率高且遗传稳定的位点PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3进行组合，即使用这四种质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben4pPolI-WSN-HA； Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA3 (neo)-PB2； Ben10 pcDNA 3 (neo)-PB1；Ben11 pcDNA 3 (neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染（5）建立的稳定细胞系，拯救出在PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3位点同时引入TAG的突变型流感病毒，命名为WSN-RNP-tag。

实施例2：定点突变的流感病毒的表达和纯化

本发明中构建的引入了密码子TAG的流感病毒拯救质粒在可以稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的哺乳动物稳定细胞系中进行转录和表达后，细胞利用这套蛋白质翻译系统使非天然氨基酸Lys-diazirine或者与Lys-diazirine结构近似的叠氮非天然氨基酸Lys-azido掺入到流感病毒的相应蛋白中，从而在流感病毒相应蛋白的被突变位点造成定点突变。

下面，发明人对Lys-diazirine和Lys-azido这两种非天然氨基酸的成功掺入和突变蛋白质的生产性能进行了检测。

（1）非天然氨基酸Lys-diazirine的合成和鉴定

非天然氨基酸Lys-diazirine 的化学合成反应式如下。

如上式所示，将原料1（5-羟基-2-戊酮）15 mL与液氨40mL在-40℃下搅拌反应5h，之后降温至-60℃，缓慢滴加NH₂OSO₃H的甲醇溶液，加毕升至室温，反应过夜。滤除沉淀，向上清液中加入三乙胺，冰浴条件下缓慢加入I₂，至反应液颜色变深，不再产生气泡为止。反应完全后蒸除溶剂，经乙醚萃取后干燥。蒸除乙醚，剩余液体减压蒸馏获得25.4g无色粘稠液体产物2。

将上述产物2用吡啶溶解，0℃搅拌下加入11 g TsCl，反应过夜。待反应完全后将反应液倒入浓盐酸与冰水的混合液中，乙醚萃取，醚层分别用1N盐酸和1N NaOH洗涤。有机相干燥柱分得到11.8g无色粘稠液体产物3。

将上述产物3用DMF溶解，加入NaN₃室温反应隔夜至反应完全，加入大量水，乙醚萃取。蒸除乙醚，剩余产物用THF:水(9:1)混溶，加入三苯基磷，室温反应。反应完后加1N HCl混匀，旋干THF，二氯甲烷把未反应的原料，PPh₃和O=PPh₃洗掉，液相加1N NaOH调pH到12，二氯甲烷萃取出4.0 g产物4。

将5.2 g原料5（Boc-Lys-OMe）与羰基二咪唑反应，制备出5.9 g化合物6。之后化合物6与上述产物4（4.0 g）偶联得到化合物7，最后经过两步脱保护，将Boc和甲酯脱除，得到目标4.5 g产物8，即Lys-diazirine。经谱学验证，结果为：

¹H NMR (400 MHz， D₂O): δ3.10 (1H， t， J = 6.3 Hz)， 2.96 (4H， m)， 1.25(10H， m)， 0.90 (3H， s);¹³C NMR (100 MHz， D₂O): 183.63， 160.66， 56.00， 39.80，39.30， 34.49， 30.84， 29.20， 26.75， 23.92， 22.43， 18.80; HREIMS m/z 308.16937[M+1]⁺ (calcd for C₁₂H₂₂N₅NaO₃， 308.16931)，证明所得到的Lys-diazirine结构正确。

（2）突变流感病毒的非天然氨基酸Lys-diazirine掺入拯救

将实施例1的步骤（6）定点突变后的流感病毒的拯救中获得的突变型流感病毒包装质粒共转染步骤(5)中的稳定细胞系，6小时后换成新的培养基，培养基中含有1%的FBS、2ug/ml的TPCK-trypsin、1mM的非天然氨基酸Lys-diazirine，并以无非天然氨基酸Lys-diazirine的培养基作为对照。此拯救实验采用的阳性对照为野生型流感病毒WSN，除了拯救病毒的质粒不同之外，其余条件均与突变型流感病毒的拯救条件相同。转染完成后，每天观察细胞的状态。被转染细胞在含非天然氨基酸培养基中培养时出现病变、而在不含非天然氨基酸的培养基中培养时不出现病变的流感病毒突变体被鉴定为阳性突变体。与之相比，被野生型流感病毒所感染的细胞在培养时，无论培养基中有没有非天然氨基酸，均会出现病变。

（3） Lys-diazirine突变流感病毒的纯化

1）.当步骤（2）拯救突变型流感病毒的稳定系细胞完全病变时，收集细胞上清，于5000g离心10min，取上清过0.45um的滤膜。

2）.使用蔗糖梯度梯度密度离心的方法纯化流感病毒。具体步骤如下：将1）中的病毒液用50ml离心管（高速专用）于10⁵g离心2h，沉淀用1mlPBS重悬。

3）.用NTE Buffer（100 mM NaCl，10 mM Tris-Cl， pH7.4， 1mM EDTA）溶解蔗糖，配成20%蔗糖溶液，过0.45 um滤膜。

