CN107849579B - 用于基因优化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及修饰编码非植物蛋白的编码序列的方法，其包括步骤：通过密码子取代优化所述编码序列，从而获得编码所述非植物蛋白的优化的编码序列；以及将至少一个野生型多聚腺苷酸化基序序列在所述优化的基因序列内重新引入其位置。

Description

用于基因优化的方法

转基因植物中的低转基因蛋白表达可归因于多个因素(参见Lu等人(2015)综述)。这包括：

-转录水平低下，其归因于基因和弱启动子之间的连接。

-转录子的异常加工，包括错误剪接(mis-splicing)和提早的多聚腺苷酸化，这产生了缺少部分编码区的转录子。

-起点(start point)上游的ATG起始密码子、以及核糖体难以接近正确的起始位点所导致的翻译起始低下。

-由于在编码区存在不常用的密码子所导致的翻译效率低下。

-转录后的因素，比如RNA的稳定性、蛋白的修饰、以及蛋白的稳定性。

通常，在植物中待表达的转基因源自其它植物物种或非植物。在宿主有机体中，这些基因在进化上适应了在其宿主有机体内以期望的表达水平进行表达，但是可能不适应在转化的植物中进行表达。此外，一些基因来自与待转化的植物相同的植物，其可能不适应在该相同植物中高水平表达。不同的有机体具有不同的DNA碱基组成(AT％或者GC％)，在真核细胞内不同的基因组也是如此(核相对于线粒体(还涉及T至U)以及在植物细胞中(质体))。DNA碱基对组成中的这种差异影响编码相同氨基酸的简并密码子的发生频率(密码子使用频率)。同源载氨基酰tRNA(charged tRNA)的丰度通常和基因组中目标密码子的频率成比例。因此，例如富含AT％的基因在富含GC％的有机体中翻译欠佳，因为缺少特定的载氨基酰tRNA。本领域中熟知，可以通过重编码转基因克服这一问题，所述重编码转基因使得密码子使用能够体现在转基因有机体中的密码子使用以及当需要高表达时，使得密码子使用匹配有机体中所高度表达的基因的密码子使用。

除了密码子使用的问题，真核的核基因具有转录子剪接和多聚腺苷酸化信号，这在真核有机体之间可能各不相同(例如，植物、动物和昆虫之间，或者双子叶和单子叶植物之间)，并且在其它有机体比如原核生物中可能是缺失的。在转基因植物中来自外源物种的基因表达可因此导致不期望的转录子加工，比如错误剪接和提早的多聚腺苷酸化。在动物中，已经发现多聚腺苷酸化信号由两个主要元件组成，位于多聚腺苷酸化位点(切割位点(CS))上游10至30bp位置的AAUAAA基序定位(positioning)元件(PE)，以及CS下游的富含U或UG的下游元件(DE)(Colgan和Manley(1997))。进行了各种努力来鉴定植物中发挥多聚腺苷酸化信号作用的DNA序列。Joshi(1987)在46个植物基因组序列中分析了编码区下游的4个结构域，并鉴定了在AAUAAA样基序上游和下游的推定共有序列。Graber等人(1999)在电脑上比较了酵母、拟南芥、水稻、果蝇、小鼠和人的多聚腺苷酸化信号。他们总结出，AAUAAA序列的使用和保留随着6种物种而不同，其中这种信号在植物和酵母中尤其弱。他们更偏好这样的模型，在其中多聚腺苷酸化信号由一系列元件组成，而元件中没有一个元件是普遍需求的。由于其它元件存在着强烈的表达(words)而补偿了缺少的一个元件。Graber等人(1999)针对植物提出了5个序列元件，按照顺序；上游元件(UE)(UUGUAU或者UUGUAA)、PE(AAUAAA或者AAUGAA＝富含A)、富含-U(UUUUCU或者UUUUUU或者其它相似情况)、CS(UA或者UC)以及第二富含U的区域。因此，植物相较于动物而言具有额外的上游元件，其有助于定义多聚腺苷酸化信号。Mogen等人(1990)报道，删除花椰菜花叶病毒(CaMV)的上游元件和PeaRbsC多聚腺苷酸化区降低了“正确”位点处的多聚腺苷酸化效率。Sanfacon等人(2007)再次针对CaMV多聚腺苷酸化信号也报道了相似结果。

由于植物中的多聚腺苷酸化信号富含AT％，原核生物缺乏这些信号，因此来自富含AT的原核生物的基因通常含有可被识别为多聚腺苷酸化序列的序列。因此，在转基因编码区存在这种“隐藏的”多聚腺苷酸化基序，导致基因(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)基因)在植物中表达不佳。Fischhoff等人(US 7741118 B1)描述了去除六聚体AATAAA样基序将改善基因表达。他们提供了16个潜在多聚腺苷酸化基序的列表，在转基因编码区中应当降低所述16个潜在多聚腺苷酸化基序的频率，以改善植物中的表达。

在植物中，非植物基因的高水平表达是关键的农艺问题。因此，需要开发新的方法来改善植物中的基因表达，特别是通过所提供的方法，相较于本领域中已知的一些其它基因修饰方法所提出的，引入更少的修饰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种修饰编码基因序列的方法，特别是当这种编码基因序列编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白时，从而在植物中获得在水平上显著高于野生型基因序列的蛋白表达。

本发明的另一个目的是提供一种制备包含修饰的基因序列的DNA构建体的方法，其中该修饰的基因序列在植物中在显著高于野生型基因序列的水平上表达。

本发明涉及一种制备修饰的编码序列的方法，所述修饰的编码序列编码非植物蛋白，该方法包括：

a)鉴定编码非植物蛋白的编码序列；

b)鉴定各个多聚腺苷酸化基序序列及其在所述编码序列内的核酸位置；

c)通过密码子取代优化所述编码序列，其中所述优化的编码序列编码所述非植物蛋白；以及

d)通过将描述于表1中的至少一个多聚腺苷酸化基序序列引入优化的基因序列而修饰所述优化的编码序列以获得修饰的基因序列，其中修饰的编码序列包含至少一个多聚腺苷酸化基序，并且所述修饰的编码序列编码所述非植物蛋白。

本发明还涉及一种修饰编码非植物蛋白的编码序列的方法，其包括步骤：

a)鉴定各个野生型多聚腺苷酸化基序序列及其在所述编码序列内的位置；

b)通过密码子取代优化所述编码序列，从而获得优化的编码序列，所述优化的编码序列编码所述非植物蛋白；以及

c)在所述优化的基因序列内引入公开于表1的至少一个多聚腺苷酸化基序序列，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含至少一个多聚腺苷酸化基序，并且所述修饰的编码序列编码所述非植物蛋白。

在一个优选的实施方案中，并且如下所公开的，优化的基因序列中引入的多聚腺苷酸化优选为如下所定义的弱多聚腺苷酸化基序。

此外，在优化的基因序列中没有引入如下所定义的强多聚腺苷酸化。

此外，优化的基因序列中引入的多聚腺苷酸化基序序列的数目是这样的，即修饰的序列中多聚腺苷酸化基序序列的总数目是3或更多，但是小于野生型序列中存在的多聚腺苷酸化基序序列的数目。

如下所述，修饰的序列因此将含有至少三个与存在于野生型序列中的多聚腺苷酸组合相同的多聚腺苷酸化的组合，修饰的序列不包含存在于野生型序列中的全部多聚腺苷酸化基序的组合。

如本文所述，通过重新引入多聚腺苷酸化基序来修饰优化的基因序列的目的在于，与优化的序列相比，这将改善或维持序列的表达。然而，实施例表明，在优化的序列中重新引入多聚腺苷酸化基序，以获得包含所有存在于野生型序列中的多聚腺苷酸化基序的修饰序列，在一些情况下可能降低优化序列的表达。仅引入一些多聚腺苷酸化基序，特别是弱的那些，以便在修饰的序列中至少有3个(并且优选至多10个或至多6个)多聚腺苷酸化基序，但不是全部多聚腺苷酸化基序，因而应可以成为能够适用于几乎任何序列并且可重复的稳健方法。

在本实施方案中，本发明因而涉及一种制备编码非植物蛋白的修饰的编码序列的方法，所述方法包括：

a)鉴定编码非植物蛋白的编码序列；

b)鉴定各个多聚腺苷酸化基序序列及其在所述编码序列内的核酸位置；

c)通过密码子取代优化所述编码序列，其中所述优化的编码序列编码所述非植物蛋白；以及

d)通过将至少一个多聚腺苷酸化基序序列引入优化的基因序列，而修饰所述优化的编码序列以获得描述于表1中的修饰的基因序列，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含至少三个多聚腺苷酸化基序，而非步骤b)中鉴定的全部多聚腺苷酸化基序，并且所述修饰的编码序列编码所述非植物蛋白。

同样地，本发明还涉及一种修饰编码非植物蛋白的编码序列的方法，包括步骤：

a)鉴定各个野生型多聚腺苷酸化基序序列及其在所述编码序列内的位置；

b)通过密码子取代优化所述编码序列，从而获得优化的编码序列，所述优化的编码序列编码所述非植物蛋白；以及

c)在所述优化的基因序列内引入公开于表1的至少一个多聚腺苷酸化基序序列，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含至少三个多聚腺苷酸化基序，而非步骤a)中鉴定的全部多聚腺苷酸化基序，并且所述修饰的编码序列编码所述非植物蛋白。

优选地，用以下一个或多个特征来执行这些方法，这些特征可以独立地或者通过任何组合来实施：

-步骤d)(或c)中引入的多聚腺苷酸化基序序列不是强多腺苷酸化基序序列(如下所述)

-步骤d)(或c)中引入的多聚腺苷酸化基序序列是弱多聚腺苷酸化基序序列(如下所述)

-多聚腺苷酸化基序序列是步骤b)中鉴定的一个，并且重新引入其在步骤b(或a)中鉴定的位置

-修饰的序列最多含6个多聚腺苷酸化基序序列

-修饰的序列最多含10个多聚腺苷酸化基序序列。

-修饰的序列中所有至少3个多聚腺苷酸化基序序列均是最初存在于野生型序列中的，并位于其在野生型序列中所在的位置。

在一个优选的实施方案中，所述优化的基因序列中引入的所述多聚腺苷酸化基序序列已经在步骤a)中被鉴定，并且在这种情况下，更优选当步骤a)中鉴定的所述多聚腺苷酸化基序序列被引入时，其被引入在所述优化的基因序列中的其位置。

在另一实施方案中，当多于一个多聚腺苷酸化基序被引入优化的序列内时，在所述优化的序列内引入的各个多聚腺苷酸化基序是步骤a)中鉴定的野生型多聚腺苷酸化基序，其被引入对应着其在编码序列中的位置的核酸位置。

本发明包括编码基因序列的鉴定。这种编码基因序列是野生型编码序列，其分离或鉴定自天然表达蛋白的有机体中。

具体而言，本发明包括编码非植物蛋白的外源编码序列的用途。优选地，非植物蛋白是由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)编码的杀虫蛋白。

编码基因序列可以是野生型编码基因序列的一个片段。例如，编码基因序列可以是编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白毒素片段的序列。此外，编码序列可以编码从不同野生型蛋白获得的两个蛋白片段之间的融合体。

在适当的情况下，编码序列可以针对转化植物中的表达增加进行优化。通过保守的密码子交换，用编码相同氨基酸的另一个密码子取代一个密码子，可以在DNA水平上进行许多优化，而不用改变蛋白序列。

可以优化的参数，例如是密码子使用、局部GC含量、剪接位点缺失、mRNA的二级结构、多聚腺苷酸化基序。

更具体地说，可以使用植物优选的密码子来合成基因以改善表达，或者可以按照植物优选的密码子使用频率使用密码子来进行合成。结果，基因的GC含量往往会增加。实现这种表达优化的方法是本领域众所周知的，并且在Campbell和Gowri(1990)中特别描述了关于宿主优选的密码子使用的讨论，更具体地用于合成植物优选的基因(WO91/16432和Murray等人(1989))。WO 91/16432特别描述了用于修饰Bt ICP基因以改善其在植物细胞中表达的方法，所述植物细胞转化有该基因；该方法包括步骤：在基因的多个翻译密码子中，将A和T序列改变为编码相同氨基酸的对应G和C序列，从而改善基因向mRNA的转录、mRNA的核积累和/或mRNA的核输出，特别是在植物细胞中的基因转录。

