CN103597070A - 合成基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特别适合于在植物中良好表达的编码感兴趣蛋白质的合成核酸序列。要求保护的合成序列利用的植物优化密码子大致为它们在天然存在于植物物种中的基因中平均利用的相同频率。本发明进一步包括使用合成DNA序列，该合成DNA序列用于除草剂耐受性、水和/或热应激耐受性、健康的油修饰及用于转化标志物基因和选择标志物基因。教导了含有合成序列的DNA构建体和转基因植物，也教导了在农业中使用所述植物的方法和组合物。

Description

合成基因
发明背景
为了在转基因植物中实现异源蛋白质的期望表达水平，已经发现了有益的是以多种方式改变天然的(有时称为野生型或初始的)DNA编码序列，例如使得密码子选择更紧密匹配宿主植物物种的密码子选择，和/或因此编码序列的G+C含量更紧密匹配通常存在于宿主植物物种的编码序列中的G+C水平，和/或使得除去使mRNA不稳定的某些序列。例如，已经使用这些方法中的一种或多种来改善苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t.)晶体蛋白昆虫毒素在植物中的表达。参见例如美国专利No.5380301，美国专利No.5625136，美国专利No.6218188，美国专利No.6340593，美国专利No.6673990，美国专利No.7741118。密码子简并性容许使用与那些在初始DNA编码序列中使用的密码子不同的密码子生成编码感兴趣蛋白质的合成DNA序列。
关于除去可以使mRNA不稳定的序列，美国专利No.7741118披露了一批16种多聚腺苷酸化信号序列(栏15，表II)，并且要求减少意图在植物中表达的合成编码序列中的此类序列的数目。下文在表1中列出了US 7741118，表II中列出的多聚腺苷酸化信号序列：
表1：US 7741118，表II中列出的多聚腺苷酸化信号序列。
1 AATAAA 6 ATACTA 11 ATACAT 16 CATAAA
2 AATAAT 7 ATAAAA 12 AAAATA
3 AACCAA 8 ATGAAA 13 ATTAAA
4 ATATAA 9 AAGCAT 14 AATTAA
5 AATCAA 10 ATTAAT 15 AATACA
US 7741118还要求优选除去序列ATTTA(称为Shaw-Kamen序列)，因为它已经鉴定为潜在地使mRNA不稳定。
与US 7741118的教导相反，我们已经发现了上文表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列数目的减少既不是必要的，也不足以实现合成基因在植物中的表达增强。
发明概述
下文表2鉴定出经常存在于玉米基因中的20种潜在的多聚腺苷酸化信号序列。
表2：存在于玉米基因中的潜在多聚腺苷酸化信号序列
1 ATATAT 6 TATTTT 11 TAATAA 16 TATTAT
2 TTGTTT 7 TTTTTT 12 ATTTAT 17 TGTTTG
3 TTTTGT 8 ATTTTT 13 TATATT 18 TTATAT
4 TGTTTT 9 TTATTT 14 TTTTAT 19 TGTAAT
5 TATATA 10 TTTATT 15 ATATTT 20 AAATAA
下文表3鉴定出经常存在于大豆基因中的20种潜在的多聚腺苷酸化信号序列。
表3：存在于大豆基因中的潜在多聚腺苷酸化信号序列。
1 ATTTTT 6 TTTTAT 11 AAATTT 16 ATATAT
2 TATTTT 7 AATTTT 12 AAATAA 17 ATTATT
3 TTATTT 8 TTTTTA 13 ATATTT 18 ATTTTA
4 TTTATT 9 TAATTT 14 TTTGTT 19 TTTAAT
5 TTTTTT 10 TTAATT 15 TTGTTT 20 TTTTAA
本发明提供了一种用于在玉米细胞中表达感兴趣蛋白质的合成DNA序列，其包含：
经密码子优化的编码所述感兴趣蛋白质的DNA序列，
至少一种选自下组的多聚腺苷酸化信号序列：I类和II类，其中：
I类选自下组：AATAAA,AATAAT,AACCAA,ATATAA,AATCAA,ATACTA,ATAAAA,ATGAAA,AAGCAT,ATTAAT,ATACAT,AAAATA,ATTAAA,AATTAA,AATACA,和CATAAA；且
II类选自下组：ATATAT,TTGTTT,TTTTGT,TGTTTT,TATATA,TATTTT,TTTTTT,ATTTTT,TTATTT,TTTATT,TAATAA,ATTTAT,TATATT,TTTTAT,ATATTT,TATTAT,TGTTTG,TTATAT,TGTAAT和AAATAA；且
其中所述经密码子优化的DNA序列含有至少一种来自II类的多聚腺苷酸化信号序列，且其中所述合成DNA序列比所述蛋白质的天然DNA序列含有更少的II类多聚腺苷酸化信号序列，并且与所述天然DNA序列相比含有相同数目的I类多聚腺苷酸化信号序列。
本发明还提供了一种用于在大豆细胞中表达感兴趣蛋白质的合成DNA序列，其包含：
经密码子优化的编码所述感兴趣蛋白质的DNA序列，
至少一种选自下组的多聚腺苷酸化信号序列：I类和III类，其中：
I类选自下组：AATAAA,AATAAT,AACCAA,ATATAA,AATCAA,ATACTA,ATAAAA,ATGAAA,AAGCAT,ATTAAT,ATACAT,AAAATA,ATTAAA,AATTAA,AATACA,和CATAAA；且
III类选自下组：ATTTTT,TATTTT,TTATTT,TTTATT,TTTTTT,TTTTAT,AATTTT,TTTTTA,ATATAT,TAATTT,TTAATT,AAATTT,AAATAA,ATATTT,TTTGTT TTGTTT,ATTATT,ATTTTA,TTTAAT,和TTTTAA，且
其中所述经密码子优化的DNA序列含有至少一种来自III类的多聚腺苷酸化信号序列，且其中所述合成DNA序列比所述蛋白质的天然DNA序列含有更少的III类多聚腺苷酸化信号序列，并且与所述天然DNA序列相比含有相同数目的I类多聚腺苷酸化信号序列。
本发明还提供了一种生成编码感兴趣蛋白质的合成DNA序列的方法，所述方法包括(a)以源自由天然序列编码的天然序列编码的天然存在多肽的感兴趣蛋白质的氨基酸序列开始，所述天然序列包含至少一种表2中列出的多聚腺苷酸化信号序列，并(b)生成合成DNA序列，该合成DNA序列编码所述氨基酸序列，并且与天然序列的相应编码序列相比含有更少的表2中列出的多聚腺苷酸化信号序列，且含有相同数目的表1中列出的多聚腺苷酸化信号序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种生成编码感兴趣蛋白质的合成DNA序列的方法，其包括(a)以源自由天然序列编码的天然序列编码的天然存在多肽的感兴趣蛋白质的氨基酸序列开始，所述天然序列包含至少一种表3中列出的多聚腺苷酸化信号序列，并(b)生成合成DNA序列，该合成DNA序列编码所述氨基酸序列，并且与天然序列的相应编码序列相比含有更少的表3中列出的多聚腺苷酸化信号序列，且含有相同数目的表1中列出的多聚腺苷酸化信号序列。
在一些实施方案中，与维持相同数目的表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列以及将表1序列维持在其在序列中的初始位置中一致，本发明提供的合成DNA序列没有表2和/或表3中列出的多聚腺苷酸化信号序列，或者尽可能多地减少表2和/或表3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列数目。
在一些实施方案中，本发明提供的合成DNA序列编码杀虫蛋白，任选地源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白，以及可用于除草剂耐受性、水和/或热应激耐受性、健康的油修饰及用于转化标志物基因和选择标志物基因的DNA序列。
本发明的合成DNA序列可以在用于表达感兴趣蛋白质的DNA构建体中使用，其中该构建体包含5’非翻译序列、本发明的合成DNA序列、和3’非翻译区，且所述5’非翻译序列含有在植物中发挥功能的启动子，且所述3’非翻译序列包含转录终止和多聚腺苷酸化信号。
本发明还提供了含有本发明的合成DNA序列的转基因植物。
还提供了控制植物中有害生物的方法，其包括在植物表达本发明的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码昆虫毒素，例如苏云金芽孢杆菌Cry蛋白。
还提供了用于植物中除草剂耐受性的方法，其包括在植物中表达本发明的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码已知的除草剂耐受性酶，例如芳氧基链烷酸双加氧酶(AAD1)(参见WO/2005/107437)，或膦丝菌素乙酰转移酶，或酶5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶。
还提供了用于在植物中修饰油概况(profile)的方法，其包括在植物中表达一种或多种本发明的合成DNA序列，其中合成DNA序列编码一种或多种用于修饰植物中的油概况的已知酶，例如脂肪酸去饱和酶。
还提供了用于植物中应激耐受性的方法，其包括在植物中表达本发明的合成DNA序列，其中合成DNA序列编码用于水和/或热应激的已知应激耐受性基因，例如应激相关蛋白(SAP1)；美国专利公开文本No:2010/0275327，和1-Cys过氧化物氧还蛋白(Per1)蛋白(Mowla等,2002,Planta215:716-726)。
还提供了在植物中添加报告基因的方法，其包括在植物中表达本发明的合成DNA序列，其中合成DNA序列编码在植物中有功能的已知转化标志物蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)或酶beta葡糖醛酸糖苷酶。
还提供了控制谷物或种子中的有害生物的方法以及控制粗粉(meal)或面粉(flour)中的有害生物的方法，所述控制谷物或种子中的有害生物的方法包括从含有表达昆虫毒素的本发明合成基因的植物获得所述谷物或种子，所述控制粗粉或面粉中的有害生物的方法包括从含有表达昆虫毒素的本发明合成基因的谷物获得所述粗粉或面粉。
还提供了源自含有本发明合成DNA的转基因植物的组合物，其中所述组合物是选自下组的商品：粗粉、面粉、蛋白质浓缩物、或油。
在一些情况中，可以通过删除AATAAA的发生并用表1中列出的另一种多聚腺苷酸化信号序列替代在本发明的合成DNA序列中维持表1中列出的多聚腺苷酸化信号数目。这在实施例1，SEQ ID NO:5中例示。
序列描述
SEQ ID NO:1是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Fa核心毒素的天然DNA序列。
SEQ ID NO:2是苏云金芽孢杆菌Cry1Fa核心毒素序列。
SEQ ID NO:3是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Fa核心毒素的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:4是苏云金芽孢杆菌Cry1Fa核心毒素序列。
SEQ ID NO:5是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Fa核心毒素的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO6是苏云金芽孢杆菌Cry1Fa核心毒素序列。
SEQ ID NO:7是编码苏云金芽孢杆菌Cry34Ab1毒素的天然DNA序列。
SEQ ID NO:8是苏云金芽孢杆菌Cry34Ab1毒素序列。
SEQ ID NO:9是编码苏云金芽孢杆菌Cry34Ab1毒素的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:10是苏云金芽孢杆菌Cry34Ab1毒素序列。
SEQ ID NO:11是编码苏云金芽孢杆菌Cry34Ab1毒素的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:12是苏云金芽孢杆菌Cry34Ab1毒素序列。
SEQ ID NO:13是编码苏云金芽孢杆菌Cry35Ab1毒素的天然DNA序列。
SEQ ID NO:14是苏云金芽孢杆菌Cry35Ab1毒素序列。
SEQ ID NO:15是编码苏云金芽孢杆菌Cry35Ab1毒素的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:16是苏云金芽孢杆菌Cry35Ab1毒素序列。
SEQ ID NO:17是编码苏云金芽孢杆菌Cry35Ab1毒素的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:18是苏云金芽孢杆菌Cry35Ab1毒素序列。