4）.将步骤3）的蔗糖加入到50ml或者15ml离心管中，将2）中的PBS重悬液滴在蔗糖溶液上。11×10⁴g，离心2h。

5）.沉淀加约15ml NTE buffer，11×10⁴g，继续离心2h。

6）.将步骤5）中的沉淀用PBS重悬。

（4）突变流感病毒的Lys-azido掺入表达及纯化

非天然氨基酸Lys-azido 的化学合成反应式如下

如上式所述，将原料1（2-溴乙醇）2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液，加入NaN3 3.12g，60℃油浴加热回流反应20h。冷却至室温，旋蒸除去丙酮，无水乙醚萃取（30mL×8），无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂得2.62g无色液体产物2。

将2（500mg，5.74mmol）加入到三光气（1.70g，5.74mmol）的THF(10ml)溶液中。0℃搅拌反应8h，溶剂蒸干。剩余物在真空下干燥1h，得到无色油状产物3。

将3溶解在1.5ml的THF中并缓慢加入Boc-Lys-OH（1.7g，6.88mmol）的1M NaOH（20ml）/THF(5ml)的溶液中。0℃搅拌反应12h并逐渐升温到室温。重新将反应液冷却到0℃并用0℃的1M 的盐酸溶液将反应液pH值调整至2~3。反应液用EtOAc萃取（30mL×5），有机层用2×100ml的饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥有机层、过滤、旋蒸除去溶剂得到1.65g无色粘稠液体产物4不用进一步纯化。

将4溶于15mL CH2Cl2中，搅拌下缓慢滴加15mL TFA，室温下反应30min后蒸出溶剂，剩余液体产物用5mL甲醇溶解，加入100mL乙醚，析出大量白色固体沉淀，过滤干燥得到1.38g白色固体终产物5。 1H NMR (D2O): δ = 1.22-1.45 (m， 4 H)， 1.67-1.73 (m，2H)， 2.99 (m， 2 H)， 3.38 (m， 2 H)， 3.70 (m， 1 H)， 4.09 (m， 2 H). 13C NMR(D2O): δ = 21.4， 28.4， 29.6， 39.5， 53.4， 56.2， 57.8， 116.0 (TFA)， 153.1，162.3 (TFA)， 172.9. HRMS: m/z calcd for C9H17N5O4 [M ]+: 259.1281; found:259.1283，证明得到的Lys-azido结构正确。

除了用Lys-azido替换Lys-diazirine外，其它条件与前述步骤2－3相同，观察引入突变的流感病毒是否引起细胞病变，即可确认突变是否成功，从而得到在相应突变位点引入UAG的突变型流感病毒。

部分的突变型流感病毒的拯救情况作为示例，可见图2。所述结果表明，在流感病毒的8个蛋白质的编码基因片段上均可引入密码子UAG，并且可以拯救出突变型流感病毒。其中，PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3这四个位点拯救突变型流感病毒的效率高，且具有遗传稳定性，是较为理想的突变位点。将这四个位点进行组合，即使用这四种质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben4 pPolI-WSN-HA； Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA 3 (neo)-PB2； Ben10 pcDNA 3 (neo)-PB1；Ben11 pcDNA 3 (neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染（5）建立的稳定细胞系，拯救出在PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3位点同时引入密码子UAG的突变型流感病毒，命名为WSN-RNP-tag（PTC-4A）。突变型流感病毒WSN-RNP-tag的拯救效率很高，且产率高，而且具有很高的遗传稳定性。是发明人制备出来的最终突变产物。

5. 突变型流感病毒WSN-RNP-tag拯救效率的考察

发明人比较了使用普通哺乳动物细胞293T和稳定表达tRNA（tRNA^Pyl）与吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL拯救突变型流感病毒WSN-RNP-tag的效率。

考察实验分为三组：第一组，使用稳定细胞系HEK293-PYL，同时转染1.2ug可表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的质粒和1.2ug拯救突变型流感病毒的质粒；第二组，使用稳定细胞系，只转染2.4ug拯救突变型流感病毒的质粒；第三组，使用普通293T细胞，同时转染1.2ug可表达tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的质粒和1.2ug拯救突变型流感病毒的质粒。结果如图10所示，使用稳定细胞系HEK293-PYL拯救流感病毒的效率远远高于使用普通293T细胞。（图10中NAEK存在情况的说明）

