JPS60500796A - 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 植物細胞の形質発現にふされしいキメラ遺伝子技術分野 この研究は遺伝子工学、植物生物学、微生物学の分野に関するものである。

背　景 過去１０年間の間に、遺伝子工学は急速に発展した。

異種生物の遺伝子馨バクテリアの細胞内に入れ、そのバクテリアに組み込まれた 遺伝子の形質を発現させるという手法が数多（知られている。この場合、通常プ ラスミツドを使用する、そのプラスミツドは、以下述べるようにレストリクジョ ン・エンドヌクレアーゼによって、一つまたはいくつかの部分に分割できる。典 型的な方法は、一つのＤＮＡ鎖乞鎖側分割得た遺伝子を、プラスミドのようなベ クターケ分割して得たものと混ぜ合わせる、というものである。棟々のＤＮＡは つなぎ合わされて、新しくプラスミツドを再構成する。Ｕ、Ｂ。

パテント４，２６７．２２４　（コーエン・ポイヤー、１９８０）；４，２６’ ４，７６１（シャイン、１９８１）；　４，２７３，８７５　（マニス、１９８ １）；４．３’２２．４９９　（バクスター等、１９８２）；４．３３６．３３ ６　（シルヘイビー等、１９８２）を径照。

この他にも参考になるような例は数多（ある°。ある論文には、ＤＮＡの情報が メツセンジャーＲＮＡに転写され、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）の情 報がタンパク質へうつし取られていく過程が説明されている。例えば、ストライ ヤー、１９８１（註：パテント以外のここに記載されている参考は、すべて例の 後に引用されている）、レーニンジャー、１９７５゜その他の論文は、遺伝子操 作の方法、生産物について述べている。マニアテイス等、１９８２；セットロー ・ホレンダー、１９７９を参照。

今までに行われてきた遺伝子工学の研′究では、遺伝子は種々の細胞、主に大腸 菌のようなバクテリア、イーストなどの微生物、あるいは哺乳動物の細胞へ組み こまれてきた。動物の細胞や微生物の細胞に聞いられた技術や物質は、植物を用 いる遺伝子工学、にそのまま利用することはできない。

ここで用いられている通り１植物“という言葉は、多細胞の分化の進んだ個体、 被子植物や多細胞の藻類のように光合成を行うものを表わしている。バクテリア やイーストなどの微生物、菌類はこの仲間に入らない。しかし、′植物細胞”と いう場合には植物から得られる細胞ならなんでも、例えばカルス、樹上の虫こぶ （肺腸）のように未分化の組織、植物の種子、珠芽、花粉、植物の胚などにも適 用されている。

数多（の植物遺伝子が単離されており、販売されているものもあり、又、そうで なくても公けに手に入れることのできるものもある。そのような遺伝子には、大 豆のマクジョンジーン（シャー等、１９８２）、コーンゼイン（ペダーソン等、 １９’８２）、大豆レジモグロビン（ハイルデイツヒ・ニールセン等、１９８２ ）、大豆貯蔵たんばく（フィッシャー、ゴールドバーブ、１９８２）がある。

遺伝子の様々の領域 遺伝子が形質乞発現する場合には、遺伝子から遺伝情報を受け取ったポリペプチ ドが形成される。この過程は、少なくとも二つの段階でできている。まず遺伝子 の一部を転写したメツセンジャーＲＮＡができ、そのメツセンジャーＲＮＡの一 部分がポリペプチドに翻訳される。転写、翻訳の過程は完全には解明されていな いが、ＤＮＡ配列がメツセンジャーＲＮＡに転写される場合、ＤＮＡの何個所か の領域でコントロールされている、と考えられている。ＤＮＡのそれぞれの部位 とは、一連の塩基の配列のことである。（つまり、アデノシン（ＡＩ、チミジン （Ｔ＋、シティジン（ＣＩ、ダアニジン（（）ｌでできているヌクレオチド残基 がある順序に配列したものである。）真核生物の遺伝子に、一般的に存在してい る領域を図１に示す。これらの領域については、それぞれ名前がつけられ簡単に 説明されている。さらに、これらの鎖酸についてもう少しくわしく説明を加える ため様々な用語が使われていることに注意が必要である。

アソシエーションレイジョン２の作用で、ＲＮＡホリメラーゼが働き、ＤＮＡの 断片をつなぎ合わせる。アソシエーションレイジョン２は転写されないが、この 遺伝子領域の働きで、活性化された後、ＲＮＡポリメラーゼは、インターピーニ ングレイジョン４にそっであるきよ離（例えば塩基１００〜３００個位）移動す る。

転写開始シクエンス６は、ＲＮＡポリメラーゼに命令を下し、ｍＲＮＡの合成を 開始する。過当な信号を受けとるとＲＮＡポリメラーゼは、転写開始シクエンス ６を飛ばして、ある距離だけ（例えは塩基２０〜６０個分）ｍＲＮＡのに成を始 める、と考えられている。これは図１にインク−ビーニノダレイジョン８として 表わされている。

それ以前の配列は、遺伝子のゾロモ」ター領域と、集合的に呼ばれている。

ＤＮＡの次の塩基配列はＲＮＡポリメラーゼの作用でメツセンジャーＲＮＡに転 写される。しかしこれか翻訳されてタンパク質が生産されるということはない。

一般に、ｍＲＮＡの５′末端はリポソームに付着している。バクテリアの細胞で は、″リポソーム結合部位“（ＲＢ’ｓ　）と呼はれる塩基の配列で、接着が容 易になっている。

しかしながら、真核生物の細胞では、ＲＢＳの存在は確かめられていない。ｍ− ＲＮＡ鎖にＲＢＳか存在するかしないかに拘らず、ｍＲＮＡはリポソームにそっ て開始コードンに到達するまで移動する。開始コドンは通常ＡＵＧという三個の 塩基配列でできている。まれに、ＧＵＧというコド；ノから翻訳が開始されるこ ともある。ｍＲＮＡの５′末端と開始コドンの間にある、翻訳されない部分は、 ｍＲＮＡの５′非翻訳領域１Ｄと呼ばれている。

ＤＮＡのこれに相当する部分はここでは、５′非翻訳領域１２と呼ばれている。

ＤＮＡのこの部分の塩基の特殊な配列は、遺伝子の形質発現に重要であるとは考 えられていない。しかし、完成していない開始コドンが存在することで、ｍＲＮ Ａの翻訳に影響がでることもあると言われている。コずツク１９７８参照。

プロモーターシクエンスは、」二連した以上に複雑であろう。例えば、バクテリ アに存在するある棟の７０ロモーターには“オペレーター“と呼ばれる制御シク エンスがある。その様な複雑なプロモーターには、遺伝子の誘導あるいは抑制に 関係している一つまたはそれ以上のシクエンスが存在することが多い。一つの例 はラックオペロンと言われるものでこれは、細胞中に乳糖が存在しなければ、乳 糖利用酵素の転写を促進することはない。もう一つの例はｔｒｐオペレーターと 呼ばれるもので、細胞中にトリプトファンが過剰に存在すると、トリプトファン 生成酵素の転写、翻訳乞促すということはない。ミラー・レニコフ、１９８２参 照。

次の塩基配列は、コーディングシクエンスまたは構造シクエンスｉ　４　（ＤＮ Ａ分子において）、あるいは１６　（ｍＲＮＡ分子内で）と叶はれている。上述 したように、ポリペプチドの翻訳は、ｍＲＮＡの開始コドン（普通はＡＶＧであ る）か、リポソームの翻訳メカニズムに到達した時に始まる。開始コドンの命令 で、リポソームは、メチオニンを出発点として各種アミノ酸乞ペプチド結合で結 合させ、ポリペプチド乞形成する、メチオニンは、常にポリペプチドのアミン基 末端となる。（このメチオニン残基はその後、ほかの酵素の作用でポリペプチド ゛から切り離される）　ＡＶＧ、開始コドンに続（塩基は、３個ずつ１組となり それぞれコドンとなる。塩基がどのように６つ組にグループ分けされてい（かを 規定する”　リーディング・フレイム″は、開始コドンにより決まる。それぞれ のコドンは、形成されつつあるポリペプチドへ行別のアミノ酸乞加えてい（遺伝 情報である。遺伝暗号（６４個の異なったコドンがあるが）はすべて解読されて いる。レーニンジヤ−の序文９６２頁参照、例えばＣＵＡは、ロイ７ンというア ミノ酸に対応する暗号であり、ＧＧＵはグリシノ、ＵＧＵはシスティンの暗号で ある。

三つのコドン（ＵＡＡ　、　ＵＡＧ　、ＵＧＡ　）は停止コドンである。停止コ ドンがリポソームの翻訳メカニズムに到達すると、形成されていたポリペプチド はリポソームから離れ、最後のアミノ酸残基がポリペプチドのカルボキシル末端 となる。

モノジストロニック遺伝子中の６′側の停止コドンにあるｍＲＮＡの部分は、こ こでは、６′−非翻訳領域１８と呼はれている。この鎖酸１８は、ｍＲＮＡが転 写された後、そのｍａｔ　ＮＡの処置、安定化あるいは輸送に関係していると考 えられている。またこのレイジョン１８には、ボリアデニレイションシグナル２ ０という塩基配列があることが、細胞内にある、ある酵素により確認されている 。この酵素は、相当量のアミノ酸残基をｍＲＮＡに加え、ポＩＪ　−Ａディル２ ２を形成する。

ＤＮＡ分子には３′非翻訳領域２４とポリアゾニレ−ジョンシグナル２６があり 、それぞれｍＲＮＡの領域１８、シグナル２０の遺伝情報を指定している。しか し、ＤＮＡ分子には、ボＩＪ　−Ａテイルはない、、ｍＲＮＡのポリアゾニレ− ジョンシグナル２０．ＤＮＡのポリアゾニレ−ジョン２６は図中、大きな点で示 されている。

遺伝子−宿主不適合性 地球上のすべての生物体に、同じ遺伝暗号が適用される。コドンに対応するアミ ノ酸は、植物、動物、微生物等あらゆる生物に共通である。しかし、遺伝暗号と なるのは遺伝子の構造シクエンスだけである。これは、ある開始コドンから停止 コドンまでのｍＲＮＡで、ｍＲＮＡを翻訳してポリペプチドが形成される場合の 遺伝情報乞持っている。

しかし、ある種の細胞の中で効率よく働く遺伝子が別の種類の異なった細胞では 全然働かないということもありうる。例えば、Ｅ、Ｃ０１ｉで形質を発現する遺 伝子が、異なったタイプのバクテリアの細胞、菌類、イー−ストに運ばれていき 、その新しい宿主のもとでは、形質乞発現しないこともある。ある完全な遺伝子 が、ある細胞内では形質乞発現するが別の細胞では発現しないということに関し ては様々な理由が考えられる。

坂ロ：岡西、１９８１参照。このような理由として次の事柄が挙げられる。

１、遺伝子が複製されない、又は新しい宿主細胞の子孫に安定して受け継がれて いがない。

２、遺伝子が新しい宿主細胞のレス）　ＩＪクションエンドヌクレアーゼあるい はその他の酵素で分解されてしまう。

３、新しい宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼが、遺伝子のプロモーターレイジョン を認識しない。

４、ＤＮＡのある領域が、宿主ＤＮＡのオペル−ターあるいはその他の制御シク エンスと似ているため、遺伝子の一部が宿主細胞のリプレッサーたんばく質、あ るいは他の分子と結合する。例えば、ラックオペロンにはあるポリペプチドがあ り、このペプチドは、ポリペプチド自身がラクトースで不活性化されないと、ラ ックプロモーターと隣り合ったある配列の塩基と結合する。ミラー・レツニコフ 、１９８２参照。

５　遺伝子の一部分が削り取られてしまったり、再構成されたり、移動して宿主 ケゞツムの他の場所に付層する例えば、数多くの原核生物の細胞中に遺伝子組み 換えを促進する酵素があるということか知られている。（例えば大腸菌のレツク ブロテイン、Ｓｈｉｂａｔａ等、１９７９参照）また、転座を促す酵素もある。

（第４５回、計量生物学コールドスプリングハーバ−シンポジウム、１９８１参 照）。更に、異なったＤＮＡ鎖の類似部分で自然遺伝子修飾が多く現われる。

ラデイング、１９７８参照。

６　遺伝情報を転写したＩｆｌＲＮＡ　Ｋ　［々の問題が生じる。

例えば、リポソームに達する前に品質が低下することがあり、ポリアデニン化さ れなかったり、リポソームに運搬されていかないこともあり、リポソームとうま く適合しないこともあり、大切な部分が、ＲＮＡプロセシング酵素で削り取られ てしまうこともある。

７　遺伝子の遺伝情報を受け取ったｍＲＮＡを翻訳して形成されたポリペプチド に問題が起ることもある。

例えばポリペプチドが細胞に毒性を現わす、配糖体をつくる変性ポリペプチドに 変わってしまう、分割されて小さなポリペプチドあるいはアミノ酸になる、細胞 内の小さな部分に閉じ込められてしまい、そこでは作動できないというようなこ とが起る可能性もある。

一般に、新しい宿主細胞かもとの宿主細胞とかなり異なっている場合、外から入 ってきた遺伝子か新しい細胞の中で形質乞発現する可能性は小さくなる。例えば 、同じ「属」に属していれば、ある１■」のバクテリアの遺伝子は別の１裡」の バクテリアに移されても発現する可能性が大きい。異なった「属」のバクテリア 内での発現の可能性は小さくなり、バクテリア以外の微生物イースト、菌類、礫 類の細胞内での発現の可能性は更に小さくなる。ある１つの「界」に属する生物 （植物界、動物界、微生物界のうちの一つ）の細胞から取り出した遺伝子が別の 「界」の生物の細胞で発現するということはほとんど考えられない。

これらの問題があるために、これまで植物細胞で外来遺伝子の形質を発現させる ことはできなかった。ある植物細胞に、他の生物のＤＮＡ　Ｙ組み込む研究を報 告したグループもある。ラルゼン、１’９７９、クレンメ等、１９８２；ディペ イ等、１９８０を参照。少な（ても三グループが植物細胞に完全な遺伝子名組み 入む方法について報告している。放射性ＤＮＡ　’ｌ用いて、外来遺伝子又はそ の一部が、植物細胞の子孫に安定して受け継がれていることが証明された。ヘル ナルステーン等１９８０　ニガルフィンケル等１９８１；マック・チルトン１９ ８１’ａｊ参照。しかし外来遺伝子が、植物細胞で発現したと℃・５報告はない 。

遺伝子−宿主不適合性に、い（つがの例外があることが発見された。例えは、大 腸菌遺伝子のいくつかは、ある種のイースト細胞で発現する、又その反対にイー ストの遺伝子が大腸菌で発現することもある。ベッグス、１９７８；ストルール 等、１９７９参照。

さらに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｅやＡ。

１ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓなど、ある種のバクテリア細胞は、種々の植物細胞に感染 し、根頭癌腫病やｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｄｉｓｅａｓｅをひき起こす。これらの Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍは、Ｔ１プラスミド、Ｒ１プラスミドと呼ばれる プラスミドを持ち、この中に植物細胞で発現する遺伝子がある。

この遺伝子の暗号はゝゝｏｐｉｎｅｓ　”と呼ばれる物質をつくり出す酵素に関 するものである。０ｐｉｎｅｓに属する物質はｏｃｔｏｐｉｎｅ　、ｎｏｐａｌ ｉｎｅ　、ａｇｒｏｐｉｎｅである。

０ｐｉｎ８Ｂはバクテリア細胞の炭素源、窒素源エネルギー源として使われる。

ペティット・テンプ、１９７８を参照。ｏｐｉｎｅ遺伝子は、バクテリア細胞内 では不活性であると考えられている。これらの遺伝子は植物細胞に入って始めて 発現する。

遺伝子−宿主不適合性という障壁をとり除（ために、様々な人為的工夫もなされ てきた。例えば、宿主バクテリアの細胞に入ると質が低下する哺乳類のポリペプ チドを、正常な宿主細胞に存在するバクテリアのポリペプチドとカプリングさせ ると質が低下しなくなる。

融合たんぽ（が生成されたことになる。板金等、１９７７Ｙ参照。また別の例と しては、宿主細胞内のエンドヌクレアーゼ゛で組みこまれた遺伝子か切断される のを防ぐため、（１）数種のエンドヌクレアーゼを欠（宿主細胞に遺伝子を入れ るか、（２）細胞内で遺伝子を複製し、メチル化しやすくする、という方法も報 告されている。マニアティス等、１９８１’ａ？参照。

さらに、遺伝子−宿主不適合性をとり防（方法として、キメラ遺伝子に関するも のがある。例えば、哺乳類のポリペプチド、インシュリン、成長ホルモン、イン ターフェロン等の遺伝情報を指定する構造シクエンスを、バクテリアの制御シク エンスと結合させる。その結果つくられたキメラ遺伝子をバクテリア細胞に入れ る。するとその遺伝子は哺乳類のポリペブチトビ生成する。グアレンチ等、１９ ８０’ａｊ参照。また、バクテリアの構造シクエンスとヴイルスの制御シクエン スとを結合させできたものは、哺乳動物の細胞に感染することができる、このキ メラ遺伝子’＆ＦｉＩ乳動物の細胞に入れると、バクテリアのポリペプチドを生 成したという報告がある。サラずン・バーブ、１９８１２；コルペル・カラピン 等、１９８２を参照。

レストリクジョンエンドヌクレアーゼ群一般的に、エンドヌクレアーゼというの は、ＤＮＡ　ＹいくつかのＤＮＡの断片に切断していく酵素である。エンドヌク レアーゼは、一本のＤＮＡ鎖の中のどこへでも働きかけ、それを切断することが できる。これに較べて、エクソヌクレアーゼは、ＤＮＡ鎖の末端からヌクレオチ ドをとり除いてい（。ここで述べられているエンドヌクレアーゼ群はすべて二本 鎖のＤＮＡとをＤＮＡの断片に切断してい（ことができる。このためには、二種 の結合鎖を破す必要がある。（１）燐酸基とデオキシリポース残基の間の共有結 合と、（２１ＤＮＡの二本鎖を結びっけている、水素結合（Ａ−ＴとＣ−Ｇ）で ある。

レス、トリクジョンエンドヌクレアーゼ（これ以後、エンドヌクレアーゼと呼ぶ ）は、ＤＮＡ　Ｙある決まった塩基配列のところで切ってい（。例えば、Ｅｃｏ ＲＩ、ＨａｅＩ工Ｉは次の配列を認識し、切断していく。

上の例において、ＢｃｏＲＩにより切断されて、つき出ている５′と結合する力 のある末端７つ（り出した。

（つまり、一本鎖の尾部が６′末端でなく５′末端である）結合力のある末端は 望ましい基を結合させることができる。例えば、ＥｃｏＲＩの末端は、ＥａｅＩ ＩＩ末端と結合することはほとんどないが、別のＢｃｏＲＩと結合することはあ る。