SEQ ID NO:19是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ab1核心毒素的天然DNA序列。
SEQ ID NO:20是苏云金芽孢杆菌Cry1Ab1核心毒素序列。
SEQ ID NO:21是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ab1核心毒素的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:22是苏云金芽孢杆菌Cry1Ab1核心毒素序列。
SEQ ID NO:23是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ab1核心毒素的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:24是苏云金芽孢杆菌Cry1Ab1核心毒素序列。
SEQ ID NO:25是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ca核心毒素的天然DNA序列。
SEQ ID NO:26编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ca核心毒素序列。
SEQ ID NO:27是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ca核心毒素的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:28编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ca核心毒素序列。
SEQ ID NO:29是编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ca核心毒素的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:30编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ca核心毒素序列。
SEQ ID NO:31是编码苏云金芽孢杆菌Cry6Aa毒素的天然DNA序列。
SEQ ID NO:32是苏云金芽孢杆菌Cry6Aa毒素序列。
SEQ ID NO:33是编码苏云金芽孢杆菌Cry6Aa毒素的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:34是苏云金芽孢杆菌Cry6Aa毒素序列。
SEQ ID NO:35是编码苏云金芽孢杆菌Cry6Aa毒素的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:36是苏云金芽孢杆菌Cry6Aa毒素序列。
SEQ ID NO:37是编码Sphingobiurn herbicidovorans AAD1蛋白的天然DNA序列。
SEQ ID NO:38是Sphingobiurn herbicidovorans AAD1蛋白序列。
SEQ ID NO:39是编码Sphingobiurn herbicidovorans AAD1蛋白的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1和表2序列得到。
SEQ ID NO:40是Sphingobiurn herbicidovorans AAD1蛋白序列。
SEQ ID NO:41是编码Sphingobiurn herbicidovorans AAD1蛋白的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:42是Sphingobiurn herbicidovorans AAD1蛋白序列。
SEQ ID NO:43是编码构巢曲霉(Aspergillus nidulans)delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白的天然DNA序列。
SEQ ID NO:44是构巢曲霉delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白序列。
SEQ ID NO:45是编码构巢曲霉delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1和表2序列得到。
SEQ ID NO:46是构巢曲霉delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白序列。
SEQ ID NO:47是编码构巢曲霉delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:48是构巢曲霉delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白。
SEQ ID NO:49是编码Xerophyta viscosa SAP1蛋白的天然DNA序列。
SEQ ID NO:50是Xerophyta viscosa SAP1蛋白序列。
SEQ ID NO:51是编码Xerophyta viscosa SAP1蛋白的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1和表2序列得到。
SEQ ID NO:52是Xerophyta viscosa SAP1蛋白序列。
SEQ ID NO:53是编码Xerophyta viscosa SAP1蛋白的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:54是Xerophyta viscosa SAP1蛋白序列。
SEQ ID NO:55是编码Aequorea victoria GFP1蛋白的天然DNA序列。
SEQ ID NO:56是Aequorea victoria GFP1蛋白序列。
SEQ ID NO:57是编码Aequorea victoria GFP1蛋白的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1和表2序列得到。
SEQ ID NO:58是Aequorea victoria GFP1蛋白序列。
SEQ ID NO:59是编码Aequorea victoria GFP1蛋白的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:60是Aequorea victoria GFP1蛋白序列。
SEQ ID NO:61是编码颖枯小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白的天然DNA序列。
SEQ ID NO:62是颖枯小球腔菌delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白序列。
SEQ ID NO:63是编码颖枯小球腔菌delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1和表2序列得到。
SEQ ID NO:64是颖枯小球腔菌delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白序列。
SEQ ID NO:65是编码颖枯小球腔菌delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:66是颖枯小球腔菌delta-9脂肪酸去饱和酶蛋白序列。
SEQ ID NO:67是编码Xerophyta viscosa PER1蛋白的天然DNA序列。
SEQ ID NO:68是Xerophyta viscosa PER1蛋白序列。
SEQ ID NO:69是编码Xerophyta viscosa PER1蛋白的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子并维持表1和表2序列得到。
SEQ ID NO:70是Xerophyta viscosa PER1蛋白序列。
SEQ ID NO:71是编码Xerophyta viscosa PER1蛋白的依照本发明的合成DNA序列，其使用针对玉米优化的密码子且除去表2中鉴定的序列并维持表1序列得到。
SEQ ID NO:72是Xerophyta viscosa PER1蛋白序列。
发明详述
本发明提供了编码感兴趣蛋白质的合成核酸序列。合成的编码序列特别适合于用于在转基因植物中表达感兴趣的蛋白质。
感兴趣蛋白质是天然存在的任何蛋白质或多肽，或任何天然存在的变体，包括但不限于此类蛋白质的加工形式。感兴趣蛋白质也可以是通过组合超过一种天然存在的蛋白质的部分或片段，诸如通过混合并匹配功能性蛋白质域形成的蛋白质。
优选的一组感兴趣蛋白质是所得的表型为农艺学性状的蛋白质或可用于创建农艺学性状的报告蛋白。这些包括但不限于对昆虫的抗性、对除草剂的耐受性、对水和/热应激的耐受性、和油概况修饰。
更优选的一组感兴趣蛋白质是所得表型为农艺学性状的组。另一个优选的组是所得表型提供除草剂耐受性的组。另一个优选的组是所得表型提供应激耐受性的组。另一个优选的组是所得表型为更健康的食物提供修饰的油概况的组。更高度优选的组是感兴趣蛋白质是提供昆虫抗性的Cry蛋白的组。
必须鉴定并分析编码感兴趣蛋白质的天然/野生型DNA序列以测定是否存在表1和2和/或3中列出的多聚腺苷酸化信号序列。依照本发明，对于意图用于玉米的编码序列，与天然序列中存在的数目相比，表2中列出的多聚腺苷酸化信号序列的数目是减少的。对于意图用于大豆的编码序列，表3中列出的多聚腺苷酸化信号序列的数目是减少的。非常重要的是，除去表2和3中列出的多聚腺苷酸化信号序列，特别是在他们以巢式(nested)多聚体形式存在的情况中。
在除了除去表2和3中列出的多聚腺苷酸化信号序列外，可以期望除去Shaw-Kamen序列ATTTA的发生。
在除了除去多聚腺苷酸化信号序列和Shaw-Kamen序列外，我们倾向于建立合成DNA编码序列，其利用的密码子大致为它们在天然存在于会使用合成DNA序列的植物物种中的基因中平均利用的相同频率。表4给出了适合于意图用于各种特定作物及一般用于双子叶植物或一般用于植物的合成基因的密码子选择的目标百分比。
表4：合成植物基因的目标重新标定(rescaled)密码子组成。
Figure BDA0000435153100000091
Figure BDA0000435153100000101
Figure BDA0000435153100000111
转基因植物
本发明的一个优选的实施方案是用编码昆虫毒素的基因转化植物。表达昆虫毒素基因的经转化植物凭借经转化植物细胞中存在控制量的主题杀虫蛋白或其变体而对昆虫靶有害生物的攻击有抗性。通过将编码B.t.杀虫毒素的杀虫特性的遗传物质掺入特定昆虫有害生物食用的植物的基因组中，成虫或幼虫在食用食物植物后死亡。已经转化单子叶植物和双子叶植物分类的许多成员。转基因农艺学作物及水果和蔬菜是有商业兴趣的。此类作物包括但不限于玉米、稻、大豆、芸苔、向日葵、苜蓿、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯，等等。存在几种用于将外来遗传材料导入植物细胞中，及用于获得稳定维持并表达导入基因的技术。此类技术包括将包被到微粒上的遗传物质直接加速到细胞中(美国专利No.4945050和美国专利No.5141131)。可以使用土壤杆菌(Agrobacterium)技术转化植物，参见美国专利No.5177010，欧洲专利No.EP131624B1，欧洲专利No.EP159418B1，欧洲专利No.EP176112B1，美国专利No.5149645，EP120516B1，美国专利No.5464763，美国专利No.4693976，欧洲专利No.EP116718B1，欧洲专利No.EP290799B1，欧洲专利No.EP320500B1，欧洲专利No.EP604662B1，美国专利No.7060876，美国专利No.6037526，美国专利No.6376234，欧洲专利No.EP292435B1，美国专利No.5231019，美国专利No.5463174，美国专利No.4762785，美国专利No.5608142及美国专利No.5159135。其它转化技术包括WHISKERSTM技术，参见美国专利No.5302523和美国专利No.5464765。电穿孔技术也已经用于转化植物，参见WO1987006614，美国专利No.5472869，美国专利No.5384253，WO199209696，美国专利No.6074877，WO1993021335，和美国专利No.5679558。在大量用于转化植物的技术外，与外来基因接触的组织类型也可以变化。此类组织会包括但不会限于胚胎发生组织、愈伤组织组织I型和II型、下胚轴、分生组织，等等。可以使用技术人员技能内的合适技术在去分化期间转化几乎所有植物组织。
