CN109295100A - 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶稳定细胞系的构建方法，该方法借助双慢病毒稳定转导、质粒稳定转染将正交的tRNA/氨酰tRNA合成酶基因稳定整合到细胞基因组。本发明进一步涉及所述方法所获得的稳定细胞系以及该稳定细胞系的应用，如表达含有非天然氨基酸目的蛋白的用途，从而可利用非天然氨基酸上特有的活性基团，可以实现高效，特异性的修饰蛋白的目的。

Description

携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶稳定细胞系的构建方 法。
背景技术
1)基因密码子扩展技术
近年来遗传密码扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子为有义编码子，通过引入相 应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白质中。根 据非天然氨基酸的性质,可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止，这一技术已经将上百种 非天然氨基酸成功地定点表达在蛋白质表面,涉及的非天然氨基酸包括含有叠氮、炔基、酮 基、醛基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多样性功能基团，可进行多种生物正交反应，如：点击化学、光敏感、糖基化、光交联等反应。
2)基因密码子扩展技术在蛋白质药物开发中的应用
现代生物技术的发展，使得蛋白质药物的大规模生产成为现实，这类药物应用于临床 的数量也越来越多。蛋白质药物是指多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、 重组疫苗。与以往的小分子药物相比,蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功 能明确、有利于临床应用的特点。但是，蛋白类药物也有其稳定性差、膜通透性差、生物半衰期短等缺点，影响了蛋白质药物的治疗潜力和临床应用。对天然蛋白结构进行改造或修饰是获取更好药代动力学性质的一种有效途径。各种修饰多从改变重组蛋白的性状入手，如增加相对分子质量、减缓蛋白酶降解、降低免疫原性、提高生物及化学稳定性等， 进而改善其体内药代动力学性质、延长体内半衰期或加速体内释放、降低中和抗体产生 率、提高患者适应性及治疗效果等。鉴于改构或修饰后蛋白质的众多优势，对蛋白质进行 重组改构以及体内外修饰也必将得到越来越为广泛的应用。第一代蛋白质修饰技术的缺陷 在于对偶联位点的不可控性，所以传统的修饰方法是非定点非定量的，并不适合大规模生 产制备的质量控制。而非天然氨基酸修饰技术位点可控的优点，在蛋白质修饰领域有广泛 应用前景。以抗体偶联药物为例，同传统修饰位点不可控的ADC(抗体药物偶联物)药物 相比，位点特异性ADC药物的特异性强、成份单一、毒性低，无疑是未来靶向药物的发展 方向(Tian Feng.et al.PNAS,2014,111:1766–1771.)。
3)基因密码子扩展技术工业应用的瓶颈
按照宿主细胞的类型，可将蛋白质表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳 动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质 的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。在工业上，要想实现蛋白质药物的高产量大规模化生产，就需要构建目的基因的高表达稳定细胞系。而将非天然氨基酸应用于蛋白质药物的开发上，一个亟待解决的问题就是如何构建稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的工程细胞。由于tRNA的转录和加工有异于蛋白质，因此如何实现正交tRNA的高效稳定表达依旧是个国际难题。实现稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶工程细胞的构建，将有效促进基因密码子扩展技术在蛋白质药物开发中的应用。
发明内容
发明人经过对现有技术的思考和研究，将古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)(其序列如SEQ ID NO:8所示)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)(其基因序列如SEQ ID NO:9 所示)的蛋白质翻译系统整合到哺乳动物细胞(例如CHO-K1细胞)基因组中。发明人利 用双慢病毒系统和携带多拷贝数正交tRNA质粒将正交的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶、带有琥 珀密码子突变的报告基因GFP以及正交的tRNA整合到宿主细胞中，从而得到了携带正交 tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系。该稳定细胞系利用定点突变的绿色荧光蛋白报告基 因作为指示，可视化的检测非天然氨基酸的插入。利用该稳定细胞系可以使非天然氨基酸 定点插入到目的蛋白序列中。
具体地，在本发明的一个具体的实施方案中，在宿主细胞CHO-K1细胞中整合了正交 tRNA/氨酰tRNA合成酶基因，主要通过六个步骤：(1)构建携带正交氨酰tRNA合成酶基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES-puro；(2)构建携带特定位点上具有琥珀密码子突 变绿色荧光蛋白报告基因的病毒载体2号pSD31-GFP39TAG-IRES-hygro；(3)构建携带有 12个拷贝数type-3 Pol III启动子启动的正交tRNA的载体pXH-12tRNA-blasticidin；(4)包 装步骤(1)中病毒1号和步骤(2)中病毒2号，对于CHO细胞，先转导病毒2号，利用 其携带的潮霉素抗性基因进行筛选，获得整合突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系； 再转导病毒1号，利用其上携带的嘌呤霉素抗性基因进行筛选，整合正交氨酰tRNA合成酶 基因。(5)将步骤(3)中载体pXH-12tRNA-blaticidin转染步骤(4)中的稳定细胞系，并 利用其上携带的杀稻瘟菌素抗性基因进行筛选；(6)在培养基中加入非天然氨基酸，利用 流式分选出表达有绿色荧光蛋白的细胞并扩大培养，最终得到稳定细胞系CHO。
该稳定细胞系能在报告基因上插入非天然氨基酸的原理在于：整合的突变型tRNAPyl/PylRS满足下列关系：(1)：突变型的tRNAPyl不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA 合成酶，只能被突变型的PylRS酰化；(2)：突变型的PylRS只能酰化tRNAPyl，不能酰 化其它tRNA，因此，突变型tRNAPyl和PylRS之间的关系是正交性的，即突变型的PylRS 只能酰化突变型tRNAPyl，同时突变型的tRNAPyl只能被突变型的PylRS酰化。这种正交性 的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸酰化到这种正交的tRNA上，并且只能酰化这种 tRNA，而不能酰化其它的tRNA。获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA系统，使非20种常 见氨基酸的Lys-azido(也可称为：NAEK)与琥珀密码子相对应，从而将非天然氨基酸定 点引入到报告蛋白GFP或其它目的蛋白上。突变型PylRS利用慢病毒 pSD31-pylRS-IRES-puro整合到稳定细胞系基因组中，其中，IRES为内部核糖体进入序列 (internal ribosome entry site)，常用于多顺反子基因表达(Pelletier J.et al.,Nature,1988,334： 320–325.)。例如，在目的基因之后插入IRES序列，后面是选择标记基因，这样转录出来 的mRNA就可以同时表达两种蛋白。利用IRES系统过表达目的基因有2个优势：1.目的基 因与标记基因共用一个启动子，避免了假阳性的出现；2.IRES翻译效率低于传统翻译起始 位点,使得目的基因表达量高于标记基因(Kozak M,et al.，Nucleic Acids Res,2005,33： 6593–6602.)。利用该双慢病毒系统，可以同时实现两个蛋白在宿主细胞中的稳定过表达。