为了进行这种优化，可以使用不同的算法来预测植物基因中多聚腺苷酸化基序的位置。例如，Ji等人(2015)开发了算法PASPA(植物和藻类中的PolyA位点预测；http://bmi.xmu.edu.cn/paspa)。也可以用其它算法，如PAC(poly(A)位点分类器，Wu等人2012)和polyA-iEP(Tzanis等人，2011)。这个系统的基础是用给定水平的概率来鉴定基序，以代表多聚腺苷酸化基序。具有在野生型序列中代表多聚腺苷酸化位点的高水平概率的多聚腺苷酸化基序，然后可以从优化的序列中除去。

本文意图，本发明中的多聚腺苷酸化基序由以下16个基序序列组成：AAAATA、AACCAA、AAGCAT、AATAAA、AATAAT、AATACA、AATCAA、AATTAA、ATAAAA、ATACAT、ATACTA、ATATAA、ATGAAA、ATTAAA、ATTAAT和CATAAA。各个多聚腺苷酸化基序可以参见表1中的polyA编码所描述的特定序列。此外，在编码序列中包含的各个多聚腺苷酸化基序不仅可以通过其序列来表征，还可以通过其在编码序列中的核酸位置来表征，例如“位于编码序列的核苷酸X和核苷酸Y之间”，或者“然而多聚腺苷酸化基序的第一核苷酸位于编码序列内的位置X”。

因此，编码非植物蛋白的编码序列特征在于多聚腺苷酸化基序的组合，其中polyA序列和编码序列内的核酸位置可以指定给编码序列中所鉴定的各个多聚腺苷酸化基序。

通过上述方法对编码序列的优化可以导致去除表1中所列的一个或多个多聚腺苷酸化基序。在一定程度上，可以去除所有多聚腺苷酸化基序，从而优化的编码序列不含任何多聚腺苷酸化基序。然而，完全去除多聚腺苷酸化基序可能对其它序列变量施加很大的限制，特别是对氨基酸序列(即，获自优化序列的蛋白缺失了相对于获自非优化野生型序列的野生型蛋白而言的同一性)。

令人惊讶的是，申请人已经证明可以在优化的基因序列中重新引入多聚腺苷酸化基序，并且仍然会观察到对于大部分多聚腺苷酸化基序，最初根据野生型序列所计算并预测的多聚腺苷酸化基序水平的降低。

不受限于解释这种现象的机制理论，本发明人推测，编码基因序列的优化是修饰那些与多聚腺苷酸化基序组合发挥作用的周围基序，以降低基因表达，从而当多聚腺苷酸化基序被重新引入到优化的编码基因序列中时，它们失去了降低基因表达的能力。

应注意的是，在优化的序列内引入的多聚腺苷酸化位点不一定存在于野生型序列中。此外，这样的位点不一定引入野生型序列中野生型多聚腺苷酸化位点的相同位置。

本领域技术人员可以确定哪些以及多少具有特定polyA编码(code)的多聚腺苷酸化基序能够引入优化的编码序列中以进行本发明，同时维持野生型蛋白的序列。

在一个优选的实施方案中，将优化的编码序列中所引入的各个多聚腺苷酸化基序，引入到与野生型编码序列中所鉴定的野生型多聚腺苷酸化位点位置相同的核酸位置。在一个最优选的实施方案中，引入优化序列内的多聚腺苷酸化基序是引入其天然(野生型)位置的野生型多聚腺苷酸化基序。

在这两个实施方案中，由修饰的编码序列编码的蛋白是由野生型非优化的序列所编码的野生型蛋白。

最优选地，本发明的方法涉及一种修饰编码序列的方法，其中所有引入的多聚腺苷酸化基序被引入至与在野生型编码序列中所鉴定的其位置相同的核酸位置，其中所得到的修饰的编码序列包含与野生型编码序列中所鉴定的多聚腺苷酸化基序相同的组合。

在该实施方案中，将编码序列内鉴定的野生型多聚腺苷酸化基序引入与其在编码序列内的位置相同的核酸位置，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含和野生型编码序列相同的多聚腺苷酸化基序的组合。

这种修饰的序列编码野生型非植物蛋白，并且能够在显著高于非优化的野生型序列的水平上表达，尽管它包含野生型编码序列中存在的所有多聚腺苷酸化基序。

本发明的方法还涉及一种修饰编码序列的方法，其中将所有引入的多聚腺苷酸化基序引入与其在野生型编码序列中鉴定的位置相同的核酸位置，所得到的修饰的编码序列应因此包含野生型编码序列中鉴定的一个、两个或三个多聚腺苷酸化基序的组合。在这种情况下，预期修饰的编码序列不包含野生型编码序列中所鉴定的所有多聚腺苷酸化基序的组合。

在一个具体的实施方案中，在步骤c)中将在编码序列中鉴定的野生型多聚腺苷酸化基序引入与其在编码序列中的位置相同的核酸位置，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含存在于野生型序列中的一个多聚腺苷酸化基序。

在另一个实施方案中，在步骤c)中将在编码序列中鉴定的野生型多聚腺苷酸化基序引入与其在编码序列中的位置相同的核酸位置，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含存在于野生型序列中的两个多聚腺苷酸化基序。

需要注意的是，为了获得包含在野生型序列中存在的两个多聚腺苷酸化基序的组合的修饰的编码序列，根据优化的序列是否已经包含了存在于野生型序列中的一个或零个这种多聚腺苷酸化基序，将存在于野生型序列中的一个或两个多聚腺苷酸化基序引入所述优化的序列。

在另一个实施方案中，在步骤c)中将编码序列中所鉴定的野生型多聚腺苷酸化基序引入与其在编码序列中的位置相同的核酸位置，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含存在于野生型序列中的三个多聚腺苷酸化基序的组合。

需要注意的是，为了获得包含在野生型序列中存在的三个多聚腺苷酸化基序的组合的修饰的编码序列，根据优化的序列是否已经包含了存在于野生型序列中的两个、一个或零个这种多聚腺苷酸化基序，将存在于野生型序列中的一个、两个或三个多聚腺苷酸化基序引入所述优化的序列。

无论所考虑的基因序列如何，预计多聚腺苷酸化基序对基因表达水平有不同的影响。多聚腺苷酸化基序可表现为强或弱基序。预期弱基序对编码基因序列表达的耐受性比强基序要好。有利地，优化的基因序列中引入的多聚腺苷酸化基序是鉴定为弱基序的多聚腺苷酸化基序。

根据其在玉米编码基因序列中的发生率(occurrence)以及根据其在植物中显示表达良好的优化基因序列中的发生率，将多聚腺苷酸化基序按照从最弱到最强进行了排序。优选，弱的多聚腺苷酸化基序选自AAAATA、AAGCAT、AATCAA和ATGAAA序列。强的基序选自AATTAA、ATACAT、ATACTA、ATATAA、ATTAAA、ATTAAT和CATAAA序列。

更优选地，弱多聚腺苷酸化基序中从更弱到不太弱的排序为：ATGAAA、AATCAA、AAAATA和AAGCAT。强多聚腺苷酸化基序从更强到次强的排序为：ATACTA、ATTAAT、AATTAA、ATTAAA、CATAAA、ATATAA、ATACAT。

最优选，表1提供了多聚腺苷酸化基序从更弱到更强的排序。

通过比较来自单子叶植物和双子叶植物的编码基因序列，注意到常见的最强多聚腺苷酸化基序是AATTAA、ATACTA、ATATAA、ATTAAA、ATTAAT和CATAAA基序。

也可以鉴定另一个弱多聚腺苷酸化基序(多聚腺苷酸化基序AACCAA)。

在本发明的一个实施方案中，优化的序列中没有加入最强的多聚腺苷酸化基序AATTAA、ATACTA、ATATAA、ATTAAA、ATTAAT和CATAAA。然而，应该指出，修饰的序列可以含有一个(或者多个这些多聚腺苷酸化基序，如果在天然(野生型)序列已经通过密码子取代得以优化之后，其存在于优化的序列中)。

最优选，加入优化序列中的多聚腺苷酸化基序选自ATGAAA、AATCAA、AAAATA、AACCAA和AAGCAT。因此，只有这些弱的多聚腺苷酸化基序被添加到优化的序列中。

在本发明的另一个实施方案中，最终修饰的序列总共包含三个至更多个多聚腺苷酸化基序，其中至少三个多聚腺苷酸化基序对应于野生型编码序列中鉴定的三个多聚腺苷酸酸化基序的组合，并且其中修饰的编码序列不包含野生型编码序列中鉴定和存在的所有多聚腺苷酸化基序。

优选地，修饰的优化序列包含三个至十个多聚腺苷酸化基序。

优选地，修饰的优化序列包含三个至六个多聚腺苷酸化基序。

重新引入多聚腺苷酸化基序的步骤可能引起多聚腺苷酸化基序外围的氨基酸改变。

也可以产生额外的基序，这可能降低基因的表达。额外的基序可包括例如隐藏的(cryptic)剪接位点GGTAAG、GGTGAT、GTAAAA和GTAAGT和/或polyA或polyT、和/或7个或更多个碱基对的重复。

因此，本发明的方法可以进一步包括对修饰的基因序列进行修饰的步骤，以确保修饰的序列所编码的蛋白序列与野生型编码基因序列所编码的蛋白序列相同。本领域技术人员知道待检测的不同类型的基序，并且适当时，将对修饰的基因序列进行修饰，使得相较于野生型编码序列所编码的蛋白功能而言，修饰的编码基因序列所编码的蛋白功能没有改变。更优选地，由修饰的编码基因序列编码的蛋白的氨基酸序列与野生型编码序列编码的蛋白的氨基酸序列相同。

本发明包括可根据制备修饰的编码序列的方法而获得的修饰的编码序列，其中多聚腺苷酸化基序被引入与其在野生型编码序列内鉴定的位置相同的核酸位置，并且其中获得的修饰的编码序列包含与野生型编码序列中鉴定的相同的多聚腺苷酸化基序组合。

在本发明中意图制备修饰的编码序列的方法的所有步骤，可以通过将计算机(insilico)序列设计与合成编码基因序列的制备相结合来进行。最优选地，上述方法的所有步骤可以在计算机上进行。因此，在这种情况下，如下所述，制备表达盒的方法将需要合成相应的修饰的编码基因序列作为第一步骤。

因此，本发明包括制备核酸分子的方法，包括步骤：进行上述方法，以及合成带有因此而获得的修饰序列的修饰核酸。

本发明的另一个实施方案是一种制备表达盒的方法，所述表达盒包含编码非植物蛋白的修饰的编码序列，所述方法包括步骤：根据上述任何方法制备编码所述蛋白的修饰的编码序列，以及将启动子和终止子可操作地连接至所述修饰的编码序列以获得用于在植物中进行表达的构建体。

更具体地说，本发明涉及一种制备表达盒的方法，其中将多聚腺苷酸化基序引入与其在野生型编码序列内鉴定的位置相同的核酸位置，并且其中获得的修饰的编码序列包含与野生型编码序列中鉴定的相同的多聚腺苷酸化基序组合。

这些盒可以通过计算机或实际合成而获得。

更优选地，编码序列编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白。

如本文所用的术语“可操作地连接”意指启动子和修饰的编码基因序列被定向，从而启动子指导编码序列的表达，通常在5'至3'的方向上。

构建体也可以包含增强子(如内含子)以及在编码序列的3'末端包含终止子。

“在植物中有活性的”启动子是在植物细胞中能够驱动与其可操作连接的基因表达的启动子。

为了表达，编码序列可以在组成型、组织特异性、发育调控或诱导型启动子的控制下而存在。

启动子可以来自同一种物种或另一物种(异源启动子)。尽管一些启动子在不同物种中使用时可能具有相同的调控模式，但通常优选在单子叶植物中使用单子叶启动子，以及在双子叶植物中使用双子叶启动子。