将DNA插入植物中的已知技术包括用通过根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化媒介物投递的T-DNA进行的转化。使用含有T-DNA的载体来转化植物细胞已经透彻研究，并且充分记载于欧洲专利No.EP120516B1；Lee and Gelvin(2008)PlantPhysiol.146:325-332；Fraley等(1986)Crit.Rev.Plant Sci.4:1-46；及An等(1985)EMBO J.4:277-284；并且是该领域中完全建立的。另外，可以采用植物原生质体与含有要投递的DNA的脂质体的融合、DNA的直接注射、生物射弹转化(微粒轰击)、或电穿孔，及其它可能的方法。
一旦插入的DNA被整合到植物基因组中，它贯穿后续世代是相对稳定的。用于转化植物细胞的载体通常含有编码蛋白质的选择标志物基因，所述蛋白质对经转化的植物细胞赋予以对除草剂或抗生素，诸如双丙氨磷(Bialaphos)、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性的。因而，单独采用的选择标志物基因应当容许选择经转化的细胞，而不含插入DNA的细胞的生长不受选择性化合物抑制。
在本发明的一个优选的实施方案中，用基因转化植物，其中蛋白质编码区的密码子选择已经针对植物进行过优化。参见例如美国专利No.5380831。还有，有利地，可以使用编码截短的毒素，例如功能性蛋白质域的植物。截短的毒素通常编码天然全长毒素的约55%至约80%。用于创建合成B.t.基因以用于植物的方法是本领域中已知的(Stewart 2007,Frontiers in Drug Designand Discovery1:297-341)。
不管转化技术如何，优选地，将基因掺入适合于通过在载体中包含植物启动子在植物细胞中表达感兴趣蛋白质的基因转移载体中。在植物启动子外，可以在植物细胞中有效使用来自多种来源的启动子来表达外来基因。另外，可以使用细菌起源的启动子，例如章鱼碱合酶启动子、胭脂氨酸合酶启动子、甘露氨酸合酶启动子；病毒起源的启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S启动子，等等。植物衍生的启动子包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、beta-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子、菜豆碱启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子、和组织特异性启动子。启动子还可以含有可以改善转录效率的某些增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于ADH1-内含子1和ADH1-内含子6。可以使用组成性启动子。组成性启动子在几乎所有细胞类型中且在几乎所有时间指导连续基因表达(例如肌动蛋白、泛素、CaMV35S)。组织特异性启动子负责特定细胞或组织类型，诸如叶或种子中的基因表达(例如，玉米醇溶蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP(酰基载体蛋白))，并且也可以使用这些启动子。也可以使用在植物发育的某个阶段期间有活性及在特定植物组织和器官中有活性的启动子。此类启动子的例子包括但不限于根特异性、花粉特异性、胚胎特异性、玉米穗特异性、棉花纤维特异性、种子胚乳特异性、韧皮部特异性的启动子，等等。
在某些情况下，可以期望使用诱导型启动子。诱导型启动子负责响应特定信号而表达基因，所述特定信号诸如：物理刺激(例如热休克基因)；光(例如RUBP羧化酶)；激素(例如糖皮质激素)；抗生素(例如四环素)；代谢物；和应激(例如干旱)。可以使用在植物中发挥功能的其它期望的转录和翻译元件，诸如5’非翻译前导序列、RNA转录终止序列和多腺苷酸添加信号序列。许多植物特异性基因转移载体是本领域中已知的。
含有昆虫抗性(IR)性状的转基因作物在整个北美洲的玉米和棉花植物中是流行的，并且这些性状的使用在全球扩张。许多种子公司已经开发出组合IR和除草剂耐受性(HT)性状的商业转基因作物。这些包括由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状和HT性状的组合，所述HT性状诸如对于下述耐受性，对乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、磺酰苯胺(sulfonanilide)等，谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂诸如双丙氨磷、草丁磷(glufosinate)等，4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂诸如硝磺草酮(mesotrione)、异口恶唑草酮(isoxaflutole)等，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂诸如草甘膦(glyphosate)等，和乙酰基-辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂诸如吡氟氯禾灵(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)、禾草灵(diclofop)，等等。其它例子是已知的，其中转基因提供的蛋白质提供对除草剂化学品种类诸如苯氧基酸除草剂和吡啶基氧乙酸盐(pyridyloxyacetate)生长素除草剂(见WO2007053482)，或苯氧基酸除草剂和芳基氧基苯氧基丙酸盐/酯(aryloxyphenoxypropionate)除草剂的植物耐受性(参见美国专利申请No.20090093366)。通过IR性状控制多个有害生物问题的能力是有价值的商业产品概念，并且若在同一植物中组合昆虫控制性状和杂草控制性状，则此产品概念的便利得到增强。此外，可以经由由B.t.杀虫蛋白(诸如本发明的B.t.杀虫蛋白)赋予的IR性状与一种或多种别的HT性状诸如上文提及的那些HT性状的单一植物组合以及一种或多种别的输入性状(例如，由B.t.衍生的或其它的杀虫蛋白赋予的其它昆虫抗性、由如RNAi等机制赋予的昆虫抗性、线虫抗性、疾病抗性、应激耐受性、改善的氮利用，等等)或输出性状(例如高油含量、健康的油组成、营养改善，等等)获得改善的价值。此类组合可以经由常规育种(育种叠加)或联合地作为牵涉同时引入多个基因(分子叠加或共转化)的新颖转化事件获得。益处包括在作物植物中管理昆虫有害生物和改善的杂草控制的能力，这对生产者和/或消费者提供继生的益处。如此，本发明可以结合多种性状使用以给改善的作物质量的完全农艺学包装提供灵活且划算地控制大量农艺学问题的能力。
本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开文本通过提及以它们不与本说明书的明确教导矛盾的程度完整并入。如本文中使用的，除非明确指示或暗示，术语“一个/种”和“所述/该”表示“至少一个/种”。“分离的”指核苷酸或多肽分子已经从其天然环境取出并且已经手动置于不同环境中。
本发明的实施方案在以下实施例中进一步限定。应当理解，这些实施例仅作为例示给予。从上述讨论和这些实施例看，本领域技术人员可以确定本发明的必要特征，并且在不偏离其精神和范围的前提下，可以对本发明的实施方案进行各种变化和修改以使其适合于各种用途和条件。如此，在本文中显示并描述的实施方案外，本发明实施方案的各种修改从前述描述看对于本领域技术人员会是显而易见的。此类修改也意图落入所附权利要求书的范围内。
除非另有记录，所有百分比按重量计，并且所有溶剂混合物比例按体积计。所有温度以摄氏度计。
实施例
实施例1
编码苏云金芽孢杆菌Cry1Fa核心毒素的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:1中给出编码Cry1Fa核心毒素的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:1中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性位点，并且恢复表1中鉴定的序列。保存由SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:3中给出了所得的DNA序列。
分析SEQ ID NO:3，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持相同数目的表1中鉴定的序列。SEQ ID NO:5中给出了体现本发明的所得序列。表5显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:5中得到维持，只是SEQ ID NO:1中AATAAA的两次发生(一次在nt426处，并且一次在nt582处)用AATCAA替代，所述AATCAA维持表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置，但是用不太成问题的序列替代两个AATAAA序列之每个。表6显示了表2中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:5中是减少的。由于表2和3中鉴定的序列中有重叠(表2中的序列1、2、6、7、8、9、10、14、13和20分别对应于表3中的序列16、15、2、5、1、3、4、6、13和12)，的确也是，表3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:5中是减少的。针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:5的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:5的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:5的合成编码区的构建体。
在此类构建体的一个实施方案中，通过拷贝的玉米泛素1启动子及其天然内含子1(美国专利No.5510474)驱动包含SEQ ID NO:5的mRNA前转录物的生成。使用包含玉米过氧化物酶5基因的3’非翻译区(ZmPer5 3'UTR v2;美国专利No.6699984)的片段来终止转录。构建含有前述基因表达盒的二元植物转化质粒pDAB111440，并将其用于生成转基因玉米植物。质粒pDAB111440进一步包含除草剂抗性基因，该除草剂抗性基因包含甘蔗杆状DNA病毒(bacilliform badnavirus)(ScBV)启动子(Schenk et al.(1999)PlantMolec.Biol.39:1221-30)的转录控制下的芳氧基链烷酸双加氧酶的编码区(AAD-1v3;美国专利No.7838733(B2),及Wright et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)。使用包含来自玉米脂肪酶基因(ZmLip3'UTR;美国专利No.7179902)的3’非翻译区的片段来终止转录。
表5：存在于天然Cry1Fa核心毒素编码区(SEQ ID NO:1)和重新设计的型式(SEQ ID NO:5)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000161
*NA=不可适用
表6：存在于天然Cry1Fa核心毒素编码区(SEQ ID NO:1)和重新设计的型式(SEQ ID NO:5)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000171
Figure BDA0000435153100000181
*NA=不可适用
实施例2
编码苏云金芽孢杆菌Cry34A毒素的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:7中给出了编码Cry34A毒素的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:7中及其位置。使用标准的遗传密码子将天然的DNA序列翻译成相应的氨基酸序列。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表7的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQID NO:7编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性位点，并且恢复表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:7编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:9中给出了所得的DNA序列。合成具有SEQ ID NO:9序列的DNA。
