JPS60500438A - 植物細胞を形質転換するためのプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物細胞を形質転換するためのプラスミド技術北の分野 本発明は、遺伝子工学、植物学および細菌学の分野に属する。

背景となる技術 過去１０年間、遺伝子工学の科学は急速に発展した。

異質遺伝子を細菌中に挿入し、細菌が挿入された遺伝子を効率よく発現しうるよ うにさせうる種々の方法が知られている。そのような方法は、ふつう、制限エン ドヌクレアーゼでひとつまたはひとつより多くの選択された切断サイトで切断さ れつるプラスミドを用いる。

代表的には、１片のＤＮＡをを切断して興味の対象である遺伝子を取得し、生ず るＤＮＡフラグメントを、シラスミドのようなベクターを切断して得られたフラ グメントと混合する。異なるＤＮＡ鎖をリゾ−ジョンして、再構築されたプラス ミドとする。たとへばＵ、Ｓ、　％許４．２６７．２２４　（Ｃｏｈｅｎおよび Ｂｏｙｅｒ　、　１９８０　）；４．２　６　４，７　６　１　（５ｂｉｎｅ　 、　１　９　８　１　）　：　４，２　７　ろ、８７５（Ｍａ、ｎｉｓ　、　１ ９８１　）　：４，３２２，４９９（Ｂａｘｔｅｒ等。

１９８２）、および４，３３６．３６６　（５ｉｌｈａｖｙ等。

１９８２）をみよ。

他に種々の参考文献がある。これらの文献のあるものには、ＤＮＡがｍＲＮＡに 転写されそしてｍｌ−１ＭＡが蛋白質に翻訳されろプロセスが記載されている。

たとへば、Ｌ、　５ｔｒｙｅｒ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、第２版、５ ５９頁および以降（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａ、ｎ社、　１９８１　）　；　Ａ−Ｌ 。

Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、８５乙１頁および 以降（Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌ、、　１９７５　）がある。他の文献は、遺伝子操 作の方法および生成物を記載している。たとへば、Ｔ、　Ｍａｎｉａから等、　 Ｍｏ１ｅｃｕＬａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ、ｎ ｕａｌ　（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ　。

１９８２　）　；　Ｊ、に、　Ｓｅｔ；ｌｏｗおよびＡ−Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ 。

Ｇｅ　ｎ　ｅ　ｔｌ　ＣＥＩｌ　ｇ　ｌ　ｎ　ｅ　ｅ　ｒ　ｌ　ｎ　ｇ　ｔ　Ｐ ｒ　ｌ　ｎ　Ｃｌ　ｐ　ｌ　ｅ　Ｓａｎ　ａ、　１Ｖｆｅ　ｔｈ　Ｏｄ　Ｓ（Ｐ ｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９７９　）がある。以降、すべての参照文献は略 称で記載する。実施例のあとに引用文献の完全リストを記載する。

今日までになされた遺伝子工学の仕事の大部分は、種々の型の細胞、主にＥ、ｃ ｏｌｉのような細菌、酵母のような種々の他の微生物および呻乳動物の細胞に遺 伝子を挿入することを包含している。しかし、動物細胞および微生物の遺伝子工 学に用いる技術および物質は、植物を含む遺伝子工学にじかに応用されない。

本明細書中で用いる”植物”の用語は、被子植物および多細胞藻類のような、光 合成をしうろ、多細胞の分化した生物を意味するとする。これには、細菌、酵母 およびかびのような微生物を含まない。“植物細胞”とは植物に由来する細胞の すべてを包含する。これには、カルスまたはクラウンゴール腫瘍のような未分化 組織ならびに植物種子、繁殖体、花粉および植物胚が外来の遺伝子情報を植物細 胞に導入するための天然とが提案された（　Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ等＋　１９ ８０　；　Ｒｏｒｓｃｈおよび５ｃｈｊ、１ｐｅｒｏｏｒｔ　、１９７８　）　 。あろタイツ０のＡ。

−ル症をおこさせうる。感染のフ０ロセスは完全には理解されていない。Ｔ１プ ラスミドの少なくとも１部が植物細胞に入る。種々の代謝上の変化を生じて、プ ラスミドが植物のケ８ツム（恐らくは染色体）に挿入されろ。植物ケゞツムに入 ったＴ１フ０ラスミドの部分は”移入されたｔｒａｎｓ　ｆｅ　ｒｒｅｄ″（Ｔ −ＤＩＶＩＡ）と呼ばれる。

Ｔ　−ＤＮＡは植物ＤＮＡ中に安定に維持される（　ｃｈｉｌｔｏＨ等、１９７ ７　；　Ｙａｄ、ｅｖ等１９８０；　Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ等。

１９８０　；　０ｔｔｃｎ等、１９８１）。

いくつかの実験室での研究は、Ｔ　−ＤＮＡ中に存在するいくつかの構造（すな わち蛋白質をコードする）遺伝子の特徴づけ（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ等、　１９８ １　；　Ｌｅｅｍａｎｓ等、　１９８２　）ならびにいくつかの他の働らきをす るように見える他のＤＮＡ配列の特徴づけを行なった。たとへぼ、゛レフトー？ −＄　−（１ｅｆｔ　ｂｏｒｄｅｒ　）および”ライトボータゞ−（ｒｉｇｈｔ 　ｂｏｒｄｅｒ　）と呼ばれる２つの配列１１　Ｔ　−ＤＮＡを表現しているよ うに思われ、そして恐ら＜　Ｔ　−ＤＮＡが植物の染色体に移入（ｔｒａｎｓｆ ｅｒ）される際のプロセスに関与するのであろう（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ等、１９ ８２）。

”根毛病誘導ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ″（Ｒｉ　）　７°ラスミドを担う、 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの別の種、つまり−Ａ−ｒｈｉｚｏｇｅ−ｎｅｓが ある。このシラスミドはＴ１プラスミドと類似する。−Ａ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎ ｅｓで植物細胞を感染すると根毛症をおこす。Ｔ１７°ラヌミドと同じ＜、”　 Ｔ　−ＤＩｑＡ”とぶ〕は、感染細胞の植物ケゞツム中に移入されろ。

植物細胞の遺伝子形質転換をおこさせうろ種々の他細菌かあ）る。Ｓｅｔｌｏｗ およびＨｏ１ａｅｎｄｅｒ　、　１９７９の１５６頁、　Ｈｏｏｙｋａａｓ等。

本明柾嘗中で用いる″Ｔ１Ｔ１７°ラヌミド用語は、（Ｉ）植物または植物細胞 に、ひとつまたはひとつより多くの遺伝的形質転換をおこしつる、ウィルヌ以外 の微生物に含まれ、そして、（２）植物ケゞツムに挿入されるＤＮＡ断片を含有 するフ０ラスミドのすべてを包含するとする。

これにはＲｉ７°ラスミドも含まれろ。

本明細書中で用いる“Ｔ　−ＤＮＡ”の用語は、（１）植物細胞のひとつまたは ひとつより多くの型のケゝノ人中に挿入されたか、または、Ｔ２）　Ｔ　−ＤＮ Ａボーダーとして役立ちうる２つの塩基配列のあいだに位置するＤＮＡ断片中に 含有されているところの、Ｔ１フ０ラスミド中ｆ存在するかまたはそれに由来す るＤＮＡ断片を意味するとする。本明細書−中で使用すする、“Ｔ　−ＤＮＡボ ータゞ−”および“ヴータ８−”の用語については、これらは経験的に定められ そして適用されろもので、Ｔ１フ０ラスミドより植物ケ９ツムに移されろＤＮＡ 断片の末端にかまたは末喝に近く現われる塩基の配列を意味するとする。

Ｔ　−ＤＮＡおよびＴ１プラスミドについての現在の刊識にかかわらず、本発明 より以前には、遺伝的に改変された植物中で発現される外来遺伝子の導入のため に、これらのベクターを利用することができないでいた。

そのような利用への障害が、遺伝子工学の挑戦において認められた。

１）Ｔｉ−Ｊ′シラスドはザイズが大きく（約２００，０００塙基対）そしてそ の結果複雑になるので、Ｔ　−ＤＮＡ中の特定のサイトを遺伝子的に改変しそし て（または）外来遺伝子を挿入するための組換えＤＮＡの標漁技術を使用しえな い。たとへばＴ〕フ０ラスミド中には、独自の制限エンＶヌクレアーゼ切断ナイ トがまったく知られていない（Ｌｅｅｍａ、ｎｓ等、１９８２）。

２）植物細胞中に挿入されそして発現されたＴ−ＤＮＡは、形質転換された植物 細胞中に高レベルの植物ホルモンを生産さすることに関与する遺伝子を含有する 。高レベルの植物ホルモンは、細胞の正常の代謝および再生フ０ロセスを妨害し 、細胞より正常な表現型の植物を形成するのを妨げる（　Ｂｒａ、ｕ、ｎおよび Ｗｏ　ｏ　ｃｉ　ｒｌ　９７６　；　Ｙａｎｇ等、１９８０）、このことの例外 は、Ｔ　−ＤＮＡがｉｎ　ｐｌａｎｔａで、植物ホルモン生産に関与する遺伝子 を除くような広範な自然発生的な欠失を受るという稀な場合である。これらの条 件では、正常な植物が得られる瀕度は低いと報告されている（　Ｏｔｔ、ｅｎ等 。

１９８１）。ところで、植物ホルモン生産に関与するＴ　−ＤＮＡ遺伝子を欠失 させ得たのは本発明が初めでである。つまり、それらの遺伝子が形質転換植物細 胞の同定および（または）選択に非常に重要であったからである（　Ｍａｒｔｏ ｎ等、１９７９）。

上述のように、外来遺伝子をフ０ラスミドに導入するための単純な組換えＤＮＡ 技術は、大きなＴ１フ０ラヌミドには応用しえない。それで、いくつかの間接的 方法が開発されたので、それについて下記に論する。Ｔ１プラスミドをベクター として使用することの第１の報告例は、細菌性トランスボ・アンをＴ　−ＤＮＡ に挿入し、ついで、植物細胞に導入するモデル実験である。細菌性トランスボー メは、植物ケ８ツム中に安定して維持されると報告された（　Ｈａｒｎａｌｓｔ ｅｅｎ等、　１９８０　；Ｇａｒｆｉｎｋｅ１等１９８１）、しかし、これらの 例で、形質転換された腫瘍細胞は、正常植物中で再生しえないことが分った。そ して細菌性遺伝子が植物細胞中で発現されたという報告もない。さらに、細菌ト ランス式・アンの挿入は、本質的にランダムであると信ぜられるので、これらの 例で挿入されたＤＮＡの位置を定めるに要する労力は大変なものである。それゆ えに、このアプローチは、植物に、予知しうる方式で望む遺伝子を導入するのに 有用であると思われない。

他の研究者は、Ｅ、　ｃｏｌｉおよびＡ、　ｔｕ、ｍｅｆａｃｉｅｎｓの両方で 増殖しうろ中間ペターの使用ジ報告した（　Ｍａ　ｔ　ｚｋ　ｅおよびＣｈｉｌ ｔｏｎ　、　１９８１　；　Ｌｅｅｍａｎｓ等１９８１　＋　Ｇａｒｆｉｎｋｅ ｌ等、１９８１）。中間体ベクターは、標焦組換えＤＮＡ技術を用いて操作しう ろ、比較的に小さいＴ１フ０ラスミドのサフ〆うグメントを含有する。このナプ フラグメントは特定の配列な欠失さすかまたは外来遺伝子を特定のサイトに挿入 することで改変しうろ。この改変ＴＤＮＡを含有する中間体ベクター（ま、つい でトランスボーメ−ンヨンまたはコンジュケゞ−ンヨンによりＡ−ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓに導入する。中間体ベクター上の変型されたＴ　−ＤＮＡフラグメン トとそれのＴ１プラスミド上野生型対し部分とのあいだの２重組換えにより、野 生型コピーが変型フラグメントでおきかえられる。適当な抗生物質を用いて、組 換えＴｉ）０ラスミドを含有する細胞を選択しうる。

この方法で種々の外来ＤＮＡがＴ　−ＤＮＡの特定のサイトに挿入された。それ から植物細胞に安定に移入されると報告された（　ＭａｔｚｋｅおよびＣｈｉｌ ｔｏｎ、　１９８１　。

Ｌｅｅｍａｎ等、１９８１．１９８２）。これらの二外来遺伝子が植物細胞中で 発現された報告はなく、形質転換された植物細胞は、正常植物へと再生しえぬま まとなる。

さらに、上記の操作では、野生型コピーを変型ＤＮＡフラグメントに代えるには 、２重クロスオーバ事象がおこるのが有利である。Ｔ　−ＤＮＡ　ｉ＋−’プフ ラグメントのコピーを２つ含有するコーインテグレート（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａ ｔｅ　）フ０ラスミドを、単純クロスオーバーでは生ずる。このような重複は、 これらの方法で望ましくない。それは、Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｌｅｎｓ細胞また は植物細胞でおこりうる相同性組換えは、挿入された外来遺伝子の損失を結果し うるからである。

上記方法の最大の欠点は２重組換えの瀕度がきわめて低いこと（約１０−４から １０−９＋　Ｌｅ　ｅＩｎａ、ｎ　Ｓ等。

１９８１）で、２重クロスオーバ組換え生成物を同定し分離するに大変な労力を 有することである。それで、Ｔｉ７’ラスミドを遺伝子工学的に処理するための 、現存のり方法を用いて実施しうろ実験の数および型は著しく限定されろ。

植物細胞にＤＮＡを挿入するための他の手段他にも色々な方法が、植物細胞にＤ ＮＡを挿入するために報告された。ひとつのそのような方法としては、ひとつま たはひとつより多くのＤＮＡ分子をカフ０セルに封入するために、リボゾームと も言われろ脂質ベシクルを用いることである。リボソゞ−ムおよびそれらのＤ１ 執）ま植物細胞に取り込まれる（たとへばＬｕｒｑｕｉｎ　。

１９８１）。挿入されたＤＮＡが植物体ｒツムに取り込まれ、複製し、そして受 けつがれてゆげ１ハ、植物細胞は形質転換されることになる。

別法に、（ａ）ポリ陽イオン物質たとへばポリーＬ−オルニチン（Ｄａｖｅｙ等 、　１９８０　）または［ｂｌリン酸カルシウム（Ｋｒｅｎｓ等、１９８２）と 複合物としたＤＮＡがある。これらの技術を用いろと、Ｔ１プラスミドのすべて または部分が植物細胞に挿入され、植物細胞に腫瘍形成性の変化を与えるという 。

