JP6458218B2 - 高オレイン酸油 - Google Patents
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Description
i)脂肪酸がパルミチン酸およびオレイン酸を含み、
ii)脂質の少なくとも95重量%がTAGであり、
iii)脂質の全脂肪酸含量の約90重量%〜約95重量%がオレイン酸であり、
iv)脂質の全脂肪酸含量の約3.1重量%未満がパルミチン酸であり、
v)脂質は約0.037未満のオレイン酸不飽和化係数(ODP)および/または約0.063未満のパルミチン酸−リノール酸−オレイン酸の値(PLO)を有する。
a)脂質の全脂肪酸含量の約90重量%〜約94重量%、または約91重量%〜約94重量%、または約91重量%〜約92重量%、または約92重量%、または約93重量%がオレイン酸である、
b)脂質の全脂肪酸含量の約3重量%未満、または約2.75重量%未満、または約2.5重量%未満、または約3重量%、または約2.75重量%、または約2.5重量%、または約2.3重量%がパルミチン酸である、
c)脂質の全脂肪酸含量の約0.1重量%〜約3重量%、または約2重量%〜約3重量%、または約3重量%、または約2重量%が多価不飽和脂肪酸(PUFA)である、
d)脂質の全脂肪酸含量の約3重量%未満、または約2.5重量%未満、または約2.25重量%未満、または約3重量%、または約2.5重量%、または約2.25重量%がリノール酸である、
e)脂質の全脂肪酸含量の約1重量%未満、または約0.5重量%未満がα−リノレン酸(ALA)である、
f)脂質の全脂肪酸含量の約0.5重量%〜約1重量%が18:1Δ11である、
g)脂質の全脂肪酸含量のODPは約0.033〜約0.01、または約0.033〜約0.016、または約0.033〜約0.023であるか、または約0.03、または約0.02、または約0.01である、
h)脂質の全脂肪酸含量のPLO値が、約0.020〜約0.063、または約0.020〜約0.055、または約0.020〜約0.050、または約0.050〜約0.055、または約0.063、または約0.055、または約0.050、または約0.040、または約0.030、または約0.020である、
i)脂質の全脂肪酸含量の約90重量%〜約96重量%、または約92重量%〜約96重量%、または約93重量%、または約94重量%が、一価不飽和脂肪酸である、
j)脂質は、約0.02未満、または約0.015未満、または約0.005〜約0.02のオレイン酸一価不飽和率(OMP)を有する、
k)脂質は、精製油の形態である、
l)脂質は水素化されていない。
1)脂質の全脂肪酸含量の約91重量%〜約94重量%がオレイン酸である、
2)脂質の全脂肪酸含量の約2.75重量%未満がパルミチン酸である、
3)脂質の全脂肪酸含量の約3重量%未満がリノール酸である、
4)α−リノレン酸は、脂質の脂肪酸含量中で検出不能である、
5)脂質の脂肪酸含量のODPは、約0.033〜約0.023、または約0.033〜約0.018である、
6)脂質の脂肪酸含量のPLO値が、約0.020〜約0.063である、
7)脂質の全脂肪酸含量の約96重量%、または約93重量%、または約94重量%が、一価不飽和脂肪酸である、
8)脂質は、約0.02未満、または約0.015未満、または約0.005〜約0.02のオレイン酸一価不飽和率(OMP)を有する。
1)脂質の全脂肪酸含量の約91重量%〜約94重量%がオレイン酸である、
2)脂質の全脂肪酸含量の約2.75重量%未満がパルミチン酸である、
3)脂質の全脂肪酸含量の約3重量%未満がリノール酸である、
4)α−リノレン酸は、脂質の脂肪酸含量中で検出不能である、
5)脂質の全脂肪酸含量の約96重量%、または約93重量%、または約94重量%が、一価不飽和脂肪酸である、および
6)脂質は、約0.02未満、または約0.015未満、または約0.005〜約0.02のオレイン酸一価不飽和率(OMP)を有する。
a)全ステロール含量の約1.5%〜約4.5%、または約2.3%〜約4.5%がエルゴスト−7−エン−3β−オールである、
b)全ステロール含量の約0.5%〜約3%、または約1.5%〜約3%がトリテルペノイドアルコールである、
c)全ステロール含量の約8.9%〜約20%がΔ7−スチグマステロール/スチグマスト−7−エン−3β−オールである、および
d)全ステロール含量の約1.7%〜約6.1%がΔ7−アベナステロールである、のうちの1つ以上またはすべてを含む。