在本发明的一个具体的实施方案中，构建了一套双慢病毒系统pSD31-IRES-puro和 pSD31-IRES-hygro，这两个病毒载体来源于病毒载体pSD31(Zhang Jing.et al.RNA,2007, 13:1375–1383.),将pSD31载体上的sv40启动子启动的puroR基因分别替换成IRES-puroR和IRES-hygroR基因，这样就得到了2个不同抗性的病毒载体pSD31-IRES-puro和pSD31-IRES-hygro。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明提供了一种在哺乳动物细胞中稳定整合正 交tRNA的方法，原理在于：将原核的tRNA用合适的真核启动子启动并进行串联表达以增 加整合概率。本发明选择了第三类RNA聚合酶III启动子(type-3 Pol III)，该类启动子转 录序列依靠的是启动子自身的启动元件，不需要任何内源性转录元件(例如A-和B-box)存在于下游的编码序列中。因此，可以在真核细胞中启动缺少内部启动元件A-和B-box的原核tRNA。本发明将12个拷贝数type-3 Pol III启动子启动的正交tRNA串联到穿梭载体pXH上，并在pXH载体上引入真核筛选杀稻瘟菌素抗性基因，得到了载体 pXH-12tRNA-blasticidn,将该载体转染细胞，并用杀稻瘟菌素筛选，分离鉴定单克隆，即可 得到稳定表达正交tRNA的细胞。
更为具体地，本发明提供了：
一种稳定细胞系的构建方法，包括如下步骤：
(1)在携带第一抗性基因的pSD31-IRES上连接吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因，获得携带第一抗性基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES；
(2)在携带第二抗性基因的pSD31-IRES上连接带有突变的绿色荧光蛋白基因，获得 携带第二抗性基因的病毒载体2号pSD31-GFP39TAG-IRES；
(3)构建携带第三抗性基因的具有12个拷贝数type-3 Pol III启动子启动的正交tRNA 的载体pXH-12tRNA；
(4)将(1)和(2)中所述的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES和病毒载体2号 pSD31-GFP39TAG-IRES，转导至宿主细胞，分别用第一抗性基因和第二抗性基因进行两轮 筛选，获得整合了吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因和突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细 胞系；
(5)将步骤(3)中所述的载体pXH-12tRNA转染到步骤(4)中所获得的稳定细胞 系，并利用其上携带的第三抗性基因进行第三轮筛选；
(6)在培养基中加入非天然氨基酸，流式分选筛选带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系。
在本发明的优选实施方案中，步骤(4)中所述宿主细胞为CHO-K1细胞。
在本发明的优选实施方案中，第一抗性基因是嘌呤霉素抗性基因，第二抗性基因是潮 霉素B抗性基因，和/或第三抗性基因是杀稻瘟菌素抗性基因；
步骤(1)中所述携带第一抗性基因的pSD31-IRES是如SEQ ID NO:2所示的pSD31-IRES-puro，所述携带第一抗性基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES是如SEQ ID NO:4 所示的病毒载体pSD31-pylRS-IRES-puro；
步骤(2)中所述携带第二抗性基因的pSD31-IRES是如SEQ ID NO:3所示的 pSD31-IRES-hygro；所述携带第二抗性基因的病毒载体2号pSD31-GFP39TAG-IRES是如 SEQ ID NO:5所示的的病毒载体pSD31-GFP39TAG-IRES-hygro；和/或
步骤(3)中所述载体为如SEQ ID NO:6所示的载体pXH-12tRNA-blasticidin。
其中，双病毒载体pSD31-IRES-puro和pSD31-IRES–hygro，其组合使用可实现双蛋白的同时过表达，其原理利用了内部核糖体进入序列(IRES)，其中，pSD31-IRES-puro载 体携带嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，pSD31-IRES-hygro载体携带含有潮霉素B(hygromycin)抗性基因，用于进行真核筛选。
其中，携带正交氨酰tRNA合成酶基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES-puro，该载体包装病毒后转导细胞，利用嘌呤霉素筛选，可以将正交氨酰tRNA合成酶整合到宿主 细胞中；携带Tyr39位突变为琥珀密码子的绿色荧光蛋白报告基因的病毒载体2号 pSD31-GFP39TAG-IRES-hygro，该载体包装病毒后转导细胞，利用潮霉素B筛选，可以将报 告基因整合到宿主细胞中；携带有12个拷贝数type-3 Pol III启动子启动的正交tRNA的载 体pXH-12tRNA-blasticidin，该载体可转染细胞，利用杀稻瘟菌素筛选，可以将正交tRNA 整合到宿主细胞中。
在本发明的优选实施方案中，步骤(4)为：首先转导病毒载体2号，利用其携带的潮霉素B抗性基因进行筛选，获得整合突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系；再转导病毒载体1号，利用其携带的嘌呤霉素抗性基因进行筛选，获得了同时整合了突变型绿色荧光蛋白报告基因和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因的稳定细胞系。
在本发明的优选实施方案中，潮霉素B的筛选浓度为300ug/ml，杀稻瘟菌素的筛选浓度为15ug/ml，和/或嘌呤霉素的筛选浓度为12ug/ml。
在本发明的优选实施方案中，所述非天然氨基酸为含有叠氮基团的非天然氨基酸Lys-azido(NAEK)
或者含有光交联基团的非天然氨基酸Lys-diazirine(DiZPK)
本发明还提供了由上述方法获得的稳定细胞系，其是CHO-K1-WY，保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年6月 12日，保藏号为CGMCCNo：14285；其分类命名为中国仓鼠卵巢细胞株。该 细胞系由2轮病毒转导和1轮质粒稳定转染获得，携带有正交tRNA/氨酰tRNA 合成酶基因，利用该稳定细胞系，可以在目的蛋白质任意位点引入非天然氨基 酸，从而创造可以仅对该位点进行特异性修饰的原料蛋白。
本发明还提供了所述的稳定细胞系在制备含有非天然氨基酸的蛋白或肽中的应用。
本发明还提供了由所述稳定细胞系所获得的至少一个位点上的氨基酸被突变为非天 然氨基酸的蛋白或肽。其中，在本发明的一个具体实施方案中，所述定点突变的蛋白为萤 火虫荧光素酶报告基因luciferase，其第F14位上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非 天然氨基酸为含有叠氮基团的非天然氨基酸Lys-azido(NAEK),后说明均以此非天然氨基 酸为例。