望むフ０ラスミＰを含有する細菌を植物細胞と融合さす方法も開発された。この 方法では共に、酵素消化で、細菌植物の細胞より細胞壁障壁を除いている。つい でこれら２つの細胞タイプは、ポリエチレングリコールのような化学剤にさらし て用いうる。Ｈａｓｅｚａｗａ等。

１９８１゜ しかし、これら上記した技術は、下記する欠点のひとつまたはひとつより多くを 有している。

１　これまでに報告された形質転換効率は非常に低い。

２、小型のＤＮＡ分子のみが植物細胞中に挿入されうる。

ろ、　わづか少数のＤＮＡ分子のみが植物細胞中に挿入されつる、モして（また は） ４、植物細胞中に挿入される遺伝子は、それが植物細胞のゲノム中に組込まれな いと、つまり、植物細胞中で複製する染色体またはプラスミド中に挿入されぬ限 り、植物細胞により安定に維持されない。

これらおよび恐らくは他の理由により、上記の腫瘍誘導性トランスホーメーショ ン以外には、上記技術のいずれかにより植物細胞に挿入された遺伝子が発現され たという報告（まない。

本発明より前には、ルーチンに再生されて形態学的に正常な植物になりうる遺伝 学的に形質転換された植物細胞が創出され同定された例はない。

本発明の要約 不発明は、分化し、形態学的に正常の植物に引き続き再生され５る、形質転換さ れた植物細胞の創製に有用ないくつかのプラスミドに関している。本発明はその ようなプラスミドを含有する微生物およびそのような）０ラスミドおよび微生物 を創製するための方法に関する。

本発明は、ある種の下記する望ましい特性を有する、ｐＭＯＮ　１２０のような 第１のフ０ラスミドに関する。植物細胞中で発現されうる遺伝子は、このフ０ラ スミドに挿入して、ｐＭＯＮ　１２８のような誘導プラスミドを与えうる。たと へばプラスミドｐＭＯＮ　１２８は、ある種の抗生物質を不活化する酵素である ネオマイシンホスホトランスフエラーゼｎ（ＮＰＴ　ＩＩ）を発現するキメラ遺 伝子は植物細胞中に発現しうる。

誘導プラスミドを、Ｔｉミツ０ラスミド含有するプラスミドのあるものはＴｉ　 ７°ラスミドと再結合して、コーインテグレートフ０ラスミドを形成する。これ は２つのフ０ラヌミド聞の相同性による。望むコーインテグレートフ０ラヌミド を創出するのにひとつだけクロス−オーバー事象が必要である。

本発明の挿入されたプラスミドの特性のゆえに、生成するコーインテグレートＴ １プラスミドは、コーイー々、 ンテタｖ　−ｌ−７’フＳ　トノ′ｒ　−ＤＮＡ領域中に、キメラ遺伝子および （または）任意の他の挿入遺伝子を含有する。挿入された遺伝子（±少なくとも ２つのＴ　−ＤＮＡポーターにかこまれ、それらのうちの少なくともひとつは、 クロスオーバー事象によりＴ１）０ラスミドに挿入された。適当な抗生物質によ り、挿入された遺伝子宮ミドまたはその部分を植物細胞中に入らせうる條件で、 デロトフ０ラスト、フ０ロトフ０ラスト由来細胞、植物の切片またはインタクト の植物のような植物？■胞と、あわせ培養する。ひとたび植物細胞内に入ると、 ２つのＴ−２ ＤＮＡボーダーにかこまれたＴ１プラスミドの部分が自然のプロセヌで植物デノ ームに挿入される。このＤＮＡ断片は、キメラ遺伝子および（または）任意の他 の望む遺伝子を含有する。なるべくは、植物ケ゛ノームに挿入されるベクターＤ ＮＡの断片は、植物細胞の再生分化を不可能とするような遺伝子を含有しないよ うにする。

形質転換された植物細胞は、挿入された遺伝子を子孫に伝える、形態学的に正常 な植物に再生されうる。

本発明方法により形質転換された植物に１１種々の用途が存在する。たとへば、 除草剤を不活化する酵素をコードする遺伝子を植物中に挿入しうる。これにより 植物および子孫は除草剤に抵抗性を示す。同様に、望む哺乳動物〆す（デチドた とへげ成長ホルモン、インスリン、インターフェロンまたはソマトヌタチンのよ うな望む哨乳動物醪すベフ０チドを植物に挿入しうる。

植物を栽培し収穫し、ボリペフ０チドを植物組織より抽出しうる。

図面の簡単な説明 第１図は、ｐＭＯＮ　１２８およびＮｏ　Ｓ−１ぐＰＴＩＩを遺伝子の例とする 、本発明の工程を示すフローチャートである。

第２図は、ｐＭＯＮ　１２０を構築するに用いられるシラスミＶであるｐＭＯＮ 　４１の創製を示す。

第６図は、ｐＭｏＮ１０９を構築するに用いられるＭｌろ一由来ＤＮＡであるＭ −４の創製を示す。

第４図は、ｐＭＯＮ　１０９を構築するに用いられろデラスミｖである１１１Ｍ ０Ｎ　５４の創製を示す。

第５図はｐＭＯＮ　１２０の構築に用いられるフ０ラヌミドであるｐＭＯＮ　１ ０９の創製を示す。

第６図は、ｐＭＯＮ１２０の構築に用いられるシラスミドであるｐＭＯＮ　１１ ろの創製を示す。

第７図は、望む遺伝子の挿入に適当な６個の制限エンドヌクレアーゼ切断サイト を有する中間ベクターであるシラスミドｐＭＯＮ　１２０の創出を示す。

第８図は、キメラＮＯ８−ＮＰＴ　Ｉ　Ｉカナマイシン抵抗性遺伝子をｐＭＯＮ 　１２０に挿入することで得られた中間体ベクターｐＭＯＮ　１２８の創出を示 す。

第９図は、単一クロスオーバ事象を用いて、野生型Ｔ１シラスミドでｐＭＯＮ　 １２８をコインテグレーンヨンし、それにより複数のボーダーを有するコーイン テグレートデラヌミドを創出することを表わす。

第１０図は、デイヌアーム（ｄｉｓａｒｍ　）されたＴｉ−シラスミドでｐＭＯ Ｎ　１２８をコーインテグレーンヨン１−１それにより非腫瘍誘導性インチグレ ートプラスミドを創出することを示す。

第１１図はカナマイシン含有培地で形質転換細胞と非転換細胞の生育を比較した グラフである。

本発明の詳細な記載 本発明のひとつの有利な具体例として、第１図のフローチャートに要約される段 階を用いて、多様のキメラ遺伝子を植物細胞に挿入した。第１図に示すように、 ６個の予備的なプラスミドを調製した。これらのブ０ラヌミドばつぎのようにデ ずインした。

１、ｐＭＯＮ　４１、これは、ツバリン−型Ｔ１シラスミドのライドボーダーお よびノパリンンンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　、　ＮＯ３） 遺伝子の５′部分を含有した。フ０ラヌミドｐＭＯＮ　ｄ　ｌの構築を下記し、 第２図に示す。

２、ｐＭＯｌ、ｌ　１０９、これはＮＯ８遺伝子のろ７部分および選択（５ｅｌ ｑｃｔａｂｌｅ　）マーカー遺伝子（ｓｐｃ　／　５ｔａｒ）な含有し、これら により、キメラ遺伝子を有するコーを下記し、第６．４、および５図に示す。

ろ　ｐＭＯＮ　１１ろ、これのオクトピン−型Ｔ１シラスミドのＴ　−ＤＮＡ　 部分内の配列と同じある配列を有するＤＮＡの領域を含有した。この領域ハ、ル フトインサイドホモロジー１ｅｆｔ　１ｎｓｉｄｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　（ＬＩ Ｈ）”領域といわれた。ｐＭＯＮ　１１乙の構築を下記し、第６図に示す。

これらのシラスミドを組上げたあとで、各プラスミドを適当なエンドヌクレアー ゼで消化し望むフラグメントを得た。ろつのフラグメント（３個のシラスミドの それぞれから１個宛）をトリプルリケゞ−ジョン（ｔｒｉｐｌｅ　１ｊ４ａｔｉ ｏｎ　）で組上げ中間体べ〃ターであるシラスミドｐＭＯＮ　１２　［４を得た 。これを第７図に示す。

プラスミドｐＭＯＮ　１２０は下に詳記する本発明の具体例でかなめの役割を演 する。この）０ラスミドはつぎの特四を有する。

１、ｐＭＯＮ　１２　Ｄは少なくとも６個の独特の制限エンドヌクレアーゼ切断 サイト（ｇｃｏＲ工、　Ｃ１ａＩ　、およびＨｉｎｄＩＩＩ）を有し、これらは 、任意の望む遺伝子の挿入しかし、正常のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ８胞内て は１Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　８胞内で複製するような、別のフ０ラスミド だとへばＴ１フ０ラスミドとコーインテグレートしないと、正常のＡｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　釧胞内ては複製しない。

ろ　ｌ）１ν＋ｏ＋ｑ　１２０は、２千１の抗生物質スー？クチノマインン（ｓ ｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　、　ｓｐｃ　）およびストレフ０１゛マー多 イン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｓｔｒ　）に抵抗性を与えろ酵素をコー−す るマーカー遺伝子を担う。この遺伝子はｓｐｃ　／ａｔｒ遺伝子と椙われ、Ｅ、 　ｃｏ見およびＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに発現されるが、植物細胞に（１ 発現されない。ｐＭＯＮ１２０はアンビンリンまたはテトラサイクリンへの抵抗 性をコードする遺伝子は担わな１・。

４、ｐＭＯＮ　１２０１？、Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピン−タイ プＴ１）０ラヌミドのＴ　−Ｄ１ｉＡ部分内の配列と相同性の配列を担う。この 配列は“レフトインサイドホモ、−−−−−−−−＋−，、−、、／丁　工Ｕ　 ）　６石線　吏１　ｂ　舌↓、れる。このホモロジー領域は、クロスオーバー事 象ヲ促進し、それによりｐＭＯＮ　１２０またはｌ）ＭＯＮ　１２０の誘導体だ とへばＩ）ＭＯＮ　１２８は、２つの７０ラスミドが同じＡ、　ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ内に存在するならばＴ１−７°ラスミドとコーインテグレートを形成す る。定義によれば、蚊コーインテグレート”フ０ラスミドは光−クロスオーバー 事象により形成される。それは、Ｔｉミツ０ラスミドまたはｐＭＯＮ　１２０− 由来シラスミド中に犀前に存在したＤＮＡ配列のすべてを含有ずろ。

５、ｐＭＯＮ　１２０しよ、ツバリン型Ｔ　−ＤＮＡ″ライトボー／ｉ”−”、 つまり、Ａ、　ｔ＋１ｔｎｅ　ｆａｃｔｅｎｓにより細胞を形質転換するあいだ 、Ｔｉミツ０ラスミドり移されそして植物細胞の染色体に挿入されるＴ−ＤＮＡ 配列ひとつの端（慣用によりライトボーダーと称するうとして作用しつる配列を 担う。

６、Ｉ）ＭＯＮ　１２０は、酵素ノパリンンンターゼ（ＮＯ８）の発現をコード する遺伝子（プロモーターを含有する）を担う。Ｏ・とたび植物体に導入される と、Ｎｏ５５％素はオピン（ｏｐｉｎｅ　）のひとつの型てあろツバリンの生産 を触媒する。オピンは大部分の型の植物において、低レベルに蓄積する、無害の 化合物である。

ツバリンの存在は植物組織に容易に検出しうる（□ｔｔｅｎおよび５ｃｈｉｌｐ ｅｒｏｏｒｔ　、　１９７８　）　ｏオビンは未形質転換植物細胞にはふつう存 在しないので、オピン遺伝子は形質転換な確かめるための有用なマーカー）−な りうる。望むならば、ｐＭＯＮ　１２０中のＮＯ８遺伝子は、この方面で湘られ ている専門家既知の種々の技術で非機能けとなしうる。たとへば、ＮＯ８遺伝子 のコード部分内にＢａｍＨＩ切断サイトが存在する。ＮＯ８の翻訳を防ぐだめＫ このサイトに、ストソデコドンまたは他の適当なオリゴヌクレオチド配列を挿入 しえた。

７、ｐＭＯＮ　１２０中の種々の遺伝子、切断ナイトおよび他の配列の相対的位 置は、本発明の実施に非常に重要である。ｐＭＯＮ　１２０プラスミド全体、ま たはその誘導プラスミドたとへばｐＭＯＮ　１２８は、コーインテグレートＴ１ デラヌミドに含有されるであろう。しかし、コーインテグレートＴ１デラヌミド の部分のみ（変型Ｔ　−ＤＮＡ領域）が植物ｒツムに挿入されるであろう。

この部分はＴ　−ＤＮＡボーダーにおいて始まり相同の領域へのみひとつの方向 に伸びる。ｐＭＯＮ　１２０において！’！、ＮＯＳヌコア（５ｃｏｒａｂｌｅ 　）　？−カー、ｓｐａ　／ｓｔｒ選択マーカーおよび６個の挿入サイトが、ｐ ＭＯＮ１２０の植物ケ８ツムに移される部分内にある。しかし、ＬＩＨに隣るｐ ＢＲ３２２−由来領域およびＰｖｕ　Ｉ切断シーイトは恐らくは植物ケ９ツム中 には移されぬであろう。

重要なこととして、ｐＭＯＮ　１２０およびその誘導物のこのような配列は、下 記に論するように、ひとつより多くの相同領域の植物デノムへの移入を防止する 。

８、ｐＭＯＮ　１２０は約８キロ塩基の長さである。これは、本発明の目的のす べてを達成するには十分に小さい。しかし、望むならば、この方面の技術で知ら れている方法により、不可欠でないヌクレオチＶ配列のひとつまたはひとつより 多くを欠失させてやや短かいヌクレオチＶとなしうる。このようなザイズの縮少 は、本発明の目的または他の目的に用いる時のフ０ラヌミドの効率または他の特 性を改良しうる。