i)油を含む、および/または油を含む油糧種子を生成する植物を生成することができる油糧種子を得ることであって、油糧種子の油含有物は本明細書に定義されるような脂質である、油糧種子を得ることと、
ii)油糧種子から油を抽出し、それによって油を生成することと、を含む。
i)油含有物がグリセロールにエステル化された脂肪酸から成るトリアシルグリセロール(TAG)を含み、および/または油含有物がグリセロールにエステル化された脂肪酸から成るトリアシルグリセロール(TAG)を含む種子を生成する植物を生成することができ、
a)脂肪酸がパルミチン酸およびオレイン酸を含み、
b)種子の油含有物の少なくとも95重量%がTAGであり、
c)種子の油含有物の全脂肪酸の約75重量%〜約95重量%がオレイン酸であり、
d)種子の油含有物の全脂肪酸の約5.1重量%未満がパルミチン酸であり、
e)種子の油含有物は、約0.17未満のオレイン酸不飽和率(ODP)、および/または約0.26未満のパルミチン酸−リノール酸−オレイン酸(PLO)値を有する、ベニバナ種子を得ることと、
ii)ベニバナ種子から油を抽出し、それによって油を生成することと、を含み、
ベニバナ種子が、第1の外因性ポリヌクレオチドを欠失している対応するベニバナ種子と比較して、発育中のベニバナ種子においてΔ12デサチュラーゼ(FAD2)遺伝子の発現を減少させることができる第1のサイレンシングRNAをコードする第1の外因性ポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、発育中のベニバナ種子においてポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結される。
1)FAD2遺伝子は、CtFAD2−1遺伝子、CtFAD2−2遺伝子、およびCtFAD2−10遺伝子、好ましくはCtFAD2−1遺伝子および/またはCtFAD2−2遺伝子のうちの1つ以上またはそれぞれである、ならびに/または
2)FATB遺伝子は、CtFATB−3遺伝子である、ならびに/または
3)FAD6遺伝子は、CtFAD6遺伝子である。
a)種子の油含有物の全脂肪酸の約80重量%〜約94重量%、または約85重量%〜約94重量%、または約90重量%〜約94重量%、または約91重量%〜約94重量%、または約91重量%〜約92重量%、または約92重量%、または約93重量%が、オレイン酸である、
b)種子の油含有物の全脂肪酸の約5重量%未満、または約4重量%未満、または約3重量%未満、または約2.75重量%未満、または約2.5重量%未満、または約3重量%、または約2.75重量%、または約2.5重量%が、パルミチン酸である、
c)種子の油分の全脂肪酸の約0.1重量%〜約15重量%、または約0.1重量%〜約10重量%、または約0.1重量%〜約7.5重量%、または約0.1重量%〜約5重量%、または約0.1重量%〜約3重量%、または約2重量%〜約3重量%、または約3重量%、または約2重量%が、多価不飽和脂肪酸(PUFA)である、
d)種子の油分の全脂肪酸の約15重量%未満、または約10重量%未満、または約5重量%未満、または約3重量%未満、または約2.5重量%未満、または約2.25重量%未満、または約3重量%、または約2.5重量%、または約2.25重量%が、リノール酸(LA)である、
e)脂質の全脂肪酸含量の約80重量%〜約96重量%、または約90重量%〜約96重量%、または約92重量%〜約96重量%、または約93重量%、または約94重量%が、一価不飽和脂肪酸である、
f)脂質は、約0.05未満、または約0.02未満、または約0.015未満、または約0.005〜約0.05、または約0.005〜約0.02のオレイン酸一価不飽和率(OMP)を有する、
g)種子の油含有物のODPは、約0.17〜約0.01、または約0.15〜約0.01、または約0.1〜約0.01、または約0.075〜約0.01、または約0.050〜約0.01、または約0.033〜約0.01、または約0.033〜約0.016、または約0.033〜約0.023であるか、または約0.03、または約0.02、または約0.01である、
h)種子の油含有物のPLO値が、約0.20〜約0.026、または約0.020〜約0.2、または約0.020〜約0.15、または約0.020〜約0.1、または約0.020〜約0.075、または約0.050〜約0.055、または約0.05、または約0.040、または約0.030、または約0.020である。
i)脂肪酸がパルミチン酸およびオレイン酸を含み、
ii)油糧種子の油含有物の少なくとも95重量%がTAGであり、