在一个优选的实施方案中，所述构建体处于组成型启动子的控制之下。

用于表达的组成型启动子的实例包括35S启动子或19S启动子(Kay等人，1987，Science，236：1299-1302)、水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell，2：163-171)、pCRV启动子(Depigny-This等人，1992，Plant Molecular Biology，20：467-479)、CsVMV启动子(Verdaguer等人，1998，Plant Mol Biol，6：1129-39)、玉米的泛素1启动子(Christensen等人，1996，Transgenic.Res.5：213)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA的调控序列，包括甘露碱合酶、胭脂碱合酶、章鱼碱合酶。

可以使用其它合适的启动子。它可以是诱导型启动子或组织特异性启动子，比如例如叶特异性启动子或种子特异性启动子。文献中描述了许多组织特异性启动子，并且可以使用它们中的任何一种。可以引用公开于US 20130024998中的启动子。

在一个实施方案中，由修饰的编码序列所编码的蛋白靶向叶绿体用于表达。以此方式，表达盒将额外含有编码将蛋白导向叶绿体的转运肽的核酸。这样的转运肽是本领域已知的。参见，例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；以及Shah等人(1986)Science 233:478-481。

本发明还包括含有本发明的表达盒(核酸构建体)的载体。

一种载体，如质粒，可因此用于转化宿主细胞。按照标准技术，构建用于转化宿主细胞的载体在本领域技术人员的能力范围内。

根据所选转化方法的指导以及根据所选的宿主细胞，确定是否使用用于转化细胞的载体，或者使用哪种载体。

可能的载体包括Ti质粒载体、仅设计用于最大程度地产生大量拷贝的穿梭载体、包含一旦发生转化而用于最终复制所必需的最少序列的附加型载体、转座子载体，包括基因序列的RNA形式的可能性。载体的选择和构建它们的方法是本领域普通技术人员通常已知的，并且在通用技术参考文献中进行了描述(Mullis，K B(1987)，Methods inEnzymology)。

对于植物细胞内的转化方法，可以举出基因直接转移的方法，比如直接微注射至植物胚中、真空渗透或电穿孔、通过PEG的方式直接沉淀或通过枪对覆盖有兴趣DNA的颗粒进行轰击。

优选用细菌菌株，特别是农杆菌(Agrobacterium)，特别是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化植物细胞。特别是，可以使用Ishida等人(NatureBiotechnology，14,745-750，1996)所述的方法转化单子叶植物。

细胞可以通过任何瞬时表达系统转化，其中一些是本领域技术人员公知的。

在一个具体的实施方案中，所述表达盒稳定整合到所述宿主细胞的基因组内。这个实施方案对植物宿主细胞特别有意义。基因组中的稳定整合意味着表达盒可以在分裂时被传递给所述宿主细胞的子代。

本发明还包括含有至少一种细胞的植物，所述细胞含有如上定义的表达盒，优选稳定整合到其基因组内。

包含这种细胞或者产生自这种细胞的转基因植物的一部分，特别是果实、种子、谷粒或者花粉，也包括在本发明中。上面提到的宿主细胞是本发明的一部分，也被认为是转基因植物的一部分。

值得提醒的是，整个植物可以从单个转化的植物细胞得以再生。因此，在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的表达盒的转基因植物(或其部分)。所述再生可以通过已知的方法进行。

由该植物受精而生长的种子在其基因组中也包含该转基因。

根据本发明的所述植物或植物的部分可以是来自各种物种的植物或其部分，特别是被子植物、单子叶植物和双子叶植物。

优选，所述植物选自玉米、小麦、大麦、油菜、甜菜和向日葵。在一个优选的实施方案中，所述植物是玉米。

附图说明

图1A、1B和1C说明各种实施方案的步骤，以进行野生型基因修饰从而在植物中高水平表达蛋白。

图2A、B、C和D说明将方法应用至苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Axmi028编码序列。

图3A、B、C和D说明Axmi028上的PASPA结果。

图4A、B、C和D说明将方法应用至苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Axmi100编码序列。

图5A、B、C和D说明Axmi100上的PASPA结果。

图6A和B显示在玉米叶的瞬时测定中Axmi028-LUC融合体(A)和Axmi100-LUC融合体(B)的荧光素酶表达水平。

图7显示使用C Myc标签抗体进行的独立Axmi028玉米转化体(A)和使用多克隆抗体进行的独立Axmi100玉米转化体(B)的Western印迹分析。在图7A中，泳道1，分子大小标记；泳道2，未经转化的玉米；泳道3-4，028-WT+GUS转化体；泳道5-6，028-opt+GUS转化体，泳道7-8，028-opt+pA+GUS转化体；以及泳道9-10，028-opt+3pA+GUS转化体。每个植物样品装载10μg蛋白。

在图7B中，泳道1、26、27和52，分子大小标记；泳道2-11，100-WT+GUS转化体；泳道12和38，未经转化的玉米；泳道13和39，来自表达Axmi100的细菌菌株的蛋白提取物；泳道14-23，100-opt+pA+GUS转化体；泳道28-37，100-opt+3pA+GUS转化体；和泳道40-49，100-opt+GUS转化体。每个植物样品装载5μg蛋白。

图8描述了玉米原生质体瞬时测定中全长蛋白Axmi028的相对表达强度。在每个泳道内，检测到的c-Myc和His标签信号的强度被设置成和nptII信号相关，如通过软件ImageLab 5.2.1，BioRad计算的。

图9显示在玉米转化体中通过QRT-PCR测定的Axmi028和Axmi100优化基因的RNA表达水平。A)3'引物对，B)5'引物对。

实施例

实施例1.通过对多聚腺苷酸化基序侧翼区域进行基因优化用于改善基因表达的 序列

Axmi028

分析了富含AT的基因(来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Axmi100(US 8314292B2)，其缺少C端结晶结构域(crystal domain))的野生型编码区域的多聚腺苷酸化基序，如表1所列。

该截短的野生型编码序列(028-WT；SEQ ID NO：1)包含31个这样的位点(图2A)。首先，合成密码子优化的Axmi028序列，如US 8314292B2所述，其缺少31个polyA位点中的30个，如在SEQ ID NO：2(028-opt图2B)中所述。针对玉米表达，对该序列进行了优化。设计了另一个序列(028-opt+pA SEQ ID NO：3；图2C)，其中30个推定的多聚腺苷酸化基序序列被重新引入到这个优化的028-opt序列中，使得Axmi028序列的氨基酸序列是保守的。

在两种情况下，重新引入多聚腺苷酸化基序导致氨基酸序列的改变。这通过引入这些多聚腺苷酸化基序的野生型序列5'的3个更多的碱基对来进行校正。此外，对序列进行了检查，以确定是否存在其它序列，而这些序列可能会降低表达，这可能是由于将优化和多聚腺苷酸化基序并行(juxtaposition)所导致的(隐藏的剪接位点GGTAAG、GGTGAT、GTAAAA和GTAAGT和/或polyA和polyT序列和/或7个或更多重复的碱基对)。在028-opt+pA序列中没有发现这种基序。这个过程如图1A所示。

本领域已经做了多种尝试来预测植物基因中多聚腺苷酸化位点的位置。Ji等人(2015)开发了算法PASPA(植物和藻类中的PolyA位点预测；http://bmi.xmu.edu.cn/paspa)。使用针对水稻定义的参数，该算法被应用于028-WT、028-opt和028-opt+pA序列。图3显示了这个分析的输出。可以看出，PASPA预测的提早的多聚腺苷酸化的概率对于028-WT序列是最大的(图3A)，对于028-opt序列是最小的(图3B)。028-opt+pA序列(图3C)与028-WT序列相比，提早的多聚腺苷酸化的概率显著降低。

Axmi100

第二富含AT的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)基因，Axmi100(US20100005543)也被进行了修饰。对于Axmi028，为了在植物中进行表达，除去了C端晶体结构域。该截短的野生型编码序列，如SEQ ID NO：4(100-WT，图4A)所述，含有25个多聚腺苷酸化基序。合成密码子优化的Axmi100序列(US20100005543)，其缺少25个野生型多聚腺苷酸化基序中的24个(100-opt或SEQ ID NO：5，图4B)。然而，针对玉米表达而进行优化的该序列具有5个额外的野生型序列中不存在的多聚腺苷酸化基序。合成SEQ ID NO：6(100-opt+pA，图4C)中所述的另一个序列，其中在与野生型编码序列中鉴定的相同核酸位置处，将24个推定的多聚腺苷酸化基序重新引入该优化的100-opt序列中。该序列保留了Axmi100的氨基酸序列并且不含有隐藏的剪接位点polyA或者polyT基序(隐藏的剪接位点GGTAAG、GGTGAT、GTAAAA和GTAAGT和/或polyA和polyT序列和/或7个或更多个重复碱基对)。

使用针对水稻定义的参数，PASPA算法被应用于100-WT、100-opt和100-opt+pA序列。图5显示了这个分析的输出。可以看出，PASPA预测的提早的多聚腺苷酸化的概率对于100-WT序列是最大的(图5A)，对于100-opt序列是最小的(图5B)。然而，100-opt+pA序列(图5C)与100-WT序列相比，提早的多聚腺苷酸化的概率显著降低。

实施例2.在玉米和烟草中多聚腺苷酸化基序侧翼区域中优化的基因的瞬时表达 测定

Axmi028

采用了两个瞬时系统。第一种是间接测定系统，其中三种不同的Axmi028序列(028-WT、028-opt和028-opt+pA)在框内融合至报道基因萤火虫荧光素酶基因(LUC)并置于组成型玉米泛素启动子(SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)控制之下。理由是Axmi028序列中任何提早的多聚腺苷酸化将终止转录子，从而防止产生含有完整Axmi028+Luc融合体的转录子的可能。那么，与028-opt-Luc对照相比，来自028-WT-Luc或028-opt-pA-Luc融合基因的Luc信号的降低可能归因于提早的多聚腺苷酸化发生率提高。含有这些融合体的质粒与对照35S-海肾荧光素酶构建体共同轰击到玉米叶组织中。24小时后测量萤火虫和海肾萤光素酶的发光，并使用对照海肾luc信号对来自萤火虫luc的信号进行归一化。然后，来自028-WT-Luc基因的归一化萤火虫luc信号，与来自028-opt-Luc和028-opt-pA-Luc基因的信号(图6A)进行比较。

第二个瞬时系统是将含有Axmi028版本的二元质粒构建体经由农杆菌渗入至烟草本塞姆氏烟草(N.benthamiana)。将组成型病毒CsVMV启动子(Verdaguer等人(1996))所驱动的028-WT、028-opt和028-opt+pA基因克隆到SB11衍生的二元载体(Komari等人(1996))，其中所述载体也含有从组成型玉米泛素启动子表达的荧光报道基因AnCyan(CloneTech)，从而形成质粒028-WT+Cyan、028-opt+Cyan和028-opt+pA+Cyan。根据Komari等人(1996)，将这三个二元载体连同空SB11+Cyan对照转移到农杆菌菌株LBA4404(pSB1)中。基本上如Leckie和Steward(2011)所述，用这4种菌株进行农杆菌渗入。渗入五种植物的四片叶子，各个叶子用四种菌株渗入叶子不同部位。3天后，将表达AnCyan的区域可视化，然后切除。在各个植物中渗入相同农杆菌菌株的区域被合并，并在液氮中冷冻。取样用于通过QRT-PCR测量Axmi28基因和AnCyan基因的转录水平，并使用针对Axmi028和AnCyan的抗体进行Western分析。在Axmi028基因序列的编码序列的3'区域中，设计用于QR-PCR分析的引物对。然后，将028-WT/AnCyan的转录表达与028-opt/AnCyan和028-opt+pA/AnCyan的转录表达进行比较，以确定在用于QRT-PCR反应的引物位置之前使用隐藏的多聚腺苷酸化基序对转录终止的作用。