分析SEQ ID NO:9，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持相同数目的表1中鉴定的序列。SEQ ID NO:11中给出了体现本发明的所得序列。表7显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:11中得到维持。表8显示了表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:5中是减少的。
合成SEQ ID NO:5的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:5的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:5的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:5的合成编码区的构建体。
表7：存在于天然Cry34Ab1编码区(SEQ ID NO:7)和重新设计的型式(SEQ IDNO:11)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000191
*NA=不可适用
表8：存在于天然Cry34Ab1编码区(SEQ ID NO:7)和重新设计的型式(SEQ IDNO:11)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000201
*NA=不可适用
实施例3
编码苏云金芽孢杆菌Cry35Ab1毒素的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:13中给出了编码Cry35Ab1毒素的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:13中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:13编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:13编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:15中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并用于与依照本发明设计的合成编码区比较。
分析SEQ ID NO:15，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持相同数目的表1中鉴定的序列，只是AATAAA的两次发生(一次在SEQ ID NO:8的nt228处，并且一次在nt276处)改变为AATCAA。SEQ ID NO:17中给出了体现本发明的所得序列。表9显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:17中得到维持。表10显示了与SEQ ID NO:13相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:17中是减少的。
合成SEQ ID NO:17的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:17的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:17的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:17的合成编码区的构建体。
表9：存在于天然Cry35Ab1编码区(SEQ ID NO:13)和重新设计的型式(SEQ IDNO:17)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000211
Figure BDA0000435153100000221
Figure BDA0000435153100000231
*NA=不可适用
表10:存在于天然Cry35Ab1编码区(SEQ ID NO:13)和重新设计的型式(SEQID NO:17)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000232
Figure BDA0000435153100000241
*NA=不可适用
实施例4
编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ab核心毒素的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:19中给出了编码Cry1Ab核心毒素的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:19中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:19编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:19编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:21中给出了所得的DNA序列。
分析SEQ ID NO:21，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持相同数目的表1中鉴定的序列。SEQ ID NO:23中给出了体现本发明的所得序列。表11显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:23中得到维持。表12显示了与SEQ ID NO:19相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:23中是减少的。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:23的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:23的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:23的合成编码区的构建体。
在此类构建体的一个实施方案中，通过拷贝的玉米泛素1启动子及其天然内含子1(美国专利No.5510474)驱动包含SEQ ID NO:23的mRNA前转录物的生成。使用包含玉米过氧化物酶5基因的3’非翻译区(ZmPer5 3'UTR v2;美国专利No.6699984)的片段来终止转录。构建含有前述基因表达盒的二元植物转化质粒pDAB111449，并将其用于生成转基因玉米植物。质粒pDAB111449进一步包含除草剂抗性基因，该除草剂抗性基因包含甘蔗杆状DNA病毒(ScBV)启动子(Schenk et al.(1999)Plant Molec.Biol.39:1221-30)的转录控制下的芳氧基链烷酸双加氧酶的编码区(AAD-1 v3;美国专利No.7838733(B2),及Wright et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)。使用包含来自玉米脂肪酶基因(ZmLip 3'UTR;美国专利No.7179902)的3’非翻译区的片段来终止转录。
表11：存在于天然Cry1Ab核心毒素编码区(SEQ ID NO:19)和重新设计的型式(SEQ ID NO:23)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000251
Figure BDA0000435153100000261
*NA=不可适用
表12：存在于天然Cry1Ab编码区(SEQ ID NO:19)和重新设计的型式(SEQ IDNO:23)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000262
*NA=不可适用
实施例5
编码苏云金芽孢杆菌Cry1Ca核心毒素的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:25中给出了编码Cry35A核心毒素的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:25中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:25编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:25编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:27中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:27，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持相同数目的表1中鉴定的序列。SEQ ID NO:29中给出了体现本发明的所得序列。表13显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:29中得到维持。表14显示了与SEQ ID NO:25相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:29中是减少的。
合成SEQ ID NO:29的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:29的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:29的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止子和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:29的合成编码区的构建体。
表13：存在于天然Cry1Ca核心毒素编码区(SEQ ID NO:25)和重新设计的型式(SEQ ID NO:29)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000291
*NA=不可适用
表14：存在于天然Cry1Ca核心毒素编码区(SEQ ID NO:25)和重新设计的型式(SEQ ID NO:29)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000292
Figure BDA0000435153100000301
*NA=不可适用
实施例6
编码苏云金芽孢杆菌Cry6Aa毒素的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:31中给出了编码Cry6Aa毒素的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:31中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:31编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:31编码的氨基酸序列。SEQID NO:33中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:33，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持表1中鉴定的序列的数目。SEQ ID NO:35中给出了体现本发明的所得序列。表15显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:35中得到维持。表16显示了与SEQ ID NO:31相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:35中是减少的。
合成SEQ ID NO:35的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:35的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:35的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止子和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:35的合成编码区的构建体。