iii)油糧種子の油含有物の全脂肪酸の約90重量%〜約95重量%がオレイン酸であり、
iv)油糧種子の油含有物の全脂肪酸の約3.1重量%未満がパルミチン酸であり、
v)油糧種子の油含有物は約0.037未満のオレイン酸不飽和率(ODP)および/または約0.063未満のパルミチン酸−リノール酸−オレイン酸(PLO)値を有する。
i)脂肪酸がパルミチン酸およびオレイン酸を含み、
ii)種子の油含有物の少なくとも95重量%がTAGであり、
iii)種子の油含有物の全脂肪酸の約75重量%〜約95重量%がオレイン酸であり、
iv)種子の油含有物の全脂肪酸の約5.1重量%未満がパルミチン酸であり、
v)種子の油含有物が、約0.17未満のオレイン酸不飽和率(ODP)および/または約0.26未満のパルミチン酸−リノール酸−オレイン酸(PLO)値を有し、
ベニバナ種子は、第1の外因性ポリヌクレオチドを欠失している対応するベニバナ種子と比較して、発育中のベニバナ種子においてΔ12デサチュラーゼ(FAD2)遺伝子の発現を減少させることができる第1のサイレンシングRNAをコードする第1の外因性ポリヌクレオチドを含み、第1の外因性ポリヌクレオチドは、発育中のベニバナ種子においてポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結される。
a)種子の油含有物の全脂肪酸の約80重量%〜約94重量%、または約85重量%〜約94重量%、または約90重量%〜約94重量%、または約91重量%〜約94重量%、または約91重量%〜約92重量%、または約92重量%、または約93重量%が、オレイン酸である、
b)種子の油含有物の全脂肪酸の約5重量%未満、または約4重量%未満、または約3重量%未満、または約2.75重量%未満、または約2.5重量%未満、または約3重量%、または約2.75重量%、または約2.5重量%が、パルミチン酸である、
c)種子の油含有物の全脂肪酸の約0.1重量%〜約15重量%、または約0.1重量%〜約10重量%、または約0.1重量%〜約7.5重量%、または約0.1重量%〜約5重量%、または約0.1重量%〜約3重量%、または約2重量%〜約3重量%、または約3重量%、または約2重量%が、多価不飽和脂肪酸(PUFA)である、
d)種子の油分の全脂肪酸の約15重量%未満、または約10重量%未満、または約5重量%未満、または約3重量%未満、または約2.5重量%未満、または約2.25重量%未満、または約3重量%、または約2.5重量%、または約2.25重量%が、リノール酸(LA)である、
e)脂質の全脂肪酸含量の約80重量%〜約96重量%、または約90重量%〜約96重量%、または約92重量%〜約96重量%、または約93重量%、または約94重量%が、一価不飽和脂肪酸である、
f)脂質が、約0.05未満、または約0.02未満、または約0.015未満、または約0.005〜約0.05、または約0.005〜約0.02のオレイン酸一価不飽和率(OMP)を有する、
g)種子の油含有物のODPが、約0.17〜約0.01、または約0.15〜約0.01、または約0.1〜約0.01、または約0.075〜約0.01、または約0.050〜約0.01、または約0.033〜約0.01、または約0.033〜約0.016、または約0.033〜約0.023であるか、または約0.03、または約0.02、または約0.01である、
h)種子の油含有物のPLO値が、約0.020〜約0.26、または約0.020〜約0.2、または約0.020〜約0.15、または約0.020〜約0.1、または約0.020〜約0.075、または約0.050〜約0.055、または約0.050、または約0.040、または約0.030、または約0.020である。
1)FAD2遺伝子が、CtFAD2−1遺伝子、CtFAD2−2遺伝子、およびCtFAD2−10遺伝子のうちの1つ以上であり、好ましくはCtFAD2−1遺伝子および/またはCtFAD2−2遺伝子である、ならびに/または
2)FATB遺伝子が、CtFATB−3遺伝子である、ならびに/または
3)FAD6遺伝子が、CtFAD6遺伝子である。
i)配列番号1〜25、40〜43、46、または47のうちのいずれか1つに提供される配列を有するヌクレオチド、
ii)本発明のポリペプチドをコードする配列を有するヌクレオチド、
iii)配列番号1〜25、40〜43、46、または47のうちのいずれか1つに提供される配列にハイブリダイズするヌクレオチド、
iv)油糧種子植物の種子内に発現させる場合、本発明の少なくとも1つのポリペプチドをコードする遺伝子の発現を減少させるような配列を有するヌクレオチド、のうちの1つ以上を含む。