当在三种Axmi028构建体之间比较Axmi028蛋白水平(已经针对AnCyan蛋白表达进行归一化)时，可以获得类似的结果。

制备另外的基因构建体，其中Axmi028版本各自具有额外的N端His标签和C端C-Myc标签，从而允许在Western印迹中使用His标签或C-Myc标签抗体对Axmi028蛋白进行可视化。这些Axmi028版本是028-h(WT)m(SEQ ID NO：17)、028-h(opt)m(SEQ ID NO：18)和028-h(opt+pA)m(SEQ ID NO：19)。将由组成型病毒CsVMV启动子(Verdaguer等人(1996))驱动的028-h(WT)m、028-h(opt)m和028-h(opt+pA)m基因克隆到SB11衍生的二元载体(Komari等人(1996))，其中所述载体也含有从组成型玉米泛素启动子表达的β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因(Jefferson等人1987)，从而形成质粒028-WT+GUS、028-opt+GUS和028-opt+pA+GUS。根据Komari等人(1996)将这三个二元载体连同空的SB11+GUS对照转移到农杆菌菌株LBA4404(pSB1))。如上述，在本塞姆氏烟草(N.benthamiana)中进行瞬时测定。还从20至25个未成熟玉米胚中提取蛋白和RNA样品，其中所述玉米胚用含有不同Axmi028+GUS构建体的农杆菌菌株共培养7天。为了补偿不同样品之间在共培养期间T-DNA递送中的潜在差异，在各个蛋白样品上进行使用4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)的GUS荧光活性测定。然后，调整Western中所用的蛋白量以产生每个样品相等的GUS活性。对于本塞姆氏烟草(N.benthamiana)中的瞬时表达分析，这些样品的分析允许比较不同Axmi028版本的表达。

Axmi100

按照与以上对Axmi028所述相同的方式，在玉米(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)和烟草中通过瞬时测定来测量100-WT、100-opt和100-opt+pA序列。因此，将100-WT的表达与100-opt和100-opt+pA的表达进行比较(图6B)。

通过使用抗Axmi100蛋白的多克隆抗体在相同的样品上进行Western印迹分析。结果与图6所示的结果一致：多聚腺苷酸化信号的存在使得可以获得蛋白的良好表达，其优于没有加入多聚腺苷酸化的优化蛋白的表达，并且优于已加入所有野生型多聚腺苷酸化的优化蛋白的表达，然而野生型蛋白不能正确表达(数据未显示)。

Axmi100版本也被表达为N端His-标签和C端C-Myc标签版本；在烟草中以及在未成熟玉米胚中的瞬时测定中100-h(WT)m、100-h(opt)m和100-h(opt+pA)m(SEQ ID NO：20、SEQID NO：21和SEQ ID NO：22)。因此100-h(WT)m的表达与100-h(opt)m和100-h(opt+pA)m的表达进行比较。

实施例3.在多聚腺苷酸化基序侧翼区域进行优化的基因在玉米中的稳定表达

Axmi028

基本上如Ishida等人(1996)所述，将实施例2中描述的菌株(028-WT+GUS、028-WT+Cyan、028-opt+GUS、028-opt+Cyan、028-opt+pA+GUS和028-opt+pA+Cyan)转化至玉米。针对每个构建体，产生至少10个具有完整T-DNA的独立单拷贝转化体。对T0叶材料进行QRT-PCR和Western分析。如前实施例所示(图7A)，将028-WT植物的叶Axim028表达和蛋白水平与028-opt和028-opt+pA转化体进行比较。

Axmi100

如上对于Axmi028所述的，不同版本的Axmi100被转化至玉米。如前实施例所示(图7B)，将100-WT植物的叶Axim100表达和蛋白水平与100-opt和100-opt+pA进行比较。

实施例4.鉴定可保留在密码子优化的序列中的弱多聚腺苷酸化基序

上述过程的进一步改进是，在优化的序列中只留下弱多聚腺苷酸化基序。尽管将表1中鉴定的所有多聚腺苷酸化基序重新引入优化序列，将表达显著提高至通过充分优化序列所获得的相似水平，该过程可能不是在所有情况下都是最佳的。这是因为，随着野生型序列中多聚腺苷酸化基序数目的增加，越多的序列不能进行优化，而且在优化序列和多聚腺苷酸化序列交界处产生不希望的序列的可能性就越大。采用计算机方法来鉴定玉米中弱的和强的多聚腺苷酸化序列。这种方法的基础是认为，在玉米基因的编码序列中强的多聚腺苷酸化基序表达不充分，而在高表达基因中则尤其如此。相反，弱的多聚腺苷酸化基序没有表达不充分。然而，基序的发生率还可能取决于其可编码的氨基酸。“编码”频繁使用的氨基酸的基序以及频繁用于该氨基酸的密码子将被过度表达。因此，保留相较于理论计算而言最为高度表达的“弱”基序，应选择这样的基序：

a)不是强的多聚腺苷酸化信号

b)被频繁使用，因为它们编码在玉米中频繁使用的氨基酸/或频繁使用的密码子。

表1：玉米编码序列中多聚腺苷酸化基序的发生率

a)玉米中的CDS分析CDS数据库v3：

首先，分析玉米的整个预测编码区域(玉米CDS数据库v3，ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-27/plants/fasta/zea_mays/cds/)。在该数据集中，使用观察到的数据集尺寸(63279365bp)和该数据集的碱基对组成(54.95％GC)，确定各个多聚腺苷酸化基序的预测数目。然后，确定发生率的实际数目，并计算实际/预测发生率的比率(见表1)。结果表明，一些多聚腺苷酸化基序显著表达不足，而一些显著过表达。

在玉米CDSv3数据集中，4个基序被150％或更多地过度表达。被过度表达的那些是弱多聚腺苷酸化基序序列以及允许良好基因表达的序列的候选者。这些多聚腺苷酸化序列可以留在优化的序列中，其损害基因表达的概率较低。这个规程在图1b中概述。

b)单子叶植物中的CDS分析：

针对表1中所列的多聚腺苷酸化基序，进行作物特异性搜索以定义在相应的兴趣作物CDS中以高水平出现的那些基序。为此目的，分析了2个确定的玉米品系(B73、AGPv3.22)的CDS，如在前面的实施例中所示，假定CDS含有频繁用于编码作物中特定氨基酸的密码子。存在于CDS密码子中的多聚腺苷酸化基序不强，但是仅具有轻微功能或者可能无功能。所以那些自然发生的基序可以保留在任何转基因中，因为它们不会影响其在感兴趣的作物中的稳定表达，并且将被称为作物特异性弱基序。

首先，在那些不同的玉米数据库中分析了多聚腺苷酸化基序的存在。对于计数检查，OligoCounter(http://webhost1.mh-hannover.de/davenport/oligocounter/，德国汉诺威医学院的Tümmler实验室)和JBrowse(Skinner等人，Genome Res.2009.19：1630-1638)用于检查基因组中的基序分布。这些计数被归一化为每个CDS数据集的预测转录子总数。

表2显示对于B73和AGPv3.22数据集，包含给定多聚腺苷酸化基序的CDS百分比。为便于比较，表1中添加了“基序发生率玉米CDSv3”一栏。其表示为整个玉米v3数据集中实际基序发生率除以数据集中理论发生率的百分比。在所有玉米数据集中多聚腺苷酸化基序的分布都很相似，其排名变化不大。值得注意的是，在玉米转录子中以相对高的频率出现的前5个多聚腺苷酸化基序ATGAAA、AAGCAT、AACCAA、AATCAA和AAAATA(在数据集B73中包含这些基序的CDS>10％)。这个结果与上面a)节中描述的实验中发现的频率一致。

尽管该分析不能被认为提供了所有弱多聚腺苷酸化基序列的穷尽列表，但可以得出结论，鉴定的5个多聚腺苷酸化基序在玉米中被证实为弱的基序。

除了玉米数据集外，还分析了另一单子叶作物高粱(Sorghum bicolor)(Sbicolor_255_v2.1)(表2)。与玉米类似，分析了这些CDS集(set)的多聚腺苷酸化基序计数的总丰度(见表2)。针对每个CDS数据集的预测转录子总数，对这些计数进行归一化。值得注意的是，两种不同的单子叶作物显示出所有多聚腺苷酸化基序的非常相似的相对丰度，其中前五名最丰富的基序完全相同。

根据这些数据，多聚腺苷酸化基序ATGAAA、AAGCAT、AACCAA、AATCAA和AAAATA可以保留在单子叶植物中表达的任何转基因中，因为它们不会影响其在感兴趣的作物中的稳定表达，并且将被称为单子叶植物特异性的弱多聚腺苷酸化基序。

有趣的是，六个最强的ATAAAA、CATAAA、ATACTA、ATTAAA、AATTAA和ATTAAT多聚腺苷酸化基序在单子叶植物中也是一致的。

c)单子叶植物和双子叶植物的弱多聚腺苷酸化基序之间的比较：

除了单子叶植物数据集外，还分析了双子叶植物甜菜(Beta vulgaris)(RefBeet-1.2)。表2显示甜菜(B.vulgaris)从最弱到最强基序呈现出相似的基序分布。在CDS数据集中发现一个基序AATAAT比在单子叶CDS中的那些更频繁。然而，在所分析的所有作物数据集之间，在最丰富的基序中有一个明显的重叠。

这些数据表明，三个多聚腺苷酸化基序ATGAAA、AAGCAT和AATCAA可能保留在开花植物中表达的任何转基因中。

总体数据显示，5个基序ATGAAA、AAGCAT、AACCAA、AATCAA和AAAATA在植物界中稳健地鉴定为弱多聚腺苷酸化基序。

表2：单子叶和双子叶植物中多聚腺苷酸化基序的发生率。“玉米CDSv3中基序发生 率”一栏所示结果是从表1中提取的

d)植物中表达的转基因中多聚腺苷酸化基序的分析

为了评价植物中表达的转基因中多聚腺苷酸化基序的存在，分析了21种细菌基因序列和5种来自真核生物的基因序列。这些基因被证明在植物中表达。计数多聚腺苷酸化基序的总数来鉴定在转基因中被描述为功能性和/或在植物中表达的那些基序(通过转基因表达水平的分析或者通过转基因植物中检测到的新表型来证明)。根据在转基因中计数的多聚腺苷酸化基序的数目，计算任何基序的丰度(基序的数目/分析的基因的数目)。根据跨基因、物种来源和表达作物之间计算的其丰度，将多聚腺苷酸化基序进行分组：高丰度的信号(所有分析的基因中≥50％)被评为无功能或非常弱的多聚腺苷酸化信号，那些中等丰度的信号(在所有分析的基因中≥25％)被评定为弱功能性的或弱多聚腺苷酸化信号。低丰度信号(在所有分析的基因中≥0％)被评定为功能性或强多聚腺苷酸化信号。

为了评估是否有特定的基序在被优化以便以更高频率在植物中进行转基因表达的基因中缺失，计算了优化后残留的多聚腺苷酸化基序的百分比。尽管不认为这种分析能提供植物中存在的所有弱多聚腺苷酸化基序的穷尽鉴定，但是除了在这种类的基因中的高丰度以外，基序的保留仍然有价值地指示其对转录子稳定性的影响弱。在所有基因中两个基序AATCAA和ATGAAA显示出最高的丰度，并且甚至在优化的序列中保持高的百分比。除了这两个基序之外，基序AAAATA在所分析的基因集中也显示出高丰度。