此外，发明人还考察了制备出的突变型流感病毒WSN-RNP-tag的产量。通过测定相同条件下制备的野生型和突变型病毒的M基因节段的mRNA水平，说明制备出的突变型流感病毒的产量与野生型基本一致（图5）。另外通过测定野生型和突变型WSN-RNP-TAG的病毒的抗原红细胞凝集效价，说明突变型流感病毒和野生型病毒的抗原红细胞凝集效价是基本一致的（图6），进一步说明，制备出的突变型流感病毒的产量很高。具体的实验操作可参考qRT-PCR的实验步骤和病毒的抗原红细胞凝集效价测定实验方法。

实施例3. 突变型流感病毒WSN-RNP-tag在细胞水平的安全性考察

发明人通过对制备出的突变型流感病毒WSN-RNP-tag进行长期的传代培养，来考察该突变型病毒在突变位点处的UAG密码子的稳定性。具体实验如下：将新制备出的突变型流感病毒WSN-RNP-tag按照MOI=0.01接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，培养基中含有1%FBS、2ug/ml的TPCK-trypsin、1mM 非天然氨基酸NAEK，并用无非天然氨基酸NAEK的培养基作为对照。待含有1mM NAEK培养基中的细胞完全病变后，取出上清，过0.45 um的滤膜，再按照1/1000的比例接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，同样以无非天然氨基酸NAEK的培养基作为对照。如此重复，进行长期的病毒传代。

由图4可知，经过长期传代，突变型WSN-RNP-tag一直维持着对非天然氨基酸的依赖性，即只能在含有非天然氨基酸的培养基中才能大量复制，使细胞发生病变。这说明在流感病毒基因中引入的UAG密码子是一直稳定存在的，进而说明所选择的位点在遗传上是稳定的。

实施例4. 突变型流感病毒WSN-RNP-tag在动物水平的安全性和有效性考察

实验流程可参考图7，具体实施方案如下：

1）将80只小鼠分成8组，每组10只。

2）饲养一天，让小鼠适应环境。

3）第二天，称量小鼠的体重，并从每组小鼠中选择5只，取它们的血清（采血体积在20-40ul即可，防止小鼠失血死亡。采集的血清在-80℃冷冻保存）。

4）饲养两天后（让被采血的动物回复正常状态），根据组别和病毒液的管号，接种下面相应的病毒液。

接种病毒的方法：麻醉，以滴鼻的方式向小鼠的鼻腔内接种50ul病毒液。半数致死剂量LD50是10000个病毒颗粒/50ul。一倍致死剂量是10*LD50，即相当于10⁵个病毒颗粒/50ul。10倍致死剂量是100*LD50，即相当于10⁶个病毒颗粒/50ul。

第一组接种1号管的病毒液（成分：PBS）；

第二组接种2号管的病毒液（成分：1倍致死剂量的WSN-wild type）；

第三组接种3号管的病毒液（成分：1倍致死剂量的WSN-RNP-tag）；

第四组接种4号管的病毒液（成分：5倍致死剂量的WSN-RNP-tag）；

第五组接种5号管的病毒液（成分：10倍致死剂量的WSN-RNP-tag）；

第六组接种6号管的病毒液（成分：1倍致死剂量的灭活WSN）；

第七组接种7号管的病毒液（成分：5倍致死剂量的灭活WSN）；

第八组接种8号管的病毒液（成分：10倍致死剂量的灭活WSN）；

每组之间防止交叉感染。

5）接种以后的每一天，称量并记录小鼠的体重，并记录小鼠的死亡情况。

6）分别在接种病毒液后的第14天和第21天，再次取那5只小鼠的血清（采血体积在20-40ul即可，采集的血清在-80℃冷冻保存）。

7）在接种病毒液后的第21天，每只小鼠鼻腔内感染新的50ul病毒液，感染剂量为100LD₅₀。

然后继续观察2-3周内，称量并记录小鼠的体重，并记录小鼠的死亡情况。此外，在感染病毒液后的第三天，从每组小鼠中取3只小鼠，取它们的肺组织，研磨匀浆后，收集上清（可置于-80℃冷冻保存）。剩下的小鼠继续观察。

由图8可知，当接种野生型流感病毒时，所有的小鼠体重均明显下降，并在接种后第10天全部死亡。当接种突变型WSN-RNP-TAG或者灭活的流感病毒WSN-positive control时，所有的小鼠体重均没有明显下降，且观察期间所有的小鼠均存活。说明，突变型WSN-RNP-TAG在动物水平具有很好的安全性。

由图9A可知，按照图7的实验方案，取各组小鼠肺组织，通过qRT-PCR的方式检测肺组织中病毒的相对含量。结果说明，当用灭火病毒或者突变型WSN-RNP-TAG对小鼠免疫后，小鼠肺组织中的病毒含量下降，并呈现免疫剂量依赖性。此外，突变型WSN-RNP-TAG的免疫效果优于灭活病毒的免疫效果。