i)発育中の種子においてオレイン酸塩Δ12デサチュラーゼ(FAD2)をコードする内因性遺伝子の発現を減少させ、FAD2が、配列番号27、28、または36のうちのいずれか1つ以上、好ましくは、配列番号27および28のうちの少なくとも1つまたはその両方に提供される、アミノ酸配列を有する、
ii)発育中の種子においてパルミトイル−ACPチオエステラーゼ(FATB)をコードする内因性遺伝子の発現を減少させ、FATBが、配列番号45に提供される、アミノ酸配列を有する、および/または
iii)発育中の種子においてω6脂肪酸デサチュラーゼ(FAD6)をコードする遺伝子の発現を減少させ、FAD6が、配列番号48に提供される、アミノ酸配列を有する。
i)油糧種子植物の細胞に、本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび/または少なくとも1つの本発明のベクターを導入することと、
ii)細胞からトランスジェニック植物を再生することと、
iii)トランスジェニック植物から1つ以上の子孫植物またはその種子を任意に生成し、
それによって、トランスジェニック油糧種子植物またはその種子を生成することと、を含む。
i)第1の外因性ポリヌクレオチド、および/または
ii)第2の外因性ポリヌクレオチド、および/または
iii)第3の外因性ポリヌクレオチド、
好ましくは、3つすべての外因性ポリヌクレオチドを含む。
i)本発明の第1のポリヌクレオチドまたは本発明の第1のベクターを含む第1の親の油糧種子植物を、本発明の第2のポリヌクレオチドまたは本発明の第1のベクターを含む第2の親の油糧種子植物と交配させることと、
ii)交配からの子孫植物を両方のポリヌクレオチドまたは両方のベクターの存在についてスクリーニングすることと、
iii)(a)第1のポリヌクレオチドもしくは第1のベクター、および(b)第2のポリヌクレオチドもしくは第2のベクターの両方を含み、植物の種子の油含有物中のオレイン酸の比率の増加、およびパルミチン酸の比率の減少をさらに有する、子孫植物を選択することと、を含む。
i)第2の核酸分子を、植物の当該核酸分子にハイブリダイズすることと、
ii)少なくとも1つの他の核酸分子を、植物の当該核酸分子に任意にハイブリダイズすることと、
iii)当該ハイブリダイズするステップ(複数を含む)の生成物、または当該ハイブリダイズするステップ(複数を含む)からの生成物の不在を検出することと、を含む。
i)本発明の方法を使用して、当該植物集団の遺伝子型を決定することであって、当該植物集団が2つの植物間の交配から得られ、このうちの少なくとも1つの植物が、CtFAD2−1、CtFAD2−2、もしくはCtFAD2−10遺伝子、好ましくはCtFAD2−1およびCtFAD2−2遺伝子のうちの少なくとも1つもしくはその両方、または少なくともCtFAD2−1遺伝子の対立遺伝子を含み、当該植物の種子の発育中、当該対立遺伝子を欠失しているベニバナ植物の対応する種子と比較して、Δ12デサチュラーゼ活性レベルの低下をもたらす、当該植物集団の遺伝子型を決定することと、
ii)当該対立遺伝子の存在または不在に基づいてベニバナ植物を選択することと、を含む。
i)第1の親のベニバナ植物を第2の親のベニバナ植物と交配させることであって、前記第2の植物は、CtFAD2−1、CtFAD2−2、またはCtFAD2−10遺伝子の当該対立遺伝子を含む、交配させることと、
ii)ステップi)の交配の子孫を、第1の親の植物と同じ遺伝子型の植物と、第1の親の遺伝子型の大部分を有するが、当該対立遺伝子を含む植物を生成するために十分な回数戻し交配することと、を含み、
その対立遺伝子が、当該植物の種子の発育中、当該対立遺伝子を欠失しているベニバナ植物の対応する種子と比較して、Δ12デサチュラーゼ活性レベルの低下をもたらし、子孫植物は、本発明の方法を使用して、当該対立遺伝子の存在または不在について遺伝子型が決定される。
a)本発明の植物を、好ましくは少なくとも1000のそのような植物集団の一部として領域内で生育させることと、
b)種子を収穫することと、を含む。
i)本発明の脂質、本発明の組成物、本発明の油糧種子またはベニバナ種子、本発明の植物もしくはその一部、本発明の宿主細胞、本発明の非ヒトトランスジェニック生物もしくはその一部、または本発明の油、のうちの1つ以上を得るステップと、