本系统也适用于含有光交联基团的非天然氨基酸DiZPK
本发明还提供了药物组合物，其中含有有效量的上述蛋白或肽，特别是用于抗病毒， 治疗多种恶性肿瘤、免疫调节。
由于不用的细胞对抗生素的敏感度不同，因而可根据不同细胞的抗生素抗性而相应地将双慢病毒载体和质粒载体的第一、第二、第三抗性基因改变。
本发明优选以CHO-K1细胞作为出发细胞构建细胞系，即将步骤(1)(2)和(3)获 得的病毒载体1号、病毒载体2号和携带多拷贝数正交tRNA质粒转导到CHO-K1细胞， 得到携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系CHO-K1-WY。
但相似的方法也可用于其他常用的哺乳动物细胞，例如Vero和Hela等。将上述三个载 体通过共表达实现协同作用效果的同类细胞系均在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果如下：
相比于其它方法，本发明的优点可体现在如下中的一个或几个：
1)构建了一套双慢病毒系统，可以同时实现双蛋白的稳定表达；
2)构建了一个携带高拷贝数正交tRNA的质粒，可以实现正交tRNA的稳定表达；
3)获得了携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系；
4)利用该稳定细胞系，可以在目的蛋白质任意位点引入非天然氨基酸，从而创造可以 仅对该位点进行特异性修饰的蛋白；
5)利用非天然氨基酸上特有的活性基团，可以实现高效，特异性的修饰目的。
附图说明
图1示出了双慢病毒载体的构建；其中，A为慢病毒载体pSD31结构示意图；B为双慢病毒载体pSD31-IRES-puro和pSD31-IRES-hygro结构示意图；C为双病毒载体 pSD31-pylRS-IRES-puro和pSD31-GFP39TAG-IRES-hygro；D为双病毒载体 pSD31-pylRS-IRES-blasticidin。
图2：pXH-12tRNA-zeo载体的构建；其中，A：pXH空白载体示意图；B：pXH-12tRNA-zeo 载体示意图；C：pXH-12tRNA-puro载体示意图；D：pXH-12tRNA-blastcidin载体示意图。
图3：筛选稳定细胞系的流程。
图4：稳定细胞系的鉴定；其中，A：稳定细胞系培养中加入的非天然氨基酸Lys-azido (NAEK)结构示意图；B：稳定细胞系加/减非天然氨基酸后的绿色荧光蛋白成像，只有加 入非天然氨基酸后，才能使带有琥珀终止密码子突变的GFP基因通读；C：Western Blot检 测稳定细胞系加/减非天然氨基酸后正交氨酰tRNA合成酶和绿色荧光蛋白的表达，只有加 入非天然氨基酸后，才能检测到全长的绿色荧光蛋白，与图4B结果相符合；D：稳定细胞系对于携带有终止密码子TAG的双报告基因Renilla-TAG-firefly的通读效率，加入NAEK，通读效率在20％左右，而不加入NEAK，通读效率在2％所有。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技 术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明 的保护范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明， 均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1双慢病毒载体的构建及获得
1.载体骨架的获得
双慢病毒载体骨架为慢病毒载体pSD31(Zhang Jing.et al.RNA,2007,13:1375–1383.), 其中，sv40启动子启动嘌呤霉素抗性基因蛋白puroR的表达。
2.SOE PCR的引物设计
发明人利用SOE PCR，将内部核糖体进入序列(IRES)和嘌呤霉素(puromycin)抗性基 因/潮霉素B(hygromycin)抗性基因的DNA片段进行拼接，分别得到IRES-puro和IRES-hygro 片段，具体引物如下表所示。
表1：SOE PCR引物列表
3.慢病毒载体的改造
在pSD31基础上，通过BamHI和xbal双酶切，将sv40启动子及puromycin抗性基因片段分别替换成IRES-puro和IRES-hygro片段，从而得到了分别带有嘌呤霉素抗性和潮霉素B抗性的双病毒载体。
4.pSD31-pylRS-IRES-puro和pSD31-GFP39TAG-IRES-hygro载体的获得
在pSD31-IRES-puro和pSD31-IRES-hygro的基础上利用BamH1单酶切引入 CMV-pylRS和CMV-GFP39TAG片段，从而获得pSD31-pylRS-IRES-puro，pSD31-GFP39TAG-IRES-hygro载体。
实施例2pXH-12tRNA-blasticidn载体的构建及获得
为了保证tRNA的表达量，需要将多拷贝串联表达的启动子-tRNA克隆到一个合适的载 体上。本发明以pXH空白载体为骨架，通过EcoRI酶切位点将zeomycin-polyA序列引入到SV40启动子后面，使其带有博莱霉素抗性。之后，再利用SalI酶切位点将12个拷贝的 启动子-tRNA序列克隆到pXH-zeo载体上，为了避免重复序列发生重组的概率，使用了4 种不同的tRNA启动子：7sk/hu6/H1/mu6。最后得到了筛选tRNA的载体bjmu-12t-zeo。
1.载体骨架的获得
pXH-12tRNA-zeo载体骨架为载体pXH,该载体是由PUC19载体改造获得的穿梭载体， 具有能在真核细胞中复制、分子量小、自带多克隆位点等优点。pXH序列如SEQ ID NO:7所示。
2.SOE PCR的引物设计
发明人利用SOE PCR，将启动子(type-3 Pol III)序列和正交tRNA的DNA片段进行拼 接，选用的启动子分别为人源7sk启动子，人源u6启动子，人源H1启动子，鼠源u6启动子，分别得到7sk-tRNA、hu6-tRNA、H1-tRNA和mu6-tRNA片段，启动子序列、tRNA序 列、具体引物如下表所示:
表2-1.启动子以及tRNA序列
表2-2.SOE-PCR基因扩增引物列表
(3)pXH载体的改造
在pXH载体基础上，通过EcoRI酶切位点将zeomycin-polyA序列引入到sv40启动子后面，使其带有博莱霉素抗性，得到pXH-zeo载体。之后，将载体用SalI单酶切，将启动 子及tRNA片段分别用SalI/xhol同尾酶双酶切，将12个拷贝的启动子-tRNA序列克隆到 pXH-zeo载体上，得到pXH-12tRNA-zeo载体。
(4)pXH-12tRNA-zeo载体抗性改造：
在pXH-12tRNA-zeo载体的基础上，通过EcoRI酶切位点将zeomycin抗性基因替换成puromycin或者blasticidin抗性基因，从而得到pXH-12tRNA-puro，pXH-12tRNA-blasticidn 两种载体。
实施例3稳定细胞系的筛选
(1)慢病毒的包装和转导,包括以下步骤：
a.HEK 293T细胞铺板：使用培养基A，成分(DMEM+10％FBS,1×NEAA,withoutsodium pyruvate)，细胞消化计数，六孔板每孔细胞接种数目为4×105细胞/每孔。
b.慢病毒包装：在细胞密度为70％～80％进行转染，质粒和转染试剂配比如表3-1。转 染后6小时，换成培养基B(DMEM+3％FBS,1×NEAA,With Sodium Pyruvate)。继续培养。 在转染后48小时，72小时收取病毒液，并用孔径为0.45μm的PVDF膜针头滤器过滤。
表3-1.慢病毒包装的质粒配比
质粒/转染试剂 每孔用量
Opti-MEM 200μl
Transfer vector 0.72μg
pRSV 0.64μg
VSVG 0.32μg
PRRE O.32μgl
Megatran 1.0 6ul