由图9B可知，通过Elisa实验检测免疫前后的各组小鼠体内抗HA抗体的含量。结果说明免疫后14天和免疫后21天小鼠体内的抗体含量均增加，且21天的抗体含量高于14天时的抗体含量。

由图9C可知，按照图7的实验方案，对各组小鼠分别进行免疫之后，用100×LD50的WSN进行攻毒。并进行了小鼠体重和死亡率的考察，发现制备的突变型病毒WSN-RNP-tag可以很好地保护动物不受病毒的感染。并且，1倍剂量的突变型WSN-RNP-tag对小鼠的保护效果甚至和10倍剂量的灭活WSN的保护效果相当。这充分显示了发明人制备的减毒流感疫苗相对于灭活疫苗具有更好的免疫原性优势。

实施例5 接种流感病毒疫苗后的小鼠体内抗NA和NP蛋白的抗体含量测定

按照与实施例4接种病毒方法完全一致的方法，用WSN-RNP-tag和灭活的WSN接种小鼠。

使用Elisa方法检测小鼠体内抗NA和NP蛋白的抗体含量。具体来说，将蛋白NA或NP用包被液稀释，30ng/100ul。Elisa专用96孔板用上述稀释液于4℃包被过夜。用Elisa洗涤液洗涤后，用含3%BSA的洗涤液于37℃阻断1h，然后将小鼠血清用0.5%BSA的洗涤液稀释后加入相应的空中，37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。然后加入HRP标记的goat anti-mouse IgG，于37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。用TMB显色液显色5-10min，并用Elisa终止液终止反应。于450nm测OD值。

结果如图12所示，WSN-RNP-tag可以诱导小鼠产生NA特异性抗体，其抗体产生水平高于灭活疫苗，说明发明人所制备的疫苗具有更好的免疫原性。更为重要的是，发明人发明的WSN-RNP-tag还可以诱导小鼠产生针对流感病毒内部蛋白NP的抗体，这有利于为小鼠提供交叉免疫保护。

实施例6 WSN-RNP-tag对小鼠肺内病毒特异性抗体IgA的诱导作用

具体实施方案如下：

1）将15只小鼠分成3组，每组5只。

2）饲养一天，让小鼠适应环境。

3）第二天，根据组别和病毒液的管号，接种下面相应的病毒液。

接种病毒的方法：麻醉，以滴鼻的方式向小鼠的鼻腔内接种50ul病毒液。与实施例4中定义相同，半数致死剂量LD50是10000个病毒颗粒/50ul。一倍致死剂量是10*LD50，10倍致死剂量是100*LD50。

第一组接种1号管的病毒液（成分：PBS）；

第二组接种2号管的病毒液（成分：10倍致死剂量的WSN-RNP-tag）；

第三组接种3号管的病毒液（成分：10倍致死剂量的灭活WSN）；

每组之间防止交叉感染。

4）分别在接种病毒液后第21天，取每组小鼠的肺组织，用PBS洗涤，收集洗涤液。收集的洗涤液可在-80℃冷冻保存。

使用Elisa的方法检测IgA的产生情况。具体来说，将纯化的WSN病毒用包被液稀释，0.5ug/100ul。Elisa专用96孔板用上述稀释液于4℃包被过夜。用Elisa洗涤液洗涤后，用含3%BSA的洗涤液于37℃阻断1h，然后将小鼠血清用0.5%BSA的洗涤液稀释后加入相应的空中，37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。然后加入HRP标记的goat anti-mouse IgA，于37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。用TMB显色液显色5-10min，并用Elisa终止液终止反应。于450nm测OD值。

结果如图13所示，说明，相对于灭活的WSN，WSN-RNP-tag可以诱导高水平的IgA，这有利于为小鼠提供交叉免疫保护。

实施例7 WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量变化

试验方法：小鼠免疫三周后，取小鼠肺组织，分离其中的T淋巴细胞。将T淋巴细胞用anti-mouse CD8a-APC抗体和流感NP366-374-tetramer-PE染色。通过细胞流式实验测流感特异性CD8+ T细胞的数量（比例），具体操作可参考文献Budimir， N. et al.Heterosubtypic cross-protection induced by whole inactivated influenza virusvaccine in mice: influence of the route of vaccine administration. InfluenzaOther Respir Viruses 7， 1202-1209 (2013)。

结果如图14所示，说明，灭活的WSN几乎不能影响NP特异性的CD8+T细胞的含量，而WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量明显增加，这有利于为小鼠提供交叉免疫保护。