ひとつまたはひとつより多くの点でｐＭＯＮ　１２０とは異なる広く多様な中間 体ベクターを、専門家は調製し利用しうるであろう。たとへぼ、形質転換された 植物細・胞をスコアするのに用いられろＮＯＳマーカーを、欠失させ、あるいは 、異なるスコアまたは選択マーカーでおきかえ、または、それらを追加しかも知 れぬ。このようなマーカー遺伝子のひとつに、下記するような抗生物質耐性遺伝 子たとへばＮＯＳ　−ＮＰＴ　ｌｌ−Ｎ０Ｓキメラ遺伝子があるかもしれぬ。別 の例として、コーインテグレートデラヌミドを有するＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ細胞の選択に用いたｓｐｃ　／　ｓ毬マーカー遺伝子も、欠失させるか、ま たは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ中だ発現される、別のスコアまたは選択マーカ ーでおき代えたりまたはそれらを補なったりしうろ。別の例として、Ｔ−ＤＮＡ ボーダーの変種（たとへばツバリン−型”レフト”ボーダー、またはオクトピン 型レフトまたはライトボーダー）も用いうる。同様に、１個より多くのボーダー （たとへぼ、２個または２個より多くのツバリンライトボーダー、または１個の ツバリンライトボーダーおよび１個のオクトホンライ）ｅ−ｘ−）も、中間体ベ クター中に望む配向に挿入しうる。このことは、専門家が決定しうるように、Ｔ 　−ＤＮＡの植物デノムへの挿入頻度を上昇させうる。また、中間体ベクター中 に、（任意の型の）レフトおよびライトボーダーの両方を挿入することもできる 。相同の領域の長さを増加さすこともできる。このことで、望む単一クロスオー バー事象の頻度を増加さすこともありうるＣ　Ｌｅｅｍａｎｓ　＝　１１９８１ ）。任意の型の望むデラスミｒたとへばツバリンまたはアグロピンＴ１デラスミ ｒまたはＲ１フ０ラスミｒより、適当な相同の領域を選ぶこともできる。このよ うな領域は、中間体ベクターが任意の望むプラスミドとコーインテグレートを形 成することを可能とするであろう。

ｐＭＯＮ　１２０の創製方法 ３個の他のシラスミドに由来するフラグメントよりデラスミＹ　Ｉ）ＭＯＮ　１ ２０を構築した。これら３個のシラスミドはｐＭＯＮ　４１、ｐＭＯＮ　１０９ およびｐＭＯＮ　１１３と称した。これら６個のプラスミドの構築はっぎに要約 して示すが、例のなかに追加の情報を加える。

シラスミドｐＭＯＮ　４１は、ツバリン型Ｔ　−ＤＮＡライトボーダおよびツバ リンシンターゼ（ＮＯ８）　遺伝子の５′部分をｐＭＯＮ　１２０に与える。そ れは、っぎのように創製される。

ｐＴｉＴろ７デラスミドと称するツバリン−型Ｔ１デラスミＹ　ヲＨｉｎｄ　工 Ｉエニンｒヌクレアーゼで消化して、種種のフラグメントを生成さすがそれらに はＨｉｎｄ　ｌｌｌ−２３７ラグメントと称する３、４　ｋｂフラグメントが含 まれる。このフラグメントは、全ＮＯ８遺伝子およびＴ−ＤＮＡライトボーｔ− を含有する。出願人等は、ＨｉｎｄＩ丁工で消化されたデラスミｌ＆　ｒ＋ＢＲ ３２’７にＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−２３７ラグメントを挿入した。ｐＭＯＮ３８と 称する生成デラスミｖは、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＢａｍＨＩの両方で消化した 。これで、２−３ｋｂフラグメントを生成するが、これはノ／マリン型ライトボ ーダーおよびＮＯ８遺伝子の５′部分を含有する（ゾロモーター領域、５′非翻 訳領域および構造配列の部分を含有する）。この２，３ｋｂフラグメントは、Ｈ ｉｎｄ　ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＢＲ６２７デラスミドに挿入した 。生ずるプラスミドは、第２図に示すようＩＣｐＭＯＮ　４１と称した。

Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの多様な株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ−ｐｅＣｕ ｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、　ＭＤ　）より 入手しうる。ＡＴＣＣ番号シ１ずべてのＡＴＣＣカタログに記載されている。そ れぞれの株は、専門家のルーチンの実験により決まる本発明に適当と思われるＴ １プラスミドを含有する。

デラスミ）”　Ｉ）ＭＯＮ　１０９は、ｓｐａ　／　ｓｔｒ選択マーカー遺伝子 およびＮＯ８の遺伝子の６′部分なｐＭＯＮ　１２０に与えた。それは、つぎの 方法で創出された。

デラスミｙ　Ｔ）ＭＯＮ　３８　（上記しそして第２図に示す）をＲｓａ　Ｉで 消化した。これは ５　’　４ＴＡＣ として示される平滑末端を創出した。

１．１ｋｂフラグメントを分離した。そしてＢａｍＨＩで消化して７２０　ｂｐ および４００　ｂｐのフラグメントを得た。それぞれに、１個の平滑Ｒｓａ末端 および付着曲のＢａｍＨＩ末端を有した。これらのフラグメントは、ＳｍａＩ（ 平滑末端創出）およびＢａｍＨＩで消化しておいた、７ア一ジＭ１ろｍｐ　８　 （Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　Ｖｉｅ）ｉｒａ　）からの２本鎖ＤＮＡに付着させ た。混合物をりヶゝ−トさせ、細胞中にトランスホームしそしてプレートに塗布 して、組換えファージを探した。挿入された７　２０　ｂｐフラグメントを含有 する組換えファージＤＮＡＬ’！、、ＢａｍＨニーＳａｍ　Ｉ挿入物のサイズで 同定した。これらファージＤＮＡのうちのひとつは第６図に示すようにＭ−４と 称した。７２０　ｂｐ挿入物は、ＮＯ８遺伝子の６′非翻訳領域（太い点線で図 に示すようにボリーアデニレーンヨンングナルを含む）ならびにＮＯ８遺伝子の 構造配列の６′部分を含有した。７２０　ｂｐ挿入物は、Ｍ　−４において、Ｍ 　１３　ｍｐ　８　ＤＮＡ中に存在したＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　工切断サイト にかこまれていた。

Ｔｎ　７と称とする細菌性トランスポ・アンは、前記のｓｐａ　／　ｓｔ、ｒ遺 伝子を含有することが知られている。

Ｔｎ７トランスポ・アンはまブこ、宿主細胞を抗生物質トリメトプリム（ｔｒｉ ｍｅｔｈｏｐｒｉｍ　）に対して抵抗性とする遺伝子を含有する。Ｔｎ　７中の ｓｐａ　／　ｓｔｒ遺伝子およびトリメトプリム抵抗性遺伝子の正確な位置およ び配向ば知られていない。公的に入手しうる種々の細胞株よりＴｎ　７　）ラン スポ・アンは得られろ。ｐＴｉＴ　３７フ０ラヌミドのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−２ ３領域にＴｎ７）ランスポデンが挿入されたＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの１ 株が分離された。この変型ｐＴｉＴ　３７デラスミドはｐａｖ　３１０６と称さ れた（　Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ等、　１９８０　）。

フ０ラスミドｐＯＶ　３１０６をＨｉｎｄ　工ＩＩで消化し、フラグメントは、 Ｈｉｎｄ　工ＩＩで消化したｐＢＲ３２７フ０ラヌミド中にショットガンクロー ニングした。これらのプラスミドはＢ、　Ｃ０１ｉ細胞中に挿入し、アンピンリ ン抵抗性（ｐＢＲ３２７遺伝子による）細胞およびトリメトプリム抵抗ａ　（Ｔ ｎ　７遺伝子による）の細胞を選択した。

ひとつのコロニーから得られたフ０ラスミドをｐＭＯＮろ１と称した。このフ０ ラヌミドレま、６　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ％ｉ入物ヲ含有した。この挿入物は 、Ｔｎ７よりのｓｐｃ　／　ｓｔｒ抵抗性遺伝子およびＮＯ８遺伝子のろ７部分 を含有した（　ｐＴｉＴろ７デラスミドに由来）。

プラヌミｙ　ｐＭＯＮ　３１の　サイズを２度にわたり縮小させた。第１の縮小 には、プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、混合物を希釈して８５０　ｂｐフラグ メントを除き、大きいフラグメントを再すケゝ−ンヨンした。ｐＭＯＮ　５３と 称する生成プラスミドは、アンピンリンおよびストレフ’）マイシンに対する抵 抗性により選択された形質転換細胞より得た。トリメトラ０リムに対する抵抗性 は測定しなかった。

プラスミドｐＭＯＮ　５ろのサイズをさらに縮小さすのに、そのフ０ラヌミドを Ｃ１ａ　Ｉで消化し、混合物を希釈して２ｋｂフラグメントを除き、大型フラグ メントを再すゲーションした。生ずる５、２ｋｂプラヌミドはｐＭＯＮ　５４と 称した（第４図）。このフ０ラスミドはＳｐＣ／　Ｓｔｒ遺伝子を含有した。

７°ラスミドｐＭＯＮ　５４をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、８ｐＣ／　 Ｓｕｒ遺伝子を含有する４、３ｉｂフラグメントを分離した。Ｍ　−４ＤＮＡを ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、そしてＮＯ８５’非翻訳領域を含有する７ 　４０　ｂｐフラグメントを分離した。これらのフラグメントは相互にリケゝ− ンヨンさせてｐＭＯＮ　６４とした。単一のＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメ ント上にＮＯ３３’部分およびｓｐｃ　／ｓｔｒ遺伝子をうるために、ｐＭＯＮ 　６４をＣ１ａＩで消化し混合物を再すケ゛−ジョンさせてｓｐｃ　／　ｓｔｒ 遺伝子の配向を逆にした。望む配向を有するフ０ラスミドはＥｃｏＲＩおよびＢ ａｍ　ＨＩを用いる切断で同定した。これらのフ０ラヌミドは第５図に示すよう にｐＭＯＮ　１０９と称した。

プラスミドｐＭＯＮ　１１ろはｐＭＯＮ　１２　Ｄに相同の領域を与えた。それ で、ｐＭＯＮ　１２０は、Ｔ１フ０ラヌミドとあわせてＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ中に存在する時にコーインテダレートデラスミドを形成した。オクトビン 型Ｔ１ｆラスミドより相同の領域を取り出した。Ｔｉ７°ラスミド中では、それ はレフトＴ　−ＤＮＡ　ｄ＜’　−＊ゞ−近くに、Ｔ１プラスミドのＴ　−ＤＮ Ａ部分内に存在した。この相同領域を”レフトインサイドホモロジー１ｅｆｔ　 ｉｎｓｉｄｅｈｏｍｏｌｏｇｙ　（ＬＩＨ）　”領域と称した。

植物細胞を形質転換しうるフ０ラスミドのいずれの型、たとへば任意のＴ１プラ スミドおよびＲ１フ０ラスミドに、相同領域が由来しうろ。

相同領域の由来したいずれの型の７０ラスミドともコーインテグレートフ０ラヌ ミドを形成し５ろ、中間体ベクターをデザインしうろ。

さらに、相同領域がＴ　−ＤｈｔＡ内に位置する必要もないかもしれなし・。た とへば、Ｔ−ＤＮＡｄで−ダーを含有しそしてＴ　Ｄ！ＪＡ領域の外１Ｙ（１に は基の配列を含有ずろ、Ｔ１プラスミドの断片より、相同領域が由来しうる。ま さに、中間体ベクターが２つの適当なＴ　−ＤＮＡボーダーを含有するなら、Ｔ 　−ＤＮＡ領域のまったく外側に相同領域があってもよいかも知れない。

出願人等は、オクトピン型Ｔ１）０ラスミドのＢａｍ−８７ラグメントを含有す るｐＢＲ由来プラスミドを有するＥ−ｃｏｌｉ培養物を得た。約７．５　ｋｂの Ｂａｍ−８７ラグメントは、Ｔ１′７°ラヌミドのレフトボーダーおよびＬＩＨ 領域を含有した（　Ｗｉｌ１ｍｉｔｚｅｒ等＋　１９８２　；　ＤｅＧｒｅｖｅ 等、１９８１）。Ｂａｎ　−８フラグメントＩ’！、　、ＢａｍＨＩで消化した プラスミドｐＢＲ３２７ｉ′ｃ挿入した。生ずるデラスミドは、第６図に示すよ うにｐＭＯＮ　９０と称した。

Ｔ）ＭＯＮ　９０はＢｇＩＩＩで消化した。ＬＩＨ領域を含有するがレフトボー タゞ−を含有しない２．６　ｋｂフラグメントを精製した。２．６ｋｂフラグメ ンはＫｌ　ｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、付着末端を平滑末端に変えた。そし てフラグメントはＨｉｎａ、ＩＩＩで消化し、１．６ｋｂフラグメント（望むフ ラグメント）および１　ｋｂフラグメントを得た。両方のフラグメントは、Ｐｖ ｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたＩ）ＢＲ３２２７°ラスミドと混 合した。混合物はリケゝ−ンヨンさせ、Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞に挿入した。細胞は アンピンリン抵抗性に関して選択した。１，６ｋｂフラグメント上には存在する が１　ｋｂフラグメント上には存在しないＳｍａ　Ｉサイトの存在に関してスコ アした。望むデラスミＶを有するコロニーを同定した。このコロニーよりのフ０ ラスミドを、第６図に示すようにｐＭＯＮ　１１ろと称した。

ｐＭＯＮ　１２０を組上げるには、６個のフラグメントを分離ぜねばならなかっ た。フ０ラスミドｐＭＯＮ　４１　ヲＰｕｖＩおよびＢａｍ　Ｉで消化した。そ してツバリン型ライトボータ゛およびＮＯ８遺伝子の５′部分を含有する１、５ 　ｋｂフラグメントを得た。フ０ラスミドｐＭＯＮ　１０９をＢａｍＨＩおよび ＥｃｏＲＩで消化し、ｓｐｃ　／　ａｔｒ遺伝子およびＮＯ８遺伝子の６′部分 を含有するろ、４ｋｂフラグメントを分離した。フ０ラヌミドｐｌｖｆＯＮ　１ １３をｐｖｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＬＩＨ領域を含有する３、１　ｋ ｂフラグメントを分離した。

これら６つのフラグメントは相互に混合し、第７図に示すように、リゲーンヨン させてｐＭＯＮ　１２０とした。ｐＭＯＮ　１２０を含有するＥ、　ｃｏｌｉの 培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ工１ｅｃｔｉｏ ｎに寄託した。受は入れ番号３９２６３を受けた。

ｐＭＯＮ　１２０または任意の顛似の中間体ベクターを創出するのに種々の方法 を用いうる。たとへば、トリプルリケゞ−ジョンに代えて、プラスミド中に望む フラグメントの２つを組上げ、そのプラスミドに第３のフラグメントを挿入しう る。

ｐＭＯＮ　１２０の使用法 前記のように、ｐＭＯＮ　１２０は、任意の望む遺伝子の挿入に適当な６個の独 自の切断ナイ）　（ＥＣ０ＲＩ。

Ｃ１ａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ　）を有する。これらの切断サイトは、ｐＭＯＮ １２０の植物ケゝツムに挿入されるであろう部分に存在する。それで、挿入され た遺伝子はまた植物ケ８ツムにも挿入させる。