百橿以上のエンドヌクレアーゼ゛が知られておりそれぞれが、ＤＮＡ　４ある決 った塩基配列のところで切断することができる。ロバーツ、１９８２Ｙ参照。レ ストリクショ゛ンエンドヌクレアーゼはすべて、塩基の配列のちがいを読み取る ことができる。その上、ある糧のものは、塩基がメチル化されているかどうか乞 判別することもできる。例えばＭ’ｂＯ工、５ａｕ３＋ａという二つのエンドヌ クレアーゼは、下に示されて・いる様な塩基配列乞切断する。

もしアデニン残基がメチル化されていれば（ｍｓ　−Ａ）、Ｍｂｏ工はこの配列 を切断できない。５ａｕ３ａは、アデニンがメチル化されていても、メチル化さ れていなくても、この塩基配列を切断する。プラスミドのメチレイジョン（従っ て切断）は、メチル化能力のある細胞でプラスミド乞複製することで、ある程度 コントロールすることができる。犬り菌のある酵素、ＤＮＡアデニンメチラーゼ （ｄａｍ　）は、ＧＡＴＣという塩基配列のアゾ）　二ン残基をメチル化する。

ｄａｍ＠’累を持たない大腸菌の菌株はｄａｍ−細胞と呼ばれる。それに対して ｄａｍ　Ｙ持って？・るものはｄａｍ＋又はｄａｍ、細胞といわれている。

いくつかのエンドヌクレアーゼは、それぞれ異なった塩基配列を切断し、他のエ ンドヌクレアーゼの作用でできた結合力のある末端と完全に適合するような結合 性末端をつ（り出す。例えば、少な（ても５檀の異なったエンドヌクレアーゼが ５’ＧＡＴＣ突出部をっ（り出て。これは表１に示されている。

表　Ｉ エンドヌクレアーゼ　塩基配列 （ｍｅ−Ａによる影響なし） 表１に挙げたエンドヌクレアーゼの作用で生じた結合力のある末端は、どれか別 のエンドヌクレアーゼの作用で生じた結合性末端と結合することもあろう。例え ばＢｇ工Ｉ工の作用で生じた末端とＢａｚｎＨＩの作用で生じた末端が結合する と、次のような塩基配列になる。

ＧＡＴＣＣ ＴＣＴＡＧＧ この配列はＢｇエエエ、Ｂ＋ａｍＨ工では切断できないが、Ｍｔ）Ｏ工（メチル 化されていない場合）又は５ａｕ３ａでは切断できる。

６ ＧＡＴＣＹ切断するエンドヌクレアーゼはＰｖｕ工と言われ次のように、３′突 出部をつくりだす。

また、エンドヌクレアーゼＣ１ａＩは次の配列を切断もしｘｌがＧ、あるいはＸ ２かＣであれば、この配列はＭｂｏ工で切断できる。（メチル化されていない場 合、メチル化されていればＣ１ａ工も阻害される。）あるいは５ａｕ３ａでも切 断できる。− ヴイールス性のプロモーター ヴイールスとは、一本鎖又は二本鎖の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ　）力いカプシド ”又はゝコート“と呼ばれるたんぽ（質性のおおい（脂質が含まれることもある ）に包まれてできている微生物である。ヴイールスは細胞より小さく、はとんど すべての生化学的反応を行うために必要な物質を持っていない。その代り、細胞 に感染し、細胞の代謝系２借りてヴイールス自身を増殖させる。

次に簡単に、どのようにしてＤＮＡヴイールスが細胞に感染するか乞説明する。

話をわかりゃ丁くするためＲＮＡヴイールスについてはふれない。まず最初に、 普通、宿主と呼ばれている細胞にヴイールスは付＊−ｒるか、又は侵入する。ヴ イールスのＤＮＡ　（ヴイールス粒子全体のこともある）は、細胞のプラスミド （染色体の外のＤＮＡループ）に入る。ヴイールスＤＮＡの情報は、メツセンジ ャーＲＮＡに転写され、翻訳されてポリペプチドかい（つか生成される、このポ リペプチドの一部が集って、新しい“カプシド“をつ（す、残りのポリペプチド は酵素として作用し、種々の生化学的反応を触媒する。ヴイールスＤＮＡも複製 され、カプシドポリペプチドと共に新しいヴイールス粒子を形成する。これらヴ イールス粒子は徐々に放出されるか、あるいは溶菌現象が起き、細胞は破壊し、 ヴイールスは放出される。放出されたヴイールス粒子は、その後、新しい宿主細 胞に感染する。ヴイールスに関するくわしい情報が必要であれば、ストライヤー 、１９８１；マシュー、１９７０ビ参照。

ここで使用されている通り、′ヴイールス“という言葉は、ファージヴアイロイ ド、複製中間体にも適用される。また１ヴイルス核酸”、′ヴイールス由来のＤ ＮＡ又はＲＮＡ　“という表現は、広（ヴイールスの核酸からとり出されたＤＮ Ａ、　ＲＮＡのすべてに適用されている。例えば、゛ヴイールスＲＮＡ　７鋳型 として生成したＤＮＡ又は、ヴイールスＤＮＡを分析し塩基配列ン決定し、それ と同じ配列のもの７化学的に合成したＤＮＡも、ヴイールス俵酸とみなされるで あろう。

染できる細胞の種類）は限られている。あるウィルスはある種のバクテリアにし か感染できない。またあるウィルスは限られた属の植物にだけ感染する。哺乳動 物にだけ感染するヴイールスもある。ヴイールスが細胞に感染するという場合、 ＤＮＡ又はＲＮＡが宿主細胞に侵入するというだけでな（、細胞内でヴイールス 粒子の増殖が起るということである。種々様々な分析を通して優れた技術７持っ た者は、ある特定のヴイールスが、ある特定の属、種、菌株に感染できるかどう かｔすぐに判定することができる。ここで用いられている様に、′植物ヴイール ス″ζいう言葉は、植物細胞に感染できるヴイールスを指しており、他の細胞に 感染するかしないかは問題ではない。

ヴアイロイド（現在、これについてくわしいことは分っていない）は例外かもし れないが、ヴイールス粒子は、感染した宿主細胞において発現する遺伝子７少な （ても１個は持っている。遺伝子が発現するには、ＤＮＡあるいはＲＮＡの一部 がｍＲＮＡに転写されるか、１ｎＲＮＡ鎖として働き、ｍＲＮＡが翻訳されてポ リペプチド形成されなければならない。はとんどのヴイールスが５〜１０個の異 なった遺伝子を持っており、適当な宿主細胞中で発現する。

ヴイールス遺伝子に由来するプロモーターは、遺伝子工学の様々分野に利用され ている。例えは、バクテリアの遺伝子からとり出したｍｇシクエンス（コーディ ング・シクエンスとも呼ばれている）を、補乳動物の細胞に感染するヴイールス からとり出したプロモーターと結合させて、キメラ遺伝子が作られた。（最も一 般的に用いられている哺乳動物のヴイールスは、５１ｍ１ａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４ 　Ｑ　、Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ　（Ｈ８Ｖ　）と呼ばれて いる。）これらのキメラ遺伝子は、哺乳動物の細胞に形質転換を起させるために 利用されている。

ムリガン等、１９７９；サウヂン・ループ、１９８２を参照。更に、バクテリア に感染するヴイールスから取り出したプロモーターを用いたキメラ遺伝子は、バ クテリア細胞の形質転換に用いられている。マニアテス等の報告したゝゝファー ジランパＰＬプロモーター“を参照。

数人の研究者は、植物細胞の形質転換のベクターとして植物ヴイールスを利用す ることが可能であろうという説を発表した。ホーン等、１９８２Ｙ参照。一般的 に、′ベクター“とはある細胞に遺伝子を移入させる時に利用されるＤＮＡ分子 である。普通、望みの遺伝子をベクターにそう人し、そのベクターを宿主細胞に 感染させる。

数人の研究者は、植物ヴイールス遺伝子に由来するブロモクーを用いて、植物細 胞内で形質を発現するキメラ遺伝子をつくり出すこともできるであろうという説 乞だした。ホーン等、１９８２．２１６頁参照。

しかしながら、多（の研究者達の努力にも拘らず、０ この発明に先だって、誰れも（１）ヴイールス性のプロモーター乞異種生物の構 造シクエンスと結合させたキメラ遺伝子を製造することに成功しなかった。また 、（２）植物細胞内でこのような遺伝子が発現したということも明らかにされて いない。

カリフラワーモザイクヴイールス（ＣａＭＶ　）ＣａＭＶのＤＮＡの塩基配列は すべて明らかにされている。ガードナー等、１９８１；ホーン等、１９８２参照 。最も一般的な型で（ま、ＣａＭＶケゞツムの長さはおよそ８０００　ｂｐであ る。しかし、自然に生じた感染性のある突然変異体では、５００　ｂｐ短か（な っているものも発見されている。・・ウアース等、１９８１参照。

ＣａＭＶケ８ツム全体が、１本のｍ１ｕｕに転写される。このｍＲＮＡの沈降係 数はろ５Ｓである。ろ２　Ｓ　ｍＲＮＡのプロモーターは、Ｇａｐ　’ｌから左 周りに１ｋｂ離れた大きなインタージェニックレイジョンにある。（ギレイ等、 １９８２参照） ＣａＭＶは、少な（とも８個のたんばく質を生産すると考えられ℃いる。これら のたんぼ（質乞つ（り出て遺伝子は、遺伝子Ｉ〜■と名付げられている一遺伝子 ■は、沈降係数１９８のｍＲＮＡに転写される。１９８ｍＲＮＡは、Ｐｂ０と℃ ・うたんはく質に翻訳される。これは、ウィルス粒子内に含まれているたんばく 質である。１９　ｓ’　ｍＲＮＡは１９Ｓ７°ロモーターにより促進される。こ のプロモーターはＧａｐｌから左周りに２．５　ｋｂ離れたところに存在する。

発明の要約 この発明は植物細胞内で発現するキメラ遺伝子、それらの遺伝子を作り出す方法 に関するものである。

キメラ遺伝子にはプロモーター領域があり、このプロモーターの作用で植物細胞 のＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡに対応するｍＲＮＡ　ｆつくり出す。このよう なプロモーター領域の１つに、ノパリンシンサーゼ（ＮＯ８）プロモーター領域 というものがあり、これは普通Ａ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓというバクテリアのＴ１プラスミツド内にある。ＮＯ８ は、Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｅの細胞内にある時は一般に不活性であり、Ｔ １プラスミドが植物細胞内に入ると活性をもつようになる。これ以外に二個のプ ロモーターがカリフラワーモザイクヴイールス（ＣａＭＶ）からとり出された。

その他のプロモーターは、植物細胞内に存在する遺伝子から、あるいは、植物細 胞に感染するヴイールスからとり出される。

キメラ遺伝子にはｍＲＮＡの５′非翻訳領域の暗号となる塩基の配列も存在する 。この領域は、植物細胞内でｍＲＮＡの構造シクエンスの発現を可能にしたり増 加させたりすることができる。必要とされる５′非翻訳慣域は、ＮＯ８遺伝子、 植物ヴイールス遺伝子、あるいは植物細胞中に存在する遺伝子からとり出される 。

キメラ遺伝子には、望ましい構造シクエンスも含ま写されて、そのｍＥＮＡが翻 訳され、望みのポリペプチドを生成する、そういう塩基配列７指している。構造 シクエンスとプロモーター領域は、異種の生物からとり出した、その構造シクエ ンスは望みのペプチドなら何んでも、バクテリアのたんばく質でも哺乳動物のた んばく質でも、それに対応する暗号となる。構造遺伝子には、開始コドンと停止 コドンがある。また構造遺伝子には、翻訳に先だってｍＲＮＡからとり除かれた イントロンが存在することもある。

キメラ遺伝子は、ｍＲＮＡの６′非翻訳領域（ボリーアデニレインヨンシグナル を含む）の暗号となることもできる。この領域は、構造遺伝子を適切に発現させ る１こめ、普通植物細胞内で発現する遺伝子からとり出される。このような遺伝 子にはＮＯ８遺伝子、植物ヴイールス域伝子、植物細胞内の遺伝子がある。

この発明に用いられた方法については以下に述べられている、また図２のフロー チャートに要約されている。

適切に集められ、そして植物のケゞツムにそう人されれば、ここで発明されたキ メラ遺伝子は他物細胞内で発現し、望みのポリペプチド、例えば哺乳類のホルモ ン、植物に抗生物質や除草剤に対する抵抗性７与えるバクテリアの酵素などケ生 ＃、−ｆるであろう。

図の簡単な説明 図は模式的なものであり、正確な寸法にもとづいて描いたものではない。

図１、典型的な真核細胞の遺伝子を表わす。

図２、この発明のステップをフローチャートで表わしたもので、キメラＮ０８− ＮＰＴＩＩ−ＮＯ８遺伝子を例にして描かれている。

図６、Ｔ１プラスミド’Ｉ＜Ｈｉｎｄエエ■に組み込んで得られたＨｉｎｄＩＩ ニー２６の断片である。

図４、ＮＯＳプロモーター領域、ＮＯ８５’非翻訳領域、ＮＯ８構造シクエンス の最初の数個のコドンを持つＤＮＡの一部を表わしたものである。

図５、ＮＯＳプロモーター領域、完全な５′非翻訳憐域を得るために、ＤＮＡの 塩基配列乞ある地点で正確に切断する。

図６、ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ構造遺伝子部位を保持しているシラスミド、ｐＭＯＮ　１ ００１とｐＭＯＮ　４０を表わす。

図７．１）ＭＯＮ　５８を得るためＮＯＳプロモーター領域をプラスミドｐＭＯ Ｎ　４０に組み入れる。

図８、Ｍ−２と命名されているＭ１３誘導体の生成、このＭ−２は、ＮＯ８ろ′ 非翻訳領域とポリーＡシグナルを保持している。

図９、Ｎ０８−ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ　−ＮＯＳキメラ遺伝子乞組み立て、シラスミド ｐＭＯＮ　３８に組み入れ、プラスミドｐＭＯＮ７５と１）ＭＯＮ　７６乞生成 する。

図１０、Ｎ０８−ＮＰＴ　工Ｉ−ＮＯＳキメラ遺伝子をプラスミド１）ＭＯＮ　 ｉ　２０に組み入れ、プラスミドｐＭＯＮ　１２８と４ ｐＭＯＮ　１２９を生成する。

図１１、ＮＰＴ　Ｉ遺伝子を保持しているプラスミドｐＭＯＮ　６６の生成。

図１２、キメラＮＯ８−ＮＰＴ　ＩＩシクエンスを保持しているプラスミドｐＭ ＯＮ　７３の生成。

図１６、キメラＮＯ８−ＮＰＴ　Ｉ　シクエンス乞保持しているプラスミド１） ＭＯＮ　７８の生成。

図１４、キメラＮＯ８−ＮＰＴ　Ｉ　−ＮＯ８Ｏ８遺伝子持保持プラスミド１） ＭＯＮ　１０６とｐＭＯＮ　１０７の生成。

図１５、キメラＮＯ８−ＮＰＴ　Ｉ　−ＮＯ８遺伝子ｉｐＭＯＮ１２０に組み入 れ、シラスミドｐＭＯＮ　１３０とｐＭＯＮ１６１を生成する。

図１６、大豆たんば＜　（’５ｂＳｓ　）プロモーターを保持しているＤＮＡ断 片の構造、。

図１７．５ｂｓｓプロモーター乞保持しているプラスミドｐＭＯＮ　１２１の生 成。

図１８、キメラ５ｂｓｓ　−ＮＰＴ　ｌｌ−ＮＯｓ遺伝子ＹＫ：ｐＭＯＮ１２０ に組み入れシラスミドｐＭＯＮ　１４１とｐＭＯＮ　１４２乞生成する。

図１９、ウシ成長ホルモンの構造遺伝子領域と、ＮＯ８３’領域乞保持している 、プラスミドｐＭＯＮ　１０８の生成。

図２０、選択的な切断面にかこまれているＢＱＨ−ＮＯ８を保持しているシラス ミドＮ　２５−　ＢＧＨの生成。

図２１、キメラ５ｂｓｓ　−ＢＧＨ−ＮＯ８遺伝子乞１）ＭＯＮ　１２０に組み 入れデフ。ＸミドｐＭＯＮ　１４７とｐＭＯＮ　１４８　Ｙ生成する。

図２２、キメラＮＯ８−ＢＧＨ−奎＋０８遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ 　１　’４９の生成。

図２６、ＥＰＳＰシンサーゼを生産する構造遺伝子領域を保持しているプラスミ ドｐＭｏＮ８の生成。

図２４、開始コドンの近くに切断面のあるＥＰｓＰシンサーゼ構造遺伝子領域ゲ 保持するプラスミドｐＭＯＮ２５の生成。

図２５、ＥＰＳＰシンサーゼとＮＯ８３’領域乞持ったキメラシクエンスを保持 するプラスミドｐＭＯＮ　１４６の生成。

図２６、キメラＮＯ８−ＥＰＳＰ　−ＮＯ８遺伝子ｆ　ｐＭＯＮ　１２０に組み 入れｐＭＯＮ　１５６を得る。

図２７、キメラ５ｂｓｓ−ＫＰＳＰ　ＮＯ８遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯ Ｎ　１５４の生成。

図２８、Ｃａ）ＡＶ　１９　Ｓプｏ　モーｐ　−Ｙ保持ｆ　ルｆ　ラスミドｐＭ ＯＮ　９３の構造とその生成。

図２９、キメラＣａＭＶ　（１９ｓ　）　−ＮＦＴ−ＮＯ８遺伝子を保持するプ ラスミドｐＭＯＮ　１５６の構造とその生成。

図６０、ＮＰＴ遺伝遺伝子分部分的持するプラスミドｐＭＯＮ　１１０の構造と その生成。

図６１、ＮＰＴ−ＮＯ８遺伝＋７部分的に保持するプラスミドｐＭＯＮ　１３２ の構造とその生成。

図６２、キメラＣａＭＶ　（ｉ　９’Ｓ　）−ＮＰＴ−ＮＯ８Ｏ８遺伝子持保持 プラスミドｐＭＯＮ　１５５の構造とその生成。

図３３、ＣａＭＶ　３２　Ｓプロモーターを保持するプラスミドｐＤＭＯＮ　８ １の構造とその生成。

図６４、ＣａＭＶ　３２　Ｓプロモーターを保持するプラスミドｐＭＯＮ　１２ ５の構造と生成。

図６５、ＣａＭＶ　３２　Ｓプロモーター馨保持するプラスミドｐＭＯＮ　１７ ２の構造と生成。

図６６、ＣａＭＶ　３２Ｂプロモーターを保持するファージＭ１２の構造と生成 。

図６７、キメラＣａＭＶ　（３２Ｓ　）　−ＮＰＴ　−ＮＯ８遺伝子を保持する プラスミドｐＭＯＮ　１８３トルＭＯＮ　１８４　ノ構造この発明の１つの提起 された具体化において、キメラ遺伝子は、次の要素を含み、生起される。

１、　プロモータ鎖酸およびツバリン合成物（Ｎ０Ｉ９　、）遺伝子から誘導さ れる５′−非翻訳領域；２、　ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼＩＩ （ＮＰＴＩＩあるいはＮＰＴ　ＩＩ　）遺伝子から誘導された構成シーフェンス ； ３、　ポリアデニル信号を含み、ＮＯ８遺伝子から誘導される３′−非翻訳領域 。