实施例8 发明人制备的含有UAG密码子的病毒疫苗对野生型病毒的抑制作用考察。

首先在细胞水平考察了含有UAG密码子的病毒对野生型病毒复制的影响。具体实施方案如下：

1.用MDCK细胞铺6孔板，每孔5×10⁵个细胞。

2.24小时后，用野生病毒（MOI=0.01）或者野生型病毒与突变病毒（MOI=0.1或者1）的混合液共同感染细胞。

3.24小时后，取200 µl细胞上清，并且每间隔12小时取一次，连续至72小时。

4.测定上清中野生型病毒的滴度。

结果如图15A和B所示，突变型病毒降低了野生型病毒的子代病毒的滴度，且升高突变型病毒的滴度或者增加突变型病毒基因组中UAG密码子的数量会增强突变型病毒对野生型病毒复制的抑制作用。

然后，在动物水平考察了含有UAG密码子的病毒对野生型病毒复制的影响。具体实施方案如下：

1.每组15只Balb/C小鼠。用野生型病毒（2×10⁴PFU）或者野生型病毒与突变病毒（2×10⁶PFU）的混合液通过鼻腔接种的方式感染Balb/C小鼠；或者先用野生病毒（2×10⁴PFU）感染小鼠，24小时后再用突变病毒（2×10⁶PFU）感染小鼠。

2.3天后，每组随机取出5只小鼠处死，取出肺组织，测定肺组织中野生型病毒的滴度。

3.剩下的10只小鼠被观察存活率和体重，持续两周。

结果如图15C，D和E所示。当单独接种野生型病毒时，所有的小鼠体重下降，并最终死亡；当同时接种野生型病毒和突变型病毒的混合液时，小鼠体重下降不明显，最终小鼠的存活率为90%，同时肺组织中的病毒明显降低；当接种野生型病毒24小时后再接种突变型病毒，小鼠体重有所下降，小鼠的存活率为40%。这说明突变型病毒可以抑制野生型病毒在小鼠体内的复制，从而为小鼠提供保护。这些结果也说明，本专利提供的技术可以制备具有治疗作用的疫苗。

以上所述制备流感病毒减毒活疫苗的方法，也可以适用于其他任何种类的病毒，优选地，手足口病毒、柯萨奇病毒、丙肝病毒HCV、乙肝病毒HBV、甲肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒HPV、单纯疱疹病毒HSV、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、水泡性口炎病毒、呼吸道合胞病毒RSV、登革病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒Zika、SARS、中东呼吸综合征病毒、轮状病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、腺病毒、艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、汉坦病毒、新型肠道病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、蓝耳病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、细小病毒。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 突变的病毒、其制备方法和应用

<130> 2

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga acgctgacgt catcaacccg 2280

ctccaaggaa tcgcgggccc agtgtcacta ggcgggaaca cccagcgcgc gtgcgccctg 2340

gcaggaagat ggctgtgagg gacaggggag tggcgccctg caatatttgc atgtcgctat 2400

gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc ttataagttc 2460

tgtatgagac cacagatccc cggaaacctg atcatgtaga tcgaatggac tctaaatccg 2520

ttcagccggg ttagattccc ggggtttccg ccatttttct cgacgacgcc gccatctcta 2580

ggcccgcgcc ggccccctcg cacagacttg tgggagaagc tcggctactc ccctgccccg 2640

gttaatttgc atataatatt tcctagtaac tatagaggct taatgtgcga taaaagacag 2700

ataatctgtt ctttttaata ctagctacat tttacatgat aggcttggat ttctataaga 2760

gatacaaata ctaaattatt attttaaaaa acagcacaaa aggaaactca ccctaactgt 2820

aaagtaattg tgtgttttga gactataaat atcccttgga gaaaagcctt gtttggaaac 2880

ctgatcatgt agatcgaatg gactctaaat ccgttcagcc gggttagatt cccggggttt 2940

ccgccatttt tctcgacaag gtcgggcagg aagagggcct atttcccatg attccttcat 3000

atttgcatat acatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac 3060

aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt 3120

tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga 3180

tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc ggaaacctga tcatgtagat 3240

cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg gggtttccgc catttttctc 3300

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<400> 6

tcactcacag agtgacatcg aaatcatggc gaccaaaggc accaaacgat cttacgaaca 60

gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc agagcatctg tcggaaaaat 120

gattgatgga attggacgat tctacatcca aatgtgcacc gaacttaaac tcagtgatta 180

tgagggacgg ctgattcaga acagcttaac aatagagaga atggtgctct ctgcttttga 240

cgagaggagg aataaatatc tagaagaaca tcccagtgcg gggaaagatc ctaagaaaac 300

tggaggacct atatacagga gagtagatgg aaagtggagg agagaactca tcctttatga 360

caaagaagaa ataagacgaa tctggcgcca agctaataat ggtgacgatg caacggctgg 420

tctgactcac atgatgatct ggcactccaa tttgaatgat gcaacttacc agaggacaag 480

agctcttgtt cgcacaggaa tggatcccag gatgtgctca ctgatgcagg gttcaaccct 540

ccctaggagg tctggggccg caggtgctgc agtcaaagga gttggaacaa tggtgatgga 600

attgatcaga atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac ttctggaggg gtgagaatgg 660