植物細胞中に細菌および哺乳動物ポリベノチドを発現しうる種々のキメラ遺伝子 が出願人等により創製された。これらのキメラ遺伝子は、１９８６年１月１７日 願、Ｕ−３，特許願ンリースＡ、４５８，４１４’“植物細胞中で発現さすに適 当なキメラ遺伝子”だ記載された。

これらのキメラ遺伝子は本発明で用いるに適当である。これらはＤＭＯＮ　１　 ’；ｌ　Ｑに挿入されて誘導体シラスミドを形成するが、これらっぎのように用 いうる。

本発明の有利な具体例として、っぎのＤＮＡ配列を有するキメラ遺伝子を創出し た。

１、　ツバリンシンターゼ（ＮＯ８）遺伝子に由来するフ０ロモーター領域およ び５′非翻訳領域２、　ネオマイシンホスホトランスフェ°ラーゼエ１（ＮＰＴ 　ＩＩ　）遺伝子に由来する構造配列；および６　ＮＯ８遺伝子に由来する６′ 非翻訳領域。

このキメラＮ０３−ＮＰＴ　ＩＩ−ＮＱＳ遺伝子はＥｃｏＲＩ末端を有するＤＮ Ａフラグメント上で分離した。このフラグメントは５．　ｐＭＯＮ　１２０のＥ ｃｏＲ，Ｉ切断ナイト中に挿入した。そして生ずるプラスミド（反対配向のキメ ラ遺伝子挿入物を有する）は、第８図に示すようにｐＭＯＮ１２８およびｐＭＯ Ｎ　１２９と称した。シラスミドＩ）ＭＯＮ１２９はキメラ遺伝子の２コピーを 有した。このことはある種の型の作業に有利な特徴でありうる。いずれのプラス ミドも、つぎのようにして植物細胞を形質転換するのに用いうる。ｐＭＯＮ　１ ２８含有Ｅ、　ｃｏｌｉの培養物はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託された。

受は入れ番号ろ９２６４を受けた。

デラスミ’ｆ　ｐＭＯＮ　１２８　（または望む遺伝子をｐＭＯＮ１２０に挿入 して得られる任意の他のシラスミド）はオクトピン型Ｔ１プラスミド（または適 当なシラスミド）を含有する微生物中に挿入する。適当な微生物に８ は、Ｔ１またはＲｉ　フ０ラスミドな担うＡ−ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ矧られて いるかまたはあとで発見されるか創出されるかもしれない他の細胞でも、本発明 に用いられるかどうか、この方面の専門家の日常的実験で定めうる。

プラスミドは微生物に任意の望む方法で挿入しうる。

たとへばプラスミドをＤＮＡを取り込みやすいように処理した細胞と接触さす形 質転換や、ｐＭＯＮ１２８または他のプラスミドを含有する細胞と接合さす方法 がある。

挿入されたプラスミド（たとへばｐＭＯＮ　１２８）　ＧｔＴ１フ０ラヌミド中 の配列と相同である領域を有する。この相同の“ＬＩＨ’“領域は単一クロスオ ーバー事象を可能とし、それによりｐＭＯＮ　１２８およびオクトピン型Ｔ１プ ラスミドは相互に結合してコーインテグレートゾラスミドを形成する。たとへば 上記５ｔｒｙｅｒの著書７５２−７５．４頁をみよ。ふつう、このことはｐＭＯ Ｎ１２８を細胞に挿入したあとのＡ−ｔｕｍｅｆａ、ｃｉｅｎｓ細胞中におこる 。別様には、異なる型の細胞中にコーインラヌミドを植物細胞中へ移し５るとこ ろのと挿入されたプラスミドたとへばｐＭＯＮ　１２８は、Ｔ１ゾラヌミげの型 に応じて、第９または１ｏ図に示す方法でＴ１フ０ラスミドと結合する。

第９図で、２の行はオクトピン型Ｔ１プラスミドのＴ−ＤＮＡ部分を表わす。４ ０行はｐＭＯＮ　１２８のような挿入されたフ０ラスミドを辰ゎす。これら２つ のプラスミドが同じ細胞中に同時に存在すると、クロスオーバー事象を生じ、コ ーインテダレートプラスミド６を与える。

コーインテグレートプラスミド６は、ひとつのレフトボーダー８および２個のラ イトボーダー１０および１２を有する。これら２つのライトボーダーは、ここで は＼　″プロキンマルｐｒｏｘｉｍａｌ”ライトボーダー１０（レフトボーダー ８にもつとも近いライトボーダ）および”デイヌタルｄｉｓｔａｌ″ライトボー ダー１２（レフトボーダー８よりより遠いライトざ−ダー）と称する。プロキン マルライトボーダー１０はフ０ラスミド４に担われる。ディスタンライトボーダ ーは、コーインテグレーンヨンの前にはＴ１７°ラヌミド２に含まれていた。ｐ ＭＯＮ　１２８および野生型Ｔ１プラスミドｐＴｉＢ６５ろにより形成されたコ ーインテグレートデラスミ１を含有するＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　（）Ｖ 　３１１１の培養物はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１．ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎに寄託された。

この培養物は受け入れ番号３９２６６を受けた。

第９図に示すコーインテグレートＴ１プラスミド６を植物細胞に挿入する時に、 ＤＮＡの２つの領域のいずれか、つまりＴ　−ＤＮＡ領域１４また！ｉＴ　−Ｄ ＮＡ領域１６が植物ケ８ツムに入りうる。

Ｔ　−ＤＮＡ領域１４は、レフトボーよゝ−８およびフ０ローキシマルライトボ ーダーにより境界をなされている。

領域１４はプラスミド４に含まれる、キメラ遺伝子かまたは他のいずれかの遺伝 子たとへばＧ’ｐＣ／　Ｓ　ｊｒ選択マーカーおよびＮ　ＯＳヌコアマーカーを 含有した。しかし領域１４ば、タラウィール病をおこしたりまたは別様・に植物 細胞の代謝または再生能力を損なうようなＴ−ＤＮＡ遺伝子はなんら含有しない 。

Ｔ　−ＤＮＡ領域１６はレフトボーｌ＋−８およびライトボーダー１０および１ ２の両方を含有する。Ｔ　−ＤＮＡのこの断片は、プラスミド４に含まれるキメ ラ遺伝子または任意の他の遺伝子を含有する。しかし、Ｔ−ＤＮＡ領域１６はま たクラウンゴール病をおことず信ぜられるＴ　−ＤＮＡを含有する。

上記Ｔ　−ＤＮＡ断片、領域１４または領域１６は植物ＤＮＡに移しうろことが ありうる。いずれの’Ｉ’　−ＤＮＡ移入についても、これは、５０−５０の確 率でおこると仮定されろ。その結果、形質転換された細胞の混合物に導びくこと になり得、それらのあるものは腫瘍性であるものは非腫瘍性である。例に記載す るように、混合物より非腫瘍性細胞を分離し培養しうろ。

別のアラ０ローチとして、非腫瘍細胞より哩瘍細胞を分離する必要を避ける方法 が開発された。クラウンゴール病をおこしえないＡ、　、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓのいくつかの変異株が分離された。このような株はふつうは”ディスアームさ れたｄ　ｌ　Ｓ　ａ　ｒ　ｍ　８　ｄ″Ｔ１Ｔ１フ０ラヌミドる。

Ｔ１またはＰ１フ０ラヌミドは、つぎの型の変異株のひとつまたは多くによりデ ィスアームされうる。

１、　ポーゲー領域のひとつを除くかまたは不活化する。レフトボーダーを有す るがライトボーダーは有しないそのようなディスアームされたオクトピンク０ラ ヌ１９８２　；　（）ａ、ｒｆｉｒ＋ｋｅ１等、１９８１）。

２、ｔｍｒおよびｔｍ３遺伝子と称する”腫瘍モルホロジーｍｏｒｐｈｏｌ○ｇ ｙ”遺伝子のひとつまたは多くを除去するかまたは不活化する。たとへばＬｅｅ ｍａｎｓ等。

１９８２をみよ。

専門家は既知の方法を用いて種々の型のディスアームされたＴ１フ０ラスミドを 調製しうる。Ｍａｔｚｋｅおよびｃｈｌｌｔｏｎ　ｌ　１９８２　；　Ｌｅｅｍ ａｎ等、１９８１；Ｋｏｅｋｍａｎ等、１９７９をみよ。

第１０図は、変異を受けてｔｍｓおよびｔｍｒ遺伝子およびライトボータ゛−を 欠失する、Ｔ　−ＤＮＡ領域２２を有するオクトピン−型Ｔ１プラスミドを表わ す。これで、部分的な’ｐ　−ＤＮＡ領域２４を有するディスアーム七＋−ｌナ ー甲］−ｆ′モスダＶシ片キ入　フ０ラスタ檗つＧ（ｒ−２ とへばｐＭＯＮ　１２８　）を、ディスアームされたＴ１フ０ラヌミド２４を担 う細胞中に挿入ずろと、クロスオーバ事象をおこしディスアームされたＴ　−Ｄ ＮＡ領域２８をｔｉコーインテグレートＴ１フ０ラスミドを創出させる。相同性 のＬＩＨ領域はこのＴ１フ０ラスミド中で、も反復されるが、ディスアームされ たＴ１フ０ラスミドはなんらの発癌遺伝子を含有しない。別様には、ライトボー ｆ−のみがＴ　−ＤＮＡ領域２２より欠失されたのならば、ｔｍｓおよびｔｍｒ 遺伝子およびオクｌ−ピンンンターゼ（ＯＣ８）遺伝子がコーインテグレート状 のディスアームされたＴ１フ０ラスミドに含有されろであろう。しかしそれらは Ｔ　−ＤＮＡボーダーの外側に存するであろう。

ディスアームされたコーインデグレー）−Ｔｉミツラスミド植物細胞の感染に用 いる。Ｔ　−ＤＮＡ領域２８１！。

形質転換されたＤＮＡろ０により示されろように植物ケゞツムに入る。ディスア ームされたＴ−ＤＮＡ２８により形質転換された植物細胞は、正常の植物ホルモ ン代謝を有する。そして分化植物へと再生する正常の能力細胞のある部分に望む クロスオーバ事象がおこるであろ５゜コーインテグレートフ０ラスミドを含有す る細胞（病原性かまたはディスアームされたもの）は、つぎのようにして、クロ スオーバーのおこらなかった他のの細胞より容易に選びうる。デラスミ￥ｐ下１ ０Ｎ　１２　Ｑおよびその誘導体は、マーカー遺伝子（ｓｐｃ　／　ｓｔｒ　） を中で複製しうる別のシラスミドと結合しないと、ｓｐｃ／ａｔｒ遺伝子は、複 製しないがまたはＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにより安定に遺伝してゆかぬで あろう。もっともありうるそのような組合わせは、相同領域のゆえに、Ｔ１フ０ ラスミドと形成されるコーインテグレートである。こたは双方を含有する培地上 の細胞の増殖で同定しそして選択しうる。

′Ｐ１シラスミド２８は第１ｏ図に示すように２つのＬＩＨ領域を含有する。コ ーインテグレートＴｉフ０ラスミドはひき続きクロスオーバー事象をうけ、ここ で２つのＬＩＨ領域が再結合するであろう。この事象は望ましくない。というの は、キメラ遺伝子を含むＬＩＨ領域のあいだのＤ　Ｎ　Ａを欠失させうるからで ある。しかし、このことが重大な困難を与えるようになるわり“でないようだ。

理由の第１は、この事象は比較的に低い確率だとへば約１０−２位で起りそうだ からである。第２にシラスミドｐＭＯＮ　１２０およびその誘導体は、クロスオ ーバー事象により欠失するであろうＤＮＡの領域に選択マーカー遺伝子（ｓｐｃ 　／　ｓｔｒ　）が位置するようにデザインしであるからである。それで、コー インテグレートデラヌミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ細胞を同定しそ して培養するために用いる選択条件ｉｉ、Ｔｉミツ０ラスミドりのキメラ遺伝子 を除去するような引き続くクロスオーバー事象をこうむった細胞の子孫を殺すこ とにも役立つであろうからである。

第１０図に示すように、コーインテグレートＴ１プラスミド中のＬ工Ｈ領域のひ とつのみが植物ｒツムに挿入されろであろう。この重大な特徴はｐＭＯＮ　１２ ０のデザインに由来し、そしてそれは、従来法で形成された望ましからぬコーイ ンテグレートデラスミドより、このコーインテグレートプラヌミドを区別する。

Ｔ−ＤＮ八へ−ダーの外側に横たわるＬＩＨ領域は植物ケゞツムに挿入されぬで あろう。このことは少なくとも２つの重大な利点を与える。第１に、植物ケゞツ ム中に挿入された２つのＬ工Ｈ領域の存在は、形質転換された植物細胞およびそ れらの子孫中で挿入された遺伝子の損失を入ちびくであろうから。第２に、ＤＮ Ａ相同（牛の２つの領域の存在は、植物ケゞツムに挿入されたＤＮＡを分析する 努力を非常に複雑化することになりうるからであろ（ＭａｔｚｋｅおよびＣｈｉ ｌｔｏｎ　１９８１　）。

キメラ遺伝子を有するコーインテグレートＴＩプラスミドを含有するＡ、　ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を同定して分離したあと、コーインテグレートデラスミ ド（または七の部分）は植物細胞に挿入せねばならない。いずれは、この段階を 直接的に実施する方法が開発されうるであろう。さしあたり、用いて便利な良い 結果を与える方法が開発された。この方法は、２つの別のＵ、Ｓ。

特許願、シリーヌＡ、４５８，４１５”拡大細菌性共存培養による植物細胞の形 質転換”およびシリーヌ／１ｉ、４５８，４１２”植物フ０ロトデラストの迅速 培養”に記載されており、共に、１９８６年１月１７日に出願されている。これ らの特許願に記載の方法をつぎに簡単に要約する。

形質転換させようとする植物細胞を、細胞壁を除く酵素と接触させる。それによ り植物細胞はプロトプラストに変わる。これらは膜に包まれた生細胞である。

酵素を除き、プロトプラストに細胞壁材料の再生を開始させる。適当な時点で、 Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの細胞（キメラ遺伝子を有するコーインテグレー トＴ１）０ラヌミドを含有する）と植物フ０ロトフ０ラストとを混合する。細胞 は、Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの植物細胞を感染することを可能とする時間 共存培養する。適当な共存培養の時間のあと−Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを 殺し、植物細胞を増殖させる。