根据这些数据，这些多聚腺苷酸化基序不太可能影响任何兴趣作物中的转基因表达。

实施例5：基因的瞬时表达测试，所述基因是优化的玉米密码子，但含有至少三个 野生型位置上的多聚腺苷酸化基序

a)如实施例2进行瞬时表达系统：

Axmi028

检测C端截短序列的Amxi028野生型中是否存在可保留在优化序列中的弱多聚腺苷酸化基序。发现了两个ATGAAA和四个AATCAA基序，这些是玉米CDSv3数据库中最过度表达的基序。经过优化的序列已经有在其626bp的野生型位置上的AATACA基序。在玉米CDS v3数据集中，这个基序既没有表达不充分也没有被过度表达(104％的实际/理论)。在优化的序列(位置1036bp和1232bp)中引入了四个AATCAA基序中的两个，总共得到三个弱基序，这些弱基序在修饰的优化编码序列中在野生型位置被鉴定出来。该序列028opt+3pA如SEQ IDNO：13所述(图2D)，不包括任何最强的ATAAAA、CATAAA、ATACTA、ATTAAA、AATTAA和ATTAAT多聚腺苷酸化基序。通过PASPA分析(图3D)，发现产生了和充分优化的序列相同的多聚腺苷酸化概率曲线(图3B)。这个实施例表明，相较于修饰的优化序列，在优化的编码序列中在其野生型位置上添加弱基序对多聚腺苷酸化基序的预测水平没有影响。

如实施例2和3所述，在玉米(SEQ ID NO：15)和烟草以及玉米胚瞬时测试系统(SEQID NO：23)中分析该028-opt+3pA序列。然后，将获自028-opt+3pA序列的RNA和蛋白表达水平与获自028+opt序列的进行比较。

b)玉米原生质体中Axmi028基因的瞬时表达系统：

通过瞬时转染将不同的Axmi028版本转化至玉米原生质体。由双倍版本的组成型病毒35S启动子(Guilley等人1982)驱动的028-WT、028-opt、028-optpA和028-opt3pA基因克隆到pD35衍生的载体中(http://www.dna-cloning.com/)，向各个Axmi028版本添加N端His标签和C端Myc标签。其还含有nptII新霉素磷酸转移酶基因，这赋予对组成型nos启动子所表达的卡那霉素的抗性(Depicker等人1982)，从而形成质粒pD35-nH-cM-Axmi028-wt、pD35-nH-cM-Axmi028-opt、pD35-nH-cM-Axmi028-optpA、pD35-nH-cM-Axmi028-opt3pA(分别为SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32)。根据PEG介导的植物原生质体转化方案(Sheen，2002)，将这四种载体连同不表达Axmi028但表达报道基因td-番茄的对照载体(SEQ ID NO：33)转染至玉米品系A188的玉米原生质体中。转染后48h通过离心收获原生质体，通过Western分析来分析总蛋白中Axmi028版本的存在，其中所述Western分析使用荧光染料CF680标记的第一抗体抗6X His IgG(通过过滤器Alexa 680进行N端His标签检测)、荧光染料Cy3标记的第一抗体抗c-Myc-Cy3(通过过滤器Alexa 546进行C端Myc标签检测)、以及作为内部对照用于检测nptII的nptII抗体和第二HRP-缀合抗体。在四种Axmi028构建体之间比较了Axmi028蛋白的水平，该水平对nptII蛋白表达进行了归一化。图8描述了Axmi028蛋白的相对表达强度。通过N端His标签(检测：荧光过滤器Alexa680)和C端Myc标签(检测：荧光过滤器Alexa546)，进行全长Axmi028版本的检测。在所有样品中，作为内部转化对照的nptII检测(检测：化学发光)是可行的。在每个泳道内，检测到的c-Myc和6His信号的强度被设置成与nptII信号相关，如通过软件Image Lab 5.2.1，BioRad计算所得的。

Axmi028瞬时测定的结论：

图6A显示在瞬时028-Luc玉米测定中，来自028-WT-Luc序列的荧光素酶的表达是来自028-opt-Luc序列的表达的10％。与获自028-opt-Luc序列的相比，将3个或全部polyA基序添加至优化的序列并不降低萤光素酶的表达。

图8显示瞬时转化后玉米原生质体中Axmi028-WT、028-opt、028-optpA和028-opt3pA的蛋白表达。信号检测只可能用于优化的版本，但不可用于WT。与获自028-opt序列的相比，将3个多聚腺苷酸化基序加入到优化的序列中没有降低表达。在该测定中，相较于028-opt和028-opt-pA的表达，加入3个多聚腺苷酸化基序产生更高的蛋白表达水平。相比之下，028-opt-pA的表达低于028-opt的表达。

Axmi100

检测C端截短序列的Ami100野生型中是否存在可保留在优化的序列中的弱多聚腺苷酸化基序。发现3个AATCAA基序，这些在玉米CDSv3数据库中被过度表达。经过优化的序列已经有存在于其1788bp的野生型位置上的AAGCAT基序。这个基序在玉米CDS v3数据集中被过度表达(152％的实际/理论)。将三个AATCAA基序中的前两个引入优化的序列(位置13bp和1192bp)，在野生型位置上给出优化编码序列中鉴定的三个弱多聚腺苷酸化基序。该序列100opt+3pA如SEQ ID NO：14所示(图4D)最终包含6个弱多聚腺苷酸化基序，并且不包含任何最强ATAAAA、CATAAA、ATACTA、ATTAAA、AATTAA和ATTAAT多聚腺苷酸化基序中。通过PASPA进行分析(图5D)，对于Axmi028+3pA，发现得到了和充分优化的序列相同的多聚腺苷酸化概率曲线(图5B)。

如实施例2和3所述，在玉米(SEQ ID NO：16)以及烟草和玉米胚瞬时测试系统(SEQID NO：24)中分析该100-opt+3pA序列。然后，将获自100-opt+3pA序列的RNA和蛋白表达的水平与获自100-opt序列的进行比较。

通过使用抗Axmi100蛋白的多克隆抗体，在相同的样品上进行Western印记分析。结果与图6所示的结果一致：多聚腺苷酸化信号的存在使得可以获得良好的蛋白表达，其优于没有加入多聚腺苷酸化的优化蛋白的表达，并且优于已加入所有野生型多聚腺苷酸化的优化蛋白的表达，然而野生型蛋白不能正确表达(数据未显示)。

在瞬时测定中Axmi100表达的结论：

图6B显示在瞬时Axmi100-Luc测定中，来自100-WT-Luc序列的荧光素酶的表达是来自100-opt-Luc序列的表达的17％。与获自100-opt-Luc序列的相比，将3个polyA基序添加至优化的序列中并不降低萤光素酶的表达。然而，添加所有polyA基序将萤光素酶的表达降低至100-opt-Luc序列的11％。

Western印记，其观察的是蛋白的量而不是活性，证实图6B所示的结果。

实施例6：基因的稳定表达测试，所述基因是优化的玉米密码子，但含有至少三个 多聚腺苷酸化基序

Axmi028

基本按照Ishida等人(1996)的描述，将实施例2和5中描述的菌株(028-WT+GUS、028-WT+Cyan、028-opt+GUS、028-opt+Cyan、028-opt+pA+GUS、028-opt+pA+Cyan、028-opt+3pA+GUS和028-opt+3pA+Cyan)转化至玉米。对于每个构建体，产生至少10个具有完整T-DNA的独立单拷贝转化体。对T0叶材料进行QRT-PCR和Western分析。将028-WT植物的叶Axim028表达和蛋白水平与028-opt和028-opt+3pA转化体进行比较。

在来自转化有Axmi028+GUS构建体的植物的玉米叶蛋白提取物上(图7A)、用针对C-Myc标签([9E10]-芯片等级ab32”(abcam))的抗体进行Western印迹分析。在用028-WT基因转化的植物中未检测到Axmi028蛋白。在用028-opt、028-opt+3pA和028-opt+pA序列转化的植物中可观察到Axmi028蛋白表达。这种表达在用028-opt+3pA转化的植物中似乎最高。

Axmi100

如上针对Axmi028所述的，将不同版本的axmi100转化至玉米。在叶饲养测定中，将100-opt和100-opt+3pA转化的植物中鳞翅目抗性水平与100-WT转化体的水平进行比较。

在来自转化有Axmi100+GUS构建体的植物的玉米叶蛋白提取物上(图7B)、用Axmi100多克隆抗体进行Western印迹分析。在用100-WT基因转化的植物中未检测到Axmi100蛋白。在用100-opt、100-opt+3pA和100-opt+pA序列转化的植物中可观察到Axmi100蛋白表达。在100-opt+pA转化体中表达似乎最不稳健，其中10个转化植物中只有5个表达显著水平的Axmi100蛋白。使用3'和5'引物对(SEQ ID 25-28)进行的RT-QPCR分析也显示玉米转化体中100-opt+pA的转录水平低于100-opt和100-opt+3pA转化体中获得的转录水平(图9)。

从这些结果可以得出结论，基因优化是获得Axmi028和Axmi100蛋白表达所必需的。加入弱多聚腺苷酸化基序不影响蛋白的表达。与优化的基因序列相比，在优化的序列中存在3个或更多个弱的多聚腺苷酸化基序不会损害蛋白表达或可以改善表达。然而，将所有polyA基序重新引入到优化序列中可降低获得与优化基因所得的蛋白表达水平相同的水平的机会。

参考文献

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序列表

<110> 吉奈克蒂夫公司

<120> 用于基因优化的方法

<130> BRV108 - WO

<150> EP 15306105.6

<151> 2015-07-06

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1891

<212> DNA

<213> Axmi028 - 缺少C-端结晶结构域的野生型序列(028-WT)

<400> 1

atgaatcaaa aaaactatga aattataggt gcttcaacaa acggcacaat tgaattacct 60

gaagattaca acactatagt cagcccctat gatgctccag catccgttac tacaactatt 120

gaaattactg gaaccatact aagcgattta ggtgttccag gagcatcatc agttagttta 180

cttttgaata aacttataaa tctattatgg ccaaatgata ccaatactgt gtgggggaca 240

ttcggaaaag aaaccgctga tcttctaaat gaagtgttat ctccagatga tccagtagta 300

aaagatgcaa ataccatttt aaaaggaata aacggatccc ttaacttata tttaaatgca 360

cttgaaatat ggaaaaaaga ccccaacaac ttaactacca tagagaatgt cacagattac 420

tttcgtagtt tgaatgtggt ttttacacat gatatgcctt catttgctgt acctggatat 480

gaaacgaagt tattaacaat ttatgcacaa gctgcaaatc ttcatttact tttattaaga 540

gatgcttcta ggtttggaga aggttgggga ctgactcaag aaatcataaa tactaactat 600

aatgatcaat tacgattgac agcagaatac acggaccatt gtgtaaagtg gtacaacgca 660

ggattagaaa aattaaaagg gaatttaact ggggaaaatt ggtatactta taatagattt 720

cgtagagaaa tgacgttaat ggtgttagac gtagttgcat tatttccaaa ctacgataca 780

cgaatgtacc cgatcggaac gtcatcagaa cttacaagaa tgatctatac agatccaatt 840

gcttatacac aaagcgatcc atggtacaag ataacatctc tttctttttc aaatattgaa 900

aacagtgcga ttccaagtcc ttctttcttc aggtggctaa aatccgtttc aattaatagc 960

cagtggtggg gcagtggtcc tagtcaaacc tactattggg ttggacatga attggtatat 1020

tctaattcaa attctaatca atcacttaaa gttaaatatg gagaccctaa ttcttttatt 1080

gagccccctg attctttcag tttttcttct acggatgttt acagaacaat atctgttgtt 1140

agaaattcag taagtaatta tatagtaagt gaagttcgat tcaattcaat tagtagtaca 1200

aatcaaatta gtgaagaaat ttataaacat caatcaaatt ggagtagaca agaaaccaaa 1260

gattcaatta cagaactatc cttagctgct aatcccccaa caacatttgg aaatgtagca 1320

gaatacagtc atagattagc atatatttca gaggcatacc aaagtcacaa cccatcaaaa 1380

tacccaacct acattcctgt attcggttgg acgcatacaa gcgtacgtta cgataataaa 1440

atcttcccgg acaaaatcac tcaaattcca gctgttaaaa gctcctcagc ccaaggtgga 1500

tcatggaaaa atatagtgaa aggccccggg tttactggag gagatgtgac aactgcagtt 1560

tcgccagcaa ctgtaaccga cataataaaa atacaagtta ctctagatcc aaattcactt 1620

tcacaaaaat atcgtgcacg acttcgctat gcttccaatg catttgtacc agctacattg 1680

tatacaaata caagtagtaa ttataatttt gaacttaaaa aaggtacaac tgaacagttt 1740

acaacatata attcatacca gtatgtagat atcccaggtt caatacaatt taataatact 1800

tctgatacag tctctgttta tttgcatatg gattcaacat ctaatgtaaa cgttcatgta 1860

gatagaattg aattcattcc aatagatgta a 1891

<210> 2

<211> 1890

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi028 优化的序列(028-opt)