acggagaaca aggattgctt atgaaagaat gtgcaacatt ctcaaaggga aatttcaaac 720

agctgcacaa agaacaatgg tggatcaagt gagagagagc cggaatccag gaaatgctga 780

gttcgaagat ctcatctttt tagcacggtc tgcactcata ttgagagggt cagttgctca 840

caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg atctgccgta gccagtggat acgactttga 900

aagagaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga ctgcttcaaa acagccaagt 960

atacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag agtcaactgg tgtggatggc 1020

atgccattct gctgcatttg aagatctaag agtatcaagc ttcatcagag ggacgaaagt 1080

ggtcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt gcttccaatg aaaacatgga 1140

gactatggaa tcaagtaccc ttgaactgag aagcagatac tgggccataa ggaccagaag 1200

tggagggaac accaatcaac agagggcttc ctcgggccaa atcagcatac aacctacgtt 1260

ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag accaaccatt atggcagcat tcactgggaa 1320

tacagagggg agaacatctg acatgagaac cgaaatcata aggctgatgg aaagtgcaag 1380

accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag ctctcggacg aaaaggcaac 1440

gagcccgatc gtgccctcct ttgacatgag taatgaagga tcttatttct tcggagacaa 1500

tgcagaggag tacgacaatt aaagaa 1526

<210> 7

<211> 1410

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 7

ggtcgacctc cgaagttggg gggagcgaaa gcaggagttt aaatgaatcc aaaccagaaa 60

ataataacca ttgggtcaat ctgtatggta gtcggaataa ttagcctaat attgcaaata 120

ggaaatataa tctcaatatg gattagccat tcaattcaaa ccggaaatca aaaccatact 180

ggaatatgca accaaggcag cattacctat aaagttgttg ctgggcagga ctcaacttca 240

gtgatattaa ccggcaattc atctctttgt cccatccgtg ggtgggctat acacagcaaa 300

gacaatggca taagaattgg ttccaaagga gacgtttttg tcataagaga gccttttatt 360

tcatgttctc acttggaatg caggaccttt tttctgactc aaggcgcctt actgaatgac 420

aagcattcaa gggggacctt taaggacaga agcccttata gggccttaat gagctgccct 480

gtcggtgaag ctccgtcccc gtacaattca aggtttgaat cggttgcttg gtcagcaagt 540

gcatgtcatg atggaatggg ctggctaaca atcggaattt ctggtccaga tgatggagca 600

gtggctgtat taaaatacaa cggcataata actgaaacca taaaaagttg gaggaagaat 660

atattgagaa cacaagagtc tgaatgtacc tgtgtaaatg gttcatgttt taccataatg 720

accgatggcc caagtgatgg gctggcctcg tacaaaattt tcaagatcga gaaggggaag 780

gttactaaat caatagagtt gaatgcacct aattctcact acgaggaatg ttcctgttac 840

cctgataccg gcaaagtgat gtgtgtgtgc agagacaatt ggcacggttc gaaccgacca 900

tgggtgtcct tcgaccaaaa cctagattat aaaataggat acatctgcag tggggttttc 960

ggtgacaacc cgcgtcccaa agatggaaca ggcagctgtg gcccagtgtc tgctgatgga 1020

gcaaacggag taaagggatt ttcatataag tatggtaatg gtgtttggat aggaaggact 1080

aaaagtgaca gttccagaca tgggtttgag atgatttggg atcctaatgg atggacagag 1140

actgatagta ggttctctat gagacaagat gttgtggcaa tgactgatcg gtcagggtac 1200

agcggaagtt tcgttcaaca tcctgagcta acagggctag actgtatgag gccttgcttc 1260

tgggttgaat taatcagggg gctacctgag gagaacgcaa tctggactag tgggagcatc 1320

atttcttttt gtggtgtgaa tagtgatact gtagattggt cttggccaga cggtgctgag 1380

ttgccgttca ccattgacaa gtagtttgtt 1410

<210> 8

<211> 900

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 8

agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60

ctctatcgtc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120

tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180

gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240

gggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgctcttaat gggaacgaag atccaaataa 300

catggacaaa gcagttaaac tgtgtaggaa gcttaagagg gagataacat tccatggggc 360

caaagaaata gcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420

caacaggata ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgcg caacctgtga 480

acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540

aatcagacat gagaacagaa tggttctagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600

ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggatatt gctagtcagg ccaggcaaat 660

ggtgcaggcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc taaaagatga 720

tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacgattcaa 780

gtgatcctct cgtcattgca gcaaatatca ttggaatctt gcacttgata ttgtggattc 840

ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttatc gtcgctttaa atacggtttg aaaagagggc 900

<210> 9

<211> 890

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 9

agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60

attgctttct ttggcatgtc cgcaaaagag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120

tccttgatcg gcttcgccga gatcagaagt ccctaagagg aagaggcagc actctcggtc 180

tggacatcga aacagccacc cgtgctggaa agcaaatagt ggagcggatt ctgaaggaag 240

aatctgatga ggcactcaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcatcgcgc tacctaactg 300

acatgactct tgaggaaatg tcaaggcact ggttcatgct catgcccaag cagaaagtgg 360

caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgga taagaacatc atactgaaag 420

cgaacttcag tgtgattttt gaccggctgg agactctaat attactaagg gccttcaccg 480

aagaggggac aattgttggc gaaatttcac cactgccctc tcttccagga catactgatg 540

aggatgtcaa aaatgcagtt ggggtcctca tcggaggact tgaatggaat aataacacag 600

ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggagac 660

ctccactcac tccaaaacag aaacggaaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa 720

gaaataagat ggttgattga agaagtgaga cacagactga agataacaga gaatagtttt 780

gagcaaataa catttatgca agccttacaa ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840

actttctcgt ttcagcttat ttaataataa aaaacaccct tgtttctact 890

Claims

1.一种突变的病毒，其特征在于所述病毒的至少一种蛋白的编码核酸在终止密码子上游的一个或多个密码子处包含一个或多个UAG密码子；所述病毒中，所述蛋白在所述UAG密码子对应处包含含有双吖丙啶或叠氮结构的非天然氨基酸；其中所述流感病毒是活的流感病毒；

其是A型流感病毒，所述蛋白选自PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M蛋白，其中

未经突变的PB2的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的PB1的氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的PA的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的HA的氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的NP的氨基酸序列与SEQ ID NO:6所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的NA的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的核酸编码的氨基酸序列相同，

未经突变的M的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的核酸编码的氨基酸序列相同，或

未经突变的NS的氨基酸序列与SEQ ID NO:9所示的核酸编码的氨基酸序列相同；

其中所述流感病毒在选自下面所列举的一个或多个基因位点对应蛋白处包含UAG密码子

a)NP蛋白上被选择的位点：

D101、G102、G126、D128、R150、M163、G169,

b)PB1蛋白上被选择的位点：

K11、R52、T105、K736、Y30、R126、M227、K229、D230、S375,

c)PA蛋白上被选择的位点：

R266、L270、D272、K289、K318、K328,

d)PB2蛋白上被选择的位点：

Q13、T24、K33、T35、S320,

e)HA蛋白上被选择的位点：

K57、G317、C319、G333、N336,

f)NA蛋白上被选择的位点：

N2、K6、V16、N28、I29、I7、I8、G11、C76、K244,

g)NS蛋白上被选择的位点：

S8、S83、A86、H101、F103、A122、K126、R37、K41、K110、K131、M1、

D2、N4、V6、S7、L43、A132,

h)M2蛋白上被选择的位点：

S23、D24、H37、W41、K49、K60。

2.权利要求1所述的突变的流感病毒，其中所述的位点为下面所列举的位点：

i)PTC-2:在PA蛋白R266,PB2蛋白K33对应基因位点同时引入UAG，

j)PTC-3:在PA蛋白R266，PB2蛋白K33，PB1蛋白R52对应基因位点同时引入UAG，

k)PTC-4A:在PA蛋白R266，PB2蛋白K33，PB1蛋白R52，NP蛋白D101对应基因位点同时引入UAG，

l)PTC-4B:在PA蛋白R266，PB2蛋白K33，PB1蛋白S375，NP蛋白M163对应基因位点同时引入UAG，

m)PTC-5:在PA蛋白R266，PB2蛋白K33，PB1蛋白R52，NP蛋白D101，NS蛋白K131对应基因位点同时引入UAG，

n)PTC-6:在PA蛋白R266，PB2蛋白K33，PB1蛋白R52，NP蛋白D101，NS蛋白K131，M2蛋白H37对应基因位点同时引入UAG，

o)PTC-7:在PA蛋白R266，PB2蛋白K33，PB1蛋白R52，NP蛋白D101，NS蛋白K131，M2蛋白H37,NA蛋白N28对应基因位点同时引入UAG，

p)PTC-8:在PA蛋白R266，PB2蛋白K33，PB1蛋白R52，NP蛋白D101，NS蛋白K131，M2蛋白H37,NA蛋白N28，HA蛋白K57对应基因位点同时引入UAG。