形質転換させた植物細胞（つまりコーインテグレートＴｉ７°ラスミドよＦ）Ｄ ＮＡを受け取った細胞）およびそれらの子孫は、植物ケゝツムに挿入した遺伝子 （単まろ６ とへば、ある種の遺伝子は種々の抗生物質の不活化をおこさす。そのような遺伝 子にはｈメラ性ＮＯ８−ＮＰＴＩＩ−ＮＯ８遺伝子（ｐＭＯＮ　１２８により担 われる）がある。

そのような遺伝子は選択マーカーの役を果たし５る。

キメラ遺伝子生成物により不活化される抗生物質を含有する培地上に１群の細胞 を培養しうる。そして選択マーカー遺伝子を含有する細胞のみが生き残るであろ う。

種々の遺伝子が植物細胞中でのスコアマーカーの役を果たしうる。たとへば、ｐ ＭＯＮ１２０およびそれの誘導フ０ラスミドたとへばｐＭＯＮ　１２８は、植物 細胞中で発現されるノパリンンターゼ（ＮＯ３）遺伝子を担う。

この遺伝子はツバリンの形成を触媒する酵素をコードする。ツバリンは、大部分 の型の植物では少量蓄積する、無害の化合物である。それは電気泳動またはクロ マトグラフ法で容易に検出しうる。

もしも植物は検出困難のポリペプチドを創出する遺伝子により形質転換されるな ら、選択マーカー遺伝子（たとへばＮ０８−ＮＰＴ　ＩＩ　ＮＯＳキメラ遺伝子 ）またはスコアマーカー遺伝子（たとべばＮＯ３遺伝子）が形質転換用ベクター 中に存在して、形質転換された細胞の同定および分離を可能とする。

恐らくは、Ｔ１または類似のシラスミドとコーインテグレートを形成するように デザインされるｐＭＯＮ　１２　Ｄ士？−Ｌ＋荊の、Ｏ→ス２ぐ山１Ｆ仁嵜の切 す一沓午ヱに活ス１うる。たとえば、出願人は、前記引用の特許願“植物細胞中 での発現に適当なキメラ遺伝子”中に論じた種種のキメラ遺伝子を創製した。

ある遺伝子が本発明に用いる適当かどうかは、専門家のルーチンな実験により決 めうる。そのような用途しまキメラ遺伝子に限定されない。たとへぼ、天然遺伝 子の複数コピーを植物細胞に挿入するのに本発明を用いうる。

本発明は、専門家のルーチンな実験で定めうるように広く多様な植物に用いるの に適当である。たとへば、本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属よりの細菌 で感染されつる任意の型の植物よりの細胞を形質転換するのに用いうるであろう 。恐らくはすべての双子葉植物およびある種の単子葉植物にＡｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍのひとつまたはひとつより多くの株を感染させうる。さらに、専門家が 決定しうるであろうが、Ｒｈ１ｚｏｂｉａ属の微生物も本発明のコーインテグレ ートデラスミドを担うのに有用であろう。このような細菌は、ある種の型の形質 転換または植物に有用であるかもしれない。

ある種の型の植物細胞はｄｙ　ビトロ−で培養しこの方面の専門家の知る技術を 用いて分化された植物に再生させうる。そのような植物にはばれいしよ、とまと 、にんじん、アルファルファおよびひまわりがある。

ｏ　二で裁培することが可能となるであろう。専門家のルーチンの実験で定めう るよ）に、再生能力の））るそのような植物体よりの細胞は、前記論議のイン　 ビトニュ共存培養方法で形質転換しうるであろう。そのような形質転換された植 物細胞は、例に記載の操作を用いて分化植物に再生させうる。

イン　ビトロ−共存培養法は、土／　ビトロ−培養および再生を受けうる植物の 形質転換にいくつかの利−細胞培養法に限定されない。たとへば種々の植物の苗 条および切片（大豆、にんじん、およびひまわり〕ｔｕｍＱｆａＣ１８ｎｓ細胞 と接触させ形質転換された。さらに、見かけ上任意の型の植物を切片または苗条 より再生さすこともできる。それで本発明の病原性かまたはなるべくはディスア ームされたコーインテグレートデラヌミドまたはそれらの混合物を用いて苗条ま たは切片を形質転換し、ついで挿入された遺伝子をそれらの子孫に伝える分化植 物へと形質転換されたまたは切片を再生さす方法を開発し与るであろう。

前記のように、本発明のコーインテグレートデラスミｒを植物細胞に伝えるのに 共存培養は不可欠ではない。細胞中にＤＮＡを挿入するのに種々の他の方法を用 いうる。そのような方法にはＤＮＡをす分ソデームカデセル中に封入すること、 ＤＮＡを、ポリ陽イオン性物質またはリン酸カルシウムのような化学物質と複合 物とすること、細菌スフェロプラストを植物プロトプラスト融合さすこと、ＤＮ Ａを細胞中にミクロ注入すること電流でＤＮＡの取り込みを誘導することなどで ある。これまでのところ、そのような方法はＤＮＡを植物細胞に挿入するのに十 分な効本で実施されていないが、活溌に研究されており、本発明の中間体ベクタ ーおよびコーインテグレートデラスミＶまたはそれに由来するプラスミドを用い て、外来遺伝子を植物細胞中に挿入するのに用い５ることなろう。

本発明は多様の目的に有用であろう。たとへば、ある種の細菌性酵素だとへば５ −エノールビルビルシキメート−ろ−リン酸ンンターゼ（ＥＰＳＰンンターゼ） はある種の除草剤により不活化される。他の酵素だとへばグルタチン−３，−） ランスフエラーｒ　（Ｏ３Ｔ　）はある種の除草剤を不活化する。そのような酵 素を植物中で発現させるキメラ遺伝子を植物に挿入し、それにより、ひとつまた ひとつより多くの除草剤に植物を抵抗性となしうる。それで、ふつう、未形質転 換植物を殺すような除草剤を、形質転換植物を裁培した農地に姉すことが可能と なる。除草剤は雑草致死剤となり、形質転換された植物は未損傷で残る。

別様には、哺乳動物のポリペプチドだとべばインスリン、インターフェロン、生 長ホルモン等ヲ植物カ作るように植物に、キメラ遺伝子を挿入することも可能で ありうる。適当な時点で植物（または植物組織）を収獲する。専門家が知ってお られる種々の方法を用いて、収獲された植物組織より望む蛋白質を抽出しうる。

本発明の別の用途は、望む物質だとべば貯蔵蛋白質または他の蛋白質の含量の高 い植物を創製することである。たとへば、望む蛋白質をコードする遺伝子のひと つまたはひとつより多く含有する植物をである。この遺伝子の追加のコピーを、 本発明により植物中に挿入しうる。別様には、その遺伝子の構造配列を、その構 造配列のゾロリフインク（ｐｒｏｌｉｆｉｃ　）転写をおこす異なるプロモータ ーの制御下にあるキメラ遺伝子に、遺伝子の構造配列を挿入できるかもしれない 。

本発明方法は、ＤＮ７′−配列が、植物細胞中の遺伝子の発現を促進するがまた は別様に調節しているかどヤ′を決めるために、ＤＮＡを同定し、分離しそして 調べるのに用いうる。たとへば、任意の型の細胞からのＤＮＡを、部分的エンド ヌクレアーゼ消化または他の方法を用いてフラグメントとなしうる。ＤＮＡフラ グメントは、ｐＭＯＮ　１２８類似のフ０ラスミド中にランダムに挿入しうる。

これらのプラスミドは、Ｎ０８−ＮＰＴ　ｌｌＮＯ３のような完全なキメラ遺イ 云子を有する代わりに、ＮＯｓフ０ロモーターまたは他のプロモーターよりむし ろＤＮＡフラグメントの挿入のための切断ナイトを有する部分的キメラ遺伝子を 有するであろ５゜挿入されたＤＮＡを有するデラヌミＶはＡ、　ｔｕｍｅｆａｃ ｌｅｎｓに挿入する。ここでそれらはＴ１フ０ラスミドと再結合しうる。コーイ ンテグレートフ０ラスミＰを有する細胞はｓｐｃ　／　ｓｔｒまたは他のマーカ ー遺伝子を用いて選択する。コーインテグレーｌ−プラスミドはついで、細菌性 同時培養または他の手法により植物中に挿入する。植物細胞はＮＰＴ　ＩＩ構造 配列のような選択マーカー構造配列を有するであろう。

しかし、この構造配列は、挿入されたＤＮＡフラグメントが構造配列のプロモー ターの役割をしなければ転写されないであろう。植物細胞は、それらをカナマイ シンまたは他の適当な抗生物質を含有する培地上に培養して選択しうるであろう 。

この方法を用いて、細菌、酵母、かび、藻、他の微生物および動物細胞のプロモ ーター領域が、種々の型の植物細胞において遺伝子プロモーターとして働らくか ど５かを評価することが可能となる。また、ひとつの型の植物におけるプロモー ターを他の型の植物細胞において評価することもできる。同様な方法を用いそし て出発プラスミド中の切断サイトを変えて、あるＤＮＡ配列が、５′非翻訳領域 、３′非御訳領域または任意の型の・調節配列として働らくかどうかを評価する こともできる。

本明細書中のＤ　Ｎ　Ａ断片”とは、天然または合成であれ、デラヌミｒ１ファ ージ、ＤＮＡフラグメントおよびぼりヌクレオチＶを含ム。

本明細書中のＤＮＡのキメラ断片”とは、異なるそして区別されるＤＮＡ断片に 由来した少なくとも２つの部分（２つのヌクレオチＶ配列）を含有するＤＮＡ断 片に限る。たとへばＤＮＡのキメラ断片は、天然に存在するフ０ラスミドのひと つまたはひとつより多く部分を単に欠失さすだけでは創出されえない。ＤＮＡの キメラ断片は、種々の方法だとへぼ、異なるフ０ラスミｖに由来する２つのフラ グメントのリケゞ−ンヨンまたは２つの異なるフ０ラスミドの塩基配列の分析に より決定された塩基配列を有するぼりヌクレオチドの合成により製造しうる。

本明細書中で用いるＤＮＡのキメラ断片とは、人為的に組上げられ、合成されま たは別様に製造されたＤＮＡ断片およびそれよりの複製または別様に由来したＤ ＮＡ断片に限定する。゛人為的”とは、ヒトの手によｒまたヒトの手を介しで、 おこされるか、強めるかまたは制御するような東件下でおこるような、酵素的、 細胞的および他の生物的プロセスを含むとする。天然のプロセスのみで創出され るプラスミド、ファージおよびポリヌクレオチドは除外する。。由来する”とは 広く解釈されたい。請求の範囲で用いる”キメラ”の用語が、材料を規定してい る。

本明シ′田書中で用いる０外来”ＤＮＡは、あらかじめ存在する植物細胞に挿入 されるＤＮＡのすべてを包含する。

”外来遺伝子”はあらかじめ存在する植物細胞に挿入される遺伝子である。

木明寓書中で用いる”マーカー遺伝子”とは、非形質転換細胞よりの形質転換さ れた宿主細胞の識別を可能とするような、表現型として同定しちる特質を宿主細 胞に与える遺伝子である。これには、ヌクリーン用（５ｃｒｅｅｎａｂｌｅ　） 　、ヌコア用（５ｃｏｒａｂｌｅ　）および選択用（５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ　） マーカーがある。

本明細書中で用いる”相同の領域”とは、プラスミドの再結合を統計学的に決め うる頻度でおこさす十分なように、ひとつの７０ラスミド中の塩基の配列が異な るプラスミド中の塩基の配列と関連していることである。なるべくは、そのよう な再結合は、再結合フ０ラヌミドを有する細胞の選択に便宜なような深度、つま り１０６個の細胞について１個より大きい深度でおこるようにすべきである。こ の用語は、種々の刊行物たとへば、Ｌｅｅｍａｎ等、１９８１により詳しく示さ れている。

専門家は、ルー千ン的な実験で、本明細書中に論議の具体的記載に相当するもの を矧り、確かめることができよう。そのような相当する事柄も本発明の範囲内に あるものとする。

例１　プラスミドｐＭＯＮ　４１の創製Ｈｉｎｄ　ＩＩＩナイトにおいて、ｐＴ ｉＴ　３７のＨｉｎｄ　Ｉエト２３フラグメント（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ等 、１９８０）を挿入された１）ＢＲ３２５デラスミ）ｏ（Ｂｏｌｉｖａｒ　。

１０７１：ｌ　）＊加べＱ　ｙｘｌ＋の泣首轟ル　Ｉｉ　Ｄ−、、ヘーめト４ びＭ、Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ博士、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学、８ｔ−Ｌｏｕｉ ｓ　、ノＭＯより得た。このクローンよりのプラスミド１０マイクログラム（μ ｇ）をＨｉｎｄ　ＩＩＩ　（特に断わらぬ限り、これらの構築に用いた制限エン ｒヌクレアーゼはすべて、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ６　Ｂｉｏｌａ、ｂｓ　、　Ｂ ｅｖｅｒｌｙ　、　ＭＡより購入し、供給者の指示に従った緩衝液で用いた）の １０＆位でろ７°Ｃで１時間消化した。０，８％アがロースケゞル上の電気泳動 で他のＨｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントより分けたあと、６．４　ｋｂ　Ｈｉｎｄ 　ｌｌｌ−２３フラグノントはガラスビードへの吸着（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎお よび０ｉｌｌｅｓｐｉｅ　）で精製した。精製された３、４　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　 ＩＩＩフラグメント（ＣＤ　１１＆　）　ｊ−！、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　（２単位 、１時間、３７°Ｃ）およびうしアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ　、０−２　 差位、１時間、６７°Ｃ）の両方で消化したプラスミドｐＢＲ３２７ＤＮＡ　（ ５ｏｂｅｒｏｎ等、１９８０）のｉ−ｏμｇと混合した。フェノールで除蛋白し 、エタノール沈殿さぜ、ＩＱμｌのＴＥ　（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　、　ｐ Ｈ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。フラグメント混合物に１単位のＴ４ Ｄト丁Ａリガーゼ（Ｍｕ　ｒ　ｒ　ａ　ｙ等、１９７９の方法で調製）を加えた 。１重位とは、１マイクログラムのＨｉｎｄ　ＩＩＩ開環ｐＢＲろ２７デラスミ Ｖの１マイクログラムを、２２℃で５分間で９０％以上閉環させる量である。混 合物フラグメントは、２５　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｏＨ３，１０ｍＭＭｇ ｃ１２．１　ｍＭジチオヌレイトール、２００　ｍＭスにルミジンＨＣＩおよび ０７５　ｍＭ　ＡＴＰ　（りが−ゼ緩衝液）中に全量１５μｍとなるように存在 させた。