ii)ステップi)の、本発明の脂質、本発明の組成物、本発明の油糧種子またはベニバナ種子、本発明の植物もしくはその一部、本発明の宿主細胞、本発明の非ヒトトランスジェニック生物もしくはその一部、または本発明の油、のうちの1つ以上を任意に物理的に処理するステップと、
ii)本発明の脂質、または本発明の組成物のうちの1つ以上の脂質、本発明の油糧種子またはベニバナ種子、本発明の植物もしくはその一部、本発明の宿主細胞、本発明の非ヒトトランスジェニック生物もしくはその一部、または本発明の油、またはステップii)の物理的に処理された生成物の少なくとも一部を、熱、化学、もしくは酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを脂質に適用することによって、工業生成物に変換するステップと、
iii)工業生成物を回収し、
それによって、工業生成物を生成することと、を含む。
i)本発明の脂質、本発明の1つ以上の脂質、本発明の油糧種子もしくはベニバナ種子、本発明の植物もしくはその一部、本発明の宿主細胞、本発明の非ヒトトランスジェニック生物もしくはその一部、または本発明の油、のうちの1つ以上を、アルコールと任意に触媒の存在下で反応させて、アルキルエステルを生成することと、
ii)任意に、アルキルエステルを石油燃料と混合することと、を含む。
配列番号1−ベニバナFAD2−1をコードするcDNA。
配列番号2−ベニバナFAD2−2をコードするcDNA。
配列番号3−ベニバナFAD2−3をコードするcDNA。
配列番号4−ベニバナFAD2−4をコードするcDNA。
配列番号5−ベニバナFAD2−5をコードするcDNA。
配列番号6−ベニバナFAD2−6をコードするcDNA。
配列番号7−ベニバナFAD2−7をコードするcDNA。
配列番号8−ベニバナFAD2−8をコードするcDNA。
配列番号9−ベニバナFAD2−9をコードするcDNA。
配列番号10−ベニバナFAD2−10をコードするcDNA。
配列番号11−ベニバナFAD2−11をコードするcDNA。
配列番号12−ベニバナFAD2−1をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号13−ベニバナFAD2−2をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号14−ベニバナFAD2−3をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号15−ベニバナFAD2−4をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号16−ベニバナFAD2−5をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号17−ベニバナFAD2−6をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号18−ベニバナFAD2−7をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号19−ベニバナFAD2−8をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号20−ベニバナFAD2−9をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号21−ベニバナFAD2−10をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号22−ベニバナFAD2−11をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号23−ベニバナFAD2−1遺伝子のイントロン配列。
配列番号24−ベニバナFAD2−2遺伝子のイントロン配列。
配列番号25−ベニバナFAD2−10遺伝子のイントロン配列。
配列番号26−切断型ベニバナFAD2−1(HO突然変異体)をコードするcDNA。
配列番号27−ベニバナFAD2−1。
配列番号28−ベニバナFAD2−2。
配列番号29−ベニバナFAD2−3。
配列番号30−ベニバナFAD2−4。
配列番号31−ベニバナFAD2−5。
配列番号32−ベニバナFAD2−6。
配列番号33−ベニバナFAD2−7。
配列番号34−ベニバナFAD2−8。
配列番号35−ベニバナFAD2−9。
配列番号36−ベニバナFAD2−10。
配列番号37−ベニバナFAD2−11。
配列番号38−切断型ベニバナFAD2−1(HO突然変異体)。
配列番号39−ベニバナFATB−1のcDNA。