3.权利要求1所述的突变的流感病毒，其中选自PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M蛋白的至少两种、三种或四种蛋白的编码核酸在终止密码子上游的一个或多个密码子处包含一个或多个UAG密码子。

4.权利要求1所述的突变的流感病毒，其中所述PA、PB1、PB2和NP蛋白中两种、三种或四种蛋白的编码核酸在终止密码子上游的一个或多个密码子处包含一个或多个UAG密码子。

5.权利要求1所述的突变的病毒，其特征在于，所述非天然氨基酸选自：

所示的Lys-diazirine，或

所示的Lys-azido。

6.如权利要求5所述的突变的病毒，其中所述的非天然氨基酸是Lys-diazirine，其在病毒蛋白中的连接方式如下式所示：

其中，由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向

R₃为

7.如权利要求5所述的突变的病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于Lys-azido，其在病毒蛋白中的连接方式如下式所示：

其中，由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，

R₄为

8.如权利要求1所述的突变的病毒，在其中PA上的R266、PB1上的R52、PB2上的K33、NP上的D101处包含非天然氨基酸。

9.如权利要求1所述的病毒，其中所述病毒的蛋白质编码序列中的正常终止密码子如果是UAG的话，已被突变成UAA。

10.权利要求1所述的突变的病毒，其是人源的或其它动物源的流感病毒。

11.一种编码如权利要求1-10中任一项所述的突变的病毒的蛋白的核酸分子，其特征在于在天然终止密码子之外，还包含人为引入的密码子UAG。

12.制备权利要求1－10中任一项所述突变的病毒的方法，包括如下步骤：

(1)将包含所述一个或多个被突变基因与合适的载体可操作地连接的突变核酸表达载体和包含其它未被突变基因的一个或多个核酸表达载体转染稳定表达古甲烷球菌的tRNA和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的动物细胞系，或者与表达古甲烷球菌的tRNA和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的质粒共同转染动物细胞系其它未被突变基因的一个或多个核酸表达载体；

(2)将被转染的细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养；和

(3)回收所述突变病毒；

其中所述稳定表达tRNA和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的动物细胞系是以保藏号CGMCCNo：11592于2015年11月17日被保藏在CGMCC的HEK293-PYL。

13.权利要求12所述的方法，其中步骤(1)中所述质粒是保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中的质粒pACYC-tRNA/PylRS。

14.筛选减毒的权利要求1-10任一项所述的突变的流感病毒的方法，包括步骤：

(1)基因突变：通过基因工程方法将病毒基因组中一个或多个基因的一个或多个选定的密码子突变为TAG密码子，得到一个或多个被突变的基因；

(2)表达载体构建：将(1)得到的一个或多个被突变的基因与合适的载体可操作地连接，得到突变基因表达载体；

(3)将步骤(2)中得到的突变基因表达载体和包含其它未被突变基因的一个或多个基因表达载体转染稳定表达tRNA和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的动物细胞系，或者与表达tRNA和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的质粒共同转染动物细胞系；

(4)将被转染的细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养，收集培养基上清液，采用包含Lys-diazirine或者Lys-azido的培养板对上清液进行病毒克隆的非天然氨基酸依赖性的检测；和

(5)将维持了对Lys-diazirine或者Lys-azido非天然氨基酸依赖性的突变体鉴定为减毒的病毒；

15.权利要求14的方法，其在步骤(5)之后还包括：

(6)将(5)中定点突变成功的候选物的突变位点进行组合，再次包装病毒，使得包装出的病毒在多个基因片段上均引入了UAG，在对应的多个蛋白上均引入了非天然氨基酸，然后再次考察包装产物对非天然氨基酸的依赖性，保留经过长期传代仍旧维持着对非天然氨基酸依赖性的组合突变体设定为最优的定点突变成功候选物。

16.权利要求15的方法，其中在步骤(6)之后还进一步包括：

(7)对(6)中获得的突变型病毒进行安全性，鉴定出安全的病毒。

17.权利要求14所述的方法，其中步骤(3)中所述质粒是保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中的质粒pACYC-tRNA/PylRS。

18.含有权利要求1-10中任一项所述的突变的流感病毒的组合物。

19.含有权利要求1-10中任一项所述的突变的流感病毒的疫苗。

20.药物组合物，其中含有有效量的权利要求1-10中任一项所述的突变的流感病毒，以及药学上可以接受的赋形剂。

21.权利要求1-10中任一项所述的突变的流感病毒在制备减毒活疫苗或者制备预防或治疗A型流感病毒感染相关药物中的用途。

22.可稳定表达tRNA和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的哺乳动物稳定细胞系，其为HEK293-PYL，保藏日为2015年11月17日，其保藏号为CGMCC No：11592。