混合物は２２°Ｃでろ時間インキュベートし、ついでＣａ、Ｃ１２処理で形質転 換に備えたぁｃｏｌｉ　Ｃ６００ニーＡ３６ａ胞と混合した（　Ｍａｎｉａｔｉ ｓ等、１９８２）。

ミナントが発現するための時間をおいてから、細胞は、２００μ／ｍ１にアンピ ンリンを含有するＬＢ固型培地（Ｍｉｌ］、ｅｒ　、　１９７２　）上に拡げた 。３７°Ｇで１６時時間インキュベート　したあとで、数百側のクローンヲ得た 。プラスミドミニ調製（Ｉｓｈ　−ＨｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋｅ　、　１ ９８１　）をこれらのコロニーの２４個に行ない、得られたフ０ラスミドＤＮＡ の部分（０，１μｇ）を、ろ、４ｋｂのＨｉｎｄ工ＩＩフラグメントの存在を証 明するために、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ひとつのプラスミドが期待された構 造を示し、Ｉ）ＭＯＮ　３８と称された。ｐＭＯＮ３ＢのＤＮＡはＴｒｉｔｏｎ 　Ｘ　−１００溶解およびＣｓＣｌグラジェント操作で試製した（　Ｄａｖｉｓ 等、１９８０）。

ｐＭＯＮ６Ｂ　ＤＮＡの５０μＩをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ（各５０単 位、２時間、６７°Ｃ）で消化し、２．３ｋｂＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ フラグメントを上記のように精製した。精製フラグメント（１μｇ）は、上記の ように精製した、ｐＢＲ６２７の２．９　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｂａｍ　 ＨＩフラグメントの１μｌと混合した。リケゞ−ンヨン（Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ 、２単位）およびに、　ｃｏｌｉ　ｍ胞の形質転換を上記のように行なってから 、５０個のアンピンリン抵抗性コロニーを得た。２０個のフ０ラスミＶミニ調製 物よりのＤＮＡを）Ｔｊ、ｎｄＩＩＩおよびＢａ、ｍＨＩで消化し、２、ろｋｂ フラグメントの存在をだしかめた。正しい構造の１個のデラスミｖを選び、第２ 図に示すようにｐＭＯＮ　ｄ　ｌと称した。ある量のこれのＤＮＡを上記のよう に調製した。

例２１．ａ１３クローンＩｖｆ−４の創製フ０ラスミドｐＭＯＮろ８（例１記載 ）のろＯｇをＲｓａ、Ｉ　（ろ０単位、２時間、６７°Ｃ）で消化しそして、前 例記載のがラスピード法を用いるアがロースケゞル電気泳動で分けたあと１１０ Ｑ　ｂｐＲｓａＩフラグメン）ｋ精製した。精製された１　１０　Ｑ　ｂｐＦｔ ｓ、ｉＩ　−ＲｓａＩフラグメント（１μｇ）を２単位のＢａｍＨＩで消化し、 ＢａｍＨＩを加熱不活化した。このＤＮＡは、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ（各２ 単位、１時間、６７°Ｃ）および０．２単位のうしアルカリホスファターゼ（Ｃ ＡＰ　）てあらかじめ消化し、０，２μＪのファージＭ　１３　ｍｐ　８　ＲＦ 　ＤＮＡと混合した。１ｏｏ＝位のＴ４ＤＮＡりが−ゼを用いるりヶゞ−ンヨン 、Ｅ−ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０１細胞の形質転換のあと、形質転換された細胞は軟 寒天と混合し、そして組換えファージの同定を可能とする条件で寒天平板に塗布 した（　ＭｅｓｓｉｎｇおよびＶｉｅｉｒａ−、１９８２）。１２個の組換えフ ァージ生成細胞を分離し、前記のようにしてＲＦフ０ラスミドミニ−調製物を得 た。ＲＦ　ＤＮＡ５をＢａｍＨＩおよびＳｍａ　Ｉで消化して７２０　ｂｐＲｓ ａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの存在を証明した。正しいフラグメントを担う組 換えＲＦ　ＤＮＡ５のひとつをＭ１３ｍｐ８Ｍ−４で消化した。この操作は第６ 図に示す。Ｍ　−４ＲＦ　ＤＮＡはＩｓｈ　−ＨｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋ ｅ　、　１９８１およびＣｏ１．ｍａ−ｎ等１９７８の操作で調製した。

例ろ　ｐＭＯＮ　１０９の構築 プラスミドｐＧＶ　３１０６　（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ等、　１９８０゜Ｃ ｕｒｒｉｅｒおよびＮｅ５ｔｌｅｒ　１９７６の方法で調製）をＨｉｎｄ　ＩＩ Ｉ　（２０単位、ｚＵＰ間、６７°Ｃ〕で消化し、２ｐｉのＨｉｎｄ　ｌｌｌ− 消化１）ＢＲｊ２７と混合した。リケゞ−ンヨン（Ｔ　４　ＤＮＡりが−ゼ、２ 蛍位）およびＥ、　ｃｏｌｉ細胞の形質転換を上記のように実施しあと、トリメ トラ０リム（ｉｏｏμｇ／ｍｌ）およびアンピシリンに抵抗性のひとつのコロニ ーを得た。この細胞よりのプラスミドＤ　Ｎ　Ａを消化して入ると、６　ｋｂ　 Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントが存在する。このプラスミドｐＭＯＮろ１と称し た。

ミニ調製プラスミドｐ　ＭＯＮろ１（ＣＪ−５μｇ）をＥｃｏＲＩ（１単位、１ 時間、６７°Ｇ）で消化し、それから加熱（１０分、７０’Ｃ）でエンドヌクレ アーゼを不活化した。１０ｉＸ１μｍのリゲーンヨン反応（Ｔ　４　ＤＮＡりが 一ゼ、１毘位）で再環化した。Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転換に用いた。そして アンピンリンおよびストレデトマインン（２５μ、９／ｍ１）抵抗性のコロニー を選択した。

６個のクローンからの７０ラスミドミニ−調製ＤＮＡを８ めた。３５　Ｑ　ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントを欠くひとつのフ０ラヌミＶはｐ ＭＯＮ　５ろと称した。このプラスミドは、上記のような形質転換でＥ−ｃｏｌ とＣＭ　４２　ｄａｍ−細胞（Ｂａ１ｅ等、　１９７９　）に導入した。

ｄａｍ−細胞より調製したミニ−調製物よりのプラスミドｐＭＯＮ　５３　（０ ，５μｇ）な上記のようにＣ１ａＩで消細胞を形質転換し、アンピシリンおよび スペクチノマインン（５０μ、９７ｍ１）抵抗性クローンを選び、５０個のコロ ニを得た。６個のコロニーよりの７０ラヌミドミニ調製ＤＮＡの消化で、すべて ２　ｋｂ　Ｃ１ａＩラグメントを欠くことが分った。これらのプラスミドのひと つは、第４図に示すようにｐＭＯＮ　５４と称した。フ０ラスミ「ＤＮＡは例１ 記代のように調製した。

フ０ラヌミドｐＭＯＮ　５４　ＤＮＡ　（２０ｔｔｊ；／　）をＥｃｏＲＩおよ びＰｓｔＩ（各２０単位、２時間、６７°Ｃ）で消化し、４．８　ｋｂフラグメ ントを、ＮＡ−４５メンプレン　アがロースケゞルより精製した（　５ｃｈｌｅ ｉ　ｃｈｅｒおよびＳｈｕ、ｅｌｌ。

Ｋｅｅｎｅ　、　Ｎ、Ｈ，）。

精製４．８ｋｂフラグメント（０，５μｇ）を、ＮＡ−４５メンプレンを用いで ′前置したＭｌろｍｐ　８　Ｍ　−４ＲＦＤＮＡＣ例２記載）より得た７　４０ 　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ　７ラグメントの０．３μＩと混合した。リケゝ −ンヨン（ＴｄＤ　Ｎ　Ａりが−ゼ、２単位）　、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＣＭ　４２ ｄａｍ−細胞の形質ｃｔｈ、およびスベクチノマイ７ノ抵抗性細胞の選択のあと 、２０個のコロニーを得た。これらのクローンの１２個から７０ラスミＶミニ調 製Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、７４Ｄ　ｂｐフラ グメントの存在を示した。このフラグメントを担う１個のプラスミドをｐＭＯＮ 　６４と称した。このフ０ラスミドＤＮＡのある量を、例１配戟のように調製し た。

ｐＭＯＮ６４のＤＮＡ（０−５ｐ、９　）をｃｘａ■（１１位、１時間、３７° Ｃ）で消化した。Ｃ１ａＩは加熱不活化し、フラグメン口’ｌ　Ｔ　４　ＤＮＡ 　ＩＪが−ゼ（１単位）で再結合させた。形質転換し、ヌペクチノマインン抵抗 性細胞を選択したあと、１２個のコロニーよりプラスミドミニ−調製物を調製し た。ＤＮＡはＢａ−ｍＨＩおよびＣｃｏＲＩで消化Ｌ　２　ｋｂ　Ｃ１ａＩフラ グメントの配向を決めた。クローンの半分は、ｐＭＯＮ　６４におけると逆の配 向でＣ１ａＩフラグメントを含んだ。これらのフ０ラスミＶのひとっ１ｉ、第５ 図に示すように、ｐＭＯＮｌ［１９と称した。

ＤＮＡは例１のように調製した。

例４　）０ラスミドルＭＯＮ　１１３の創製フ０ラスミＫｐｌＪＷろ１ｃｍ８． ２９　Ｃ（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ等。

１．９８０　）を、Ｓ、　（）ｅｌｖｉｎ博士、Ｐｕｒｄｕｅ大学、Ｗｅ　３　 ｔＬａ、ｆａｙｅｔｔｅ　、ＩＮ、より得た。このプラスミドは、ｐＴｉＡ　６ ７．５　ｋｂ　Ｂａｍ　−３７ラグメントヲ含有シタ。

Ｂａｍ　−８フラグメントば、前例におけるように１ＪＡ−４５メンプレンを用 い、５０ｔＪのＢａｍ　ＨＩ−消化ｐＮＷろＩ　Ｃ−８，２９Ｃより精製した。

精製７．５　ｋｂ　Ｂａｍ　−８フラグメント（１，０μｊｊ　）は、Ｂａｎｏ ＨＩ　（２単位）およびロ、２単位のうしアルカリポヌファターゼ（ＣＡＰ　） で６７°Ｇで１時間あらがしめ消化したｐＢＲ３２７ベノターＤＮＡの０．５μ ｇと混合した。混合物は前記のように除蛋白し再懸濁した。混合フラグメントは Ｔ　４１Ｊが−ゼ（２毘位）で処理しＥ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒｅｃ　Ａ細胞 を形質転換いアンピレン抵抗性コロニーを選択シタ。

これは前記のようにした。これらのクローンの１２個についてプラスミドＤＮＡ をうるためのミニ−調製物を用意した。ＤＮＡはＢａｍＨＩで消化しｐＢＲ６２ ７ベクターおよび７．５　ｋｂ　Ｂａｍ　−８７ラグメントの存在を示した。両 方のフラグメントを示すひとつのフ０ラヌミドはｐＸｌｏＮ　９０と称した。Ｄ ＮＡは例１記載のように調製した。

ｐＭＯＮ　９０　ＤＮＡの２５μＩをＢｇＩＩ工（２５単位、２時間、６７°Ｃ ）で消化し、２．６　ｋｂ　ＢｇＩエエフラグメン日まＮＡ　−４５メンブレン で精製した。平滑末端を創るために、フラグメント（２μｇ）は、１０μｍの６ 　ｍＭＮａｃｌ、６．６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｏＨ３，６，６ｍＭ　Ｍｇ Ｃｌ２および０−５ｍＭジチオスレイトール（Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液）に再懸濁さ せた。４個のデオキシーヌクレオチド（ｄＡＴＰ　、　ｄＴＴＰ。

ｄＣＴＰ　、およびａｃ−Ｔｐ　）を加え１　ｍＭの最終濃度とし、Ｋｌｅｎｏ ｗポリメラーゼを加熱不活化し、１０単位のＴ（ｉｎｄＩＩＩを加えた。３７℃ で１時間Ｈｉ、ｎｄＩエエ消化をおこかない　ついで酵素を熱不活化した。Ｈｉ ｎｄＩＩＩ−ＢｇＩＩｒ（平滑）フラグメント（１μｇ）を、前記のように、Ｈ ｉｎｃｌＩＩＩおよびＰＶＩＪ丁丁消化ついでうしア！レヵリホヌフ了ターゼ処 理て生成させた、ｐＢＲろ２２の２，２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｐｖ−ｕＩＩ フラグメント（Ｂｏ　ｌ　ｉ　ｖａ　ｒ等。

１９７７　）ノｏ、２５　μａｗ加えた。１００単位（７）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ を用いるりヶ８−　ンヨ７　、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＴＪろ９２細胞の形質転換お よびアン２リンン抵抗性コロニーの選択を前例のように行ない、１９個のコロニ ーを得た。１２個のコロニーよりプラスミドミニ調製物を用意し、ＦＪｉｎｄＩ ＩＩで消化して組換えフ０ラヌミドのナイズを決めモしてＳｍａ　Ｉて正しいフ ラグメントの挿入されていることを決めた。正しい構造のひとつのフ０ラヌミＩ Ｓを、第６図に示すように、ｐＭＯＮ　１１ろと称した。プラスミドＤＮＡは例 １のように試製した。

例５　フ０ラスミドｐＭＯＮ　１２　［１の創製）０５　スミｌ’　ｐＭＯＮ　 １０９　（例ろ記載）の２０　μｇを、ＥｃｏＲＩおよび１３ａ、ｍＨＩ　（各 ２０巣位、２時間、３７°Ｃ〕で消化、前例記載のようにＮＡ　−４５メンプｌ ／ンを用いてろ、４　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製した 。

フ０ラスミＹ　ｐＭＯＮ　４１　（例１記赦）の２０ａｇをＢａｍＨＩおよびｐ ｖＢ　Ｉ　（各２０単位、２時間、６７°Ｃ）で消化２ ｂ法−４５メンブレンを用いて精製した。