表15：存在于天然Cry6Aa编码区(SEQ ID NO:31)和重新设计的型式(SEQ IDNO:35)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000311
Figure BDA0000435153100000321
*NA=不可适用
表16：存在于天然Cry6Aa编码区(SEQ ID NO:31)和重新设计的型式(SEQ IDNO:35)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000322
*NA=不可适用
实施例7
编码Sphingobiurn herbicidovorans AAD1的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:37中给出了编码AAD1蛋白的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:37中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:37编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:37编码的氨基酸序列。SEQID NO:39中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:39，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持表1中鉴定的序列的数目。SEQ ID NO:41中给出了体现本发明的所得序列。表17显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:41中得到维持。表18显示了与SEQ ID NO:37相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:41中是减少的。
合成SEQ ID NO:41的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:41的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:41的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止子和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:41的合成编码区的构建体。
表17：存在于天然AAD1编码区(SEQ ID NO:37)和重新设计的型式(SEQ IDNO:41)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000351
*NA=不可适用
表18：存在于天然AAD1编码区(SEQ ID NO:37)和重新设计的型式(SEQ IDNO:41)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000352
Figure BDA0000435153100000361
*NA=不可适用
实施例8
编码构巢曲霉Delta-9去饱和酶的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:43中给出了编码构巢曲霉Delta-9去饱和酶蛋白的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ IDNO:43中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:43编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:43编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:45中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:45，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持表1中鉴定的序列的数目。SEQ ID NO:47中给出了体现本发明的所得序列。表1显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:47中得到维持。表20显示了与SEQ ID NO:43相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:47中是减少的。
合成SEQ ID NO:47的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:47的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:47的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:47的合成编码区的构建体。
表19：存在于天然构巢曲霉Delta-9去饱和酶编码区(SEQ ID NO:43)和重新设计的型式(SEQ ID NO:47)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000371
Figure BDA0000435153100000381
*NA=不可适用
表20：存在于天然构巢曲霉Delta-9去饱和酶编码区(SEQ ID NO:43)和重新设计的型式(SEQ ID NO:47)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000382
Figure BDA0000435153100000391
*NA=不可适用
实施例9
编码Xerophyta viscosa SAP1的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:49中给出了编码Xerophyta viscosa SAP1蛋白的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:49中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:49编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:49编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:51中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:52，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持表1中鉴定的序列的数目。SEQ ID NO:53中给出了体现本发明的所得序列。表1显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:53中得到维持。表21显示了与SEQ ID NO:49相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:53中是减少的。
合成SEQ ID NO:53的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:51的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:53的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:53的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止子和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:53的合成编码区的构建体。
表21：存在于天然Xerophyta viscosa SAP1编码区(SEQ ID NO:49)和重新设计的型式(SEQ ID NO:53)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000401
*NA=不可适用
表22：存在于天然Xerophyta viscosa SAP1编码区(SEQ ID NO:49)和重新设计的型式(SEQ ID NO:53)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000411
Figure BDA0000435153100000421
*NA=不可适用
实施例10
编码Aequorea victoria GFP1的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:55中给出了编码Aequorea victoria GFP1的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:55中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:55编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:55编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:57中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:57，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持表1中鉴定的序列的数目。SEQ ID NO:59中给出了体现本发明的所得序列。表1显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:59中得到维持。表23显示了与SEQ ID NO:55相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:59中是减少的。
合成SEQ ID NO:59的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:59的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:59的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止子和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:59的合成编码区的构建体。
表23：存在于天然Aequorea victoria GFP1编码区(SEQ ID NO:55)和重新设计的型式(SEQ ID NO:59)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000431
*NA=不可适用
表24：存在于天然Aequorea victoria GFP1编码区(SEQ ID NO:55)和重新设计的型式(SEQ ID NO:59)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000441
*NA=不可适用
实施例11
编码颖枯小球腔菌FAD9的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:61中给出了编码颖枯小球腔菌FAD9蛋白的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:61中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:61编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:61编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:63中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:63，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持表1中鉴定的序列的数目。SEQ ID NO:65中给出了体现本发明的所得序列。表1显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:65中得到维持。表25显示了与SEQ ID NO:61相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:65中是减少的。