このキメラ遺伝子は、この中でＮＯ８−ＮＰＴＩニーＮＯ８遺伝子とみなされる が、集められているいろな植物細胞に挿入され、カナマイシンなどのアミノグリ コシド抗生物質に抵抗するためにそれをひきおこす。

このキメラ遺伝子を集合させる方法は図２のフローチャートに要約されているが 、詳細は以下および例に記述されている。この方法のステップを理解することに おいて読み手を助けるために、ＮＯ８−ＮＰＴ　ＩＩ　−ＮＯＳキメラ遺伝子内 に含まれた多（のプラスミドおよび分節は、図２のカッコ内に引用される。しか しながら、図２の方法は広く多様な他のプラスミドおよび分節に適切である。読 み手のさらなる助けとして図２に示されたステップは呼ひ出し番号４２以下を付 されている。

この呼び出し番号は次の解説に引用される。この発明の技術およびＤＮＡシーク エンスは広く多様な植物の変より感染される植物のどれでもＹ％−む。

ＮＯＳプロモーり領域および５′−非翻訳領域出願者は、ツバリン合成物（ＮＯ ８）プロモータ領域を得、利用することを決め、異種遺伝子の表示ンど支［・乙 づる。ＮＯＳはｐＴｉＴ　３７のような、ある型の７０ラスミドに正しく運ばれ る、５ｃｉａｋｙ他、１９７８゜ＮＯＳプロモータはＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ　ＩＹ＋１１１胞の中にある間正しく不活性化する。完全なＮＯ８遺伝子は プロモータおよび蛋白暗号化シーフェンスを含み、その中にＴ１シラスミドのＴ −ＤＮＡ部があり、それは植物が感染して根こぷ腫瘍を形成するとき、植物９ツ 宋巳体に挿入される。

８ １度植物細胞の内側にＮＯＳプロモータ領域が植物細胞の中のＲＮＡポリメラー ゼ乞注ぎ、ＮＯ８Ｏ８蛋白暗号化シーフェンス１ｍＲＮＡ写する。そのｍＲＮＡ は１玩゛、・てＮＯ８酵素に翻訳される。

プロモータ領域（結合領域２、中間領域４、転写開始シーフェンス６、中間領域 ８として図１に示−ｆ）の異なる部分間の境界およびプロモータ領域と５′−非 翻訳領域間の境界は十分にはわかっていない。出願者は完全なプロモータ領域お よび５′−非翻訳領域をＮＯ８］賞伝子から利用することを決ボする。そのＮＯ ３遺伝子は植物細胞内に表示されることで知られて℃・る。しかしながら１ない しそれ以」二のこのシーフェンスが長さにおいての修正、あるいは他のシーフェ ンスによる置換などの多くの方法において緩和されることは、全く可能である。

プロモータ領域および５′−非翻訳領域内の、そのような緩和は、バクテリア細 胞（参照例、Ｒｏｂｅｒｔｓ他、１９７９）および哺乳類細胞（参照例、Ｍｃｋ ｎｉｇｈｔ、１９８２）において研究されている。この発明により教えられた利 用方法論で、植物細胞内遺伝子の表示上プロモータ領域および５′−非翻訳領域 緩和の効果を研究することは現在可能である。そのような緩和を用℃・て、植物 細胞内遺伝子の表示の増加を可能にする。そのような緩和は、この発明のキメラ 遺伝子に行なわれるとき、この発明の範囲の中にある。

ツバリン型腫瘍誘発プラスミドは、ｐＴｉＴろ７と命名されるが、それは基本的 手順でＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの菌株から分離される（　Ｃｕｒｒｉｅｒ とＮｅ５ｔｅｒ、１９７６）。

それは多数の分節を作るエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉと共に分解され る。これらの沙節はゲル上の大きさによって分離され、分節の１つは離さ、ｒシ こ：ｒ″ルかも移動される１、この分節はＴ１プラスミドから２３番目の最大分 節であるため、ＨｉｎｄＩＩ　−２３と命名される；それはおよそ、大きさでろ ４００ベースペア（ｂｐ　）であり、あるいは６．４キロベース（ｋｂ　）とし てみなされる。他者の仕事（参照例、Ｈｅｒｎａ１８ｔｅ８ｎＳ他、１９８０） からＨｉｎｄＩ　Ｉ　２ろ分節は完全なＮＯ８’遺伝子を含み、それがプロモー タ領域、５′−非翻訳領域、開始コドン・終了コドン分有する構成シーフェンス 、３′−非翻訳領Ｉ戎を含むことが知られている。ＨｉｎｄＩＩＩ−２６分節は 図６で示される。

多（の分裂および一連の実験とから、ＨｉｎｄＩＩＩ　−２３分節が他り〕エン ドヌクレアーゼ、８ａｕ３ａにより分解可能であること、分節の大トサ）ヱ約６ ５０１）１）にすることが決定される。そしてそれは完全なＮＯＳゾロモータ領 域、ら′−非翻訳領域、Ｎ０８ｍ成シークエンスのはじめの数コドン７含む。こ の分節は続けられ、塩基シーフェンスは、図４に表わされる。ＮＯ８Ｏ８構成シ ーフェンス始コドン（ＡＴＧ　）は、５５０　ｂｐ分節内のベースペア６０１で 始める。出願者はベースペア５ＱＱおゾロモータ領域および完全５′−非翻訳領 域を含む、長さ約ろＯＯベースペアの分節乞もって、しかし翻訳塩基をもってで はなく、それらを用意する。３５０　ｂｐ分節を、精密に正しい位置で分割する ため、出願者はＳＩＡと命名されたＭ１３クローンを得、以下に記される手順を 利用する。

ＳＩＡクローンを生起するためにＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙの Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｂｅｖａｎ博士は、ろ５０　ｂｐＳａｕ　５　ａ分節’４　Ｄ ＮＡ単鎖に転換する。これはウィルスそのファージは生活環における二重鎖（ｄ ８）および単鎖（ａｓ　）両段階を経る（　Ｍｅｓｓｉｎｇ　仲、１９８１）、 ｄｓろ５０１）ｐ分節はＭ１３ｍｐ２の二重鎖複製形成りＮＡに挿入され、それ はＢａｍＨＪと共に分割されている。２つの分節は結紮され、Ｅ、ｃｏｌｉＪ胞 乞感染させる。３５０　ｂｐを含むｄｓ　ＤＮＡは続いて複製された分節を挿入 し、■鎖（ウィルス性鎖）はＭ１３ウィルス性蛋白殻蛋白によりまわりを包まれ る。ＳＩＡと命名された１クローンにおいてろ５０ｂｐ分節の部位はＮＯ８遺伝 子の反知覚鎖（ｍＲＮＡと同じシーフェンスを含む）がウィルス性鎖で運搬され るということである。感染された細胞から解放されたウィルス性粒子は分離され 、出願者に提供される。

単鎖Ｓ工Ａ　ＤＮＡは反知覚３５０　ｂｌ）分節をＮＯＳプロモータ領域と共に 含み、ウィルス性粒子から分離され反復される。１４−　ｍｅｒオリコゞヌクレ オチドゾライマーは出版された手順（ＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ 、１９８１、Ａｄａｍｓ他による修正、１９８２）を用いて合成される。

この１４ｍａｒは図４に示されるようにろ５０　ｂｐ分節の塩基２８７から６０ 口を補足するように配される。

合成プライマーの５′終了は３２ｐで放射能性分類される；これは星印で図中に 表わす。

プライマーのコピーは３５０　ｂｐ分節反知覚鎖を含む単鎖Ｓ工Ａ　ＤＮＡのコ ピーと共に混合される。プライマーは図５の１番上に示されるようにＳＩＡ　Ｄ ＮＡのめられる領域を焼還する。この出現後、Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラー ゼは支配された多くの未分類デオキシヌクレオシドシリン酸塩（ａＮＴＰ’　ｓ 　）、Ａ、Ｔ、Ｃ，、Ｇが加えられる。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼはヌクレオチ ドをプライマーの３′（未分類）終了に、５′（分類）終了にでなく、加えられ る。結果は、図５に示されるように単鎖ＤＮＡの円形ループてあり、その１部は ＤＮＡの第２鎖により合わせられる。第２鎖の５′終了は５ａｕ３ａ挿入のＮｏ ろｏｏ対塩基に位置する。

部分的二重鎖ＤＮＡはその後筒ろエンドヌクレア−セゞＨａｅＩＩＩにより分解 される。ＨａｅＩＩＩはＤＮＡ単鎖と二重鎖の両方を分制し得る。Ｈａｅ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ分割部位はろ５０　ｂｐ挿入の外側の数カ所に存在することが知られて（ ・る。しかしろ５　Ｄ　ｂｐ挿入の内側には何も在しなし・０これはつの３′突 出を生起する。

ＨａｅＩＩＩ分節混合は、Ｔ、Ｉ）ＮＡポリメラーゼおよび未分類ｄＮＴＰ’ｓ で処理された。これはＤＮＡ　の単錨部分の原因となり、Ｓａｕろａ挿入の＃６ ０１塩基に最も近いＨａｅＩＩＩ分割部位まで、分節から移動するために広げら れる。この方法でＡＴＧ開始コドンは＃ろ０ロベースペアかう移動し、およそ長 さ５５０　ｂｐのｂｌｕｎｔ終了二重鎖を離れる。

より分解され、それは５５０　ｂｐ分節をＮＯＳノロモータ領域の外側の単部位 で分割される。それから、分節はケゞル上の大きさにより離され、放射能性分類 分節は分離される。この分節は完全なＮＯ８７″′ロモ−タ領域および５′−非 翻訳領域を含む。

５′−・・・ＣＴＧＣＡ ・・ＧＡＣＧＴ　のシーフェンスをもつ１鈍化Ｇ−のシーフェンスをもつ１凝集 性 終了を（ＥｃｏＲＩ　部位に）有する。

短鎖の長さは約３０８　ｂｐである。

前述のステップはステップ４２．４４．４６として図２にあられされている。

この分節は図７に示されるように１）ＭＯＮ　４０　（以下に記述）に挿入され ｐＭＯＮ　５３を得る、。

生起 バクテリアｔｒａｎｅｐｏｓｏｎはＴｎ　５と命名されているが、それは完全な ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ遺伝子を含むことが知られ、プロモータ領域および構成シーフェ ンス、３′−非翻訳領域を含む。ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ酵素は、カナマイシン、ネオマ イシン、０４１８などの、あるアミノグリコシド抗生物質を不活性化する；参照 ＪｉｍｅｎｅｚとＤａｖｉｓ、１９８０ｃこの遺伝子は１．３ｋｂ分節の中に含 まれ、ファージラムダｂｂｋａｎ　−ｒ　ＤＮＡ　（Ｄ、Ｂｅｒｇ他、１９７５ ）Ｙ２エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ　がら分解することに よって得る。この分節は公共研究所シラスミド、ｐＢＲ６２７に挿入され、Ｈｉ ｎｄＴ　ＩＩおよびＢａｍＨＩ　により分解されている。図６に示されるように 起因プラスミドはｐＭＯＮ　１　ｑ　０１と命名され、約４．７　ｋｂである。

ＮＰＴＩＩ構成シークエンスを運ぶＤＮＡ分節の大きさを縮小する１こめ、出願 者は、次の方法でＩ）ＭＯＮ　Ｉ　Ｄ　０１プラスミドから約５００　ｂｐはど 削除する。第１にｐＭＯＮ　１００１をＮＰＴＩＩ遺伝子の外側にある独自のＳ ｍａ１限定部位で分解する。次に、１０ｍｅｒ合成ヌクレオチド連鎖 ５’ＣＣ（）ＧＡＴＣＣＧＧ ＧＧＣＣＴＡ（）ＧＣＣを Ｓｍａ１分割部位に挿入する。これはＳｍａ　１分割部位を除去し、それ５　Ｂ ａｍＨＩ分割部位で置換する。第２のＢａｍＨＩ分割部位は丁でにあり、新しい 分割部位がら約５００ｂｐである。出願者はＢａｍＨＩがらプラスミドを分解し 、４．２　ｋ’ｂ分節から５０Ｑ　ｂｐ分節を分離し、４．２　ｋｂ分節を円形 化する。起因シラスミドは、Ｅ、ｃＯｌｉに挿入され、これはそれからアンピシ リン、カナマイシンに抵抗性があるとして選択される１、Ｅ、　ｃｏｌｌのクロ ーンコロニーは選択され、図６に示されるように、これらの細胞はｐＭＯＮ　４ 　Ｑと命名されるプラスミドを含んでいる。

前述したステップは図２にステノア′４８．５０としてあられされている。

出願人はｐＭＯＮ　４　ＱからＮＰＴＩＩプロモーターを削除し、それ２第７図 に示すごと（数の方法で前記のごときＮＯＳプロモーター断片−と置き換−えた 。

あらかじめの開裂と配列決定実験は（ＲａｏおよびＲｏｇｅｒｓ、１９７９、Ａ ｕｅｒｓｗａｌｄ他、１９８　Ｄ　）　ＢｇｌＩＩ開裂部位がプロモーター領域 と構造配列との間のＮＰＴ　ＩＩ遺伝子に存在することを示した。プラスミドｐ ＭＯＮ　４０はＢｇｌＩＩで消化した。コーヘーシブ末端を次に開裂プラスミド アダしノウボリメラーゼおよび４つのｄＮＴＰ’　ｓと混合する−ことにより満 たし、次のプラント末端を得た。

５’　−ＡＧＡＴＣＧＡＴＣＴ− −ＴＣＴＡＧ　ＣＴＡＧＡ−５’ ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ’ｓ７除き、次いで開裂プラスミドｆＥｃｏＲＩで 消化した。ＮＰＴＩＩプロモーター領域乞含むより小さい断片２除き、１個のＥ ｃＯＲＩ末端と１個のプラント末端２有する大きな断片なのこす。この大きな断 片を前記の、第５図に示したＮＯＳプロモーターを含む３０８　ｂｌ）断片と混 合した。この断片’ｆ　ＩＪケゞ−トし、ｌＵ、ｃｏｌｉに挿入した。Ｅ、Ｃ０ １ｉクローンをアンピシリン耐性に対して選択した。ＮＰＴ　Ｉ　Ｉプロモータ ー領域（細菌プロモーター）のＮＯＳプロモーター領域（これは植物細胞におい てのみ活性であると信じられる）での置換えはＮＰＴ　Ｉ　Ｉ構造配列”＜Ｅ、 ｃｏｌｉ中で不活性ならしめた。３６個のカナマイシン感受性クローンからプラ スミドを得た。１個のクローンからのプラスミドｆ　ｐＭＯＮ　５８と命名し、 以下の工程に用いた。

次の工程を第２図に工８５２および５４として表わす。

プラスミドｐＭＯＮ　５８を消化してＮＯＳプロモーター領域、ＮＯ８５’非翻 訳領域およびＮＰＴＩＩ構造配列を含む１．ろｋｂのＥｃＯＲＩ　−ＢａｍＨＩ 断片を得る。この工程は工程５６として第２図に示す。

ＮＯ８３’配列乞ＮＰＴＩＩ遺伝子に挿入「背景技術」で既述したように、真核 遺伝子における３′未翻訳領域の機能は十分理解されていない。しかし、少なく とも１つの１要な配列、ポリ−アゾニールシグナル２含むと考えられている。

本発明者の推測によれば、細菌性６′未翻訳領域を有する遺伝子は、植物に発現 されることが知られている、ＮＯ８の如き遺伝子から６′未翻訳領域を有する同 一遺伝子として植物細胞にて有効に発現されなかったのであろう。したがって、 本発明者は既に存在するＮＰＴＩＩ３’未翻訳領域以外に、キメラ遺伝子にＮＯ ８３’未翻訳領域乞加えることを決定した。刃１ｊ法として、本明細書で記述す る方法を使って、ＮＰＴＩＩ又はその他の存在する６′未翻訳領域を除きかつ植 物細胞にて溌現されることが知られている、目的の６′未翻訳領域でそれを置換 することが可能である。各種型の６′未翻訳領域（例えばオクトピン型又はアグ ロ２ン型Ｔ１シラスミドがらの６′領域、又は植物細胞中に通常存在する遺伝子 からの６′領域）は任意の特定のキメラ遺伝子、任意の特定の植物細胞に使用す るのに適して℃・るか又は望ましく、本発明方法２使って通常の実験により、当 業者により測定することができる。

植物細胞忙挿入されるべき構造配列に当然に続＜６′未翻訳領域はその型の植物 細胞にてその構造配列の有効な発現を促進するかどうかは、当業者は常法の実験 で測定することができろ。もしそうなら、異なる６′未翻訳領域乞キメラ遺伝子 に挿入するのに要する数工程は、本発明方法２行なうために必要としないであろ う。

前述した如く、ｐＭＯＮ　５８から、ＮＰＴ　Ｉ　Ｉの構造的シーフェンスに結 合する１こめに適当なＮＯ８６’の翻訳されていない領域を含むＤＮＡフラグメ ントを得るために、本発明者は、第３図に示されたＴ１プラスミドからの６．４ 　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ　−２３フラグメントを利用した。この３．４　ｋｂフ ラグメン）Ｙ分離し、ＢａｍＨＩ　Ｙ用いてダイジェストして、ＮＯ８の構造的 シーフェンス〔ストップコード７　（５ｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ　）　ン含んでいる 〕の６′部分およびＮＯ８遺伝子の翻訳されていない６′部分（ポリ−アゾニレ −ジョンシグナルを含んでいる）を得た。この１．１　ｋｂフラグメントＹ、Ｈ ４ＨｄＩＩＩおよびＢａ　ｍＨ工でダイジェストされたｐＢＲ３２７中に入れた 、この結果得られたシラスミドを、第８図に示した如（ｐＭＯＮ　４２として示 した。

シラスミドｐＭＯＮ　４２　’ｌ　ＢａｍＨＩおよびＲｓａ　Ｉ　でダイジェス トし、所望の翻訳されていないＮＯ８３’領域を含む７２０　ｂｌ）フラグメン トラケル中で精製した。この７２０　ｂｐフラグメントを、他の内ヌクレアーゼ 、ＭｂＯＩでダイジェストし、次いでＥ、Ｃ０１ｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■の大 きなフラグメントで処理した。これにより、ボＩＪ−Ａシグナルを含有する翻訳 されていないＮＯＥ！　５’領域の大きな部分を含む、ＭｂＯＩプラント床部（ ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｓ　）　’ＩＩ有する２　６０　ｂｐフラグメントを得た。

前記操作ン第２図中に工程５８によって示した。しかし、種々な変法ン用いるこ とができることは容易に理解されるであろう。例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ　２３フ ラグメント’４．　Ｍｂｏ’Ｉで直接ダイジェストし、翻訳されていないＮＯ８ ろ′領域乞有する所望の２６０　ｂｐフラグメントを得ることが可能である。

キメラ遺伝子のアセンブリー乞完成させるために、（翻訳されていないＮＯ８ろ ′領域を含んでいた）２６０ｂｐＭｂｏＩ　フラグメント乞、ＣＮＯＳプロモー ター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ　）領域および翻訳されていない５′領域およびＮＰＴ 　ＩＩ構構造的シークエクス含んゝでい１こ）　ｐＭＯＮ５８から１．３　ｋｂ 　ＥｃｏＲｌ、−ＢａｍＨＩフラグメントに、（（ることか必要であった。この くくりを容易にしかつフラグメントの配向を調節するために、本発明者は、２６ ０ｂｐフラグメントのＭｂｏ　Ｉ床部Ｔ（ＢａｍＨＩ（フラグメントの５′末部 ）およびＥｃｏＲｌ（フラグメントの６′末部）に変換することに決定した。こ の工程ン実施するために、本発明者は次の方法を使用した。