ｐ！・７丁ＯＮ　１１３　ＤＮ　（例４記載）を上記のようにＰｖｕＩおよびＥ ｃｏＲＩ　（各単位、２時間、６７°Ｃ）で消化し、３、１ｋｂＰｖｕＩ　−Ｅ ｃｏＲＩフラグメントをＮＡ−４５メンブレンで精製した。プラスミドｐＭＯＮ 　１２０を組−ヒげるために、３．１　ｋｂＤｃｏＲＩ　−ＰｖｕＩ　ｐＭＯＮ 　１１ろフラグメン）　（１，５μ９）をｐＭＯＮ　１０９よりのＥｃｏＲＩ　 −ＢａｍＨＩフラクグメント（３，４ｋｂ　、）の１５μｇと混合した。１０° Ｃで１６時間Ｔ　４１Ｊガーゼ（６単位）で処理したあと、加熱（１０分、７０ °Ｃ）してリガーゼを不活化し、５単位のＢａ　ｍＨＩを加えた。上記のように 、６７°Ｃで６０分加熱を続け、それから加熱してＢａｍＨＩエンドヌクレアー ゼを不活化した。ついでＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ（２単位）および最終濃度 で０．７５　ｍＭとなる新鮮ＡＴＰとあわせて、ｐＭＯＮ　４１よりの１．５　 ｋｂ　ＰｖｕＩｌ−ＢａｍＨＩフラグメントの０．７５μｇを加えた。最終りガ ーゼ反応を抵抗性細胞を選んだ。数１００個のコロニーのうちの１２個よりプラ スミドミニ調製物を用意し、ＢａｍＨＩおよびｇｃｏＲＩに対して単一サイトで サイズ約３ｋｂのプラスミドをめてスクリーニングした。正しい構造のひとつの プラスミドをｐＭＯＮ　１２０と称した。これ第７図に、別の構築方法とあわせ て示した。例１のようにｐＭＯＮ　１２０　ＤＮＡを調製した。

ｐＭＯＮｌ　２０を含有するＥ、　ｃｏｌｉの培養物はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｉｃ　寄託され、受は入れ番号 ろ９２６ろを受けた。

例６７°ラスミｔＰｐＭＯＮ　１２８．ｇよびｐＭＯＮ　１２９の創出 シラスミドｐＭＯＮ　７５　（前記引用の１植物細胞中での発現に適当なキメラ 遺伝子”と題する別の特許願に詳記した〕はキメラＮＯ３−ＮＰＴ　Ｉニー　Ｎ Ｏ８遺伝子を含有する。このシラスミド（およびｐＭＯＮ　１２８　、下記）は ＥｃｏＲＩで消化でき、そしてＮＯ３−ＮＰＴ　工ｌ−ＮＯ３遺伝子を含有する １、５　ｋｂフラグメントを精製しつる。

プラスミドｐＭＯＮ　１２０はＥｃｏＲＩで消化しそしくうしアルカリホスファ ターゼで処理した。フェノール除蛋白質およびエタノール沈殿のあと、ＥｃｏＲ Ｉ−切断ｐＭＯＮ　１２０直線状ＤＮＡをｐＭＯＮ　７５または７６よりの１． ５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩキメラフラグメントの０，５μｓと混合した。混合物はＴ ４ＤＮＡＩＪが−ゼの２単位とで１時間２２０Ｃで処理した。Ｅ、ｃｏｌｈ畑胞 の細胞転換およびスペクチノマインン（５０μｇ／ｍｌ）抵抗性コロニーの選択 のあと９、叙千個のコロニーが現われた。それらの６個を分離し、培養し、プラ スミドミニ−調製物を用意した。フ０ラスミドのＤＮＡはＥｃｏＲＩで消化して １−ｓｋｂキメラ遺伝子挿入物をチェックしＢａ、ｍＨＩで挿入物の配向を決め た。ＢａｍＨＩ消化の結果、ｐＭＯＮ１２８においてキメラ遺伝子は、ｐＭｏＮ １２０のインタクトノパリンンンターゼ遺伝子と同じ方向に転写されることが分 った。ｐＭＯＮ　１２８含有Ｅ、　ｃｏｌｉ培養物はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託された。この培養物は受け入れ 番号３９２６４を受げた。ｐＭＯＮ　１２９中の挿入物の配向は、ｐＭＯＮ１２ ８におけると逆であった。

ｐＭＯＮ　１２９の消化物中の追加の１．５　ｋｂ　Ｂａ、ｍＨＩフラグメント は、第８図に示すように、フ０ラスミドｐＭＯＮ１２９がキメラＮＯ３−ＮＰＴ 　ＩＩ　ＮＯ８遺伝子のタンデム複製を担うことを示した。

例７　コーインテグレートプラス５１！ｐｌ諺０Ｎ１２８：：ｐＴｉＢ　６Ｓ３ ＴｒａＣの創製 フ０ラスミドｐＭＯＮ　１２８　（例６）を、下記のトリーパレンタルフ０レー トメーティング法（ｔｒｌ−ｐａｒｅｎｔａ上ｐｌａｔｅ　ｍａｔｉｎｇ　ｐｒ ｏｃｅｄｕ、ｒｅ）　ｔ、ｙ用いで、Ｔｉ　！う７ミドｐＴｉＢ６ｓ５ｔｒａ０ （Ｌｅｅｍａｎｓ等、１９８２）ｋ担う、クロラムフェニコール抵抗ａ　Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＣＶろｉ　ｉ　ｉ　＝ｃ＝５ ８　ＣＩに移した。ｐＭＯＮ　１２８乞担うＥ、　ｃｏｌｉの培養物の０．２　 ｍｌ　ｆ、ｐＲＫ　２０１３プラスミド（Ｄｉｔｔａ等、１９’８０）Ｙ担５　 Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＨＢ　１０１の培養物の０．２　ｍｌおよびＧＶ５１１１細胞 のＱ、２ｍｌと混合した。Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ　（ＬＢ　）中で細胞の混合 物を培養し、ＬＢプレートに塗沫し、３０’Ｃで１６から２４時間培養し、フ０ ラヌミドの移入およびコーインテグＶ−）プラスミドの生成をおこさせた。細胞 はｉ　Ｑ　ｍＭのＭｇ５Ｏ，の３ｍｌｍｌ中温懸濁スベクチトノマインンおよび ７トレ・デトマインンの各１００μ！ｊ／ｍ１およびクロラムフェニコールの２ ５μＩを含有スるＬＢフ０レート上に塗沫した。４８時間６０°Ｃでインキュベ ートしたあと約１０コロニーを得た。ひとつのコロニーを選び、上記濃度にスペ クチノマイシン、ストレフ０トマインンおよびクロラムフェニコールヲ含有スる ＬＢ培地中６０°Ｃで発育させた。

対照実験に用いるために、別の型のコーインテグレびヌトレデトマインンを用い コーインテグレートデラスミドを有する細胞を選択することにより調製した。

ｐＭＯＮ　１２　Ｄのように、これらのプラスミドはキメラＮＯ８−ＮＰＴ　Ｉ Ｉ　ＮＯ８遺伝子な含有しない。

例８　植物細胞培養で用いる溶液 出願人等はつぎの溶液を用いた。

リットル中 酵素ミックス　セルリジン（Ｃｅｌｌｕｌｙｓｉｎ）　５　Ｅマセｏフイム（Ｍ ａｃｅｒｏｚｙｍｅ）　０．７　ｊｊＭｇＳＯ４−７Ｈ２０２４６ｍｙ ６ ＣｕＳ○、’５Ｈ２００，０２５＆ｊ マンニトール　１ｉｏｇ Ｍ３９　ＭＳ塩（下記をみよ）４．ろＩヌクロース　ろｏ、ｏｇ Ｂ５ビタミン（下記をみよ〕１ｍ１ マノニトール　９０．０．９ 植物ホルモン ヘンシル’７テ＝ン（Ｂ　Ａ　）　０．５　”ｙ２．４−Ｄ　１１１１９ ＭＳ−ＥＳ　ＭＳ　塩　４．ろ　Ｊ カルベニ７リン　１０１１１９゛ 植物ホルモン インドール酢酸　０．１ｍシ・ ＭＳＯＭＳ塩　４，６ｇ フイータゞ−７０レートＭＳ　塩　４．ろ　ｌ培地　ヌクロース　ろｏ、ｏ　ｇ 植物ホルモン Ｂ八　〇、５ｍシ゛ ＭＳ２ＣＭＳ塩　４．３９ 植物ホルモン クロルフエノキソ酢酸　２　ｍ？ ＭＳ　１０４　ＭＳ塩　４，３ｇ スクロース　３０．ｔｌ　、＠ Ｂ５ビタミン　１　ｍｌ 植物ホルモン ＭＳ　１１　ＭＳｊＡ　４．３９ スクロース　３０．０　ｇ Ｂ５ビタミン　１　ｍｌ 植物ホルモン ゼアチン　１■ Ｂ５ビタミン　ミオ−イノシトール　１００　９ストツク　チアミンｎｃｘ　１ ０　９ ニコチン酸　１ｇ ピロトキシンＨＣＩ　１　ｇ フロート　リンス　ＭＳ　塩　０．４６　ｇ（Ｆｌｏａｔ　ｒｉｎｓｅ）　スク ロース　１７１．２．９ｐｖｐ−４０４０，０、！９ ＭＳ塩は、Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ 、Ｎ、Ｙ。

より乾燥粉末状プレーミンクスを購入 例９　フ０ロトフ０ラヌトの調製 螢光燈の２または３列および白熱電球の２列を有する栽培室（約５，０００ルツ クス）中で、Ｍｉｔｃｈｅｌｌｐｅｔｕｎｉａ植物を栽培した。温度は２１℃の 定温とし、明期は１日１２時間とした。植物はＶｅ　ｒｍｉ　ｃｕｌ　ｉ　ｔｅ とＰｒｏ　−ｍｉｘ　ＢＸ　（Ｐｒｅｍｉｅｒ　Ｂｒａｎｄｓ社、カナタゞ〕の ５　［１１５０混合物で栽培した。植物には、Ｈｏａｇｌａｎｄ養分溶液を１日 １回潅水した。密で繁みとなって発育しでいる暗緑色の植物より組織を採取した 。１０％の市販漂白用溶液に少量の洗浄剤またはＴｗｅｅｎ　２０を加えたもの で時々振りながら２０分間かけて葉を滅菌した。葉は無菌蒸留水で２またはろ回 すすぎ、薄片（約１　ｖｒｍ　）を、葉より、主葉脈に直角に切り取った。薄片 は、約１ｇの組織対１０ｍ１の酵素の比率に酵素混合物に加えた。

皿はパラフィルムでンールし、暗い、間接光下かまたは暗所で、たえずか（はん しながら（回転シェーカー上４０　ｒｐｍ　）インキュベートした。酵素インキ ュベーションはふつう、１夜、約１６−２０時間おこなった。

消化混合物は、６８，７４．または８８μｍのふるいを通してふるい大きながす および葉を除いた。ａ液は＋　７０から１００５’で５分遠心しデロトデラヌト Ｙペンソトとした。上清を叶いしゃし、ペレットはおだやシにフロートリンス溶 液中に再懸濁させた。この懸濁液り主バブコック（ｂａｂｃｏｃｋ　）びんにあ げた。びんは、くびの底より上２または３　ＣＴｆＬＶＣｋたした。フロートリ ンスの頂部に１ｎｎｌの発育培地ＭＳ９を注意して層とした。

バブコックびんのバランスをあわせ、５００から１００　Ｏｒｐｍで１０から２ ０分遠心した。フ０ロトデラストは境界面において、くびの内部で緊密なパンダ を形成した。フロートリンスを余分に取り出礁ぬよ５に注意しで、ピペットでバ ンドを除いた。プロトプラストはＭＳ９中に希釈した。この時点でプロトプラス トはＭＳ９で洗うか、または、洗うことなく希釈して、プレートにあげた。

プロトプラストは５Ｘ１０’／ｍ〕にＭＳ９培地中に懸濁させ、６ｍ１／フラヌ コにＴ−７５フラヌコ中に塗床した。暗い間接光中かまたは暗所で２６から２８ ００で、平らな表面上でフラスコはインキュベートした。

組織より酵素を除いてから６口重に、最初の容量の半分の容量のＭＳ○培地（マ ンニトールは不含）を各フラスコに加えた。第４日にまた、同じ量のＭＳＯを加 えた。

それで、マンニトール濃度は最初の希釈で約０．３６Ｍ　。

第２の希釈で約０．２５Ｍとなった。

例１０　細菌との共存培養 ゾロドプラスト分離第５日に、５から７日令タバコ懸濁培養物（ＴＸＤ細胞）を （必要なら）ＭＳ２Ｃ培地で希釈して、１００Ｘ　１５ｍｍ’？）　１７皿中の 寒天培地の表面に１　ｍｌが容易に拡がる程度とした。これは１０から１５％（ Ｗ／ｖ）懸濁液である。０．８％寒天をＭ　Ｓ　−ＥＢ培地と混合し、混合物を オートクレーブし、混合０ 物を冷却しフ０レート中で固化させて寒天培地を得た。

ＴＸＤ懸濁液のＩｍ工をフィーダーツ０レート培地の２５ｍ１Ｋ拡げた。ＴＸＤ ７−（−グー、１ｉＪｌ　胞上Ｋ　Ｗｈａ　ｔｍａ−ｎ　Ａ６．１０紙の８．５ １デイスクを重ねた。そして、平らにした。

同じ口紙の７ｃｍディスク乞、大きい方の中央においた。

別に、Ａ−ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞の培養物（酵母エキスペラ０トン培地中 に培養〕の１部宛を植物裡胞を含有するフラスコに入れた。それらの１組は、キ メラＮＯ３−ＮＰＴ　ｌｌＮＯ３遺伝子を有するｐＭＯＮ　１２３　：：　Ｔｉ 　コーインテグレートフ０ラスミドを有する細胞を含有した。それらの他の組は キメラＮＯ３−ＮＰＴ　ＩニーＮＯ８遺伝子を有しないｐＭＯＮ　１２　Ｄ　： ：　Ｔｉ　コーイｙチクレートｙ’　５ヌミドを有する細胞を含有した。

細菌を加えて細胞密度１０”個／ｍｌとした。細胞混合物の０．５　ｍｌ　ｋ　 ７αロ紙ディスクの表面上に薄層として拡げた。フ０レートはパラフィルムまた はフ０ラスチックの袋に包み、螢光燈の直射光の下にインキュベートした。ひと つの棚上にはフ０レート数５以下とした。

７日のうちにコロニーを見分けた。１４日までに、コロニーの付着した７ぼディ ヌクを、５００μ、９／ｍ１カルベンリンと５０μＩ硫酸カナマイシン含有新し いＭＳＯ寒天培地（フィーダー細胞なし）　（Ｓｉｇｍａ　ｒ　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ　、　ＭＯ）に移した。ｐＭＯＮ　１２８コーインテグレ上に、盛ん に発育する緑色コロニーを観察しえた。

ｐＭＯＮ　１２０コーインテグレートフ０ラヌミドを含有するＡ、　ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓと共存培養した植物細胞を含有するプレート上には形質転換された コロニーは見出ださなシン含有培地中に持続して発育しえた。ナウザーンプロン テイング（５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）実験（Ｅ。