<400> 2

atgaaccaga agaactacga gatcatcggc gcgtccacca acgggacgat cgagctgccc 60

gaggattaca acacgatcgt cagcccgtac gacgcgcctg catcagtgac aaccaccatc 120

gagatcacgg ggacaatcct gtctgacctc ggtgtgcctg gagcaagttc agtcagcctt 180

ctgctcaaca agctgatcaa cctgctctgg ccgaacgaca ccaacaccgt gtggggtacg 240

ttcggcaagg agacggccga tctcctcaac gaggtcctgt cacctgatga cccagttgtc 300

aaggacgcta atacgatcct caaggggatc aacgggtcgc tgaacctcta cctgaacgcc 360

ctcgagatct ggaagaagga cccgaacaac ctgactacta tcgagaacgt gactgactac 420

ttccggtcac tcaacgtcgt gttcacgcac gacatgccct cgttcgccgt ccctggatac 480

gagaccaagc tgctcaccat ctacgcccag gctgcaaacc tccatctgct gttgctcagg 540

gacgcatcac gtttcggtga gggatggggt ttgacccagg agatcatcaa cacgaactac 600

aacgaccagc tccgcctcac cgccgaatac accgaccact gcgtgaagtg gtacaacgcc 660

ggcttggaga agctgaaggg caacctcacg ggtgagaact ggtacacgta caaccggttc 720

cgcagggaga tgaccctcat ggtgctggac gtggtcgcat tgttcccaaa ctacgacacc 780

cgcatgtacc cgatcgggac atcaagcgag cttacccgta tgatctacac tgaccccatc 840

gcctacaccc agtccgaccc atggtacaag atcacgtccc tgagcttctc gaacatcgag 900

aacagcgcga tcccctcccc atcgttcttc cgctggctca agtccgtcag cattaactcc 960

cagtggtggg gttccggacc ttcacaaacc tactactggg tggggcacga actggtctac 1020

agcaacagca acagcaacca gtcgctgaag gtgaagtacg gcgaccctaa cagcttcatc 1080

gagcccccgg attccttctc cttcagcagc acggacgtgt acaggaccat ctcagtcgtg 1140

cgtaattccg tgtcgaacta catcgtgtcg gaggtgcggt tcaacagcat ctcctccacc 1200

aaccagatca gcgaggaaat ctacaagcac cagtctaact ggagccggca ggagacaaag 1260

gactcaatca ccgagctgag cctggccgcc aacccgccaa ccacgttcgg aaacgttgcc 1320

gagtacagtc accgcctggc ttacatctca gaggcgtacc agtctcacaa cccatctaag 1380

tacccgacct atatccccgt gttcgggtgg acccacacat ccgtgaggta cgacaacaag 1440

attttcccgg acaagatcac gcagatcccc gcggttaaga gtagctcagc tcagggggga 1500

agctggaaga atatcgtcaa ggggcccgga ttcacgggtg gagacgtgac gacggcggtt 1560

tcacctgcaa ctgttacgga tattatcaag atccaggtta cccttgatcc caacagtctg 1620

agccagaagt atcgggcacg ccttcgctac gccagcaacg ccttcgtccc ggcaaccctt 1680

tatacgaaca cctcgtcaaa ctacaacttc gaactgaaga agggcacgac tgagcagttc 1740

acgacctaca acagctacca gtacgtggac atccccggca gcatccagtt caacaatacg 1800

tccgacaccg tgtcggtcta cctgcacatg gactcaacct cgaacgtgaa cgtgcacgtg 1860

gaccggatcg agttcatccc gatcgactga 1890

<210> 3

<211> 1890

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有全部存在于WT序列中的AATAAA-样基序的Axmi028优化序列(028-opt+pA)

<400> 3

atgaatcaaa agaactatga aatcatcggc gcgtccacca acgggacgat cgagctgccc 60

gaggattaca acacgatcgt cagcccgtac gacgcgcctg catcagtgac aaccaccatc 120

gagatcacgg ggacaatact atctgacctc ggtgtgcctg gagcaagttc agtcagcctt 180

ctgctcaata aactgatcaa cctgctctgg ccgaacgaca ccaacaccgt gtggggtacg 240

ttcggcaagg agacggccga tctcctcaac gaggtcctgt cacctgatga cccagttgtc 300

aaggacgcta atacgatcct caagggaata aacgggtcgc tgaacctcta cctgaacgcc 360

ctcgagatct ggaagaagga cccgaacaac ctgactacta tcgagaacgt gactgactac 420

ttccggtcac tcaacgtcgt gttcacgcac gacatgccct cgttcgccgt ccctggatat 480

gaaaccaagc tgctcaccat ctacgcccag gctgcaaacc tccatctgct gttgctcagg 540

gacgcatcac gtttcggtga gggatggggt ttgacccagg agatcataaa tactaactac 600

aacgaccagc tccgcctcac cgccgaatac accgaccact gcgtgaagtg gtacaacgcc 660

ggcttggaga aattaaaggg caacctcacg ggtgagaact ggtacacgta caaccggttc 720

cgcagggaga tgaccctcat ggtgctggac gtggtcgcat tgttcccaaa ctacgacacc 780

cgcatgtacc cgatcgggac atcaagcgag cttacccgta tgatctacac tgaccccatc 840

gcctacaccc agtccgaccc atggtacaag atcacgtccc tgagcttctc gaacatcgag 900

aacagcgcga tcccctcccc atcgttcttc cgctggctca agtccgtctc aattaattcc 960

cagtggtggg gttccggacc ttcacaaacc tactactggg tggggcacga actggtctac 1020

agcaacagca acagcaatca atcgctgaag gtgaagtacg gcgaccctaa cagcttcatc 1080

gagcccccgg attccttctc cttcagcagc acggacgtgt acaggaccat ctcagtcgtg 1140

cgtaattccg tgtcgaacta catcgtgtcg gaggtgcggt tcaacagcat ctcctccacc 1200

aatcaaatca gcgaggaaat ctacaagcac caatcaaact ggagccggca ggaaaccaag 1260

gactcaatca ccgagctgag cctggccgcc aacccgccaa ccacgttcgg aaacgttgcc 1320

gaatacagtc accgcctggc ttacatctca gaggcgtacc agtctcacaa cccatcaaaa 1380

tacccgacct atatccccgt gttcgggtgg acccacacat ccgtgaggta cgacaataaa 1440

attttcccgg acaagatcac gcagatcccc gcggttaaga gtagctcagc tcagggggga 1500

agctggaaaa atatcgtcaa ggggcccgga ttcacgggtg gagacgtgac gacggcggtt 1560

tcacctgcaa ctgttacgga tataataaaa atacaggtta cccttgatcc caacagtctg 1620

agccaaaaat atcgggcacg ccttcgctac gccagcaacg ccttcgtccc ggcaaccctt 1680

tatacgaata catcgtcaaa ctacaacttc gaactgaaga agggcacgac tgagcagttc 1740

acgacatata acagctacca gtacgtggac atccccggct caatacagtt caataatacg 1800

tccgacaccg tgtcggtcta cctgcacatg gactcaacct cgaacgtgaa cgtgcacgtg 1860

gaccggatcg agttcatccc gatcgactga 1890

<210> 4

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 缺少C-端结晶结构域的野生型序列(100-WT)

<400> 4

atgaatcgaa ataatcaaaa tgaatgtgaa attattgatg cccctcattg tggatgtccg 60

tcagatgatg ttgtgaaata tcctttggca agtgacccaa atgcagcgtt acaaaatatg 120

aactataaag attatttaca aacgtatgat ggagactata cagattctct tattaatcct 180

aacttatcta ttaatactag ggatgtacta caaacaggta ttactattgt gggaagaata 240

ctagggtttt taggtgttcc atttgcgggg caactagtta ctttctatac ctttctctta 300

aatcagttat ggccaactaa tgataatgca gtatgggaag cttttatgga acaaatagaa 360

gggattatcg ctcaaagaat atcggagcaa gtagtaagga atgcgcttga tgccttaact 420

ggaatacacg attattatga ggaatattta gcggcattag aggagtggct ggaaagaccg 480

agcggcgcaa gggctaactt agcttttcag aggtttgaaa atctacatca attatttgta 540

agtcagatgc caagttttgg tagtggtcct ggtagtgaaa gagatgcggt agcattgctg 600

acagtatatg cacaagcagc gaatctccat ttgttgttat taaaagatgc agaaatttat 660

ggggcgagat ggggacttca acaaggccaa attaatttat attttaatgc tcaacaagat 720

cgcactcgaa tttataccaa tcattgtgtg gcaacatata atagaggatt aggagactta 780

agaggcacaa atactgaaag ttggttaaat taccatcaat tccgtagaga gatgacatta 840

atggcaatgg atttagtggc attattccca tactataatt tacgacaata tccaaacggg 900

gcaaaccctc agcttacacg tgatgtatat acagatccga ttgtatttaa tccatcagct 960

aatgtaggat tatgtagacg ttggggcaat aacccatata atacattttc ggaacttgaa 1020

aatgccttca ttcgcccgcc acattttttt gataggttga atagtttaac aattagtaga 1080

aatagatttg acgttggatc aaactttata gagccttggt ctggacatac gttacgccgt 1140

agttttctga acacttcggc agtacaagaa gatagttatg gccaaattac taatcaaaga 1200

acaacaatta atctaccagc taatggaact gggcgagtgg agtcaacagc agtagatttt 1260

cgtagcgcgc ttgtggggat atacggcgtt aatagagctt cttttattcc cggtggtgtg 1320

tttaatggca cgactcaacc ttctactgga ggatgtagag atttgtatga ttcaagtgat 1380

gaattaccac cagaagaaag tagtggaacg tttgaacata ggttatctca tgttaccttt 1440

ttaagtttta caactaatca ggctggatcc atagccaatg cagggcgcgt ccctacttat 1500

gtctggaccc atcgagatgt ggaccttaat aacacgatta ctgcagatag aattacacac 1560

ttaccattga taaaatcaaa tgtgcaacgc agtggtcgcg cagtaaaagg accaggattt 1620

acaggaggag atgtactccg aatgtcatca agtgatgctg atatatcaat aataggaata 1680

acggcaggtg caccgctaac acaacaatat cgtataagat tgcgttatgc ttcaaatgta 1740

gatgttacta tccgtttagt gagacaggac acccaaagta atataggaag cataaactta 1800

ttacgtacaa tgaacagtgg agaggagtca aggtatgaat catatcgtac tgtagagatg 1860

cctggtaatt ttagaatgac tagtagttca gcacagattc gactatttac tcaaggactt 1920

cgagtgaatg gagaattgtt tcttgatagt cttgaattta tcccagttaa tccgacacgt 1980

gaggcggaag aggatttaga agcagcgaag aaagcggtga cgagcttgtt tacacgttaa 2040

<210> 5

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi100 优化的序列(100-opt)