前記２６０　ｂｐ　Ｍｂｏ　ｒ　フラグメントは、その末端がフレノウ・ポリメ ラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　）によって粗い状態に変更され ており、Ｍ　ｉ　”）　ｍｐ　８ＤＮＡのＳｍａ　Ｉ切断部位に挿入されている 。前記Ｓｍａ　Ｉ切断部位は第８図に示されているように、Ｍ　ｉろｍｐ　３　 ＤＮＡの中に存在する他の色々な切断部位に囲まれている。

Ｍｂｏ　Ｉ　フラグメントは、粗い状態に切断されたＳｍａ　Ｉ末端に、どちら の方向からでも挿入することが可能である。各種の異なるクローンにおけるＭｂ ｏＩ７ラグメントのオリエンテーション（０ｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　）はＭｂｏ Ｉフラグメントの中に不整的（ａｓｓｙｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ　）に存在するＨ ｉｎｆ工　切断部位を用いて検出された。前記Ｍ　１３　ｍｐ　８　ＤＮＡの中 でＫｃｏＲＩ切断部位近（に存在するＮＯ８３’非翻訳領域の６′末端を有する クローンが選ばれた。このクローンは第８図に示されたようにＭ−２クローンと 命名された。

前記Ｍ−２クローンから得られる複製型の（二重らせん）　ＤＮＡはＥｃｏＲＩ およびＢａｍＨＩによって分解すれ、２８Ｄｂｐフラグメントが分離され１こ。

いっぽう、ｐＭＯＮ　５８プラスミドがＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨＩによって分 解され、１６０Ｑ　ｂｐフラグメントが分離された。

前記２個のフラグメンｌ−’Ｙ結合して、第９図に示されるようにＦｉｃｏＲ工 末端を有するＮ０８−ＮＰＴ　ＩＩ　−ＮＯＳキメラ遺伝子の組立Ｚ完了した。

前記２個のフラグメントン結合をコントロールする種々の方法がある。例えば、 ２個のＫｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントは相互にＤＮＡ　ＩＪガーゼを用 いて結合させ、ＥｃｏＲＩを切断することが可能である。Ｋｃ’ＯＲＩを不活性 化させた後、子牛アルカリ・ホスファターゼ［：　ｃａｌｆａ＋、ｋａｌｉｎｅ 　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（ＣＡＰ　）　〕で処理され１コＥｃｏＲＩ末端を 有てろベクター分子を前述の混合物中に添加してもよい。前記混合物中のフラグ メントは、種りのオリエンテーションに結合させることができる。前述のフ０ラ スミド混合物は大腸Ｋｌ　（Ｅ、　ｃｏｄ、　）を形質変換させるために用いら れ、所望のオリエンテーションを有するプラスミドを含む細胞は、下記に説明さ れるように選択され、分別された。

ｐＭＯＮろ８と命名されたプラスミドは、前記のＨｉｎｄＩＩＩ　−２３７ラグ メント（ＴｉプラスミドｐＴｉＴ　３７から得られたもの）を、前記のプラスミ ドｐＢＥろ２７のＨ１ｎαＩＩＩ切断部位に挿入することにより創製した。プラ スミドｐＭＯＮ　３８、大腸菌（Ｅ、　Ｃｔ）’Ｅｌユ）で説明され１こアム２ シリン耐性遺伝子である１、独特なＥｃｏＲＩ部位を含んでいろ。プラスミドｐ ＭＯＮろ８はＥｃｏＲｌで切断され、それ自身が再結合することを防ＩＥ″１− るためにアルカリ・ホスファターゼで処理される。〔米国特許第４＋２６４，７ ３１　（５ｈｉｎｅ、１９８１）参照〕。得られたフラグメントは１）ＭＯＮ　 ５８から得られｆ二重ろ口Ｏｂ′ｒ：。

ＮＯ８ＮＰＴ　丁Ｉならびに、前述のバラグラにて説明されｆこように結合さ− Ｂ、ＥｃｏＲＩ−切断（−て得られたＭ−２から製造された２　８　Ｑ　ｂｐ　 ＮＯＳフラグメントと混合ざ数個のクローンが選別され、挿入され１こキメラ遺 伝子のオリエンテーションは、切断実騨により評価した。

相反するオリエンテーションを挿入するＮＯ８−ＮＰＴＩＩ−ＮＯ８を運ぶプラ スミド２有する２個のクローンが選別され、それぞｆｉ　ｐＭＯＮ　７５および ｐＭＯＮ　７６と館名された。キメラ遺伝子はｐＭＯＮ　７５またはｐＭＯＮ　 ７６のいずれか一方をＫｃｏＲＩで分解し、１５８０．ｂｐフラグメントＹ精製 することによって分離することが可能である。

上記方法はステップ６０により第２図上に表わされる。

これはＮＯ８−ＮＰＴ　ＩＩ　−ＮＯＳキメラ遺伝子の議論を完成する。この遺 伝子の発生についての追加の情報は実施例において提供されるこのキメラ遺伝子 のコぎ−はプラスミドｐＭＯＮ１２８に含有される；それはＥｃｏＲＩ　Ｙ用い てのダイジェスシヨンによりｐＭＯＮ　１２８がら除去されることができる。ｐ ＭＯＮ　１２８’に：含有するＥ。

ｃｏｌｉのカルチャーはアメリカンタイプコレクションで寄託された；このカル チャーはアクセツション番号ろ９２６４がわりあてられた。

このキメラ遺伝子の利用性を与えるために、出願人はそれを植物細胞に挿入した 。ＮＰＴＩＩ構造的配列はこれｔ起こす、植物細胞において表わされそして植物 細胞に対して通常前であるカナマイシンの濃度に対する抵抗性を獲得するそれら の子孫において表わされる。

本発明の別の好ましい態様において ＋１１　ＮＯＳプロモーター領域及び５′非翻訳領域、（２１ＮＰＴ　Ｉのコー ドである構造的配列、及び（３）ＮＯ８３′非翻訳領域 χ含むキメラ遺伝子が発生された。

ＮＰＴ　Ｉ及びＮＰＴ　ＩＩはそれらのアミノ酸配列及び構造的特異性において 主要な差異を有する異なった且つ区別される酵素である。例えば、イー・ベック 等１９８２乞参照せよ。種々のタイプの植物細胞におけるこれらの２種の酵素の 相対的安定性及び活性はまだ十分に理解され℃いないぞしてＮＰＴ　Ｉは成るタ イプの実験及び植物の形質転換において使用するためにＮＰＴ　ＩＩより好まし いかもしれない。

完全ＮＰＴ　Ｉ　遺伝子を含む１２００ｂｐフラグメントはｐＡＣＹＣ１７７、 （チャン及びコーエン（Ｃｈａｎｇ　ａｎｄＣｏｈｅｎ　）　１９７８　）、Ｙ エンドヌクレアーゼＡｖａ　ＩＩで分解することによって得られた。ＡＶａＩＩ の末端をフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）ポリメラーゼで平滑末端に変換しそして合 成リンカ−（５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　１ｉｎｋｅｒ　）　Ｙ用いてＢａｍＨ］末端 に変換した。このフラグメントｖ図−１１に示したように、ｐＢＲ５２７がも得 られたプラスミド中の唯一のＢａｍＨＩサイ）　（５ｉｔｅ　）中に挿入した。

得られたプラスミドをｐＭＯＮ　６６と命名した。

プラスミドＩ）ＭＯＮ　５７　（図−１１で示したｐＢＲ３２７のプリージョン （ｄｅｌｅｔｉｏｎ　）誘導体）をＡｖａ　ＩＩで分解した。ｐＭＯＮ　５７の ２２５ｂｐフラグメントｖシラスミドＰＵＣ８（フイエイラ及びメリック（Ｖｉ ｅｉｒａ　ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ　）　１９８２　）から得た２　２５　ｂｐ　 Ａｖａ■Ｉフラグメント同族体で置き換え、ＰｓｔＩ開裂部位をもたないｐＭＯ Ｎ　５７の誘導体乞得た。このプラスミドをｐＭＯＮ６ ６７と命名した。

プラスミドｐＭＯＮ　５８　（前述及び図−７に示した））ｉ５ＥｃｏＲ工及び ＢａｍＨＩで分解し、ＮＯＳプロモーターとＮＰＩＩＩ構造配列を有する１ろｏ 　ｏ　ｂｐフラグメントを得た。このフラグメン）　５　ＫｃｏＲＩ及びＢａｍ ＨＩで分解されたｐＭＯＮ　６７中に挿入した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ 　７３と命名し図−１２に示した。

ｐＭＯＮ　７ろ”＜ＰｓｔＩ　とＢａｍＨＩで分解し、ＮＯＳプロモーター領域 と５′非翻訳領域を含む２．４　ｋｂフラグメントを分離した。プラスミドｐＭ ＯＮ　６６　（図−１１に示し１コ）をＸｈｏ　Ｉ及びＢａｍＨＩで分解し、Ｎ ＰＴＩの構造配列を含む９５０　ｂｐフラグメン）Ｙ得た。このフラグメントは 構造配列の５′末端で約６０のヌクレオチドを欠落していた。欠落塩基を含有し 、適切なＰｅｔＩ　及びＸｈｏ　Ｉ末端乞有する合成リンカ−を作成し１こ。ｐ ＭＯＮ７７フラグメント、ｐＭＯＮ　ｔ５　ｔ５フラグノント及び合成リンカ− を−緒に結合せしめて図−１６に示すプラスミドｐＭＯＮ　７８　’＆得た。こ のプラスミドはＮＯＳプロモーター領域と、ＮＰＴＩ構造配列と結合している５ ′非翻訳領域を含有する。ＡＴＧ開始コドンはＮＯ８構造配列のＡＴＧ開始コド ンが占める位置と同一位置であった。

プラスミドｐＭＯＮ　７３　Ｙ　ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでダイジェストシ 、キメラＮ０８−ＮＰＴ　Ｉ　ｉＪ域を有する１３００ｂｐフラグメントを製出 し１こ。Ｍ−２クローン（前述しかつ第９図に、示した）からの二Ｍ　鎖ＤＮＡ ’ｔ　ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでダイジェストし、ポリ−アゾニレ−ジョン シグナルを有しかつＮＯ８ろ′非翻訳領域χ有する２８ｏｂｐフラグメントを製 出した。上部の二種のフラグメントな共にリグイトし、ＲｃｏＲＩでダイジェス トされた（前述の）プラスミドｐＭＯＮ　３８中に入れられたＮＯ８−ＮＰＴニ ー　ＮＯＳキメラ遺伝子乞造った。この結果得られた、反対の配向７有するキメ ラ遺伝子のインサー）Ｙ有する二種のプラスミドを第１４図中にＩｐＭＯＮ　１ ０６および１）ＭＯＮ　１０７として示した。

シラスミドＩ）ＭＯＮ　１０６またはｐＭＯＮ　１０７のいずれかｑ　ＥｃｏＲ Ｉで消化し、キメラＮ０３−ＮＰＴ　Ｉ　−ＮＯ８遺伝子を含む１．６　ｋｂ断 片′なつくる。この断片を、ＥｃｏＲＩで消化しそしてアルカリホスファターゼ で処理したプラスミドｐＭＯＮ　１２０に挿入する。得られ１こプラスミドは反 対方向をもつ挿入物乞有し、第１５図に示すごと（ｐＭＯＮ　１５０及びｐＭＯ Ｎ　１３１と命名した。

Ｎ０８−ＮＰＴＩ−ＮＯＳキメラ遺伝子を植物細胞に挿入し１こ。これはカナマ イシンに対する耐性を獲得した。これは植物細胞におけるキメラ遺伝子の発現を 示す。

本発明の別の望ましい具体例として、（１）大豆中に天然に存在する遺伝子から 得られるプロモーター領域及び５′非翻訳領域〔この遺伝子はりブロース−１， ５−ピスーホスフエ−トカルポキシラーゼの小さなサブユニット（５ｂｓｓ、大 豆の小さなサブユニットとして）４５ をコードする〕、（２１ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ　７コードする構造配列および（５１Ｎ Ｏ８３′非翻訳領域からなるキメラ遺伝子ビ・つくった。

５ｂｓｓ遺伝子は光合成炭素固定に包含される大豆の葉における蛋白質について コードする。この５ｂｓｓ蛋白は大豆の葉において、最も豊富な蛋白質である（ 全体の葉蛋白質の約１０％にのぼる）ので、ｅｂｓｓプロモーター領域は多産の 転写乞惹起する。

大豆のｒノ人中のｓ　ｂｓｓ蛋白質をコードするほぼ六つの遺伝子があると信じ られている。５ｂｓｓ遺伝子フアミリーのメンバーの一つ、ＳＲ８１（高度に大 豆の葉中に転写されて（・る）はクローンされかつ特徴づけられた。プロモータ ー領域５′非翻訳領域および構造的配列の部分はプラスミドｐＢＲ３２５（Ｂｏ ｌｉｖｅｒ、１９７８）のＥｃｏＲエザイト中にサブクローンされた２、　１　 ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント上に含有される。得られたプラスミドｐｓＲ８２ ，１は米国ジョーシア州アゼンス所在ジョーシア大学のＲ，Ｂ、　Ｍｅａｇｈｅ ｒ博士からモンサンド社に贈呈され１こ。ｐｓＲＥｌ　２．１からの２．１　ｋ ｂ　ＥＣ０ＲＩフラグノントは第１６図に示されている。

プラスミドｐＳＲ８２，１はダムに、ｃｏｌｉ細胞から造られ、８００　ｂｐフ ラグメントを得るためにＭｂＯＩ　４以てクリープされた。このフラグメントは ＢｇｌＩ　Ｉ　’ｌ以てクリープされ１こプラスミドｐＫＣ７（ＲａｏおよびＲ Ｏｇｅｒｓ　。

１９７．９）中にインサートされた。得られたプラスミ４６　特表顯ＧＯ−５０ ０７９Ｇ　（１４）ドは第１７図に示されるようにｐＭＯＮ　１２’ｌと命名さ れた。

プラスミドｐＭＯＮ　１２１はＥｃ　ｏＲＩでダイジェストされ、そして５ｂｓ ｓプロモーター領域を含有する１２００ｂｌ）フラグメントは単離された。別に プラスミドＭＯＮ　７５（前述され第９図に示され１こ）はＥｃｏＲＩおよびＢ ｇｌＩＩを以てダイジェストされ、そして１２５０ｂｐフラグメントはＮＰＴ　 丁Ｉ構造配列および’ＮＯ８３’非翻訳領域を含有して単離された。この二つの フラグメントは相容性のＢｃｌ　Ｉ　／　ＢｇｌＩＩオーバーハングスで結紮さ れて５ｂｓｓ−ＮＰＴ工Ｔ−１ｉｃｌｓ−４メラ遺伝子を含有する２４５Ｄｂｐ フラグメント乞創出しＴこ。このフラグメントはＥｃｏＲＩでクリープされ１こ Ｉ）ＭＯＮ　１２０中にイ１ンサートされて、第１８図に示されるように、反対 のオリエンテーションを有するキメラ遺伝子７有する二つのプラスミドを創出し た。プラスミドはｐＭＯＮ　１４１およびｐＭＯＮ　１４２と命名された。

５ｂｓｓ−ＮＰＴＩＩ　−ＮＯＳキメラ遺伝子が、二・三のタイプの植物細胞に 挿入され、該植物細胞がカナマイシン耐性を持つようにする。

この成功裡の転換は、一つのタイプの他物からのプロモーター領域が、完全に異 なる属、科及び目の植物からの植物細胞内の遺伝子ケ発現させることかできると いうことを証明した。

キメラ５ｂｓｓ−ＮＰＴＩＩ　−ＮＯ８遺伝子はまた、もう一つの有意な特徴を 有してい１こ。シーフェンシング実験は、８００　ｂｐ　Ｍｈｏ　Ｉ片が５ｂｓ ｓ構造配列のＡＴＧ開始コドン乞含有していたこと２示した。この開始コドン２ 除りよりもむしろ、出願人は読取り枠内の開始コドンの後に停止コドンを挿入す ることに決定した。これはジンストロニックｍＲＮＡ配列ケ創り出し１こ。該配 列）’！、５ｂｓｓポリペシタイドのトランケーテツドアミノ部分と完全ＮＰＴ 　Ｉ　Ｉポリペシタイドとをコードした。ＮＴＰＩＩポリペブタイドの発現は、 ジシストロニソクｍＲＮＡが植物細胞内で翻訳されうろことを最初に立証した。

５ｂｓｓプロモーターは以下忙述べられるプラスミドｐＭＯＮ　１５４に含有さ れる。このプラスミドを含有するＥ、　ｃｏｌｉの培養物はアメリカンタイプカ ルチャーコレクションに寄託されている。この培養物は受付番号３９２６５とな った。

ＢＧＨキメラ遺伝子の製造 本発明の代りの好ましい具体例にお℃・て、（１）　５ｂｓｓプロモーター領域 及び５′非翻訳領域、（２）ボビン生長ホルモン（ＢＧＨ）ケコードする構造配 列、及び（５１ｔｑｏｓ　５′非はん訳領域、乞含むキメラ遺伝子が製造された 。このキメラ遺伝子は次の如く製造された。

このポリペプチドである牛生長ホルモン（例えは１９８２年ＯＷｏｙｃｈｉｋら の著誉参照）をコードする構造配列がｐＢＲ３２２−誘導プラスミドに挿入され １こ。

得られ１こプラスミドをプラスミドＣＰ−１と命名しＴこ。

このプラスミド７ＥｃｏＲＩとＨｌｎｄＩＩＩで消化し、上記構造配列を含有す る５７０ｂｐのフラグメントラ得た。

二重ストランドになっているＭ　−２ＲＦ　ＤＮＡ　（既に記載し第８図に示し たもの）ヲＥｃｏＲ■とＨｉｎｄＴＩＩで開裂し、ポリ−アデニル化シグナルを 有するＮＯ８３’の翻訳されていない頭載ぞ含む２９０　ｂｐのフラグメント’ ＞得た。２つのフラグメントＹ　ＩＪガーゼで結合しＥｃｏＲＩで消化してＥｃ ｏＦｌ工端部乞有する乞有６０　ｂｐのフラグメント欠生成させＴこ。これはＮ Ｏ８ろ′の翻訳されていない領域に結合され７ＣＢＧＨ−コーディング構造配列 を含んでいた。このフラグメントラ、ＥｃｏＲＩで〆白化され、アルカリ性ホス ファターゼで処８！すれているプラスミドｐＭＯＮ　３３中に導入し、第１９　 ｅｉｃ示３ｆｔ、ｐＭＯＮ　１０８と命名される新規シラスミドを生成させた。