c.病毒转导：待病毒感染的细胞计数提前一天铺六孔板，每孔加入2ml病毒液,加入 Polybrene使得病毒液中Polybrene的浓度为8μg/ml。
d.病毒滴度测定：采用倍比稀释法，感染HT1080细胞形成克隆。
e.抗生素筛选：病毒转导24h后就可以进行抗生素筛选，筛选浓度要根据具体细胞的 杀伤曲线来决定，其中CHO-K1细胞的筛选浓度为潮霉素B筛选浓度为300ug/ml，嘌呤霉素筛选浓度为12ug/ml，对博来霉素不敏感；抗生素筛选10天，直至不加病毒液的空白组 全部死亡，加入病毒液的实验组形成单克隆，将单克隆扩大培养得到稳定细胞系。
(2)pXH-12tRNA-blastcidin载体的稳定转染，包括以下步骤：
a.将pXH-12t-blasticidin载体转染(1)中筛选得到的稳定细胞系。
b.转染24小时后换液，加入非天然氨基酸NAEK。
c.转染72小时后，观察绿色荧光，换液，加入15ug/ml的balstcicidn。
d.每3天换液，直到blank组全部死亡，转染组形成克隆。
e.流式分离纯化GFP阳性克隆，继续用相同剂量的三种抗生素扩大培养，得到稳定细 胞系CHO-K1-WY。
稳定细胞系CHO-K1-WY，可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏日期为2017年6月12日，保藏号为CGMCC No：14285的细胞系获得。
实施例4稳定细胞系的鉴定
本发明中构建的稳定细胞系CHO-K1-WY中含有源自古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(pylRS)，在表达细胞中，以琥珀终止密码子(TAG)为有义 编码子，能够使非天然氨基酸NAEK掺入到蛋白中。下面，发明人对NAEK的掺入可能性 和突变蛋白质的生产性能进行了检测。
1.非天然氨基酸NAEK的合成和鉴定
非天然氨基酸Lys-azido的化学合成反应式如下
如上式所述，将原料1(2-溴乙醇)2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液， 加入NaN3 3.12g，60℃油浴加热回流反应20h。冷却至室温，旋蒸除去丙酮，无水乙醚萃取(30mL×8)，无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂得2.62g无色液体产物2。
将产物2(500mg，5.74mmol)加入到三光气(1.70g，5.74mmol)的THF(10ml)溶液中。0℃搅拌反应8h，溶剂蒸干。剩余物在真空下干燥1h，得到无色油状产物3。
将3溶解在1.5ml的THF中并缓慢加入Boc-Lys-OH(1.7g，6.88mmol)的1M NaOH(20ml)/THF(5ml)的溶液中。0℃搅拌反应12h并逐渐升温到室温。重新将反应液冷却到0℃并用0℃的1M的盐酸溶液将反应液pH值调整至2～3。反应液用EtOAc萃取(30mL×5)， 有机层用2×100ml的饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥有机层、过滤、旋蒸除去溶剂得到 1.65g无色粘稠液体产物4不用进一步纯化。
将4溶于15mL CH2Cl2中，搅拌下缓慢滴加15mL TFA，室温下反应30min后蒸出溶剂，剩余液体产物用5mL甲醇溶解，加入100mL乙醚，析出大量白色固体沉淀，过滤干燥 得到1.38g白色固体终产物5。1H NMR(D2O):δ＝1.22-1.45(m,4H),1.67-1.73(m,2H),2.99 (m,2H),3.38(m,2H),3.70(m,1H),4.09(m,2H).13C NMR(D2O):δ＝21.4,28.4,29.6,39.5,53.4,56.2,57.8,116.0(TFA),153.1,162.3(TFA),172.9.HRMS:m/z calcd for C9H17N5O4[M]+:259.1281；found:259.1283，证明得到的Lys-azido结构正确。
2：突变荧光素酶的NAEK掺入表达
以萤火虫荧光素酶的突变型(luciferase-Phe-14TAG)为例：将携带突变型萤火虫荧光 素酶的核酸载体转染实施例3的稳定细胞系CHO-K1-WY，同时加入NAEK至终浓度1mM，37℃，5％CO2表达48小时后裂解细胞；
向细胞裂解液加入荧光素酶底物，检测荧光读值。结果如图4D所示。加入非天然氨基 酸后，可以得到全长有活性的突变型萤火虫荧光素酶蛋白。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下， 本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1653
<212> DNA
<213> 萤火虫Photinus pyralis
<400> 1
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct ggaagatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtggac atcacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt 360
tcgcagccta ccgtggtgtt cgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaagctcc caatcatcca aaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtgccag agtccttcga tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga 600
tctactggtc tgcctaaagg tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac 840
aagattcaaa gtgcgctgct ggtgccaacc ctattctcct tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960
aaggaagtcg gggaagcggt tgccaagagg ttccatctgc caggtatcag gcaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcaaag aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cctgaagtct 1320
ctgattaagt acaaaggcta tcaggtggct cccgctgaat tggaatccat cttgctccaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taa 1653
<210> 2
<211> 7678
<212> DNA
<213> pSD31-IRES-puro
<400> 2
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360
attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660
gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720
ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780
aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840
ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900
gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960
agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020
tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080
gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140
aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200
ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260
tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaatttaaa 1320
agaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1380
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1440
acagggacag cagagatcca gtttggggat ccaattccgc ccctctccct cccccccccc 1500
taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt 1560
ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt 1620
gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt 1680
cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct 1740
ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt 1800
ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt 1860
ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa 1920
ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta 1980
gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa 2040
aacacgatga taagcttgcc acaacccaca aggagacgac cttccatgac cgagtacaag 2100
cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac cctcgccgcc 2160
gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca catcgagcgg 2220
gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg 2280
gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg 2340
gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg 2400
cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg 2460
gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc 2520
cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc 2580
cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc 2640
gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgatctag aggatcataa 2700
tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 2760
tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 2820
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 2880
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcgggctgc 2940
aggaattcga tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 3000
tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 3060
ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 3120
ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca 3180
ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt 3240
ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg 3300
cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga 3360
aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt 3420
ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc 3480
cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt 3540
gggccgcctc cccgcatcga taccgtcgac tagccgtacc tttaagacca atgacttaca 3600
aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 3660
actcccaaag aagacaagat ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 3720
tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 3780
tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat 3840
ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag aattcgatat caagcttatc 3900
gataccgtcg acctcgaggg ggggcccggt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta 3960
cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 4020
aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 4080
gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggaaattgta agcgttaata 4140
ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4200
aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 4260
cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 4320
ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 4380
cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 4440
ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 4500
gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 4560
cgccgctaca gggcgcgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 4620
gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 4680
tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 4740
ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 4800
taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 4860
gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 4920
aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 4980
gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 5040
ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 5100
ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 5160
acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 5220
taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 5280
tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 5340
cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 5400
ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 5460
gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 5520
gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 5580
aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 5640
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 5700
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 5760
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 5820
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 5880
atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 5940
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 6000
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 6060
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 6120
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 6180
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 6240
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 6300
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccgcaac cggccttttt acggttcctg 6360
gccttttgct ggccttttgc tcacatgtct ttcctgcgtt acccctgatt ctgtggataa 6420
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ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 6600
gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 6660
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tccaccgcgg tggcggcctc gaggtcgaga tccggtcgac cagcaaccat agtcccgccc 6840
ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 6900
tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 6960
aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagcttcg acggtatcga 7020
ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 7080
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tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta 7320
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg 7380
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 7440
tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 7500
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 7560
gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg aattcggagt 7620
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtatggg tctctctg 7678
<210> 3
<211> 8103
<212> DNA
<213> pSD31-IRES-hygro
<400> 3
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360
attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660
gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720
ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780
aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840
ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900
gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960
agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020
tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080
gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140
aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200
ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260
tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaatttaaa 1320
agaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1380
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1440
acagggacag cagagatcca gtttggggat ccaattccgc ccctctccct cccccccccc 1500
taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt 1560
ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt 1620
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ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt 1860
ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa 1920
ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta 1980
gtcgaggtta aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa 2040
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ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 16380
gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcga 16418
<210> 7
<211> 3754
<212> DNA
<213> pXH骨架
<400> 7
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccc 2280
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 2340
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 2400
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 2460
ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag 2520
aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 2580
gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 2640
tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 2700
tcggggcatc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 2760
tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 2820
gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 2880
ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg gggatttcgg cctattggtt 2940
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaattaa ttctgtggaa tgtgtgtcag 3000
ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca ggcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 3060
caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 3120
aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc 3180
cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta 3240
tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt 3300
tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggaattca 3360
ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 3420
cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 3480
ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt 3540
acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 3600
gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 3660
tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 3720
cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcga 3754
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> tRNACUApyl
<400> 8
ggaaacctga tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gggtttccgc ca 72
<210> 9
<211> 1260
<212> DNA
<213> pylRS
<400> 9
atggataaaa aaccattaga tgttttaata tctgcgaccg ggctctggat gtccaggact 60
ggcacgctcc acaaaatcaa gcaccatgag gtctcaagaa gtaaaatata cattgaaatg 120