配列番号40−ベニバナFATB−2をコードするcDNA。
配列番号41−ベニバナFATB−3をコードするcDNA。
配列番号42−ベニバナFATB−2をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号43−ベニバナFATB−3をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号44−ベニバナFATB−2。
配列番号45−ベニバナFATB−3。
配列番号46−ベニバナFAD6をコードするcDNA。
配列番号47−ベニバナFAD6をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号48−ベニバナFAD6。
配列番号49−RNAサイレンシングの構築体に使用されるCtFAD2−2配列。
配列番号50−RNAサイレンシングの構築体に使用されるCtFATB−3配列。
配列番号51−RNAサイレンシングの構築体に使用されるCtFAD6配列。
配列番号52−アラビドプシスサリアナ(Arabidopsis thaliana)オレオシンプロモーター。
配列番号53−亜麻リシンプロモーター。
配列番号54−ノパシンターゼ(Nos)ポリアデニル化信号。
配列番号55−オクトピンシンターゼ(Ocs)ポリアデニル化信号。
配列番号56−ol対立遺伝子の領域に対応する野生型CtFAD2−1配列。
配列番号57−フレームシフト(S−317、CW99−OL、およびLeSaf496と同じ)を有するOl対立遺伝子のCtFAD2−1配列。
配列番号58〜158−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号159〜169−Ct FAD2酵素のモチーフ。
配列番号170−野生型ベニバナ変型SU CtFAD2−1 5’UTRイントロン。
配列番号171−高オレイン酸ベニバナ変型S−317 CtFAD2−1 5’UTRイントロン。
特に具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝子学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学における)によって一般的に理解されているのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
ODP=(リノール酸(%)+α−リノレン酸(%))/(オレイン酸(%)+リノール酸(%)+α−リノレン酸(%))である。
例えば、実施例15のTG603.12(5)は、2.15%の全リノール酸およびα−リノレン酸含量、93.88%のリノール酸、α−リノレン酸 オレイン酸含量を有し、ODPを0.0229とする。
PLO=(パルミチン酸(%)+リノール酸(%))/オレイン酸(%)である。
例えば、実施例15のTG603.12(5)は、4.71%の全リノール酸およびパルミチン酸含量ならびに91.73%のオレイン酸含量を有し、PLOを0.0513とする。
OMP=(一価不飽和脂肪酸(%)−オレイン酸(%))/オレイン酸(%)
例えば、実施例15のTG603.12(5)は、1.13%のオレイン酸(0.84% C18:1Δ11+0.29% C20:1)を除いた全一価不飽和脂肪酸含量および91.73%のオレイン酸含量を有し、OMPを0.0123とする。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換可能に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。本発明のポリヌクレオチドは、その起源または操作によって、(1)天然に関連しているポリヌクレオチドのすべてもしくは一部分に関連していないか、(2)天然に連結するもの以外のポリヌクレオチドに連結するか、または(3)天然に生じない、ゲノム、cDNA、半合成、または合成起源、二本鎖もしくは一本鎖から成り得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である:遺伝子もしくは遺伝子断片のコードもしくは非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座(複数を含む)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、任意の配列のキメラDNA、核酸プローブ、およびプライマー。本発明の好ましいポリヌクレオチドには、植物細胞中で転写することができる二本鎖DNA分子、およびサイレンシングRNA分子が含まれる。