ｐＭＯＮ　１０８　’ｘ　ＥｃｏＲＩで消化し８６０　ｂｐのフラグメント２得 ることにより、そして生成するＥｃｏＲ工７ラグメント上に鈍端（ｂｌｕｎｔ　 ｅｎｄｓ　）を生じさぜるためにに１ｅｎＯＷボリメラ＝ゼを用いて、特異なり ｇ　ＩＩＩレストラクションサイ）　”＜　Ｂ（）Ｈ構造配列のｂ′端部に導入 １−１こ。　。

このフラグメント乞リガーゼでプラスミドｂ＋　２５（ＢａｍＨＩサイトに挿入 されたＢｇＴ、Ｈ及びｘｂａＴ　ケ蓮搬する合成リンフ）−を含有するｐＢｌ（ ろ２７誘ｍ体）に結合させた。なお二〇フ０ラスミドはン：ｂａ丁　てあら力・ しめ開裂され、Ｋｌｅｎｏｗボリノラーゼで処理されて鈍＊ｔｆｊケ得たもので ある（　Ｎ　２５はＸｂａＴ　サイトから１２塩基だけはなれた特異なりｇ　Ｉ ＩＩサイトを含有する）。第２０図に示されたオリエンテーションにおいて８６ ０　ｂｐのＢＧ）ｌ　−ＮＱＳフラグメントを含有する、生成プラスミドをプラ スミドＮ　２５−　ＢＧＨと命名した。このシラスミドはＢＧＨ構造配列の５′ 端部から約２５塩基はなれた特異なりｇＩＩＩ開裂サイトを含有する。

ｄａｍ　−Ｚ、ｃｏｌｉ細胞より調せいされたプラスミドＮ２５−　ＢＧＨはＢ ｇｌ　ＩＩ及びＣ１ａＩ　により消化され８６０　ｂｐ片を生成し、この片はＮ Ｏ８３’のほん訳されていない領域についているＢＧＨ構造配列ヶ含んでいた。

一方、別にｄａｍ−Ｅ、ｃｏｌｉ細胞よりプラスミドｐＭＯＮ　１２１　（既述 及図１７を参照）２調せいしＣ１ａ　Ｉ及Ｂｃｌ　Ｉで消化され５ｂｓｓプロモ ーク領域暑含む１１００　ｂｐ片乞生成した。この片は相［６するＢｃｌ　Ｉ　 ／　ＢｇｌＩＩオーバノ・ング（ｏｖｅｒｈａｎｇ　）に於てリガーゼで結合さ れ、Ｃ１ａＩで消化されてキメラ的５ｂｓ８−　ＢＧＨ−ＮＯ８遺伝子を含む約 ２　ｋｔ＋のＣ１ａ　Ｉ片を生成した。この片は予めＣ１ａ　Ｉにより消化され たＩ）ＭＯＮ　１２０　（既述、図１０参照）にインサートされた。図２１に示 さ）する如く生成されたプラスミド、逆方向に（１ｎｏｐｐｏｓｉｔｅｄｉｒｅ ｃｔｉｏｎｅ　）キメラ的遺伝子をインサートｇれたものはｐＭＯＮ　１４７及 ｐＭＯＮ　１４　Ｂと命名された。

図２２に示す方法で別のキメラ的ＢＧＨ遺伝子、即ち（ｉｌ　ＮＯＳゾロモータ 鴇域及５′非はん訳領域（２１ＢＧＨの為のコードである構造配列、及（３１Ｎ Ｏ８３’非はん訳領域 プラスミドｐＭＯＮ　７６　（上述及図９参照）はＥｃ　ｏＲ工及ＢｇＩＩＩで 消化されＮＯＳプロモータ領域及５′非（獣釈領域を含む３　Ｄ　８　ｂｐ片を 生成した。ｄａｍ　−Ｅ、　ｃｏｌｉ　細胞より調せいされたプラスミドＮ　２ ５−　ＢＧＨ（上述及図２０参照）はＢｇｌＩＩ及Ｃ１ａ　Ｉ　により消化され ＢＧＨｍ造配列及ＮＯ８非はん訳領域ン含む９　Ｄ　Ｏｂｐ片が生成された。こ の２片はりが−ゼで結合されＥＣｏＲＩ及Ｃ１ａ　Ｉ端をもつ片の中にキメラ的 ＮＯ８−ＢＧＨ−ＮＯ８遺伝子が得られた。この片はｐＭＯＮ　１２０及Ｃ１ａ 　Ｉで消化されて得られｆ、−８ｋｂ片でリカーゼ結合された。結果として生！ 戊したプラスミドはｐＭＯＮ　１４９と命名され図２２に示されている。

キメラＮ０Ｓ−ＥＰＳＰ　−ＮＯ８遺伝子の創製他の、好ましい具体例として、 （１１ＮＯＳプロモーター領域と５′非翻訳領域、（２）大腸医酵素、５−　ｅ ｖｏｌｐｙｒｕｖｙｌ　ｓｈｉｋｉｍａｔｅ−６−ｐｈｏｓｐｈｏｖｉｃ　ａｃ ｉｄシンテーセゞ（ＥＰＳＰ酵素）の暗号となる構造順列、（３＋　ＮＯ８３１ 非翻訳領域とから成るキメラ遺伝子を創製した。

ＥＰＳＰシンテーゼは、モンサント社から「ラウンドアップ」の登録商標で市販 されて（・る除革剤、ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅの標的酵素と考えられている。ｇｌ ｙｐｈｏ　５ａｔｅはＥＰＳＰシンテーゼ活性を抑制することが知られており（ Ａｍｒｈｅｉｎ他、１９８０）、細菌中のＥＰＳＰ　シ７テーゼ遺伝子の増殖が 、そのｇ１７ｐｈ０８ａｔｅ　Ｋ　ｎする耐性を増大することも知られている。

それ故、植物中のＦ；ＰＥ１ｔＰシンテーゼ活性の水準を増加することが、形質 転換された植物に、ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ耐性を付与するのであろう。ｇｌｙｐ ｈｏｓａｔｅは、大抵の植物に有毒であるから、これは雑草の防除に有益な手段 Ｚ与える。ＥＰＳＰＰＥＰシンテーゼ活性する様に形質転換された、口重の作物 の種子を、畠に播く。ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ　Ｙ、形質転換されない植物を全部 、絶滅する濃度で畠に施し、形質転換された植物を、被害を受けずに残すことが 出来よう。

ＥＰＳＩ−’シンテーゼ遺伝子は、次の方法を含む各種の方法で単離することが 出来る。大腸菌ＤＮＡ　０）ＨｉｎｄＩＩＩ切断により作られた各種のＤＮＡ断 片を有するλフアージ文庫を創製することが出来る。例えばＭａｕｉａｔｉｓ他 、１９８２ン参照。

ＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子は、芳香族アミノ酸の生成に関与する遺伝子の一種で ある。これらの遺伝子は「アロ」遺伝子と呼ばれ、ＥＰＳＰ　／ンテーゼはｆｉ ｊｏ　Ａと呼ばれる。機能的アロ遺伝子を含まない細胞はアロ細胞と呼ばれる。

アロ細胞は通常、芳香族アミノ酸を補給し１こ培地で生育されなげればならない 。Ｐｉｔｔａｒｄ及びＷａｌｌｉｓ、１９６６’Ｙ参照。

ＥＰＳＰンンテーゼ遺伝子乞持たない変異大腸菌細胞に感染させるのに、各種の ＨｉｎｄＩＩＴ断片ケチ持つ異なったλファージ２用いることが出来よう。感染 しんアロ細胞乞芳香族アミノ酸ケ含まない培地で培養し、この様な培地で生育し 得る形質転換され１こアロ“クローンを選択することが出来よう。この様なりロ ーンはｇｐｓｐシンテーゼ遺伝子を含む可能性が強い。この様なりローンからフ ァージ粒子乞単離し、この様なファージからＤＮＡ乞単離することが出来よう。

ファージＤＮＡは１、またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断され、何 回かの分析過程により、ＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子乞含む断片乞単離−［ること か出来よう。

上記に要約したのと同様の操作ケ用（・て、申請人は、全大腸菌ＥＰＳＰンン・ テーセゞ遺伝子を含むｉ　１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＴ断片を単離した。この断片を 、ＢｇＩＩＩで消化して、全ＥＰＳＰノンテーゼ遺伝子化含む、ろ、５ｋｂのＨ ｉｎｄＩＩＴ　−Ｂｇ１１工ＶＪｉ片ン生成させた、この５．５ｋｂ断バーンプ ラスミドｐＫＣ７（Ｒａｏ及びＲＯｇ、ｅｒＳ、１９７９　）グラスミドｐＭＯ Ｎ　４　Ｙ　Ｃ１ａＩ　で消化して、ＫＰＳＰ　／ンテーゼ構造順列を含む２． ５　ｋ’ｂの断片を得１こ。この断片をＣ］、ａ　Ｉ　で消化したｐＢＲ６２７ に挿入し、２６図に示すｐＭＯＮ　Ｂを創製した。

ｐＭＯＮ　８をＢａｒ＋ｉＴＴ　トＮｄｅ　Ｉ　で消化して、４．９　ｋｂ断片 を得た。この断片は、ＥＰＳＰ　’／ンテーゼ構造順列のアミン端末乞記号化す る約２００のヌクレオチドヲ欠いていた。

不在のヌクレオチドは、２４図に示す様にｐＭＯＮ　３から得られるＨ１ｎｆ工 ／ＮｄｅＩ　断片と、（１）　ＥＰＳＰ　シンテーゼの出発コドンと最初の６つ のヌクレオチド、（２）％異ＢｇＩＩＩサイト、（３）適当なりａｍＨＩと旧ｎ ｆＩ末端を含む合成オリゴヌクレオチド順列乞連結することによって置き換えら れ１こ。その結果出来上つ１こプラスミド、１）ＭＯＮ　２５は、そのまへのＥ ＰＳＰシンテーゼ構造順列と、出発コドンの附近に位置イろ特異なり　ａｍＨＩ とＢｇＩＩＩと乞含んでいる。

二重らせんＭ　−２ＤＮＡ　（前述し、８図に示し１こ）乞ＨｉｎｄＴＩＴとＥ ｃｏＲＩで消化し、ＮＯ８５’非翻訳領域とポリアデニル化信号を含む２９０　 ｂｐ断片を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した１）ＭＯ Ｎ　２５プラスミドに導入し、ＮＯ８３’非翻訳領域に接合したＥＰＳＰ構造順 列を含むｐＭＯＮ　１４６　（２５図に示す）と呼ばれるプラスミドを創製した 。

ｐＭＯＮｌ　４６　ｋ　Ｃ１ａ　Ｉ　とＢｇｌｌＩで切断し、ＮＯ８３’非翻訳 領域に接合し７ＣＥＰＳＰ構造順位乞持つ２．ろｋｂ断片を得１こ。１）ＭＯＮ 　７６　（前述し、９図に示した）乞Ｂｇ工ＩＩとＥｃ　ｏＲ工で消化し、ＮＯ Ｓプロモーター領域と５′非翻訳領域を含む５１０　ｂｐ断片を創製した。これ らの断片をＣ１ａ　Ｉ　とＥＣ０ＲＩで消化したｐＭｏＮｌ　２０　（１０図に 前述し、示した）と混合し、混合物を連結した。その結果、出来上つ１こシラス ミド’４ｐＭＯＮ　１５３と呼ぶか、２６図に示す。このプラスミドはキメラＮ Ｏ８−ＫＰＳＰ　−ＮＯ８遺伝子を含む。

キメラ３ｂｅｓ　−ＫＰＳＰ　−Ｎ０ＥＩ遺伝子を含むプラスミドは２７図に示 す様に、次の方法で作られた。シラスミドｐＭＯＮ　１４６　（前述し、２５図 に示し１コ）　Ｙ　Ｃ１ａ　ＩとＢｇＩＩＩで消化し、２．６ｋｌ）断片を精製 した。この断片は、ポリアデニル化信号を、持つＮＯ８３’非翻訳領域に接合し たＥＰＳＰンンテーゼ構造順列乞含んでい１こ。シラスミドｐＭＯＮ　１２１　 （上記に前述し、１７図に示し１こ）をＣ１ａ　Ｉ　とＢｃ　ＩＩで消化、１． １　ｋｂ断片を精製した。この断片は５ｂｓｓプロモーター領域と５′非翻訳領 域とを含んでいる。２種の断片を混合し、Ｔ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼで連結し 、次いでＣ１ａ　Ｉ　で消化し１こ。これによって共存的ＢｇｌＩＩとＢｃＩＩ 端末で結合し７Ｌ　’キメラ５ｂｓｓ−ＥＰＳＰ　−ＮＱＳ遺伝子が創製された 。この・Ｃ１ａＩ端末を持っキメラ遺伝子ＹＣ１ａＩ　で消化され、分生アルカ リ・フォスファターゼ（ＣＡＰ　）で処理されたプラスミドｐＭＯＮ１２０に挿 入した。この混合物をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで連結した。その結果、出来上った 断片とプラスミドの混合物をスペクチノマイシン耐性のために選択され１こ大腸 菌細胞を形質転換するのに使用し１こ。耐性細胞の集落乞単離し、この集落中の シラスミドを、２７図に示す様に、ｐＭＯＮ　Ｉ　５４と呼ぶことにした。

ｐＭＯＮ　１５４を含む大腸劇の培養物を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｅｎｔｅｒに寄託した。この培養物は受入番号３９２６５を与えら れた。

ＣａＭＶ　（１９Ｓ　）　−ＮＰＴＩＩ　−ＮＯ８遺伝子の創製この発明の他の 好ましい具体例として、次の要素を含むキメラ遺伝子が創製された。

土　プロモーター領域と、ｐ６６蛋白質の暗号となるＣａＭＶ　（１９ｓ　）遺 伝子由来の５′非翻訳領域２、ＮＰＴ　ＩＩ遺伝子の所要のＡＴＧ出発コドンの 直ぐ内側のＴＧＡ末端順列と同じ枠の中のＡＴＧ出発コドンと、何個かの内部Ａ ＴＧ順列を含むＣａＭＶ　（１９Ｓ　）遺伝子からの部分的暗号順列 ロネオマイシン・フオスフオトランスフエラーセ■工（ＮＰＴＪＪ　）遺伝子由 来の構造順列。この順列はＮＰＴＩＩ構造順列内のＴＧＡ順列と同じ解読わく内 の擬似ＡＴＧ順列によって先行された。

Ｊ　Ｎｏｐａｌｉｎｅシンテーゼ（ＮＯ８）遺伝子由来のポリアデニル化信号を 含む６′非翻訳領域 こ〜でＣａＭＶ　（１９Ｓ　）　−ＮＰＴＩＩ　−ＮＯ８遺伝子と呼ぶキメラ遺 伝子乞、シラスミドｐＭＯＮ　１２０に挿入し、２９図に示し、９例に記述する ｐＭＯＮ　１５６と呼ばれるプラスミドを創製した。プラスミドｐＭＯＮ　１５ ６乞、Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＩＩａ胞に挿入じ、そこでＡ、　ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ細胞内のＴ１プラスミドとの単回交叉により、共同組込みＴｉ プラスミドが形成された。共同組込みシラスミド中のキメラ遺伝子は、Ｔ１プラ スミド中の修正Ｔ−ＤＮＡ領域内にあり、左右のＴ　−ＤＮＡ境界に囲まれてい た。

６ 同様のキメラ遺伝子が、６２図に示し、１０例に記述するｐＭｏＮｌ　５５と呼 ばれるプラスミド中で創製され、組み合わされた。このキメラ遺伝子は２つの例 外の点を除いてＩ）ＭＯＮ　１５６内の遺伝子に似ていた。

１．３個の解読わくの全部に停止コドンを有するオリゴヌクレオチドリンカーが 、ＣａＭＶ　（１９ｓ　）部分的構造順列とＮＰＴ　ＩＩ構造順列の間に挿入さ れたことへ２、ＮＰＴＩＩ構造順列の５′側の擬似ＡＴ（）順列が除かれ１ここ と。

このキメラ遺伝子の構造を、１　Ｄ、例に記述した。この遺伝子は、Ａ、　ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ａＩ胞に、次いで植物細胞に挿入された。その表現水準は 、より高濃度のカナマイシンでの生長で定量される様、ｙ、９ＭＯＮ＋１５６内 の同様な遺伝子よりも、明らかに高かつ１こ。共−組込みＴｉｔ！　ｐＭＯＮ　 １５５プラスミドを含むＡ、ｔｕｍｅｆａｃｆｅｎｓ　＠胞は、Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　’Ｉ”ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｋ寄託され、受入番号ろ９ ３３６が与えられ１こ。

この発明の、他の好ましい具体例では、（１１３２Ｓ　ＣａＭＶ　ｍＲＮＡの転 写を起すプロモーター領域（２１ＮＰＴ　ＩＩの暗号となる構造順列（３１Ｎ０ ８６′非翻訳領域 より成る斤メジ遺伝子が創製されに０ このキメラ遺伝子の組み台せは、１１例と、ろろ〜３７図に記述されている。こ の遺伝子は植物細胞に挿入され、その植物をカナマイシン耐性にした。

ペテユニナ植物は通常、ＣａＭＶに感染しない。この技術に卓越し１こ人々は、 一定の実験手段によって、何か特別の植物ビールス・プロモーター（ＣａＭＶプ ロモーターの様な）が、そのプロモーターが得られたビールスの通常の宿主範囲 以外の植物細胞を含む、何等かの型の植物細胞内で、満足すべぎ水準で僚能する か否かを決定することが出来よう。

異種のＤＮＡ′ｆ２ｒ：植物細胞中に挿入するいくつかの方法が知られている。

申請人によって用も・られに一つの万物と共存培養する方式を含んで、・た。キ メラ遺伝子を持つＴ　−ＤＮＡの一片乞植物ケ゛ツムに移し、形質転換を起させ た。この方法はし植物細胞の形質転換のためのプラセミドＪ　５ｅｒｉａｌ　Ａ 　４５８，４１１と１遺伝的に形質転換され１こ植物ｊ　５ｅｒｉａｌ　４４５ 　Ｂ＋４０２の１９８６年１月１７日付申請の２つの米国特許申請に詳細に記述 されている。、 以下に各種の他の方法を記す。これらの方法は、今日迄に達成されに形質転換の 効率は低いものの、理論的に、本発明のキメラ遺伝子乞植物細胞に挿入出来ると して利用されるＮＰＴ　Ｉ　及びＮＰＴ　ＩＩの様なキメラ遺伝子）はＤＮＡ　 ’ｉ植物や植物細胞に挿入する方法の研究を便ならしめると思われる。

１、ＤＮＡ乞植物細胞に挿入する他の一つの技術は、リポ・戸−ムとも呼ばれる 脂質小胞の利用を含む。リポ・戸−ムは１またはそれ以上のＤＮＡ分子をカプセ ル化するのに用いられる。リポ・戸−ムとそのＤＮＡ含量は植物細胞に取り入れ られる。例えばＬｕｒｑｕｉｎ、１９８１を参照。若しも、挿入されたＤＮＡが 植物ゲノムに併合され、複製され、遺伝されれば、植物細胞は形質転換される。