gcgtgtggag accatcttgt tgtgaataat tccaggagtt gtagaacagc cagagcattc 180
agacatcata agtacagaaa aacctgcaaa cgatgtaggg tttcggacga ggatatcaat 240
aattttctca caagatcaac cgaaagcaaa aacagtgtga aagttagggt agtttctgct 300
ccaaaggtca aaaaagctat gccgaaatca gtttcaaggg ctccgaagcc tctggaaaat 360
tctgtttctg caaaggcatc aacgaacaca tccagatctg taccttcgcc tgcaaaatca 420
actccaaatt cgtctgttcc cgcatcggct cctgctcctt cacttacaag aagccagctt 480
gatagggttg aggctctctt aagtccagag gataaaattt ctctaaatat ggcaaagcct 540
ttcagggaac ttgagcctga acttgtgaca agaagaaaaa acgattttca gcggctctat 600
accaatgata gagaagacta cctcggtaaa ctcgaacgtg atattacgaa atttttcgta 660
gaccggggtt ttctggagat aaagtctcct atccttattc cggcggaata cgtggagaga 720
atgggtatta ataatgatac tgaactttca aaacagatct tccgggtgga taaaaatctc 780
tgcttgaggc caatgcttgc cccgactctt tacaactatc tgcgaaaact cgataggatt 840
ttaccaggcc caataaaaat tttcgaagtc ggaccttgtt accggaaaga gtctgacggc 900
aaagagcacc tggaagaatt tactatggtg aacttctgtc agatgggttc gggatgtact 960
cgggaaaatc ttgaagctct catcaaagag tttctggact atctggaaat cgacttcgaa 1020
atcgtaggag attcctgtat ggtctatggg gatactcttg atataatgca cggggacctg 1080
gagctttctt cggcagtcgt cgggccagtt tctcttgata gagaatgggg tattgacaaa 1140
ccatggatag gtgcaggttt tggtcttgaa cgcttgctca aggttatgca cggctttaaa 1200
aacattaaga gagcatcaag gtccgaatct tactataatg ggatttcaac caatctataa 1260

Claims (10)

1.一种稳定细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在携带第一抗性基因的pSD31-IRES上连接吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因，获得携带第一抗性基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES；
(2)在携带第二抗性基因的pSD31-IRES上连接带有突变的绿色荧光蛋白基因，获得携带第二抗性基因的病毒载体2号pSD31-GFP39TAG-IRES；
(3)构建携带第三抗性基因的具有12个拷贝数type-3Pol III启动子启动的正交tRNA的载体pXH-12tRNA；
(4)将(1)和(2)中所述的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES和病毒载体2号pSD31-GFP39TAG-IRES，转导至宿主细胞，分别用第一抗性基因和第二抗性基因进行两轮筛选，获得整合了吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因和突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系；
(5)将步骤(3)中所述的载体pXH-12tRNA转染到步骤(4)中所获得的稳定细胞系，并利用其上携带的第三抗性基因进行第三轮筛选；
(6)在培养基中加入非天然氨基酸，流式分选筛选带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系。
2.根据权利要求1所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述宿主细胞为CHO-K1细胞。
3.根据权利要求1所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，第一抗性基因是嘌呤霉素抗性基因，第二抗性基因是潮霉素B抗性基因，和/或第三抗性基因是杀稻瘟菌素抗性基因；
步骤(1)中所述携带第一抗性基因的pSD31-IRES是如SEQ ID NO:2所示的pSD31-IRES-puro，所述携带第一抗性基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES是如SEQ ID NO:4所示的病毒载体pSD31-pylRS-IRES-puro；
步骤(2)中所述携带第二抗性基因的pSD31-IRES是如SEQ ID NO:3所示的pSD31-IRES-hygro；所述携带第二抗性基因的病毒载体2号pSD31-GFP39TAG-IRES是如SEQ ID NO:5所示的的病毒载体pSD31-GFP39TAG-IRES-hygro；和/或
步骤(3)中所述载体为如SEQ ID NO:6所示的载体pXH-12tRNA-blasticidin。
4.根据权利要求3所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(4)为：首先转导病毒载体2号，利用其携带的潮霉素B抗性基因进行筛选，获得整合突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系；再转导病毒载体1号，利用其携带的嘌呤霉素抗性基因进行筛选，获得了同时整合了突变型绿色荧光蛋白报告基因和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因的稳定细胞系。
5.根据权利要求4所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，潮霉素B的筛选浓度为300ug/ml，杀稻瘟菌素的筛选浓度为15ug/ml，和/或嘌呤霉素的筛选浓度为12ug/ml。
6.根据权利要求3所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，所述非天然氨基酸为含有叠氮基团的非天然氨基酸Lys-azido(NAEK)
或者含有光交联基团的非天然氨基酸Lys-diazirine(DiZPK)
7.根据权利要求1-6任一方法获得的稳定细胞系，其是CHO-K1-WY，保藏号为CGMCC No：14285。
8.一种如权利要求7所述的稳定细胞系在制备含有非天然氨基酸的蛋白或肽中的应用。
9.利用权利要求7所述的稳定细胞系所获得的至少一个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸的蛋白或肽。
10.药物组合物，其中含有有效量的权利要求9中的蛋白或肽，特别是用于抗病毒，治疗多种恶性肿瘤、免疫调节。
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