合成SEQ ID NO:65的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:65的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:65的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止子和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:65的合成编码区的构建体。
表25：存在于天然颖枯小球腔菌FAD9编码区(SEQ ID NO:61)和重新设计的型式(SEQ ID NO:65)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000461
*NA=不可适用
表26：存在于天然颖枯小球腔菌FAD9编码区(SEQ ID NO:61)和重新设计的型式(SEQ ID NO:65)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000462
Figure BDA0000435153100000471
Figure BDA0000435153100000481
*NA=不可适用
实施例12
编码Xerophyta viscosa PER1的合成编码区
比较序列。SEQ ID NO:67中给出了编码Xerophyta viscosa PER1蛋白的天然DNA序列。分析此序列以测定表1中鉴定的哪些序列存在于SEQ ID NO:67中及其位置。然后，对要在玉米中使用的合成基因使用表4的栏中给出的靶密码子频率逆翻译由SEQ ID NO:67编码的氨基酸序列。分析所得的DNA序列，并在必要时改变密码子以除去不想要的可读框并除去不想要的限制性酶识别位点，同时维持表1中鉴定的所有序列。保存由SEQ ID NO:67编码的氨基酸序列。SEQ ID NO:69中给出了所得的DNA序列。会合成此序列，并将其用于与依照本发明设计的合成基因比较。
分析SEQ ID NO:69，并且改变密码子以除去表2中鉴定的潜在多聚腺苷酸化信号序列，同时维持表1中鉴定的序列的数目。SEQ ID NO:71中给出了体现本发明的所得序列。表1显示了表1中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目和位置在SEQ ID NO:71中得到维持。表27显示了与SEQ ID NO:67相比，表2和3中鉴定的多聚腺苷酸化信号序列的数目在SEQ ID NO:71中是减少的。
合成SEQ ID NO:71的DNA，并且将在转化为表达此序列的植物细胞中观察到的表达水平与在转化为表达SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69的植物细胞中观察到的表达水平比较。
针对玉米中的表达优化SEQ ID NO:71的合成编码区。
通过组合SEQ ID NO:71的合成编码区与包含在植物细胞中发挥功能的启动子的5’非翻译区和包含转录终止子和多聚腺苷酸化序列的3’非翻译区生成用于表达SEQ ID NO:71的合成编码区的构建体。
表27：存在于天然Xerophyta viscosa PER1编码区(SEQ ID NO:67)和重新设计型式(SEQ ID NO:71)中的表1序列
Figure BDA0000435153100000491
*NA=不可适用
表28：存在于天然Xerophyta viscosa PER1编码区(SEQ ID NO:67)和重新设计的型式(SEQ ID NO:71)中的表2序列
Figure BDA0000435153100000501
Figure BDA0000435153100000511
*NA=不可适用
实施例13
用Xv SAP1对玉米进行的
Figure BDA0000435153100000512
转化
构建标准的WHISKERS转化载体，其中将拟南芥启动子Rd29A置于本发明的XvSAP1重新设计编码区序列(SEQ ID NO:53)的5’。这些序列侧翼有玉米PER5,3'和5'非翻译区以稳定重新设计的编码区的表达。将由稻肌动蛋白1启动子驱动的pat选择盒(参见例如US5648477)置于XvSAP1表达盒的3’。
用合适的限制酶消化载体DNA以释放含有存在于载体主链中的细菌氨苄青霉素抗性基因的片段，并且以生成适合于WHISKERSTM介导的转化的线性DNA片段。通过高压液相层析(HPLC)按制备规模实现含有XvSAP1和pat表达盒的线性片段的纯化。经由WHISKERSTM介导的转化(基本上如记载于美国专利No.5302523和5464765;美国专利公开文本No.2008/0182332;及Petolino and Arnold(2009)(Methods Molec.Biol.526:59-67)的)将此植物转化DNA投递到玉米Hi-II悬浮细胞培养物中。
将转化体在选择培养基中放置，此后，在约8周的过程里获得经转化的隔离群。选择培养基是含有双丙氨磷(Gold BioTechnology)的基于LS的培养基(LS基础培养基，N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水合物；PhytoTechnologies Labr.)，30.0gm/L蔗糖，6mM L-脯氨酸，1.0mg/L AgNO3，250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L Gellan胶，pH5.7)。将胚转移到含有3mg/L双丙氨磷的选择培养基，直到获得胚胎发生隔离群。通过以2周时间间隔转移至新鲜选择培养基放大回收的隔离群，用于再生和进一步分析。
为了再生，将培养物转移至“28”诱导培养基(MS盐和维生素，30gm/L蔗糖，5mg/L苯甲基氨基嘌呤，0.25mg/L2,4-D，3mg/L双丙氨磷，250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L Gellan胶，pH5.7)，在低光照条件(14μEm-2s-1)下持续1周，然后在高光照条件(约89μEm-2s-1)下持续1周。随后，将组织转移至“36”再生培养基(与诱导培养基相同，只是缺乏植物生长调节剂)。当小植物的长度达到3-5cm时，将它们转移至含有SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt盐和维生素(1972);PhytoTechnologies Labr.)，1.0gm/L肌肉肌醇，10gm/L蔗糖和2.0gm/L Gellan胶，pH5.8)的玻璃培养管以容许枝条和根的进一步生长和发育。将植物移植到与本文中早先描述相同的土壤混合物，并在温室中培养至开花。进行受控的传粉以进行种子生成。
实施例14
土壤杆菌转化
在二元植物转化和表达质粒的构建中使用标准克隆方法。限制性内切核酸酶和T4 DNA连接酶获自NEB。使用
Figure BDA0000435153100000521
质粒制备试剂盒或
Figure BDA0000435153100000522
AX Xtra Midi试剂盒(两者都来自Macherey-Nagel)遵循制造商的说明书实施质粒制备。在凝胶分离后使用
Figure BDA0000435153100000523
PCR纯化试剂盒或
Figure BDA0000435153100000524
凝胶提取试剂盒(两者都来自Qiagen)纯化DNA片段。
依照本发明的合成基因可以由商业厂家(例如DNA2.0,Menlo Park,CA)合成，并且以标准质粒载体中的克隆片段提供，或者可以通过含有合适核苷酸序列的其它构建体的标准分子生物学操作获得。
在一个非限制性例子中，基本克隆策略可以将全长编码序列(CDS)在NcoI和SacI限制性位点处亚克隆到植物表达质粒中。利用例如
Figure BDA0000435153100000525
技术或标准限制酶片段克隆规程，将所得的植物表达盒亚克隆到二元载体质粒中，所述植物表达盒含有在植物表达元件(例如植物可表达启动子、3'端转录终止和多聚腺苷酸添加决定子，等等)控制下的合适编码区。例如，若利用
Figure BDA0000435153100000526
技术，则可以使用LR ClonaseTM(Invitrogen)来将全长且经修饰的基因植物表达盒重组成二元植物转化质粒。方便的是，采用二元植物转化载体，其含有当质粒存在于大肠杆菌(E.coli)和土壤杆菌细胞中时含有赋予对抗生素壮观霉素的抗性的细菌基因。也方便的是，采用二元载体质粒，其含有在期望的宿主植物中有功能的植物可表达选择标志物基因。植物可表达选择标志物基因的例子包括但不限于那些编码转座子Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aphII)(其赋予对抗生素卡那霉素、新霉素和G418的抗性)的基因，以及那些编码对草甘膦；潮霉素；甲氨蝶呤；膦丝菌素(双丙氨磷)，咪唑啉酮，磺酰脲和三唑并嘧啶除草剂，诸如氯磺隆(chlorosulfuron)、溴草腈(bromoxynil)、茅草枯(dalapon)等的基因。
制备根癌土壤杆菌菌株Z707S(Z707的链霉素抗性衍生物;Hepburn et al.,1985,J.Gen.Microbiol.131:2961-2969.)的电感受态细胞，并使用电穿孔(Weigel and Glazebrook,2002,Arabidopsis:A Laboratory Manual)转化。在电穿孔后，将1mL YEP培养基(gm/L：酵母提取物，10；胨，10；NaCl,5)添加至小杯，并将细胞YEP悬浮液转移至15mL培养管，于28°在水浴中在不断摇动的情况下温育4小时。将细胞在具有壮观霉素(200μg/mL)和链霉素(250μg/mL)的加琼脂(25gm/L)的YEP上铺板，并将板于28°温育2-4天。将完全分开的单菌落选出，划线到如前述的具有壮观霉素和链霉素的新鲜YEP+琼脂板上，并于28°温育1-3天。
使用载体特异性引物及从选择的土壤杆菌菌落制备的模板质粒DNA通过PCR分析实施二元植物转化载体中合成基因插入物的存在。使用Qiagen
Figure BDA0000435153100000531
Mini Prep提取来自在如前述的具有壮观霉素和链霉素的YEP中培养的15mL过夜培养物的4mL等分试样的细胞团粒，其按照制造商的说明书实施。包括来自用于土壤杆菌电穿孔转化的二元载体的质粒DNA作为对照。以0.5X浓度使用来自Invitrogen的Taq DNA聚合酶按照制造商的说明书完成PCR反应。在MJ Research Peltier热循环仪中实施PCR反应，所述MJ Research Peltier热循环仪编程为以下条件：步骤1)94°持续3分钟；步骤2)94°持续45秒；步骤3)55°持续30秒；步骤4)每kb预期产物长度，72°持续1分钟；步骤5)29次至步骤2；步骤6)72°持续10分钟。在循环后于4°维持反应。将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳(例如0.7%至1%琼脂糖，w/v)分析，并通过溴化乙啶染色显现。选择如下的菌落，其PCR产物与质粒对照相同。
或者，通过土壤杆菌操作领域技术人员公知的标准分子生物学方法对从候选土壤杆菌隔离群制备的质粒DNA进行限制性消化物指纹定位，从而实施含有合成基因插入物的二元植物转化载体的质粒结构。
经由土壤杆菌介导的转化方法获得经转化植物的领域中的技术人员会了解，可以有利使用除Z707S外的其它土壤杆菌菌株，并且菌株的选择可以取决于要转化的宿主植物物种的身份。
实施例15
双子叶植物中杀虫蛋白的生成
土壤杆菌转化。使用浸花法(Weigel and Glazebrook,同上)转化拟南芥Col-01。使用选择的土壤杆菌菌落来接种含有适合于选择的抗生素的1mL至15mL YEP培养基培养物。将培养物于28°在以220rpm不断摇动的情况下温育过夜。使用每个培养物接种两个500mL含有适合于选择的抗生素的YEP培养基培养物，并将新培养物于28°在不断摇动的情况下温育过夜。将细胞于室温以约8700xg沉淀10分钟，并弃去所得的上清液。将细胞团粒在500mL渗透培养基中温和重悬，所述渗透培养基含有：1/2x Murashige和Skoog盐(Sigma-Aldrich)/Gamborg氏B5维生素(Gold BioTechnology,St.Louis,MO)，10%(w/v)蔗糖，0.044μM苯甲基氨基嘌呤(10μL/升1mg/mL在DMSO中的储液)和300μL/升Silwet L-77。将约1月龄的植物浸入培养基中15秒，注意确保最新的花序浸没。然后，将植物侧放，并覆盖(透明的或不透明的)24小时，用水清洗，并竖立放置。将植物于22°以16小时光照/8小时黑暗光周期培养。在浸渍后约4周，收获种子。