今日までリポ・戸−ムを用いてＤＮＡを植物細胞に届けようという努力は大きな 成果を挙げていな℃・（Ｆｒａｌｅｙ及びＰａｐａｐｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、 １９８１Ｌ比赦的小さなりＮＡ分子だけが、リボゾームで植物細胞に移し換えら れているが、表現されているものはない。しかし、リポ・戸−ム送達技術は、活 発に開発されており、本発明のキメラ遺伝子ン含むプラスミドンリボ・戸−ムを 含む手段で植物細胞に移し換えるために、種々の方法が開発される可能性が強い 。

２、他の別の技術は、植物細胞を、（ａｌ　ｐｏ１７−　Ｌ　−ｏｒｖｉｔｈｉ ｎｅ　（Ｄａｖｅｙ他、１９８０）の様な多価カチオン物質か、ｔｂ＋ｂｌカル シウム（Ｗｒｅｎｓ他、１９８２）で錯体としたＤＮＡと接触させることを含む 。今日まで達成された形質転換の効率は低いが、これらの方法は今でも活発に研 究されている。

６　所要のプラスミドを含む細菌の植物細胞との融合を含む方法が開発された。

この様な方法は細菌乞スフェロプラストに、植物細胞を原形質体に転換すること を含む。これらの方法の両方とも、酵素消化を用いて、細菌及び植物細胞から細 胞壁バリヤーを除くのである。

２つの細胞型は、その後、ポリエチレングリコールの様な化学薬品に暴露するこ とによって融合される。

Ｈａｓｅｚａｗａ他、１９８１Ｙ参照。今日までこの方法で達成された形質転換 効率は低いが細菌及び動物細胞の融合を用いる同様の実験は良い結果を生んでい る。

Ｒａ、ｓｓｏｕｌｚａｄｅｇａｎ他、１９８２’ｅ参照。

４、遺伝的に動物細胞を形質転換するのに用いられて、成功した他の２つの方法 は（ａｉ微微小ガラスケ用いるＤＮＡの動物細胞への直接微量注入（Ｃａｐｅｃ ｃｈｉ、１９８０”１と（ｂｌ、動物細胞によるＤＮＡの電流誘導取り込み（Ｗ ｏｒｇ。

及びＮｅｕｗａｎｎ、１９８２）’！ａｊ含む。これらの技術の何れもが、今日 まで植物細胞の形質転換に用いられていないが、本発明のキメラ遺伝子を植物細 胞に挿入するのに有用であろう。

本発明のキメラ遺伝子ｉ　ＤＮＡ順列の同定、単離、研究に用いて、これらが植 物細胞内で遺伝子の表現の促進や他の調整が可能であるかどうかを決定すること が出来る。

例えば、どの様な細胞型からのＤＮＡでも部分ヌクレアーゼ消化や他の方法を用 いて、断片にするεとが出来る。ＤＮＡ断片は、構造順列のＡＴＧ出発コドンか ら、５′の方向に位置する特異切断サイドで切断したキメラ遺伝子の複数のコピ ーと混合される。出来れば、構造順列は若し適当に転写されれば、ある種の抗生 物質に対する耐性を宿主冗与えるポリ、ペゾチドの様な選択標識に、翻訳される とよい。ＤＮＡ混合物は連結されて、プラスミドを形成し、そのシラスミドは、 その抗生物質に感受性のある植物細胞を形質転換するのに用いられる。この細胞 は、その抗生物質゛の適当な濃度を含む培地上で培養される。植物細胞は構造順 列が転写され、抗生物質に耐性を与えるポリペプチドに翻訳される場合にのみ、 生存し、再生する。これは◆挿入されｒｃ　ＤＮＡ断片が遺伝子プロモーターの 役割を果す場合にのみ、起ると考えられる。耐性のある集落は更に、評価を受け て、その通りであるか否が乞決定するのに用いられる。

この技術を用いて、細菌、酵母、カビ、藻やその他の微生物や動物細胞のプロモ ーター領域を評価し、これらが又、植物細胞の各種の型で遺伝子プロモーターと して作用するが否かを決定することが出来る。又、ある型の植物からのプロモー ターを他の植物細胞の型の中で評価することも出来る。同じ様な方法で、キメラ 遺伝子の切断サイ）Ｙ変えることにより、どの様なりＮＡ順列でも、５′非翻訳 領域、６′非翻訳領域、又は他の調整順列の如何なる型でも、その挙動を評価す ることが出来る。

若し、望まれれば、各種ＤＮＡ順列の調整効果の評価方法に部分キメラ遺伝子を 用いることが出来る。例えば、ＮＯＳプロモーター領域とＮＯ８５’非翻訳領域 の両方又は一方をＮＯ８−ＮＰＴＩＩ　−ＮＯＳキメラ遺伝子から除くことが出 来る。これにより、ＮＰＴＩＩ構造順列の前に切断サイｌｆ−有するがプロモー ター領域を持たないキメラ遺伝子を創製することが出来る。

挿入されたＤＮＡ断片が、（１）構造順列の解読わく乞変えるか、（２）ポリペ プチドのアミノ端末を変える出発コドンを含む場合は、オリゴヌクレオチド乞切 断サイトと構造順列の出発コドンの間に置くことが出来る。オリゴヌクレオチド はすべての３種の解読わくに停止コドン乞食むであろう。それ故、若しも、出発 コドンが挿入されたＤＮＡ断片に含まれていれば、・遺伝子は２シストロン遺伝 子であろう。最初のポリペプチドの末端は挿入された出発コドンの解読わくの中 にあるどちらかの停止コドンになるであろう。第２の出発コドンは選択標識酵素 である別のポリペプチドの翻訳を始める、請求の範囲に用いられるいろＣ・ろな 句は、請求の範どの特殊用語でもその意味は、この出願の本文および図に関して 説明されなければならない。特にＪｄ学において矛盾して用いられるいろいろな 用語が展開することが認められる。たとえば、いろいろな意味がゝゝゾロモータ “という語を発展させ、その語のあるもということになる。説明によっておこる 問題を努力してさける１こめに、出願者は種々の用語を定義するよう試みた。し かしながら、そのような定義は仮定されることな（、あるいは包括的であるよう にも意図されることなく、適切な文学に照らして説明されなければならない。

ゝゝキメラ遺伝子“の語は、異なる独特な遺伝子η・ら誘導され１こ、最低２つ の部分を含む遺伝子とろなす。

この中に用（・られているように、この語は集合、合成、あるいはその逆に人工 の努力として生み出された遺伝子を限定し、また複製、あるいは逆にそこから誘 導されるどんな遺伝子をも限定する。９人工の努力“は、もしもそれが人間的努 力、あるいは介在により引きおこされ、高められ、支配された状態のもとで起こ っ１こ過程ならば、酵素の、細胞の、また他の生物学的過程？含む：すなわち自 然な過程で単に作られただけの遺伝子は除外する。

ここに用いられているように、″遺伝子“は技術における巧みさにより遺伝子と して順当に認められているＤＮＡの環部な限定する。たとえばシラスミドは植物 誘導フロモータ領域および異種構成シーフェンスを含むが、もし、それら２つの 環−節がプロモータ領域が構成シーフェンスの転写をおこすようなシラスミドの 中で互いに位置しないならば、その時、その２つの環部は同じ遺伝子に含まれた ものとしてみなされることはない。

この発明はキメラ遺伝子に関するものであり、そのキメラ遺伝子は、それらプロ モータ領域に関しては゛ゝ異種“である構成シーフェンスを有する。これは少な くとも２型のキメラ遺伝子を含む。

１　植物細胞とは異質の遺伝子のＤＮＡ、ｒ、−とえばもしも哨乳類蛋白ま−は バクテリア蛋白を暗号化する構成シーフェンスが植物プロモータ領域に連らなら せられるならば、そのような遺伝子は異種とみなされる。

２　異なる植物プロモータ領域により自然に助長される植物細胞遺伝子、たとえ ば、もしも植物蛋白を暗号化する構成シーフェンスが順当に少量のプロモータに よって支配されれば、構成シーフェンスは多産プロモータと一緒にされる。これ は、より多量の構成シーフェンス転写をひきおこし、それにより高い蛋白をもっ た植物の先導が十分になる。そのような構成シーフェンスは多産プロモータに関 しては異種とみなされる。

しかしながら、この発明にとって完全な構成シーフェンスが完全なゾロモータ領 域に異種であることば重要ではない。たとえば、この発明のキメラ遺伝子は、作 られてゝゝ融解蛋白“、すなわち２つの離れた構成シーフェンスから誘導された ポリペプチド部分を含む蛋白に翻訳される。これは全部あるいは一部の異種構成 シーフェンス乞植物遺伝子の構成シーフェンス、っまことにより完成される。

この中に用いられるように、″書き込み遺伝子から誘導されたゾロモータ領域″ という句は、ゴないしそれ以上の部分のプロモータ領域が書き込み遺伝子から誘 導されているとき、プロモータ乞・その意味に含む。

たとえば、１ないしそれ以上の特殊植物誘導プロモータ領域の部分（図１に示さ れる中間領域８のような）は、特別型宿主細胞内の起因キメラ遺伝子の表覗、を 還元することのない異種構成シーフェンスを含む遺伝子のような、異なる遺伝子 から誘導された１ないしそれ以上のシーフェンスで置換される。そのようなキメ ラ遺伝子は植物誘導結合領域２、中間領域４、異種中間領域８．５′−非翻訳領 域１０、構成シーフェンスがあとにつく転写開始シーフェンス６を含む。そのよ うなキメラ遺伝子はこの発明の範囲内であるっこの中に用℃・られているように 、１〜から誘導された“という句は、広く解釈される。たとえば、構成シーフェ ンスは次のことを含むいろし・ろな過程により特別な遺伝子゛から誘導“される ： １　遺伝子のプラスミド内挿入、細胞培養によるプラスミド複製、試験管内複製 、また他の方法などのような種々の方法により再生産され請求められるシーフェ ンスはエンドヌクレアーゼ分解のような種々の方法によるＤＮＡコピーから遺伝 子が得られる；２　遺伝子により暗号化されたｍＲＮＡは、ｍＦｔＮＡから補足 ＤＮＡ　”％準備、その後のエンドヌクレアーゼからのｃＤＮＡ分解などの種々 な方法で得られ、処理される；６　構成シーフェンスにおける塩基シーフェンス はエンドヌクレアーゼマツピングあるいはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法のよう な種々の方法で決定される請求められるシーフェンスの倍化、あるいは接近化す るＤ１法鎖に！化学合成、またオリゴヌクレオチド分節の結紮法により作られる 。

４　塩基の構成シーフェンスは、遺伝子コードをポリペゾチド内のアミノ酸残留 物シークエンスに適合することによりもとをたどれる。一般に、いろいろなりＩ ＪＡ構成構成シーフェンス剰な遺伝子コードのためにポリベゾチドを決定する。

この変化から、塩基のめられるシーフェンスが選択され、その（選択された）シ ーフェンスを持つＤＮＡ　＠が作られる。

もしめられるなら、どのＤＮＡシークエンスも存在塩基を、ある塩基と代えるこ とにより緩和される。そのような緩和は多くの理由で行なわれる。たとえば、シ ーフェンス内の１またはそれ以上の塩基は特殊なエンドヌクレアーゼの分割部位 を作り、あるいは削除するために他の塩基と置換されるもう１つの例としてシー フェンス内の１ないしそれ以上の塩基がメツセンジャーＲＮＡのゝ゛茎と輪“構 成の発生を還元するために置換される。そのような緩和シーフェンスは、この発 明の範囲内にある。

構成シーフェンスはイントロンとエクソンを含む：そのような構成シーフェンス はＤＮＡあるいは第一転写ｍＲＮＡから誘導される。代わって、構成シーフェン スは突起ｍＲＮＡから誘導され、その突起ｍＲＮＡからは１ないしそれ以上のイ ントロンが削除される。

出願者はプラスミド内挿入封１２８およびｐＭＯＮ　１５４を含むＥ、　ｃｏｌ ｉ細胞の２培養をＡｍ５ｒｉｃａｎ　ＴＩｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃ ｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）に預けている。これらの細胞はＡＴＣＣ加入番号３９２ ．．６４および３９２６５として、それぞれ委託されている。出願者は両方の培 養の５重要な特質“を持つ微生・物培養を請求した。この中に用いられるように 、細胞培養の１重要な特質“は、培養を、この中に含まれる情報により明らかに され、示唆され、可能にされ、用法にかなったものとされ、その特質を限定する 。培養の多くの特質は技術におけるその巧みさとして知られた技術により緩和さ れる；たとえば、細胞内への特殊プラスミドあるいは遺伝子の挿入により特殊抗 生物質に対して細胞が耐え、あるいは、ｐＭＯＮ　１２８またはＩ）ＭＯＮ　１ ５４プラスミドが指示細胞から移動され、また細胞の異なる菌株内に挿入される 。

そのような変化はこの発明の範囲内にある。しかもそれは非常に改良され、その 改良が、この細胞培養に接する多くの研究を経て起こることは疑う余地がない。

技術におけるその巧みさは、通常実験程度の使用を認め、あるし・は確認を可能 にし、特有の統合体に対する多数の等価物はこの中に記述されている。そのよう な等価物はこの発明の範囲内にある。

例 ５０マイクログラム＜　ｕｇ　）のラムダファージｂｂｋａ、ｎ　−Ｉ　ＤＮＡ 　（Ｂｅｒｇ他、１９７５）は、１００単位のＨｉｎｄＩＩＩ　（すべての制限 的エンドヌクレアーゼはＮｅＷ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ］、ａｂｓ　、　Ｂｅ ｖｅｒｌｙ、　ＭＡで得られ、別な方法で書かれていなければ、供給者の指示に 従って緩衝器と共如用いられる）と共、Ｋ　２時間、６７℃で分解される。加熱 不活性化（７（］℃、１０分間）後、６．３　ｋｂ　Ｔｎ　５　ＨｉｎｄＩＩ分 節はスクロース勾配上で純化される。１　ｕｇの純化されたＨｉｎｄＩＩＴ分節 はＢａｎＨＩ　（２単位、１時間、３７℃）と共に分解され、１．８　ｋｂ分節 ヲ生起させる。エンドヌクレアーゼを加熱不活性化する。

プラスミドｐＢＲ３２７（５ｏｂｅｒｏｎ他、１９８１）、１　ｕｇは、Ｈｉ　 ｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ工（各２単位、２時間、３７°Ｃ）と共に分解される 。分解に伴いエンドヌクレアーゼは加熱不活性化され、分割されたｐＢＲ３２７ ＤＮＡはＢａｍＨニーＨｉｎｄＩＩＩ　Ｔｎ５分節に加えられる。

Ｑ、７５　ｍＭの濃度−・のＡＴＰ添加後、１０単位のＴ、　ＤＮＡりが−ゼ（ Ｍｕｒｒａｙ他法、１９７９により準備）が加えられ、反応は１６時間、１２− １４℃で続けられる。

１単位ノＴ、ＤＮＡリガーゼは５分１ｐ’５．２２℃でｉ　ｕｇのＨｉｎｄＩＩ Ｉ−分割：ｐＢＲ３’２７プラスミドの９０％円形化ｒｅｃ　Ａ　５６細胞（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ他、１９８２）を変換するのに用いられる。Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏ ｔｈ　（ＬＢ　）における１時間、６７℃の表示後、細胞は２００　ｕｇ／ｍｌ アムピンリンおよび４　Ｑ　ｕｇ／ｍＪカナマイシン・をを含む固体ＬＢ媒質板 上に広げられる。６７℃、１６時間の培養保育に続き数百のコロニーが出現する 。プラスミドミニプレゾＤＮＡはこれらのうち６コロニーから準備される（　Ｉ ｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｚとＢｕｒｋθ、１９８１）、エンドヌクレアーゼ分解は 全６プラスミドが１．１３　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ分節を運搬する ことを示す。これらの単離の１つが６図に示されるようにｐＭＯＮ　１００１と 命名される。

５　ｕｇプラスミドＰＭＯＮ　１００１　（例１に記述）は、Ｓｍａ　Ｉ　と共 に分解される。反応はフェノール抽出により終了、ＤＮＡはエタノールにより促 進される。Ｂａｍ　Ｉ連鎖ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ　（０，１ｕｇ）はＡＴＰおよ びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ｌ＃Ｄ　）と共にリン酸化されているが、それは１　ｕ ｇのｐＭＯＮ　１０’　Ｄ　１分節に加えられる。混合はＴ４ＤＮＡリガーゼ（ １００単位）を１８時間、１４℃で処理する。ＤＮＡ　ＩＪガーゼを不活性化す るために、７０℃、１０分間加熱後ＤＮＡ混合はＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ （２０単位、６時間、３７℃）と共に分解され、電気泳動によりアガロースデル 上で分離される。４．２　ｋｂＳｍａＩ　−ＢａｍＨＩ媒介体分節に対応する帯 はゲルから削除される。４．２　ｋｂ分節はがラスビーズ士で吸着により純化さ れ（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎとＧ１１ｌｅｓｐｉｅ　、１９７９　）、エタノール は２　Ｑ　ｕｌのＤＮＡ　ＩＪが−ゼ緩衝器において／ｉＴＰと共に促進され、 再停止される。、Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪが−ゼ（２０単位）が加えられ、混合は、１ ５時間、室温で培養保育される。ＤＮＡはルビシラ大垣化物ショックれる（　Ｍ ａｎｉａｔｉｓ他、１９８２）、１時間、６７℃、ＬＢ内表示後、細胞は２　Ｄ 　Ｑ　ｕｇ／’ｍｌのアムピシリンおよび２０　ｕｇ／ｍｇカナフィシンを含む ＬＢ板上に広げられる。板は３７°Ｃ１１６時間、培養保育される。１２のアム ビシリン抵抗、カナマイシン抵抗コロニーカ選ばれ、２　ｍｅ培養が育ち、ミニ シラスミド準備が行なわれる。シラスミドのエンドヌクレアーゼマツぎングは１ ２のうちの１０はＳｍａ　工部位も単ＢａｍＨＩ部位も含まないことを示し、特 定の大きさ、４．２　ｋｂである。１゜コロニーの１つからのシラスミＶは６図 に示されるようにｐＬｓＯＮ　４０と命名される。

例３　：　ＮＯＳプロモータ分節の生起次のシーフェンス５’　−ＴＧＣＡＧＡ ＴＴＡＴＴＴＧＣ，−３’と共にオリゴヌクレオチドが合成される（　Ｅｌ、ｅ ａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒ、１９８１、Ａｄａｍｓ他１ｃより修正、１ ９８２）、このオリゴスクレオチドは　３　ａ　ｐ放射能ラベルを含む。

この放射能ラベルは５ンミジン残留物にポリヌクレオチーキナーゼにより加えら れる。

ＡｎＭ１３ｍｐ？誘導体はｓＩＡと命名されているがそれはＷａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　ｓｔ、　Ｌｏｕｉｅ、　ＭＯのＭ、Ｂｅｖａｎと Ｍ、−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎとにより出願者に示されて℃・る。出願者の知識と 信念のうち最良のものはＳＬＡ　ＤＮＡが次の方法により得られたことである。