<400> 5

atgaacagga acaaccaaaa tgaatgtgag atcattgatg ctcctcattg tggctgccct 60

tctgatgatg tggtgaaata tcctcttgct tcagatccaa atgctgctct ccagaacatg 120

aactacaagg actacctcca aacatatgat ggagactaca ccgacagctt gatcaacccc 180

aacctctcca tcaacacaag agatgtgctg caaactggca tcaccattgt tggaaggatc 240

ttgggcttcc tcggcgtccc cttcgccggc cagctggtga ccttctacac cttcctcctc 300

aaccagctat ggccaacaaa tgacaatgct gtttgggagg ccttcatgga gcagattgaa 360

ggcatcattg ctcaaaggat ctccgagcaa gtggtgagaa atgctctgga tgctctcacc 420

ggcatccatg actactacga ggagtacctc gccgcgctgg aagaatggct ggagaggcca 480

tcaggagcaa gggccaacct cgccttccaa agatttgaga acctccacca gctgttcgtg 540

agccagatgc cctccttcgg cagcggccct ggatcagaaa gagatgctgt ggcgctgctc 600

accgtctatg ctcaagctgc caacctccat ctgctgctgc tgaaggatgc tgagatttat 660

ggagctagat ggggcctcca gcaaggccag atcaacctct acttcaatgc tcagcaggac 720

aggacaagga tctacaccaa ccactgcgtc gccacctaca acagaggcct tggagatctc 780

cgcggcacca acactgaatc atggctgaac taccaccagt tcagaaggga gatgaccttg 840

atggccatgg atctggtggc gctgttcccc tactacaacc tccgccaata tccaaatgga 900

gctaatcctc agctgacaag agatgtctac acagatccca tcgtgttcaa cccttctgca 960

aatgttggcc tctgccggag atggggcaac aacccctaca acaccttctc agagctggag 1020

aatgccttca tcaggccgcc gcacttcttc gaccgcctca acagcctcac catcagcagg 1080

aacagatttg atgttggaag caacttcatc gagccatgga gcggccacac cttgaggagg 1140

agcttcctca acacctctgc tgttcaagaa gattcatatg gccagatcac caaccagagg 1200

accaccatca accttccagc aaatggaact ggaagagttg aaagcaccgc cgtggacttc 1260

agatctgctc tggtgggcat ctatggagtg aacagagctt ccttcatccc cggcggcgtg 1320

ttcaatggca ccacccagcc aagcaccggc ggctgccgag atctctatga ttcttcagat 1380

gagctgccgc cagaagaaag cagcggcacc ttcgagcacc gcctcagcca tgtcaccttc 1440

ttgagcttca ccaccaacca agctggaagc attgcaaatg ctggaagggt gccaacatat 1500

gtttggaccc acagagatgt tgatctaaac aacaccatca ccgccgacag gatcacccat 1560

cttcctctca tcaagagcaa tgttcaaaga agtggccgcg ccgtcaaggg gccaggcttc 1620

actggaggag atgtgctgag gatgagctcc tcagatgctg acatctccat catcggcatc 1680

accgccggcg ctcctctcac ccagcagtac aggatcaggc tgcgctatgc aagcaatgtt 1740

gatgtcacca tcaggctggt gaggcaggac acccaaagca acattggaag catcaacctc 1800

ctccgcacca tgaactcagg agaagaaagc agatatgaaa gctacaggac ggtggagatg 1860

ccaggaaact tcagaatgac aagcagctcg gcgcagatcc gcctcttcac ccaaggcctc 1920

cgcgtcaatg gagagctgtt cctggacagc ttggagttca tccccgtcaa cccaacaaga 1980

gaagcagaag aagatctgga ggccgccaag aaggccgtca ccagcctctt caccaggtaa 2040

<210> 6

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有全部存在于WT序列中的AATAAA-样基序的Axmi100优化序列(100-opt+pA)

<400> 6

atgaacagga ataatcaaaa tgaatgtgag atcattgatg ctcctcattg tggctgccct 60

tctgatgatg tggtgaaata tcctcttgct tcagatccaa atgctgctct ccaaaatatg 120

aactacaagg actacctcca aacatatgat ggagactaca ccgacagctt gattaatccc 180

aacctctcca ttaatactag agatgtgctg caaactggca tcaccattgt tggaaggata 240

ctaggcttcc tcggcgtccc cttcgccggc cagctggtga ccttctacac cttcctcctc 300

aaccagctat ggccaacaaa tgacaatgct gtttgggagg ccttcatgga gcagattgaa 360

ggcatcattg ctcaaaggat ctccgagcaa gtggtgagaa atgctctgga tgctctcacc 420

ggaatacatg actactacga ggagtacctc gccgcgctgg aagaatggct ggagaggcca 480

tcaggagcaa gggccaacct cgccttccaa agatttgaga acctccacca gctgttcgtg 540

agccagatgc cctccttcgg cagcggccct ggatcagaaa gagatgctgt ggcgctgctc 600

accgtctatg ctcaagctgc caacctccat ctgctgctat taaaggatgc tgagatttat 660

ggagctagat ggggcctcca gcaaggccaa attaatctct acttcaatgc tcagcaggac 720

aggacaagga tctacaccaa ccactgcgtc gccacatata acagaggcct tggagatctc 780

cgcggcacca acactgaatc atggctgaac taccaccagt tcagaaggga gatgacatta 840

atggccatgg atctggtggc gctgttccca tactacaacc tccgccaata tccaaatgga 900

gctaatcctc agctgacaag agatgtctac acagatccca tcgtgttcaa cccttctgca 960

aatgttggcc tctgccggag atggggcaac aacccatata atacattctc agagctggag 1020

aatgccttca tcaggccgcc gcacttcttc gaccgcctca acagcctcac catcagcagg 1080

aacagatttg atgttggaag caacttcatc gagccatgga gcggccacac cttgaggagg 1140

agcttcctca acacctctgc tgttcaagaa gattcatatg gccagatcac caatcaaagg 1200

accacaatta atcttccagc aaatggaact ggaagagttg aaagcaccgc cgtggacttc 1260

agatctgctc tggtgggcat ctatggagtg aacagagctt ccttcatccc cggcggcgtg 1320

ttcaatggca ccacccagcc aagcaccggc ggctgccgag atctctatga ttcttcagat 1380

gagctgccgc cagaagaaag cagcggcacc ttcgagcacc gcctcagcca tgtcaccttc 1440

ttgagcttca ccaccaacca agctggaagc attgcaaatg ctggaagggt gccaacatat 1500

gtttggaccc acagagatgt tgatctaaac aacaccatca ccgccgacag gatcacccat 1560

cttcctctca taaaatcaaa tgttcaaaga agtggccgcg ccgtcaaggg gccaggcttc 1620

actggaggag atgtgctgag gatgagctcc tcagatgctg acatctcaat aatcggcatc 1680

accgccggcg ctcctctcac ccagcagtac aggatcaggc tgcgctatgc aagcaatgtt 1740

gatgtcacca tcaggctggt gaggcaggac acccaaagca acattggaag cataaacctc 1800

ctccgcacca tgaactcagg agaagaaagc agatatgaaa gctacaggac ggtggagatg 1860

ccaggaaact tcagaatgac aagcagctcg gcgcagatcc gcctcttcac ccaaggcctc 1920

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tcaatggaga gctgttcctg gacagcttgg agttcatccc cgtcaaccca acaagagaag 3960

cagaagaaga tctggaggcc gccaagaagg ccgtcaccag cctcttcacc aggggattga 4020

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tatatataat aattatcatt aattagtagt aatataatat ttcaaatatt tttttcaaaa 4260

taaaagaatg tagtatatag caattgcttt tctgtagttt ataagtgtgt atattttaat 4320

ttataacttt tctaatatat gaccaaaatt tgttgatgtg caggtacgcg gaatacttcg 4380

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ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga 6000

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<210> 12

<211> 6135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pZmUbi-Axmi100(opt+pA)-LUC-nosTerm

<400> 12

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tgtccggtta tgtaaacaat ccggaagcga ccaacgcctt gattgacaag gatggatggc 5460

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cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 6060

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有3个存在于WT序列中的AATAAA-样基序的Axmi028优化序列(028-opt+3pA)

<400> 13

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<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有3个存在于WT序列中的AATAAA-样基序的Axmi100优化序列(100-opt+3pA)

<400> 14

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ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc 60

acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga 120

ataatataat ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca 180

gttagacatg gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct 240

ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt 300

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tcggaggtgc ggttcaacag catctcctcc accaaccaga tcagcgagga aatctacaag 1260

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<210> 19

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi028 h(opt+pA)m

<400> 19

atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaatc aaaagaacta tgaaatcatc 60

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<211> 2106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi100 h(WT)m

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<210> 21

<211> 2106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi100 h(opt)m

<400> 21

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<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi100 h(opt+pA)m

<400> 22

atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaaca ggaataatca aaatgaatgt 60

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gcttcagatc caaatgctgc tctccaaaat atgaactaca aggactacct ccaaacatat 180

gatggagact acaccgacag cttgattaat cccaacctct ccattaatac tagagatgtg 240

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caaagatttg agaacctcca ccagctgttc gtgagccaga tgccctcctt cggcagcggc 600

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catctgctgc tattaaagga tgctgagatt tatggagcta gatggggcct ccagcaaggc 720

caaattaatc tctacttcaa tgctcagcag gacaggacaa ggatctacac caaccactgc 780

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aactaccacc agttcagaag ggagatgaca ttaatggcca tggatctggt ggcgctgttc 900

ccatactaca acctccgcca atatccaaat ggagctaatc ctcagctgac aagagatgtc 960

tacacagatc ccatcgtgtt caacccttct gcaaatgttg gcctctgccg gagatggggc 1020

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ttcgaccgcc tcaacagcct caccatcagc aggaacagat ttgatgttgg aagcaacttc 1140

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gaagattcat atggccagat caccaatcaa aggaccacaa ttaatcttcc agcaaatgga 1260

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agcattgcaa atgctggaag ggtgccaaca tatgtttgga cccacagaga tgttgatcta 1560

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tcctcagatg ctgacatctc aataatcggc atcaccgccg gcgctcctct cacccagcag 1740

tacaggatca ggctgcgcta tgcaagcaat gttgatgtca ccatcaggct ggtgaggcag 1800

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taatga 2106

<210> 23

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi028 h(opt+3pA)m

<400> 23

atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaacc agaagaacta cgagatcatc 60

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caggctgcaa acctccatct gctgttgctc agggacgcat cacgtttcgg tgagggatgg 600

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tacaccgacc actgcgtgaa gtggtacaac gccggcttgg agaagctgaa gggcaacctc 720

acgggtgaga actggtacac gtacaaccgg ttccgcaggg agatgaccct catggtgctg 780

gacgtggtcg cattgttccc aaactacgac acccgcatgt acccgatcgg gacatcaagc 840

gagcttaccc gtatgatcta cactgacccc atcgcctaca cccagtccga cccatggtac 900

aagatcacgt ccctgagctt ctcgaacatc gagaacagcg cgatcccctc cccatcgttc 960

ttccgctggc tcaagtccgt cagcattaac tcccagtggt ggggttccgg accttcacaa 1020

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tcagaggcgt accagtctca caacccatct aagtacccga cctatatccc cgtgttcggg 1440

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<210> 24

<211> 2106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Axmi100 h(opt+3pA)m