一実施形態において、本発明の細胞/種子/植物/生物は、導入された突然変異体または外因性ポリヌクレオチドを含み、内因性酵素の生成および/または活性を下方調節する、典型的に、導入された突然変異体または外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞と比較する場合、オレイン酸の生成の増加、好ましくはパルミチン酸およびPUFA、例えばリノール酸の生成の減少をもたらす。そのようなポリヌクレオチドの例には、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロRNA、内因性酵素に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および二本鎖RNAが含まれる。
RNA干渉(RNAi)は、特定のタンパク質の生成を特異的に阻害するために特に有用である。この技法は、対象となる遺伝子のmRNAまたはその一部と本質的に同一である配列およびそれに相補的である配列を含むdsRNA分子の存在に依存する。好都合に、dsRNAは、組み換えベクターまたは宿主細胞における単一のプロモーターから生成することができ、センスおよびアンチセンス配列は、配列、好ましくは非関連配列によって共有結合で結合され、標的RNAまたはその相補体と同一性を有する配列がループ構造を形成することができるが、対応する転写物中のセンスおよびアンチセンス配列がループ構造を形成する結合配列を有するdsRNA分子を形成するようにハイブリダイズすることを可能にする。典型的に、dsRNAは、中断されたパリンドロームとして配置される、逆方向反復構造においてセンスおよびアンチセンス配列を有する二本鎖DNA構築物によってコードされ、反復配列は、dsRNA分子内でハイブリダイズする配列を生成するように転写され、中断配列は、dsRNA分子内でループを形成するように転写される。好適なdsRNA分子の設計および生成は、十分に当業者の能力内であり、具体的には、Waterhouse et al.(1998)、Smith et al.(2000)、第WO99/32619号、第WO99/53050号、第WO99/49029号、および第WO01/34815号を参照されたい。
マイクロRNA(略称miRNA)は、概して、19〜25ヌクレオチド(植物において、通常、20〜24ヌクレオチド)の不完全なステムループ構造を形成するより大きな前駆体に由来する非コードRNA分子である。
遺伝子は、ゲノム中にすでに存在する、関連内因性遺伝子および/または導入遺伝子の発現を抑制することができ、これは相同依存性遺伝子サイレンシングと称される現象である。相同依存性遺伝子サイレンシングの例のほとんどは、導入遺伝子の転写レベルで機能するものと、転写後に操作されるものの2つのクラスに分類される。
本明細書で使用される「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換することができ、1つ以上の特定のポリヌクレオチドの発現をもたらすことができるDNAまたはRNAベクターである。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞内で複製する、または宿主細胞ゲノムに取り込むことができる。発現ベクターは、典型的には、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターには、真菌、藻類、および植物細胞を含む、本発明の宿主細胞中において機能する(すなわち、遺伝子発現を誘導する)あらゆるベクターが含まれる。
転移核酸は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用することができ、1つ、好ましくは2つの境界配列、および対象となるポリヌクレオチドを含むことができる。転移核酸は、選択可能なマーカーをコードしても、コードしなくてもよい。好ましくは、転移核酸は、細菌におけるバイナリーベクターの部分を形成し、バイナリーベクターは、この細菌におけるベクターの複製、バイナリーベクターを含む細菌性細胞の選択もしくは維持を可能にする要素をさらに含む。真核細胞への転移の際、バイナリーベクターの転移核酸成分は、真核細胞のゲノムへの組み込みが可能である。