拟南芥生长和选择。容许新鲜收获的T1种子以于室温在存在干燥剂的情况下干燥至少7天。将种子在0.1%琼脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中悬浮，然后于4°分层2天。为了准备好种植，将10.5英寸x21英寸萌发盘(T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN)中的Sunshine混合物LP5(Sun Gro Horticulture Inc.,Bellevue,WA)用细蛭石覆盖，用霍格兰溶液(Hoagland and Arnon,1950)地下灌溉，直到潮湿，然后容许排水24小时。将分层种子播种到蛭石上，并用湿度圆盖(dome)(KORD Products,Bramalea,Ontario,Canada)覆盖7天。使种子萌发，并将植物在Conviron(CMP4030或CMP3244型；Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在长日照条件(16hours light/8hours dark)下以光强度120-150μmol/m2sec于恒定温度(22°)和湿度(40-50%)培养。最初，用霍格兰溶液，随后用去离子水给植物浇水以使土壤保持润而不湿。
在播种后5-6天除去圆盖，并用化学选择剂喷雾植物，以杀死从非转化种子萌发的植物。例如，若由二元植物转化载体提供的植物可表达选择标志物基因是pat或bar基因(Wehrmann et al.,1996,Nat.Biotech.14:1274-1278)，则可以通过用1000X Finale(5.78%草丁磷,Farnam Companies Inc.,Phoenix,AZ.)溶液喷雾选择经转化的植物。以5-7天时间间隔实施两次后续喷雾。将存活者(活跃生长的植物)在最终喷雾后7-10天鉴定，并移植到以Sunshine MixLP5准备的盆中。将移植的植物用湿度圆盖覆盖3-4天，并在Conviron中在上文提及的生长条件下放置。
双子叶植物转化领域的技术人员会了解，在使用其它植物可表达选择标志物基因(例如除草剂耐受性基因)时可用选择经转化植物的其它方法。
转基因拟南芥的昆虫生物测定法。证明表达Cry蛋白的转基因拟南芥系在人工饮食覆盖测定法中针对敏感性昆虫物种是有活性的。通过合适的方法量化从转基因和非转基因拟南芥系提取的蛋白质，并且调节样品体积以标准化蛋白质浓度。对人工饮食进行生物测定法，如上文描述的。测定法中包括非转基因拟南芥和/或缓冲液和水作为背景检验处理。
实施例16
用于生成超二元载体的土壤杆菌转化
土壤杆菌超二元系统方便用于转化单子叶植物宿主。用于构建和确认超二元载体的方法是完全公开的，并且通过提及并入本文(Operating Manual forPlasmid pSB1,Version3.1,available from Japan Tobacco,Inc.,Tokyo,Japan)。使用标准分子生物学和微生物学方法来生成超二元质粒。使用如上文对二元载体描述的方法完成超二元质粒结构的验证/确认，并且可以进行修饰，如Operating Manual for Plasmid pSB1中提示的。
实施例17
单子叶植物中杀虫蛋白的生成
土壤杆菌介导的玉米转化。将来自High II F1杂交(Armstrong et al.,1991,Maize Genet.Coop.Newsletter65:92-93)的种子种植到5加仑盆中，该盆含有95%Metro-Mix360无土生长培养基(Sun Gro Horticulture,Bellevue,WA)和5%粘土/壤土的混合物。使用高压钠和金属卤化物灯与16:8小时光照:黑暗光周期的组合在温室中培养植物。为了获得不成熟的F2胚以进行转化，实施受控的近缘传粉。在传粉后8-10天时在胚的大小是约1.0to2.0mm时分离不成熟的胚。
感染和共培养。如下将玉米穗表面灭菌，即用液体皂洗涤，在70%乙醇中浸没2分钟，然后在20%商业漂白剂(0.1%次氯酸钠)中浸没30分钟，之后用无菌水漂洗。制备含有超二元载体的土壤杆菌细胞悬浮液，即将1-2环细菌转移至5mL含有100μM乙酰丁香酮的液体感染培养物(LS基础培养基(Linsmaier and Skoog,1965,Physiol.Plant.18:100-127)，N6维生素(Chu et al.,1975,Scientia Sinica18:659-668)，1.5mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)，68.5gm/L蔗糖，36.0gm/L葡萄糖，6mML-脯氨酸,pH5.2)中，所述细菌在含有100mg/L壮观霉素、10mg/L四环素、和250mg/L链霉素的YEP固体培养基上于28°培养2-3天。将溶液涡旋振荡，直到实现一致的悬浮液，并且将浓度调节至最终密度约200Klett单位(使用具有紫色滤器的Klett-Summerson比色计进行)，或550nm处的光密度约0.4。将不成熟的胚直接分离到含有2mL感染培养基的微量离心管中。将培养基取出，并用1mL具有200Klett单元密度的土壤杆菌溶液更换，并将土壤杆菌和胚溶液于室温温育5分钟，然后转移至共培养培养基(LS基础培养基，N6维生素，1.5mg/L2,4-D，30.0gm/L蔗糖，6mM L-脯氨酸，0.85mg/L AgNO3，100μM乙酰丁香酮，3.0gm/L Gellan胶(PhytoTechnology Laboratories.,Lenexa,KS),pH5.8)，于25°在黑暗条件下持续5天。
共培养后，将胚转移至选择培养基，之后，在约8周的过程里获得经转化的隔离群。为了选择用含有植物可表达pat或bar选择标志物基因的超二元质粒转化的玉米组织，基于LS的培养基(LS基础培养基，N6维生素，1.5mg/L2,4-D，0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水合物；PhytoTechnologiesLabr.)，30.0gm/L蔗糖，6mM L-脯氨酸，1.0mg/L AgNO3，250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L Gellan胶,pH5.7)与双丙氨磷(Gold BioTechnology)一起。将胚转移到含有3mg/L双丙氨磷的选择培养基，直到获得胚胎发生隔离群。通过以2周时间间隔转移至新鲜选择培养基放大回收的隔离群，用于再生和进一步分析。
玉米转化领域的技术人员会了解，在使用其它植物可表达选择标志物基因(例如除草剂耐受性基因)时可用选择经转化植物的其它方法。
再生和种子生成。对于再生，将培养物转移至“28”诱导培养基(MS盐和维生素，30gm/L蔗糖，5mg/L苯甲基氨基嘌呤，0.25mg/L2,4-D，3mg/L双丙氨磷，250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L Gellan胶，pH5.7)，在低光照条件(14μEm-2s-1)下持续1周，然后在高光照条件(约89μEm-2s-1)下持续1周。随后，将组织转移至“36”再生培养基(与诱导培养基相同，只是缺乏植物生长调节剂)。当小植物的长度达到3-5cm时，将它们转移至含有SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt盐和维生素(1972);PhytoTechnologies Labr.)，1.0gm/L肌肉肌醇，10gm/L蔗糖和2.0gm/L Gellan胶，pH5.8)的玻璃培养管以容许枝条和根的进一步生长和发育。将植物移植到与本文中早先描述相同的土壤混合物，并在温室中培养至开花。进行受控的传粉以进行种子生成。
或者，可以使用二元载体来生成转基因玉米植物，其含有一个或多个稳定整合到植物基因组中的嵌合基因且包含本文中公开的编码区。例如，在土壤杆菌介导的转化后生成包含至少一个SEQ ID NO:5,11,17,23,29,35,41,47,53,59,65或71的编码区的植物。采用二元转化载体的玉米转化方法是本领域中已知的。在一个实施方案中，经转化的组织根据其在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力选择，并且在适当时对其筛选蛋白质生成。
穗灭菌和胚分离。从温室中培养的玉米近交系B104的植物获得未成熟的玉米胚，并自花或近缘传粉以生成穗。在传粉后约9至12天收获穗。在实验当天，将脱壳(de-husked)的穗通过在20%次氯酸钠(6.15%)溶液中浸没进行表面灭菌，并摇动20至30分钟，接着在无菌水中漂洗三次。灭菌后，将未成熟的合子胚(1.5至2.4mm)在无菌条件下从每个穗切开，并随机分配到含有液体接种培养基的微量离心管中。接种培养基含有：2.2gm/L MS盐(Frame et al.,2011,Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.INPlant Embryo Culture Methods and Protocols:Methods in MolecularBiology.T.A.Thorpe and E.C.Yeung,(Eds),SPRINGER SCIENCE ANDBUSINESS MEDIA,LLC.pp327-341)；1X ISU改良的MS维生素(Frame et al.,2011同上)；68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L L-脯氨酸；100mg/L肌肉肌醇；和200μM乙酰丁香酮(在DMSO中制备)；pH5.4。对于给定的实验组，使用来自合并的穗的胚进行每次转化。
土壤杆菌培养启动。将含有二元转化载体pDAB111440(实施例1)的土壤杆菌菌株DAt13192(国际PCT公开文本No.WO2012016222(A2))的甘油储液在含有合适抗生素的AB最低限度培养基板(Watson,et al.,(1975)J.Bacteriol.123:255-264)上划线，并于20℃培养3至4天。将单菌落挑出，并划线到含有相同抗生素的YEP板(gm/L：酵母提取物，10；胨，10；NaCl5)上，并于20℃温育1-2天。
土壤杆菌培养和共培养。从YEP板采集土壤杆菌菌落，在50mL一次性管中在10mL接种培养基中悬浮，并使用分光光度计将细胞密度调节至0.2至0.4的OD550(于550nm测量的光密度；细胞生长的测量)。将土壤杆菌培养物在旋转摇动器上以125rpm(室温)温育，期间实施胚切开。将不成熟的合子胚(先前从灭菌的玉米粒分离并在1mL接种培养基中放置)在相同培养基中清洗一次。将2ml土壤杆菌悬浮液添加至每管胚，并将管在摇动器平台上放置10至15分钟。将胚转移到共培养培养基上，以盾片面朝上为方向，并于25℃在24小时光照下以50μEm-2sec-1光强度温育3天。共培养培养基含有4.33gm/LMS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L在KOH中的麦草畏(Dicamba)(3,6-二氯-邻茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L肌肉肌醇；100mg/L酪蛋白酶促水解产物；15mg/L AgNO3；100μM在DMSO中的乙酰丁香酮；和3gm/L GELZANTM(SIGMA-ALDRICH)；于pH5.8。
愈伤组织选择和推定事件的再生。共培养期后，将胚转移至静息培养基，并在24小时光照下以50μEm-2sec-1光强度且于25℃温育3天。静息培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L在KOH中的麦草畏；100mg/L肌肉肌醇；100mg/L酪蛋白酶促水解产物；15mg/L AgNO3；0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水合物;PHYTOTECHNOLOGIES LABR.;Lenexa,KS)；250mg/L羧苄青霉素；和2.3gm/L GELZANTM；pH5.8。将胚转移到选择培养基1(其由静息(resting)培养基(上述)及100nM精吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)(0.0362mg/L)组成)上，并在黑暗中和/或在24小时光照下以50μEm-2sec-1光强度于28℃温育7至14天。将增殖的胚胎发生愈伤组织转移到选择培养基2(其由静息培养基(上述)及500nM精吡氟氯禾灵酸(0.1810mg/L)组成)上，并在24小时光照中以50μEm-2sec-1光强度于28℃温育14至21天。此选择步骤容许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