ＡｐＴｉＴ　３７プラスミドはＨｌｎｄＩＩＩと共に分解され、６．４　ｋｂ分 節はＨｉｎｄＩＩＩ−２３分節として分離され命名された。この分節は５ａｕ３ ａと共に分解され、３４４　ｂｐ分節Ｓａ　ｕ３ａ終了と共に生起する。この分 節は二重鎖に挿入され、Ｍ１３ｍｐ７フア・−ジ媒介体からＤＮＡを複製形成し く　Ｍｅｏｓｉｎｇ他、１９８１）、それはＢａ＋ｎＨ工と共にカットされる。

３４４　ｂｐ挿入のある２つの組みかえファージはＮＯＳゾロモータ分節の反知 覚鎖を含むものの１つを結果として生ずる。組みかえファージはＳＩＡと命名さ れ、クローンコピーが出願者に与えられる。

出願者はＳＩＡ　ＤＮＡ　（１４，４ｕｇ　；　ｂｐｍｏｌ　）の単鎖形成を準 備し、上述の２　Ｑ　ｐｍｏｌ、１４−　ｍｅｒオリゴヌクレオチドと共に焼還 する（１０分間、７０℃、後室温にさます）。オリゴスクレオチドは図４および ５で示されるように塩基２８６〜６００で挿入し、５ａｕ３ａを焼還する。

２００　ｕ１０ＳＩＡ型焼還オリゴヌクレオチドは、４　（］、ＮＴＰ’Ｓ　（ １ｍＭ、２．５　ｕ／の最終濃度で出現）と５０ｕ／のに１１ＢｎＯＷポリメラ ーゼと共に混合される、混合は６０分間、室温で培養保育される。この間ポリメ ラーゼはｄＮＴＰ’ｓをオリゴヌクレオチドの３′終了に加える。ポリメラーゼ は加熱不活性化さ才１（７０℃、３分間）、Ｈａ、ｅＩＩＩ（１６０単位）が加 えられる。混合は培養保育され（１時間、５５℃）、Ｊ（ａｅＩＩＩは不活性化 され（７０℃、３分間）、４　ｄＮＴＰ’ｓ　（１ｍＭ、１２ｕ）およびＴ４Ｄ ＮＡポリメラーゼ（５・０単位）が加えられる。

混合は培養保育され（１時間、６７℃）、ポリメラーゼは不活性化（７０°Ｇ、 ３分間）される３、これは約５７０　ｂｐの分節を生ずる。ＥｃｏＲＩ（１５０ 単位）は加えられ、混合は培養保育（１時間、６７℃）され、ＫｃｏＦ、Ｉは不 活性化（７０℃、６分間）される。

分別された混合は２５係グリセロールから６％アクリラマイドに分けられる。オ ートラジオグラフィーは大きさ約３　ｉ　Ｑ　ｂｐの放射能分類帯を示す。この 帯は削除される、。前述の手順（・ま図５に示される。

２ 例４　：　ｐＭＯＮ　５８の生起 ５　ｕｇシラスミドｐＭＯＮ　４０　（例２に記述）はＢｇｌｌｌ（１０単位、 １．５時間、３７℃）と共に分解、ＢｇｌＩＩは不活性化（７０℃、１０分間） される。

４　ｄＮＴＰ’ｓ　（１ｍＭ、５　ｕ／　）およびに’ｌｅｎｏｗポリメラーゼ （８単位）は加えられ、ε合は培養保育（６７℃、４０分間）され、ポリメラー ゼは不活性化（７０℃、１０分間）される。ＥｃｏＲＩ　（Ｉ　Ｑ里位）は付加 され、培養保育（１時間、ろ７°Ｃ）されて、カーフアルカリフォスファターゼ （ＣＡＰ　）が伺加され、培養保育（１時間、６７°Ｃ）される。約３．９　ｋ ｂの分節はＮＡ−〜４５膜を用いてアガロ−スケゞル上で純化される（　５ｃｈ ｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｅｕｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ　ＮＨ）　。分節（＋−ＯｐｌＬ ）は例乙に記されたようにＮＯＳノロモータ分節（０，１ｐＭ　）、Ｔ４ＤＮ７ １リガーゼ（１０口単位）と共（Ｃ混合される。混合は培養保育（４℃、１６時 間）される。起因プラスミドはＥ、　ｃｃ＋１．ｉ細胞に挿入され、そのＥ、ｃ ｏｌｉ細胞は２００　ｕｇ／ｍ７！アムピシリンを含む媒質上で選ばれる。

３６クロ一ンＡｍｐＲコローーは選択され、ミープレゾゾラスミドはこれらのコ ロニーから作られる。１コロニーからのシラスミには５　Ｑ　８ｂｐ　Ｆ２ｃｏ ＲＩ　−ＢｇｌＩＩ分節を証明し、新５８ｔＩＩ分割部位は５０８　ｂｐ　ＮＯ ８分節と新Ｐｓｔ工部位により運ばれる。このプラスミドはｐＭＯＮ　５８と命 名さ肚、図７で示されるようにｐＭＯＮ５　Ｆ３　ＤＮＡが上述のように準備さ れる。

例５　：　ｐＭＯＮ　４２の生起 プラスミドｐＢＢ　３２５−　）（ｉｎｄＩＩＩ　−２３はシラスミドｐＢＲ３ ２５の誘導体であり、（Ｂｏｌｉｖａｒ、１９７８）ＨｉｎｄＩＩＩ部位内でｐ Ｔ工Ｔろ７のＨｉｎｄＩＩＩ　−２３分節を運ぶのであるが（図３参照）、それ はＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ のＭ、Ｂｅｖａｈと＊、　−り。

Ｃｈｉｌｔｏｎにより出願者に示された。このシラスミドのＤＮＡは準備され、 ３０　ｕｇはＨｌｎｄ　工ＩＩ（５０単位）とＢａｍＨＩ　’（５０単位）と共 に分解される。１．１　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａ＋ｎＨＩ分節はアがロース ケゞル電気泳動後ガラスピーズ上の吸着により純化される（　Ｖｏｇｅｌｓｔｅ ｉｎとＧ１１１．ｅｓｐｉｅ、１９７９）、純化された分節（０，５ｕｇ　）は ｐ７３Ｒ３２７の２．９　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｂａｍ）（１分節に加えら れる。ＤＮＡりが一ゼ（２０単位、４時間、２２°Ｃ）で処理後、起因プラヌベ ドはに、ｃ○１１６００細胞に挿入される。２０Ｑｕｇ／ｍｅでアムピシ、リン に対して起こるクローン抵抗は固体媒質上で選択される：２２０クローンが得ら れる。ミニプレゾゾラスミドＤＮＡはこれらのクローンのうちの６クローンから 作られ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩとＢａｍＴ−ＩＩと共に分解後１．１　ｋ？）分節の 存在と共にテストされる。正しい挿入を証明する１シラスミドは１）ＭＯＮ　４ ２と命名される。プラスミドｐＭＯＮ　４２　ＤＮＡは先の例で記されたように 準備される。

例（Ｓ：Ｍ１３１３クローン２の生起 ｄａｍ　−Ｅ、ｅＯ１ｌ細胞から準備された７　’５　ｕｇシラスミドＩＩＩＭ ＯＮ　４２　（例５に記述）は、Ｒｓａ　ＩおよびＢａｍＨＩ（各５０単位、ろ 時間、３７℃）と共に分解され、７２　Ｑ　ｂｐ　ＲｓａニーＢａｍＨＩ分節は ＮＡ　４５膜を用いて純化される。純化７２０　ｂｐ　ＢａｍＨニー　１’ｌｓ ａ　Ｉ分節のうち３　ｕｇはＭｂｏ　Ｉ　と共に分解（１０分間、７０°Ｇ）さ れ、終局はＤＮＡポリメラーゼ１および４　、ｄＮＴＰ’　ｅの巨大に１８ｎＯ ｗ分節と共に補填により鈍化させる。そのとき０．１　ｕｇ起因ＤＮＡ混合はＳ ｍａＩ（１，１位、１時間、３７°Ｃ）、カー７アルカリフオスフアターゼ（０ ，２単位）と共に先に分解されたＯｌ［１５ｕｇＭ　１３　ｍｐ　８に加えられ る。結紮（１０単位Ｔ、　ＤＮＡ　ＩＩが−ゼ１６時間、１２°Ｃ）、Ｅ、ｃｏ ｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０１細胞の感化後、数百の組みかえファージが得られる。二重 のＲＦＤＮＡは％１２の組みかえファージ運搬クローンから準備される。ＦＦＤ ＮＡ（０，１ｕｇ　）けＫｃｏＲＩ　（１１％位、１時間、３７℃）と共に分割 され、　”’　ｐ−ｄＡＴＰとＫｌｅｎＯｗポリメラーゼと共に終局分類されＢ ａｍＨＩ（１酢位、１時間、６７℃）と共に再分解される。ＥｃｏＲＩおよびＢ ａｍＨＩ部位はＳｍａ■部位を補う。そのため２６０　ｂｐ　Ｍｂ○１分節を含 むクローンは、６％ポリアクリラマイドデル上の電気泳動とオートラジオグラフ ィー後分類される２　７０　ｂｐ分節を生ずるように同定される。１２クローン のうちの４つはこの分節を運搬する。挿入の定位はＥ（！ＯＦＩ　−分割とＩ（ ｉｎｆＩ　（１単位、１時間、６７℃）をもった終局分類ＲＦＤＮＡ　（０，Ｌ ：、ｑｇ　）の分解により決定される。

５ ＨＩｒｆｆＩは１度目は分節６′終了から９９　’ｂｐ、２度目はＮＯＳコドン 領域に最も近い終局から４２　ｂｐを２６０ｂｐＭｂｏＩ分節を分割する。各定 位の２クローンが得られる。１クローンは図８に示されるようにＭ−２として分 解、２６０１）１）分節はＫｃｏＲＩ部位と共に分節の６′終了で含まれる。Ｍ 　−２ＲＦ　ＤＮＡはＭｅｓｓｉｎｇ他１９８１の手順で準備された。

例７　：　ｐＭＯＮ　７５およびｐＭＯＮ　７６の生起５０　ｕｇＭ　−２ＲＦ 　ＤＮＡ　（例６に記述）は５０単位のＥｃＯＲ工および５０里位ＢａｍＨＩと 共に２時間、６７℃で分解される。２７０　ｂｐ分節（１ｕｇ　）はアがロース ダルおよびＮＡ−４５膜を用いて純化される。シラスミド１）ＭＯＮ　５８　（ 例４に記述）はＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（各５０　ｕｇ、５０単位、２時間 、６７°Ｃ）と共に分解、１３００　ｂｐ分節はＮＡ　−４５膜を用いて純化す る。

２７　Ｄ　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ　（０，１ｕｇ）および１３００ｂ ｐＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ（Ｑ、５　ｕｇ　）で分節は混合され、Ｔ、ＤＮＡ １）が−ゼ（２単位）１２時間、１４°Ｃで処理される。

７０℃で１０分間加熱し、りが−ゼを不活性化したあと、混合はＥｃｏＲＩ　（ １０単位）で１時間、３７°Ｇで処理、その後不活性化するために７０”Ｃ：、 １０分間ＫｃｏＲＩを加熱する。これは図９に示されるように、キメラＮＯ８− ＮＰＴ　ＩＩ　−ＮＯ８遺伝子集合を１．６ｋｂ分節上に完成する。

シラスミドｐＭＯＮ　３８はｐＢＲ３２７のＨｉ、ｎｄＩＩＩ部位内に挿入され たｐＴｉＴ　３７　ＨｉｎｄＩＩＩ　−２３のクローンである（　５ｏｂｅｒｏ ｎ他、ｉ　９８Ｑ　Ｌ　ｐＭＯＮろＢｎｕＡ（２０膜ｇ）はＥＣ０ＲＩ　（２０ 単位、２時間、３７℃）およびカーフアルカリフォスファターゼ（口、２単位、 １時間、６７°Ｃ）と共に分解される。ｐＭＯＮ　３３　ＤＮＡ反応はフェノー ルと共に抽出され、エタノールと共に促進され、２Ｑｕ７のｉ　Ｑ　ｍＭＴｒｉ ｓ−Ｈｃｌ　、１　ｍＭＥＤＴＡ　、　ｐＨ３内で乾燥され再停止され４）。

０．２　ｕｇの分割ｐＭＯＮ　３３　ＤＮＡは上述のキメラ遺伝子混合に加えら れる。混合はＴ４ＤＮＡ　リが−ゼ（４５位、１時間、２２℃）で処理され、Ｆ ｂ塩化物処理Ｌ　Ｃｏ１１Ｃ６Ｄロｒｅｃ　Ａ　５６細胞と共に変換されるため に混合される。アムピシリン抵抗（２０Ｄ　ｕｇ／ｍ１）−ロニーの選択をする 平面培養後、６３の潜在性候補が得られろ。プラスミドＤＮＡのアルカリミニプ レプはこのうちの１２で作られ適正な構成のための限定エンドヌクレアーゼによ り選別される。１．５　ｋｂ　ＥｃｏＦＩ分節および新Ｂｇｌ　ＩＩ部位を含む プラスミドＤＮＡ’　ｅはＨａｍＨＩと共に分解され、１．５　ｋｂ　ＥｃｏＲ Ｉ分節の定位を決める。それぞれの挿入定位の１つが選ばれる。１プラスミドは 図９に示されるようにｐＭＯＮ　７５および他のｐＭＯＮ　７６と命名される。

これらのプラスミドからＤＮＡは先の例において記されたように準備される。

７７ １．５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ分節けＥｃＯＲＩ分解によりｐＭＯｋｌ　７５あるい はｐＭＯＮ　’７６がら削除され、先の例に記述したようにアがロースデル電気 泳動後純化される。プラスミドｐＭＯＮ　１２０　（別に出願”植物細胞変換の プラスミド“先に引用）からの５　ｕｇ　ＤＮＡはＥＣ０ＲＩと共に分解、カー ７アルカリフオスフアターゼで処理する。フェノール蛋白分離およびエタノール 析出後、糸状ＤＮＡのＫｃｏＲＩ分割ｐＭＯＮ　１２０はｒ］、５　ｕｇｌ、５ 　ｋｂ　Ｅ（！ＯＲＩキメラ遺伝子分節と共に混合される。混合は、２単位のＴ 、　ＤＮＡ　ＩＪガーゼにより１時間、２２℃で処理される。

Ｅ、ｃｏｌｉ細胞の変換（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９Ｂ２）およびスペクチノマ イシン（５０ｕｇｌｍｉ　）に抵抗を示すコロニーの選択後、数千のコロニーが あられれる。そのうちの６コロニーが選ばれ、育てられてプラスミドミニプレグ が作られる。プラスミドＤＮＡ’　ｓは］１ｃｃｏＦ、工と共に分解され、１． ５ｋｂキメラ遺伝子挿入がチェックされ、ＢａｍＨＩと共に挿入定位を決定する 。ＢａｍＨＩ分解は、ｐＭＯＮ　１２８内のキメラ遺伝子がｐＭＯＮ　１２０の 完成ツバリン合成物遺伝子と同じ方向に転写されることを示す。１）ＭＯＮ　１ ２９内の挿入定位はｐＭＯＮ　１２８内のそれ（挿入定位）に対し反対側になる ：　ｐＭＯＮ　ｌ　２９の分解における付加１．５　ｋｂ　ＢａｍＨＩ分節の出 現はシラスミドｐＭＯＮ　１２９が図１０で示されるように、キメラＮＯ８−Ｎ ＰＴＩＩ　ＮＯ８遺伝子の直列複写の連撮を示す。

７８　蒲昭ＧＯ−５００７９Ｇ　（２２）ＣａＭＶ　ＤＮＡを含むシラスミドは 、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、　ＤａｖｉｓのＲ，Ｊ、 ５ｈｅｐｈｅｒｄ博士からＭｏｎ５ａｎｔｏ　Ｃｏｍｐａｎｙへ示された。出願 者の最良の知識と信念にとって、これらのプラスミド（ｐＯ８Ｉと命名）はＣＭ 　４−１８４　（Ｈｏｗａｒｔｈ他、１９１ｊ１）と命名されるＣ’ａＭＶ鎖の 完全なゲノムのｐＢＲ３，２２シラスミドの５ａＩＩ限定部位への挿入により得 られる。Ｅ、ｃＯ１ｉ細胞はｐＯ８Ｉと共に変換され、アムピシリン（Ａｍｐ　 ”　）に抵抗を示し、テトラサイクリン（Ｔｅｔ”　）に感応性がある。

この発明に用いられ得るＣａＭＶ　ＤｉＪＡの分離に適したＣａＭＶの多（の菌 株は公に有効である；参照、例、ｐｏＳＩ　ＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩと共に分割 される。６つの小分節はＮＡ−４５膜を用いて０．８チアガロースゲル上の電気 泳動後純化される（　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｕｅｌｌ。

Ｋｅｅｎｅ　ＮＨ）　ｏ最小分節の大きさは約５００　ｂｐで１９８プロモータ を含む。二の分節は６％アクリラマイドデル上でさらに純化される。この分節の シーフェンスを変えない、多ぐの処置の後（図２８に示す）、それはＭｂｏ　Ｉ 　と共に分解されて４５５　ｂｐ　ＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｍｂｏ　Ｉ分節を生起す る。この分節はＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩからｐＭＯＮ　７５　（例７に記述 、図９に示す）を分解することにより得られた１　２５０　ｂｐ分節と混合され る。この分節はＮＰＴＩＩ構成シー構成シークコンスＯ８ろ′−非翻訳領域を含 む。２つの分節は融和性のあるＭｂｏ　Ｉ　およびＢｇ］■工突出部により共に 結紮され、ＣａＭＶ　（１９Ｓ　’）−ＮＰＴＩＩ−、ＮＯＳキメラ遺伝子を含 む分節を生起する。

この分節はＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩと共に結紮され、ｐｈｌＯＮ１２０ 内に挿入される。起因プラスミドは図２９に示されるようにｐＭＯＮ　１５６と 命名される。

プラスミドｐＭＯＮ　１５６はＥ、Ｃｏ１１細胞内ＩＣ１またＴ−ＤＮＡ緑によ り囲まれたＣａＭＶ　（１９Ｓ　）　−ＮＰＴＩＩ　−ＮＯＳキメラ遺伝子をも つ相互融和性のあるＴ１プラスミドを形成するＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎＳ細 胞内に続いて挿入される。相互融和プラスミドを含むＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ細胞は、ペチュニア細胞と共に相互培養される。相互培養ペチュニア細胞は カナマイシンを含む媒質上で培養される。相互培養ペチコーニア細胞の発生は、 カナマイシンを５０　ｕｇ／ｍｌまで含む媒質上でコロニーを残し、生産する。

これはＣａＭＶ　（１９ｓ　）　−ｈ＋ｐｒＩＩ　−ＮＯ３遺伝子がペチュニア 細胞内に表示されることを示す。この結果は植物細胞ＤＮＡ変換の５ｏｕｔｈｅ ｒｎ　ｂｌ○ｔ　ａｒｚａｌｙｓｉｓにより確認された。

プラスミドｐＭＯｈ＋　７２は１．３　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ分節 をバクテリア転位Ｔｎ　５　（ＮＰＴＩＩ構成シ−フェンスを含む）から、Ｈｉ ｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩと共に分解されたＰｓｔＩ　−ｐＢＲ３２７ゾラス ミド内に挿入することに０ より得られる。このプラスミドはＢｇｌＩＩおよびＰｓｔ　Ｉと共に分解され、 ＮＰＴＩＩ構成シー構成シークコンスる。