<400> 24

atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaaca ggaacaatca aaatgaatgt 60

gagatcattg atgctcctca ttgtggctgc ccttctgatg atgtggtgaa atatcctctt 120

gcttcagatc caaatgctgc tctccagaac atgaactaca aggactacct ccaaacatat 180

gatggagact acaccgacag cttgatcaac cccaacctct ccatcaacac aagagatgtg 240

ctgcaaactg gcatcaccat tgttggaagg atcttgggct tcctcggcgt ccccttcgcc 300

ggccagctgg tgaccttcta caccttcctc ctcaaccagc tatggccaac aaatgacaat 360

gctgtttggg aggccttcat ggagcagatt gaaggcatca ttgctcaaag gatctccgag 420

caagtggtga gaaatgctct ggatgctctc accggcatcc atgactacta cgaggagtac 480

ctcgccgcgc tggaagaatg gctggagagg ccatcaggag caagggccaa cctcgccttc 540

caaagatttg agaacctcca ccagctgttc gtgagccaga tgccctcctt cggcagcggc 600

cctggatcag aaagagatgc tgtggcgctg ctcaccgtct atgctcaagc tgccaacctc 660

catctgctgc tgctgaagga tgctgagatt tatggagcta gatggggcct ccagcaaggc 720

cagatcaacc tctacttcaa tgctcagcag gacaggacaa ggatctacac caaccactgc 780

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accttcgagc accgcctcag ccatgtcacc ttcttgagct tcaccaccaa ccaagctgga 1500

agcattgcaa atgctggaag ggtgccaaca tatgtttgga cccacagaga tgttgatcta 1560

aacaacacca tcaccgccga caggatcacc catcttcctc tcatcaagag caatgttcaa 1620

agaagtggcc gcgccgtcaa ggggccaggc ttcactggag gagatgtgct gaggatgagc 1680

tcctcagatg ctgacatctc catcatcggc atcaccgccg gcgctcctct cacccagcag 1740

tacaggatca ggctgcgcta tgcaagcaat gttgatgtca ccatcaggct ggtgaggcag 1800

gacacccaaa gcaacattgg aagcatcaac ctcctccgca ccatgaactc aggagaagaa 1860

agcagatatg aaagctacag gacggtggag atgccaggaa acttcagaat gacaagcagc 1920

tcggcgcaga tccgcctctt cacccaaggc ctccgcgtca atggagagct gttcctggac 1980

agcttggagt tcatccccgt caacccaaca agagaagcag aagaagatct ggaggccgcc 2040

aagaaggccg tcaccagcct cttcaccagg gagcagaagc tgatctccga agaggacctc 2100

taatga 2106

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cMyc_F引物

<400> 25

gaagctgatc tccgaagagg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cMyc_R引物

<400> 26

tgaaccaaac gaggaagatg 20

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> His-tag_3_F引物

<400> 27

ttggtgtaag ctattttctt tgaa 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> His-tag_3_R引物

<400> 28

gatgtgccat ggtggagata 20

<210> 29

<211> 7211

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pD35-nH-cM-Axmi028-wt

<400> 29

gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 60

ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 120

acagctatga ccatgattac gccaagctcg aaattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc 180

tggagctcac tggattttgg ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca 240

aatacaaata catactaagg gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctataaga 300

accctaattc ccttatctgg gaactactca cacattattc tggagaaaaa tagagagaga 360

tagatttgta gagagagact ggtgattttt gcgggtcccg ctcagaagaa ctcgtcaaga 420

aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 480

cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 540

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tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 660

ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 720

tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 780

tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 840

gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 900

cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 960

gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt 1020

tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 1080

agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 1140

agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatccaagct 1200

cccatggtgg ccactcgagg tgcagattat ttggattgag agtgaatatg agactctaat 1260

tggataccga ggggaattta tggaacgtca gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct 1320

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tagctcatta aactccagaa acccgcggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc 1440

agttccaaac gtaaaacggc ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct 1500

taattctccg ctcatgatct agaggccatg gcggccgcta gatcgggcca acatggtgga 1560

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tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca 1740

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg 1800

acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca 1860

agtggattga tgtgaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag 1920

atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa 1980

acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg 2040

aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct 2100

ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 2160

accttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg 2220

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atgctccagc atccgttact acaactattg aaattactgg aaccatacta agcgatttag 2520

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caaatgatac caatactgtg tgggggacat tcggaaaaga aaccgctgat cttctaaatg 2640

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atatgccttc atttgctgta cctggatatg aaacgaagtt attaacaatt tatgcacaag 2880

ctgcaaatct tcatttactt ttattaagag atgcttctag gtttggagaa ggttggggac 2940

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cggaccattg tgtaaagtgg tacaacgcag gattagaaaa attaaaaggg aatttaactg 3060

gggaaaattg gtatacttat aatagatttc gtagagaaat gacgttaatg gtgttagacg 3120

tagttgcatt atttccaaac tacgatacac gaatgtaccc gatcggaacg tcatcagaac 3180

ttacaagaat gatctataca gatccaattg cttatacaca aagcgatcca tggtacaaga 3240

taacatctct ttctttttca aatattgaaa acagtgcgat tccaagtcct tctttcttca 3300

ggtggctaaa atccgtttca attaatagcc agtggtgggg cagtggtcct agtcaaacct 3360

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cggatgttta cagaacaata tctgttgtta gaaattcagt aagtaattat atagtaagtg 3540

aagttcgatt caattcaatt agtagtacaa atcaaattag tgaagaaatt tataaacatc 3600

aatcaaattg gagtagacaa gaaaccaaag attcaattac agaactatcc ttagctgcta 3660

atcccccaac aacatttgga aatgtagcag aatacagtca tagattagca tatatttcag 3720

aggcatacca aagtcacaac ccatcaaaat acccaaccta cattcctgta ttcggttgga 3780

cgcatacaag cgtacgttac gataataaaa tcttcccgga caaaatcact caaattccag 3840

ctgttaaaag ctcctcagcc caaggtggat catggaaaaa tatagtgaaa ggccccgggt 3900

ttactggagg agatgtgaca actgcagttt cgccagcaac tgtaaccgac ataataaaaa 3960

tacaagttac tctagatcca aattcacttt cacaaaaata tcgtgcacga cttcgctatg 4020

cttccaatgc atttgtacca gctacattgt atacaaatac aagtagtaat tataattttg 4080

aacttaaaaa aggtacaact gaacagttta caacatataa ttcataccag tatgtagata 4140

tcccaggttc aatacaattt aataatactt ctgatacagt ctctgtttat ttgcatatgg 4200

attcaacatc taatgtaaac gttcatgtag atagaattga attcattcca atagatgtaa 4260

agcttacgga gcagaagctg atctccgagg aggacctgta acgtgtcgac cctgctttaa 4320

tgagatatgc gagacgccta tgatcgcatg atatttgctt tcaattctgt tgtgcacgtt 4380

gtaaaaaacc tgagcatgtg tagctcagat ccttaccgcc ggtttcggtt cattctaatg 4440

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tgtcctcgac aggccttaag ggccagatct tgggcccggt acccaattcg ccctatagtg 4560

agtcgtatta caattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 4620

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aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa 4800

ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt 4860

gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa 4920

agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag 4980

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agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc 5160

cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 5220

aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 5280

accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 5340

tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 5400

gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 5460

ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 5520

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gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 5760

cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 5820

gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 5880

gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 5940

ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 6000

gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 6060

ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 6120

tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 6180

actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 6240

taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 6300

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 6360

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ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 6480

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cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 6660

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ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 6840

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 6900

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 6960

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 7020

tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 7080

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<210> 30

<211> 7211

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pD35-nH-cM-Axmi028-opt

<400> 30

accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 60

acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctcgaaa ttaaccctca 120

ctaaagggaa caaaagctgg agctcactgg attttggttt taggaattag aaattttatt 180

gatagaagta ttttacaaat acaaatacat actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg 240

agcgaaaccc tataagaacc ctaattccct tatctgggaa ctactcacac attattctgg 300

agaaaaatag agagagatag atttgtagag agagactggt gatttttgcg ggtcccgctc 360

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gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac 720

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tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag 840

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tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg 960

ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg 1020

ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg 1080

cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat 1140

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gaatatgaga ctctaattgg ataccgaggg gaatttatgg aacgtcagtg gagcattttt 1260

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aacgttgcgg ttctgtcagt tccaaacgta aaacggcttg tcccgcgtca tcggcggggg 1440

tcataacgtg actcccttaa ttctccgctc atgatctaga ggccatggcg gccgctagat 1500

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acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac 1740

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catcgtggaa aaagaagacc ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 2160

ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 2220

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tctatctctc tcgactagta tgcaccacca ccatcaccac atcgatatga accagaagaa 2340

ctacgagatc atcggcgcgt ccaccaacgg gacgatcgag ctgcccgagg attacaacac 2400

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gatcaacctg ctctggccga acgacaccaa caccgtgtgg ggtacgttcg gcaaggagac 2580

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gatcctcaag gggatcaacg ggtcgctgaa cctctacctg aacgccctcg agatctggaa 2700

gaaggacccg aacaacctga ctactatcga gaacgtgact gactacttcc ggtcactcaa 2760

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cggtgaggga tggggtttga cccaggagat catcaacacg aactacaacg accagctccg 2940

cctcaccgcc gaatacaccg accactgcgt gaagtggtac aacgccggct tggagaagct 3000

gaagggcaac ctcacgggtg agaactggta cacgtacaac cggttccgca gggagatgac 3060

cctcatggtg ctggacgtgg tcgcattgtt cccaaactac gacacccgca tgtacccgat 3120

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gctgagcctg gccgccaacc cgccaaccac gttcggaaac gttgccgagt acagtcaccg 3660

cctggcttac atctcagagg cgtaccagtc tcacaaccca tctaagtacc cgacctatat 3720

ccccgtgttc gggtggaccc acacatccgt gaggtacgac aacaagattt tcccggacaa 3780

gatcacgcag atccccgcgg ttaagagtag ctcagctcag gggggaagct ggaagaatat 3840

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tacggatatt atcaagatcc aggttaccct tgatcccaac agtctgagcc agaagtatcg 3960

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agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 5340

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 5400

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 5460

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 5520

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 5580

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 5640

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 5700

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 5760

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 5820

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 5880

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ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 6060

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ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 6180

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ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 6420

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 6480

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 6540

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cgccccgtcc ggtcctgccc gtcaccgaga tctgagatca cgcgttctag tccgcaaaaa 12720

tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctctattttt ctccagaata atgtgtgagt 12780

agttcccaga taagggaatt agggttctta tagggtttcg ctcatgtgtt gagcatataa 12840

gaaaccctta gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc 12900

taaaaccaaa atccagtgac ctgcaggcat gcaagctgat ccactagagg ccatgg 12956

Claims (7)

1.一种修饰编码非植物蛋白的编码序列的方法，其包括步骤：

a)从AAAATA、AACCAA、AAGCAT、AATAAA、AATAAT、AATACA、AATCAA、AATTAA、ATAAAA、ATACAT、ATACTA、ATATAA、ATGAAA、ATTAAA、ATTAAT和CATAAA中鉴定各个野生型多聚腺苷酸化基序序列及其在所述编码序列内的位置；

b)通过用于植物表达的密码子取代优化所述编码序列，从而获得编码所述非植物蛋白的优化的编码序列，其中优化导致去除一个或多个多聚腺苷酸化基序；以及

c)将至少一个选自AAAATA、AACCAA、AAGCAT、AATAAA、AATAAT、AATACA、AATCAA、ATAAAA、ATACAT和ATGAAA的多聚腺苷酸化基序序列重新引入优化的编码序列，其中重新引入的基序不是选自AATTAA、ATACTA、ATATAA、ATTAAA、ATTAAT和CATAAA的多聚腺苷酸化基序，从而获得修饰的编码序列，所述修饰的编码序列包含至少三个但不是全部野生型多聚腺苷酸化基序，以及所述修饰的编码序列编码所述非植物蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)中重新引入所述优化的编码序列内的各个多聚腺苷酸化基序是被重新引入和其在编码序列内的位置相对应的核酸位置。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤c)中引入的多聚腺苷酸化基序序列是选自ATGAAA、AAGCAT、AACCAA、AATCAA或者AAAATA的多聚腺苷酸化基序序列。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中修饰的编码序列包含3至10个选自基序ATGAAA、AAGCAT、AACCAA、AATCAA和AAAATA的多聚腺苷酸化基序的组合，并且其中修饰的编码序列包含至少3个野生型编码序列中所鉴定的多聚腺苷酸化基序的组合。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中修饰的编码序列包含3至6个选自基序ATGAAA、AAGCAT、AACCAA、AATCAA和AAAATA的多聚腺苷酸化基序的组合，并且其中修饰的编码序列包含至少3个野生型编码序列中所鉴定的多聚腺苷酸化基序的组合。

6.一种制备表达盒的方法，所述表达盒包含编码非植物蛋白的修饰的编码序列，所述方法包括：

a)将权利要求1至5中任一项所述的方法应用至编码所述非植物蛋白的编码序列，以及

b)将启动子和终止子可操作地连接至所述修饰的编码序列来获得用于在植物中进行表达的构建体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中编码序列编码杀虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)蛋白。

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