将增殖的胚胎发生愈伤组织转移至再生前培养基上，并在24小时光照下以50μEm-2sec-1光强度于28℃培养7天。再生前培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；45gm/L蔗糖；350mg/L L-脯氨酸；100mg/L肌肉肌醇；50mg/L酪蛋白酶促水解产物；1.0mg/L AgNO3；0.25gm/L MES；0.5mg/L在NaOH中的萘乙酸；2.5mg/L在乙醇中的脱落酸；1mg/L6-苯甲基氨基嘌呤；250mg/L羧苄青霉素；2.5gm/L GELZANTM；和500nM精吡氟氯禾灵酸；pH5.8。将具有枝条样芽的胚胎发生愈伤组织转移至再生培养基上，并在24小时光照下以50μEm-2sec-1光强度培养7天。再生培养基I含有4.33gm/LMS盐；1X ISU改良的MS维生素；60gm/L蔗糖；100mg/L肌肉肌醇；125mg/L羧苄青霉素；3.0gm/L GELZANTM；和500nM精吡氟氯禾灵酸；pH5.8。将具有初生根的小枝条转移至PHYTATRAYS(PHYTOTECHNOLOGIESLABR.;Lenexa,KS)中的枝条/根培养基，并在16:8小时光照:黑暗下以140至190μEm-2sec-1光强度于27℃温育7天。枝条/根培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；100mg/L肌肉肌醇；3.5gm/LGELZANTM；pH5.8。通过定量实时PCR或其它标准分子分析技术对推定的转基因小植物分析转基因拷贝数目，并将其转移至土壤。
在温室中转移并建立T0植物以生成种子。将根据其在含有500nM精吡氟氯禾灵酸的培养基上生长的能力选择的经转化的植物组织移植到METRO-MIX 360无土生长培养基(SUN GRO HORTICULTURE)中，并在生长室中受冷而变得耐寒。然后，将植物移植到SUNSHINE CUSTOM BLEND160土壤混合物中，并在温室中培养至开花。进行受控传粉以生成种子。
在V-3至V-5阶段对选择的T0植物的叶组织取样。将两份6mm直径叶样品在96孔簇管架中于-80℃贮存，直到分析日。将两个DAISYTM钢BB和200μL提取缓冲液(含有0.05%Tween20和5μL/ml SIGMA蛋白酶抑制剂混合物(产品目录编号9599)的PBS溶液)添加至每管。将样品在KLECO珠研磨机(Visalia,CA)中以最大设置碾磨3分钟。将样品以3,000xg离心5分钟，然后将100μL上清液转移至空的样品管。再添加100μL提取缓冲液至植物样品，并再用珠碾磨3分钟。再次离心后，将100μL此提取物与前100μL组合。将组合的上清液混合，并在提取同一天分析。
通过标准ELISA(酶联免疫吸附测定法)或蛋白质免疫印迹(Western印迹)对从测量面积的叶组织提取蛋白质分析Cry1Fa蛋白和AAD-1蛋白的表达。对于Cry1Fa ELISA检测，依照制造商的说明书使用来自ENVIROLOGIX ELISA试剂盒(产品目录编号AP016NW V10;Portland,ME)的试剂。w使用针对纯化的AAD-1蛋白制备的兔抗体通过标准ELISA方法(例如如Ausubel et al.(1995and updates)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York中教导的)实施AAD-1检测。
表29中公开了从经pDAB111440转化的植物的提取物获得的ELISA结果。蛋白质水平以每平方厘米收获的叶面积检测的ng主题蛋白质表示。
表29：从用质粒pDAB111440转化的玉米植物提取的Cry1Fa和AAD-1蛋白的表达水平，如通过ELISA法检测的。
样品ID Cry1Fa AAD-1ng/cm2
ng/cm2
111440[3]-001.001 2.30 14.0
111440[3]-015.001 3.80 0.0
111440[3]-023.001 3.80 320.0
111440[3]-020.001 5.40 190.0
111440[3]-011.001 17.00 0.0
如上文那样制备表29中列出的5个经pDAB111440转化的植物的蛋白质提取物(及来自非转化的阴性对照植物的提取物)，并在免疫印迹(Western印迹)上用Cry1Fa抗体探测。免疫印迹规程基本上如由Gallagher et al.(2008;Immunoblotting and Immunodetection.Current Protocols in Immunology8.10.1–8.10.28)描述的。将蛋白质样品(80μL)与20μL INVITROGENNuPAGE LDS样品缓冲液混合，于>90℃加热5分钟，在INVITROGENNuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶上加载，并在MOPS SDS运行缓冲液中运行(200伏特，持续45分钟)。将BIORAD PRECISION PLUS双色标准品在分开的道中加载。依靠INVITROGEN iBLOT凝胶转移系统依照制造商的说明书将蛋白质转移至0.2μM硝酸纤维素膜。将膜用INVITROGEN WESTERN BREEZEBLOCKING MIX封闭，然后与一抗(纯化的抗Cry1F兔抗体No.D0609RA07-A0;Strategic Diagnostics Inc.,Newark,DE)，接着与二抗(INVITROGEN生物素化的山羊抗兔抗体)起反应。这接着是INVITROGENHRP-链霉抗生物素蛋白缀合物，并通过PIERCE SUPERSIGNAL WEST PICOLUMINOL ENHANCER AND STABLE PEROXIDE(No.34080)检测起反应的条带。
阳性对照道含有0.5ng或1.0ng纯化的Cry1Fa核心毒素蛋白，其通过在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)表达系统(参见例如美国专利申请No.20100269223A1)中表达全长Cry1Fa编码区生成。将全长Cry1Fa蛋白用胰蛋白酶处理以释放计算分子大小68kDa的Cry1Fa核心毒素区段，其在免疫印迹上作为阳性对照标准品使用。在来自阴性对照植物的提取物中没有检测到抗体反应性条带，而所有5个转基因植物提取物含有略微大于75kDa的评估大小的单一主要条带(在强度上大致等于对照Cry1Fa蛋白)。
控制昆虫有害生物的方法。在昆虫与有效量的经由转基因植物表达投递的毒素接触时，结果通常是昆虫死亡，或者昆虫不以使毒素对昆虫可用的来源为食。
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Claims (23)

1.一种用于在玉米细胞中表达感兴趣蛋白质的合成DNA序列，其包含：
a)编码所述感兴趣蛋白质的经密码子优化的DNA序列，
b)至少一种选自下组的多聚腺苷酸化信号序列：I类和II类，其中：
I类选自下组：AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA，和CATAAA；且
II类选自下组：ATATAT，TTGTTT，TTTTGT，TGTTTT，TATATA，TATTTT，TTTTTT，ATTTTT，TTATTT，TTTATT，TAATAA，ATTTAT，TATATT，TTTTAT，ATATTT，TATTAT，TGTTTG，TTATAT，TGTAAT，和AAATAA；且
其中所述经密码子优化的DNA序列含有至少一种来自II类的多聚腺苷酸化信号序列，且其中所述合成DNA序列比所述蛋白质的天然DNA序列含有更少的II类多聚腺苷酸化信号序列，并且与所述天然DNA序列相比含有相同数目的I类多聚腺苷酸化信号序列。
2.权利要求1的合成DNA序列，其基本上没有II类多聚腺苷酸化信号序列。
3.权利要求1的合成DNA序列，其没有II类多聚腺苷酸化信号序列。
4.权利要求1的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码选自下组的天然蛋白质：杀虫蛋白、除草剂耐受性蛋白、应激耐受性相关蛋白、和油概况修饰蛋白(oil profile modification protein)。
5.权利要求4的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码杀虫蛋白。
6.权利要求4的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码芳氧基链烷酸双加氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase)1蛋白。
7.一种用于在大豆细胞中表达感兴趣蛋白质的合成DNA序列，其包含：
a)编码所述感兴趣蛋白质的经密码子优化的DNA序列，
b)至少一种选自下组的多聚腺苷酸化信号序列：I类和III类，其中：
I类选自下组：AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA，和CATAAA；且
III类选自下组：ATTTTT，TATTTT，TTATTT，TTTATT，TTTTTT，TTTTAT，AATTTT，TTTTTA，ATATAT，TAATTT，TTAATT，AAATTT，AAATAA，ATATTT，TTTGTT TTGTTT，ATTATT，ATTTTA，TTTAAT，和TTTTAA，且
其中所述经密码子优化的DNA序列含有至少一种来自III类的多聚腺苷酸化信号序列，且其中所述合成DNA序列比所述蛋白质的天然DNA序列含有更少的III类多聚腺苷酸化信号序列，并且与所述天然DNA序列相比含有相同数目的I类多聚腺苷酸化信号序列。
8.权利要求7的合成DNA序列，其基本上没有III类多聚腺苷酸化信号序列。
9.权利要求7的合成DNA序列，其没有III类多聚腺苷酸化信号序列。
10.权利要求7的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码选自下组的天然蛋白质：杀虫蛋白、除草剂耐受性蛋白、应激耐受性相关蛋白、和油概况修饰蛋白。
11.权利要求10的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码杀虫蛋白。
12.权利要求10的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码芳氧基链烷酸双加氧酶1蛋白。
13.一种选自下组的合成DNA序列：SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:11,SEQID NO:17,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:65,和SEQ IDNO:71。
14.一种用于表达感兴趣蛋白质的DNA构建体，其包含5’非翻译序列、感兴趣蛋白质的编码序列、和3’非翻译区，其中所述5’非翻译序列含有植物细胞中有功能的启动子，所述编码序列是权利要求1的合成DNA编码序列，且其中所述3’非翻译序列包含转录终止序列和多聚腺苷酸化信号。
15.一种用于表达感兴趣蛋白质的DNA构建体，其包含5’非翻译序列、感兴趣蛋白质的编码序列、和3’非翻译区，其中所述5’非翻译序列含有植物细胞中有功能的启动子，所述编码序列是权利要求7的合成DNA编码序列，且其中所述3’非翻译序列包含转录终止序列和多聚腺苷酸化信号。
16.一种转基因植物，其含有权利要求1的合成DNA序列。
17.一种转基因植物，其含有权利要求7的合成DNA序列。
18.一种控制谷物或种子中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求5的合成DNA的植物获得所述谷物或种子。
19.一种控制谷物或种子中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求11的合成DNA的植物获得所述谷物或种子。
20.一种控制谷物或种子中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求5的合成DNA的植物获得所述谷物或种子。
21.一种控制粗粉(meal)或面粉(flour)中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求5的合成DNA的谷物获得所述粗粉或面粉。
22.一种源自权利要求16的转基因植物的组合物，其中所述组合物是选自下组的商品：粗粉、面粉、蛋白质浓缩物、或油。
23.一种源自权利要求17的转基因植物的组合物，其中所述组合物是选自下组的商品：粗粉、面粉、蛋白质浓缩物、或油。
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