ｄａｍ−細胞からのプラスミドｐＭＯＮ　１　［Ｉ　Ｄ　１　（例１に記述、お よび図６に示す）はＢｇｌ　Ｉ　ＩおよびＰｓｔ　Ｉ　と共に分解され、ＮＰＴ ＩＩ構成シー構成シークコンス共に２１　ｓ　ｂｐ分節を得る。この分節はＭｂ ｏＩ　と共に分解され、１９４　ｂｐ分節を得る。

三重結紮は（ａ）　ｐＭＯＮ　７２の巨大Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢＳＩＩＩ分節；（ｂ ）　ｐＭｏＮｌ　００１よりのＰｓｔ　Ｘ　Ｍ−００Ｉ　分節；（Ｃ）すｌ（て の３読みこみわく内の終了コドンをもつＢｇｌＩＩおよびＭ’ＯＯＩ　終了と共 に合成連鎖を用いることにより行なわれる。Ｅ、ｃｏｉｉ細胞の変換およびアム ピシリン抵抗コロニーの選択後、ＡｍｐＲコロニーからのプラス２ドＤＮＡは分 析される。シラスミドをめ・られる構成と共に含むコロニーが確認される。この プラスミドは図３０に示されるようにｐλＩＯＮ　１１０と命名される。

ＮＰＴＩＩ構成シー構成シークコンス了をｐＭＯＮ　１１０内の５′部に加える ためにｐλ１ＯＮ１１０はｘｈｏ　Ｉて処理される。起因突出終了部は補填され てＫ　１　ｅ　ｒｒ　ＯＷポリメラーゼおよび４デオキシヌクしオチド三リン酸 塩（ｃｌＮＴＰ’ｓ　）、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇ−Ｃの処理により鈍化終了をもたらす 。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼは加熱により不活性化され、分節ばＰｓｔＩ　と共 に分解され、６．６ｋｂ分節は純化される。プラスミド１）ＭＯＮ　７６　（例 ７に記述、図９に示す）は！（ｉｎｄＩＩＩで分解され補填されて鈍化終了をｘ ｌｅｎｏｗポリメラーゼおよび４　ｄ　ＮＴＰ’　ｓと共にもたらし、Ｐｓｔ　 Ｉ　と共に分解される。１１００ｂｌ）分節は純化され、それはＮＰＴＩＩ構成 シークエンスの１部およびツバリン合成物（ＮＯ８）　３′−非翻訳領域を含む 。この分節は、５．６ｋｂ分節と共にｐＭＯＮ　１１０から結紮される。混合は Ｅ、ｃＯ１ｉ細胞を常に変換する；ＡｍｐＲ細胞は選択され請求められる構成を もつシラスミドのあるコロニーが確認される。

このシラスミドは図６１に示されるようにｐＭＯＮ１３２と命名される。プラス ミドｐＭＯＮ　９３　（図２８に示す）はＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉと共に分解され、 ４７６　ｂｐ分節が分離される。この分節はＭｂｏＩ　と共に分解され、４５５ 　ｂｐ分節が純化される。そしてそれはＣａＭＶ（１９８）プロモータ領域およ び５′−非翻訳領域を含む。プラスミドｐＭＯＮ　１３２はＥｃｏＦ、Ｉおよび ＢｇｌＩＴと共に分解され、１２５０　ｂｐ分節を（１）合成連鎖が６つ全部の 読みこみわくにおいて終了コドンと共に準備されること；　（２）　ＮＰＴ　Ｉ 　Ｉ構成シーフェンス’　（３）　ＮＯ８３／−非翻訳領域と共に得る。これら ２分節は一致したＭｂｏ　ＩおよびＢｇｌＩＩ終了を通して共に結合され、Ｃａ ＭＶ（１９８）−ＮＰＴＩＩ　−ＮＯＳキメラ遺伝子を生起する。

この遺伝子ばＩ）ＭＯＮ　１２０に挿入される。ｐＭＯＮ　１２０はＨｉｎｄＩ ＩＩおよびＥｃｏＲＩと共に分解され、プラスミドｐＭＯＮ　１５５を図３２に 示すように生起する。

プラスミド１）ＭＯＮ　１５５はＴ１プラスミド、ｐＴｉＢ６５３を含むＡ、　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｇ　Ｖ　３ＩＩＩ細胞内に挿入される。

ｐＭＯＮ　１５５シラスミドは単−交差事を用いてＴ１プラスミドと共に相互融 和プラスミドを形成する。この相互融和プラスミドを含む細胞はＡｍｅｒｉｃａ ｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎと共に預けられるＡＴＣＣ 加入番号３９３３６に指定されている。こ、の発明のキメラ遺伝子を含む分節は 相互融和プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩから分解することにより 、また１、７ｋｂ分節を純化することにより、得ることができる。これらの細胞 はペチュニア細胞を変換するために用いられ、そのペチュニア細胞は少な（とも １００υｇ７ｍｌカナマイシンを含む媒質上で育つようにされている。

プラスミドｐＯ８工（例９に記述）ば°Ｂｇ１工Ｉ　Ｊ−共に分解され、１２０ ０　ｂ、ｐ分節は純化される。この分節はろ２Ｓノロモータ領域および５′−非 翻訳領域の１部を含む。それはＢａｍＨＩおよびＢｇｌ　ＩＩと共に分解されて いるプラスミドｐＳＨＬ　７２内に挿入される（　ｐＳＨＬ　７２はｐＡＧ０６ ０と機能上等しい。Ｃｏ１ｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ他、１９８１に記述）。起 因プラスミドは図３３に示されルヨウにｐＭＯＮ　５　Ｑと命名される。

クローンＢｇｌ　ＩＩ分節はポリアデニル部位とシテ３２　Ｓ　ＲＮＡ転写のた めに作用するＤＮＡ領域を含む。このポリアデニル領域は次のように移動される ：　ｐＭＯＮ５０　ｋＬ　ＡＶａ　ＩＩ　ト共に分解され、１１ｏｏｂｐ分節が 純６ 化される。この分節はＥｃ　ｏＲＩ　およびＥｃ　ｏＲＶと共に分解される。起 因１９０　ｂｐ　ＥｃｏＲニーＥＣ０ＲＶ分節は純化され、プラスミドｐＢＲ３ ２７に挿入され、それはＥｃｏＲＩおよびＥ’ｃｏＲＶと共に分解される。起因 プラスミド、］）ＭＯＮ　８１は１９０　ｂｐ　ＥｃＯＲＶ　−ＥｃｏＲＩ分節 上のＣａＭＶ　３２　Ｓプロモータを含む。図６６に示される通りである。

Ｃａ、ＭＶ　（３２Ｓ　）の純粋なプロモータ領域を確かにすることはｐＭＯＮ 　８１内にあられれ、分節の５’（ＥｃｏＲＶ）終了に隣接する領域が次の方法 でｐＭＯＮ　３　ｉに挿入される。ｄａｍ−細胞によりを備されるシラスミドｐ ＭＯＮ５０はＥ　ｃ　ｏ　Ｒ工およびＢｇｌ、ＩＩと共に分解され、起因１５５ ０　ｂｐ分節は純化され、ＭｂｏＩ　と共に分解される。起因７２５　ｂｐ　Ｍ ｂｏＩ　分節は純化され、プラスミドｐｋｃ　７　！　ＲａＯとＲｏｇｅｒｓ、 １９７９　）の独特なりｇｌＩＩ部位に挿入して、プラスミドｐＭＯＮ　１２５ を得る。図３４に示される通りである。２つのλζｂｏＩ終了に隣接する塩基の ンークエンスばＢｇｌ　Ｉ　Ｉ部位を再生し、７２５１）ｐ分節なりｇＩＩＩと 共に削除されろ。

３２Ｓプロモータを運ふ分節を発生させるために、７２５　ｂｐ　ＢｇｌＩＩ分 節はＩ）ＭＯＮ　１２５から純化され、続いてＥｃｏＲＶおよびＡｌｕ　Ｉ　と 共に分解され、１９０　ｂｐ分節を生ずる。プラスミドｐＭＯＮ　３１ばＢａｍ ＨＩと共に分解され、Ｋｌｅｎｏｗポリノラ−ゼで処理し、ＥｃｏＨＶと共に分 解される。６．１ｋｂ　ＥｃｏＦｔ、Ｖ　−ＢａｍＨＩ　（ｂｌｕｎｔ　）分節 は純化され、’Ｉ　９　Ｑ　ｂｐ　ＥｃｏＲＶ　−Ａｌｕ　Ｉ分節ト共に混合、 ＤＮＡ　ＩＪが一ゼで処理する。変換およびアムピシリン抵抗細胞の選択に従い 、ＣａＭＶ　（３２Ｓ　）プロモータシーフェンスを３８０　ｂｐ　ＢａｍＨニ ーＥｃｏ五分節上に運ぶプラスミドｐＭＯＮ　１７２が荷られる。図３５に示さ れる通りである。この分節＋？　３２　ｓ　ＲＮＡのためにポリアデニル領域を 運ぶことはしない。Ａｌｕ　丁終了の補填ＢａｍＨＩ部位への結紮はＢａｍＨＩ 部位を再生する。

ＣａＭＶ　（３２Ｓ　）　７’ロモ−タに隣接した限定エンドヌクレアーゼ部位 を再配列するために３８０　ｂｐ　ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ分節はｐＭＯＮ　１ ７２がら純化、Ｋ１ｅｎＯＷポリメラーゼで処理し、ファージＭ　１３　ｍＴ） 　８の独特Ｓｍａ　１部位に挿入される。１つの再組みかえファージＭ１２は３ ８０　ｂｐ分節を図７６に示される定位に運ぶ。このファージからの複製形成り ＮＡは３２ｓプロモ一タ分節をＥＣ０ＲＩ　（５’　）　−ＢａｍＨＩ　（３’ 　）分節上に運ぶ。

キメラ遺伝子（ＣａＭＶ　（３２ｓ　）７０ロモーク領域ＮＰＴＩＩ構成ンーク エンス−ＮＯ８３’−非翻訳領域）を運ぶプラスミドは次のように集合される。

３８０　ｂｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ　ＣａＭＶ　（３２Ｓ’　）プロモータ領 域はファージＭ１２ＲＦＤＩｑＡがら純化され、１２５０　ｂｐ　ＢｇＩＩ’Ｉ 　−ＥｃｏＲＩ　ＮＰＴ　ＩＩ　−ＮＯ８分節と共にｐＭＯＮ　７５から混合さ れる。これら２つの分節の一致したＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ終了を通シテノ 結合は１．６ｋｂ　ＣａＭＶ　（３２８）　−ＮＰＴ　ＩＩ　−ＮＯＳキノラ遺 伝子に起因する。この遺伝子は８５ 定位内のＢｃｏＲＩ部位で１）ＩＴ！ＯＮ　１２　Ｄ　Ｋ挿入される。起因プラ スミド、ｐＭＯＮ　１８５および１８４に図３７にあられれる。

これらのプラスミドはペチュニア細胞を変換するために用いられる。変換細胞は １０Ｑ　ｕｇ　７ｍｌカナマイシンを含む媒質上での成長を可能にする。

参考文献 元原稿参照（１）こと。（Ｐ７４０１０〜Ｐ７７■６）浄書（パＪ古に１てなし ） 狛９図 Ｅｃｏ　Ｒｌ 晃１０図 ＮＯ５Ｉ７Ｊ鯨。

嶌１５図 ８０１１ポリ−ＡＡｌ１４立 鳥３６図 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 牲猜（７）８猫’＞Ｑ４’７’ｌｔ”ｌ’ｔ＝９迅・σしパＡメづ遼イ多ごゲ３ 、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 昭和５９　年１２月２５日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 手続補正書（自発） 昭和５９年１１月ｆｑ日 特許庁長官殿 ２、発明の名称 植物細胞の形質発現にふされしいキメラ遺伝子３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和　年　月　日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書及び請求の範囲翻訳文 国際調査報告 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　キメラ遺伝子は次の領域を順に構成する植物細胞の１ないしそれ以上の型 の中に発現される。 ａ、植物細胞に自然に発現される遺伝子から誘導されるプロモータ領域； ｂ、５′−非翻訳領域； Ｃ，ゾロモータ領域に関して異種の構成シーフェンス； この中でプロモータ領域は植物細胞内の構成シーフェンスの転写をひきおこす。 ２、　キメラ遺伝子は次の領域を順に構成する植物細胞の１ないしそれ以上の型 の中に表われる。 ａ、植物細胞に自然にあられれる遺伝子から誘導されるプロモータ領域； ｂ、５′−非翻訳領域； Ｃ，フロモータ領域に関して異種の構成シーフェンス； この中でキメラ遺伝子あるいは原遺公子はその構成遺伝子を含む第２核酸シーク エンスに対するプロモータ領域を含む第１核酸シークエンスの試験管内結紮によ り生起される。 ３、　キメラ遺伝子は次の領域を順に構成する植物細胞の１ないしそれ以上の型 の中に表われる。 ７ れるプロモータ領域； ｂ、５′−非翻訳領域； Ｃ，プロモータ領域に関して異種の構成シーフェンス； この中でキメラ遺伝子は、変１負されない植物訓胞トコ叱べて、変換された植物 細胞において表切型の変質をひきおこすに足りるレベルで１ないしそれ以上の型 の植物細胞内に表わされる。 ４、　キメラ遺伝子は次の領域を順に構成する植物細胞の１ないしそれ以上の型 の中に表われる。 ａ、植物細胞に自然にあられれる遺伝子から誘導されるプロモータ領域； ｂ、５′−非翻訳領域； Ｃ，ゾロモータ領域に関して異種の構成シーフェンス； この中でキメラ遺伝子は植物から９動ある（・は鈍化され得る多量の起因ポリペ プチドを生起するに足りるレベルで、１ないしそれ以上の型の植物細胞内に表わ される。 ５６′−非翻訳領域を含む請求の範囲のキメラ遺伝子は自然に植物細胞内に表わ される遺伝子から誘導される。 ６６′−非翻訳領域を含み、ポリアデニル信号を含む請求の範囲１のキメラ遺伝 子は自然植物細胞内に表わされる遺伝子から誘導される。 Ｚ　その中に５′−非翻訳領域のある請求の範囲１のキメラ遺伝子が自然に植物 細胞に表わされる遺伝子から誘導される。 ８、　請求の範囲１のキメラ遺伝子はプロモータ領域および構成シーフェンスの 開始コドンの間の開始コドンの欠如により特徴づけられる。 ９　請求の範囲１のキメラ遺伝子は仮の開始コドンおよび終了コドンをプロモー タ領域と構成シーフェンスの間に含み、その中の仮の開始コドンおよび終了コド ンは同じ読みこみわくの中にある。 １０、請求の範囲１のキメラ遺伝子はその中でプロモータ領域が自然にアグロバ クテリウム属のバクテリア内におこるＴ１あるいはＦ、ｉプラスミドの遺伝子か ら誘導される。 １１　請求の範囲１のキメラ遺伝子は、この中でプロモータ領域が自然に変換さ れない植物のゲノム内にある遺伝子から誘導される。 １２、請求の範囲１のキメラ遺伝子は、その中でゾロモータ領域が１ないしそれ 以上の植物細胞を感染させ得るウィルスから誘導される。 １６、請求の範囲１３のキメラ遺伝子は、その中のウィルスはカリフラワーモザ イクウィルスの鎖である。 １４　請求の範囲１３のキメラ遺伝子はそのウィルスの鎖によって普通に感染さ れない１ないしそれ以上の植物細胞内に表わされる。 １５　請求の範囲１のキメラ遺伝子は、その中で構成シーフェンスが哨乳類遺伝 子から誘導される。 １６　請求の範囲の遺伝子は、その中で構成シーフェンスがバクテリア遺伝子か ら誘導される。 １７　請求の範囲１のキメラ遺伝子は、その中で構成シーフェンスがポリペプチ ドの翻訳を暗号化し、それは１ないしそれ以上の型の植物細胞あるいは変換され ない植物細胞または植物に有毒な濃度の植物毒物質に身をさらしても生き残れる ような植物を表１する、。 １８、請求の範囲１７のキメラ遺伝子は、その中で植物毒物質が変換されない植 物細胞あるいは分化された植物を再生し得ない未分化植物組織を表現する。 １９　請求の範囲１７のキメラ遺伝子は、その中で植物毒物質が除草剤を構成す る。 ２０　請求の範囲１のキメラ遺伝子は、その中で構成シーフェンスが変換されな い植物細胞の中に自然に存在する遺伝子から誘導され、またその中で構成シーフ ェンスはそれが誘導される遺伝子よりほかに、植物遺伝子から誘導されるプロモ ータ領域の支配下に配置される。 ２１、請求の範囲１のキメラ遺伝子はその中で構成シーフェンスの１部がプロモ ータに関して異体同型である。 ２２　請求の範囲１のキメラ遺伝子を含む微生物。 ２３、請求の範囲２のキメラ遺伝子を含む微生物。 ２４、請求の範囲乙のキメラ遺伝子を含む微生物。 ２５　請求の範囲４のキメラ遺伝子を含む微生物２６、微生物の培養はシラスミ ドを含み、それは細胞培養に含まれたシラスミドの重要な特色を有する。細胞培 養は３９２６’４および３’９２６５から成るグループから選択されたＡＴＣＣ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒを持つ。 ２Ｚ　微生物の培養は細胞培養の重要な特色を有し、細胞培養は３９２６４およ び３９２６５がら成るグループから選択されたＡＴＣＣａｃｃｅｓｅｉｏｎ　ｎ ｕｍｂｅｒを持つ。 ２８、微生物の培養は細胞培養から下ろされ、細胞培養３９２６４および３９２ ６５から成るグループから選択されたＡＴＣＣａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅ ｒを持つ。 ２９　植物細胞内構成シーフェンスの表示上のＤＮＡの第１環節の評価し得る効 果の方法、構成：ａ、ＤＮＡの第１環節のマーカーポリペプチドを暗号化する構 成シーフェンスを含むＤＮＡの第２環節への結紮。 ｂ、結紮されたＤＮＡ環節を変換されない植物細胞ケ゛ツムに挿入すること。こ の変換されない植物細胞は、結紮されたＤＮＡ環節の挿入に先立ち、マーカーポ リペプチド内で不完全であり、それにより変換植物細胞を生起する。 Ｃ６植物細胞の培養。 ｄ、変換植物細胞内のマーカーポリペプチドの量が、変換されない植物細胞内の それより大きいかどうかを決定すること。 １ ６０、請求の範囲２９の方法は、その中でマーカーポリペプチドが、植物細胞内 にある場合、１ないしそれ以上の植物毒物質に抵抗する植物細胞をひきおこす。 ３１．１ないしそれ以上の型の植物細胞内の表示に足るキメラ遺伝子は、請求の 範囲２９の方法により限定されたＤＮＡの第１環節および構成シーフェンスを構 成する。構成シーフェンスはＩ）ＮＡの第１環節に関しては異種である。 ６２　微生物は請求の範囲３１のキメラ遺伝子を含む。 浄書（内容に変更なし）