５ｏｕｔｈｅｒｎ　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８　：　５０ろ（１９ ７５））は、これらの細胞がキメラＮＯ８−ＮＰＴ　Ｉ工遺伝子を含有すること を確実にした。

両方の組の形質転換細胞（そして、ＮＰＴタイゾエ酵素をコードするキメラ遺伝 子で同様に形質転換された第３の組の細胞）をカナマイシン抵抗性に関してアッ セイした。結果は第１１図に示した。

例１１　形質転換された植物の再生 第９図および関連した記載にあるように、形質転換されたカナマイシン抵抗性コ ロー−Ｃ例１０　）＋ｓ、腫瘍性および非腫瘍性両方の細胞を含有した。腫瘍性 形質転換細胞より非腫瘍性形質転換細胞を分け、非腫瘍性細胞よ゛り分化した植 物組織を再生さすのにつぎの操作を用いた。

６０μ９７ｍ１の硫酸カナマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを 含有するＭｅ　１０４寒天培地にコロニーを発育させ、直径約１ｃｍに至らせた 。腫瘍性のコロニーは大部分やや淡い緑色を帯び大部分の非腫瘍性コロニーより はより粗な構成であった。腫瘍性コロニーはピンセットでＭＳ　１０４培地より 取り、３０μ９７ｍｌカナマイシンおよび５００μ／ｍ１カルベニンジンを含有 するＭＳ　１１培地土においた。コロニーが発育したところで、淡緑色に見え粗 な構成のコロニーを除きすてた。

ＭＳ　１１培地は植物ホルモンであるゼアチンを含有した。これは非腫瘍性コロ ニーに苗条生成を誘発した。

ついに）工、カナマイシン抵抗性コロニーいくつかの苗条が芽生えるのを認めた 。これらの苗条は望むナイズまで発育させ、鋭利な刃で切り取り、ＭＳＯのよう な植物ホルモンを含有しない培地に挿入し、根を再生させうる。望むならば発根 な促すのに培地にナフタレン酢酸を補給しうる。植物（ま寒天培地中で望む大き さまで発育させ、土に移し５る。適切に栽培すれば植物は成熟し種子を生じよう 。獲得された形質は古典的メンデル遺伝学により、子孫に受けつがれるであろう 。

参考文献 ニー°ブラウン（Ａ、　Ｂｒａｕｎ　）およびエイチ・ウッド４９６（１９７６ ） エム、デー、チルトンＣＭ、、Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏ！１）等、　Ｃｅ１ｌ　１１ ：２６３（１９７７） チー、キュリ了−（’ｌ”−Ｃｕｒｒｉｅｒ　）およびイ、−、ヌスタ１８：３ ０７（１９８０） アール、タブリュー、ディビス（ＲｌＷ、　Ｄａｖｉｓ　）等。

Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｌ（１９ ８０ンエイチ、ドウ　グレープ（Ｈ−Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ　）等、　Ｐｌａｓｍｉ ｄ６：２３５（１９８１） Ｓｃｉ、ＵＳＡ７７　：　７３４７　（１９８０）デー、が−フィンケ＃　（Ｄ ＋Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　）等、　（１’ｅｌｌ工２７　：　１４３（１９８１） ジュー６／−−ナルステイーンス（Ｊ、　Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ　）等、　 Ｎａｔｕｒｅ　２８７　：　６５４　（１９８０）デー、インユーホロウイクズ （Ｄ、　Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ　）お４ １４１　：１２９（１９７９） ジエー、リーマンス（Ｊ、　Ｌｅｅｍａｎｓ　）等、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

、ｒ、１　：１４７（１９８２） ニー、エル、レーニンジャー（Ａ、Ｌ＋Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）＋Ｒ８３，６：ろ ７７３（１９７９） Ｈａｒｂｅｒ　Ｌａｂ８　１　１　９．８　２　）エル、　マー　１−ン（Ｌ− Ｍａｒｔｏｎ　）等、　Ｎａｔｕｒｅ　２７７　：１２９（１９７９） チー、マツグ（Ｔ、　Ｍａｔｚｋｅ　）およびエムーデ　チルトンＣＭ　−Ｄ　 Ｃｈｉｌｔｏｎ　）　、　Ｊ　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ＋１　：３９ （１９８１） ゾエー、メンング（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　）等ｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓＲｅｓ、　９　：ろ０９（１９８１） ジエー、メンング（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ〕およびジエー、バＭｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒエヌ、ミュレ イ（Ｎ、　Ｍｕｒｒａｙ　）等、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

オールド（Ｒ，５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　）　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓエル、オノテン（Ｌ、　０ｔｔｅｎ　）　、　１＝７ｏ１．　（）ｅｎ 、　Ｃｅｎｅｔ。

１８ろ：２０９（１９８１） アール、ロバーツ（Ｒ，Ｐｏｂｅｒｔ、ｓ　）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓオールド（Ｒ，５ｃｂｌｐｅｒｏｏｒｔ　）　、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ。

１８９　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　／　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　、　Ｎ＋Ｙ、（ １９７８）ジエ、グー、セットロウ（Ｊ、　Ｋ、　５ｅｔｌｏｖ　）およびニー 、ボラエンｆ　−（Ａ、　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　）　、　Ｇｅｎｅｔｉｃエッ クス、ソベロン（Ｘ、　５ｏｂｅｒｏｎ　）等、　Ｇｅｎｅ　９　：２８７（１ ９８０） エル、ストライアー（Ｌ＋５ｔｒｙｅｒ　）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

第２版（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、＋　１９８１　）エム、トマ ンヨウ（ｌｖｉ　、　Ｔｂｏｍａｓｈｏｗ　）等、　Ｃｅ１ｌ　１９　ニア２９ 　（１９８０） ビー、フォーゲルスタイン（Ｂ、　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　）およびデー、ジレ スパイ（Ｄ、　０ｉｌｌｅｓｐｉｅ　）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　：　６１５−６１９　（１９７９）２８７；３５９（１ ９８０） 浄会（内さ）こ変更なし） 第１　図 ＥｃｏＲｌ 非腫瘍３４Ｔ−ＤＮＡ また１ま 腫泡診導Ｔ−ＤＮＡ 嶌９区 見１０図 第１１　図 手続補正書（自発） 昭和５９年１１月１４０ 特許庁長官殿 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 昭和　年　月　口 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 手続、補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ２、発明の名称 琢童バ（７）５屯１イ１「私膏欠巾必Ｗりｑ′ダベミ゛ド３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 昭和５９　年１２月２５　日 ６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　要素として、 ａ、第１のＴ−ＤＮＡボーダーより複製されるかまたは由来するところの第１の 塩基配列と；ｂ、植物細胞のひとつまたはひとつより多くの型のうちに発現され るところのひとつまたはひとつより多くの遺伝子を包含しでいる第２の塩基配列 と；ｃ、　Ｔｉシラスミドと相同の領域を包含している第６の塩基配列とを、 順次に包含しており、ここで、第６の配列は、１１）第１のＴ　−ＤＮＡボーダ ーに相補性であ°るＴ−ＤＮ八へ−ダー、および （２１Ｔｉ）０ラスミド上のひとつまたはひとつより多い腫瘍誘導遺伝子 のあいだの野生型Ｔ１プラスミド中に位置するところの選択された塩基配列に相 同である、キメラプラスミド。 ｆ２）　Ｔｉシラスミドが複製する、ひとつまたはひとつより多くの型の微生物 中でマーカーとして機能する遺伝子を包含する、上記（１）項記載のキメラフ０ ラスミド。 （３）　該遺伝子が選択マーカーとして機能する上記（２）項記載のキメラプラ スミド。 （４）　ひとつまたはひとつより多くの型の植物細胞中でマーカーとして機能す る遺伝子を包含する、上記ｆ１．ｊ１記載のキメラプラスミド。 ８ （５）該遺伝子がスコアマーカーとして機能する、上記（４）項記載のキメラシ ラスミド。 （６）　少なくともひとつの遺伝子が、植物細胞中において、植物細胞中のひと つまたはひとつより多くのオパイン物質の生産乞触媒するところのポリペプチド に発現される、上記（５）項記載のキメラシラスミド。 （７）該遺伝子が選択マーカーとして機能する、上記（４）項記載のキメラシラ スミド。 ・８）　Ｔ１７°ラヌミドを含有し５るひとつまたはひとつより多くの型の微生 物中でマーカーとし１機能する第１の遺伝子と、ひとつまたはひとつより多くの 型の植物細胞中でマーカーとして機能する第２の遺伝子とを包含する、上記（１ ）項記載のキメラシラスミド。 （９）　Ｔ１フ０ラスミドが複製する、ひとつまたはひとつより多くの型の微生 物中では複製しない、上記（１）項記載のフ０ラヌミド。 （１０）　要素として、 ａ、第１のＴ−ＤＮＡボーダーより複製さ゛れるかまたは由来するとこの第１の 塩基配列と；ｂ、植物細胞のひとつまたはひとつより多くの型のうちに発現され るところのひとつまたはひとつより多くの遺伝子を包含しでいろ第２の塩基配列 と：ｃ、Ｔｉフ０ラヌミドと相同の領域を包含して（・る３の塩基配列とを、 順次に包含しており、ここで第６の配列は、Ｔ１プラヌミド中のいずれかの塩基 配列と実質的な相同性を有する塩基配列の入である、キメラフ０ラスミド。 旧）Ｔ】シラスミドが複製するひとつまたはひとつより多くの型の微生物中でマ ーカーとして機能する遺伝子を包含する、上記００）項記載のキメラプラスミド 。 ０２）該遺伝子が選択マーカーとしで機能する上記１ＩＩ１項記載のキメラフ０ ラヌミド。 （１３）　ひとつまたはひとつより多くの型の植物細胞中でマーカーとして機能 する遺伝子を包含する、上記ｕ６＋項記載のキメラプラスミド。 ■　該遺伝子がスコアマーカーとしで機能する上記０３１項記載のキメラプラス ミド。 ０！５１　少なくともひとつの遺伝子が、植物細胞中においで、植物細胞中のひ とつまたはひとつより多くのオパイン物質の生産を触媒するところのボリベフ０ チドに発現される、上記０３）項記載のキメラ７°う７ミド。 ０６）該遺伝子が選択マーカーとして機能する、上記１．１３ｊ項記載のキメラ プラスミド。 （ｌη　Ｔｉプラスミドを含有しているひとつまたはひとつより多くの型の微生 物中でマーカーとして機能する第１の遺伝子と、ひとつまたはひとつより多くの 型の植物細胞中でマーカーとして機能する第２の遺伝子とを包含する、上記ｕＯ ）項記載のキメラプラスミド。 （１（至）　要素としで、 ａ、第１のＴ　−ＤＮＡボーダーより複製されるかまたは由来するところの第１ の塩基配列と；ｂ、植物細胞中で発現される遺伝子を包含する第２の塩基配列と ； ｃ、Ｔｉミツ０ラヌミド相同の領域を包含している第ろの塩基配列とを、 順次に包含しでおり、ここで、キメラフ０ラヌミドは相同領域での単一クロスオ ーバ事象を用いてＴ１プラスミトトのコーインテグレートフ０ラスミドを形成で き、ここで、コーインテグレートゲラスミドは、第１のＴ−ＤＮＡボーダー、第 ２の塩基配列および相補的Ｔ　−ＤＮＡボーダーを包含する第４の塩基配列を含 有するものとなり、ここで第４の塩基はなんらの腫瘍銹導遺伝子を金材しないも のとなるような、キメラプラスミド。 （１９１Ｔｉ）０ラスミドの複製するひとつまたはひとつより多い型の微生物中 でマーカーとじ１機能する遺伝子を包含する、上記０８）項記載のプラスミド。 （ｚＯ）　ひとつまたはひとつより多くの型の植物細胞中でマーカーとしで機能 する遺伝子を包含する、上記（Ｉ８）項記載のキメラプラスミド。 （２１）　Ｔｉミツ０ラヌミド複製するひとつまたはひとつより多い型の微生物 中でマーカーとしで機能する第１の遺伝子と、ひとつまたはひとつより多い型の 植物細胞中でマーカーとしで機能する第２の遺伝子とを含有する上記（１８＋項 記載のキメラプラスミド。 （２２）　要素として ａ、第１のＴ　−ＤＮＡボーダーより複製されるかまたは由来するところの第１ の塩基配列と：ｂ、植物細胞中で発現される遺伝子を包含する第２の塩基配列と ； Ｃ８第１のＴ　−ＤＮＡボーダーに相補的の第２のＴ−ＤＮＡボーダーより複製 されるかまたはそれに由来するところの第２の塩基配列とを、 順次に包含しており、ここで、２つのＴ　−ＤＮＡボーダのあいだには、植物を 腫瘍性としたりまたは形態学的に正常な植への再生を不可能とするような゛塩基 配列は存在しない、キメラプラスミド。 （至）　上記（２２のキメラプラスミドを含有するシラスミド。 （２４１ＤＮＡをＴ１〕０ラヌミドに挿入して得られる、上記恭項記載のフ０ラ スミド。 、２５）　Ｔｉミツ０ラヌミド複製するひとつまたはひとつより多くの盟の微生 物のうちでマーカーとして機能する遺伝子を含有する、上記蜘項記載のシラスミ ド。 （２６）　ひとつまたはひとつより多くの型の植物細胞中でマーカーとして機能 する遺伝子を含有する、上記蜘項記載のプラスミド。 ｆ２７）　Ｔｉプラスミドが複製するひとつまたはひとつより多くの型の微生物 中でマーカーとして機能する第１の遺伝子と、ひとつまたはひとつより多くの型 の植物姐箇由でマーカー〉墳能す乙笛りの；膏缶羊シシ合有す２ る、上記開環記載のシラスミド。 （財）　上記（１）項記載のキメラプラスミドを含有する微生物。 □□□　上記（８）項記載のキメラプラスミドを含有する微生物。 （７）　上記（１＆項記載のキメラプラスミドを含有する微生物。 ６υ　上記ｌ２Ｉ１項記載のキメラプラスミドを含有する微生物。 ６ｚ　上記器項記載のキメラプラスミドを含有する微生物。 （３３１上記罰項記載のキメラプラスミドを含有する微生物。 ＋３４１　３９２６３．ろ９２６４．３９２６６より成立つ群より選択されたＡ ＴＣＣ受は入れ番号を有する細胞の培養物中に含有されるプラスミドに関連する 特性を有するプラスミド。 ６５）　ろ９２６３．ろ９２６４　、ろ９２６６より成立つ群より選択されたＡ ＴＣＣ受は入れ番号を有する細胞の培養物に由来す細胞培養物。 浄書（内容（二変更なし）