本発明はまた、組み換え細胞、例えば、本明細書に定義された1つ以上のポリヌクレオチドまたはベクター、またはそれらの組み合わせで形質転換された宿主細胞である 組み換え植物細胞も提供する。「組み換え細胞」という用語は、本明細書で「トランスジェニック細胞」という用語と互換的に使用される。本発明の好適な細胞には、例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは酵素をコードする、本発明のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターと形質転換され得るあらゆる細胞が含まれる。細胞は、好ましくは、それによって脂質を生成するために使用することができる細胞である。組み換え細胞は、培養における細胞、インビトロにおける細胞、または例えば植物等の生物における、または例えば、種子もしくは葉の器官における細胞であり得る。好ましくは、細胞は、植物中にあり、より好ましくは植物の種子中にあり、より好ましくはベニバナ等の油糧種子植物の種子中にある。一実施形態において、植物細胞は、本明細書に記載される脂肪酸組成物を有する脂質または油を含む。
本発明はまた、本発明の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、本発明の細胞、本発明のベクター、またはこれらの組み合わせを含む植物も提供する。「植物」という用語は、植物全体を指すが、「その部分」という用語は、植物器官(例えば、葉、茎、根、花、果実)、単細胞(例えば、花粉)、種子、種子部分、例えば胚、内胚乳、胚盤、もしくは種皮、植物組織、例えば維管束組織、植物細胞、およびそれらの子孫を指す。本明細書で使用される植物部分は、植物細胞を含む。
トランスジェニック植物は、概ね、Slater et al.,Plant Biotechnology−The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)、およびChristou and Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley and Sons(2004)に記載されているもの等の当技術分野で知られている技術を用いて生成することができる。
一実施形態において、TILLING(ゲノムにおける標的誘導の局所病変)を使用して、例えば、Δ12デサチュラーゼ、パルミトイル−ACPチオエステラーゼ、ω6もしくはΔ6デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子、またはそれらのうちの2つ以上の組み合わせの内因性遺伝子をノックアウトする植物を生成することができる。
TILLINGは、さらに、Slade and Knauf(2005)、およびHenikoff et al.(2004)において記載されている。
突然変異植物系統を生成するための技法は、当技術分野で知られている。突然変異植物を生成するために使用することができる突然変異原の例には、照射および化学変異誘発が含まれる。突然変異体はまた、T−DNA挿入およびトランスポゾン誘導型突然変異誘発のような技法によっても生成され得る。植物における任意の所望の遺伝子における突然変異は、当技術分野で知られている、人工的なジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクター(TALEN)、またはCRISPR技術(Cas9型ヌクレアーゼを使用)による部位特異的な方法において導入することができる。突然変異誘発手順は、植物の任意の親細胞、例えば、種子または組織培養中の親細胞において行われ得る。
マーカー利用選抜は、古典的な繁殖プログラムにおいて反復親と戻し交配する場合に必要とされるヘテロ接合植物を選択する、広く認識されている方法である。各戻し交配世代の植物の集団は、戻し交配集団において通常は1:1の比率で存在する対象となる遺伝子についてヘテロ接合であり、その分子マーカーを使用して、遺伝子の2つの対立遺伝子を識別することができる。例えば、若い苗条からDNAを抽出し、遺伝子移入された所望の形質についての特異的マーカーで試験することにより、エネルギーおよび資源をより少ない植物に集中させながら、さらなる戻し交配のための植物の早期選択がなされる。戻し交配プログラムをさらに迅速化するために、完全に種子を成熟させるのではなく、未成熟種子からの胚(開花後25日目)を切り取り、滅菌状態下に栄養培地で生育させ得る。三つ葉の段階でDNA抽出と組み合わせて使用される「胚救助法(embryo rescue)」と称される、このプロセスおよび所望の遺伝子型についての分析は、その後の反復親へのさらなる戻し交配のために温室または野外で成熟するまで育成し得る、所望の形質を持つ植物の迅速選択を可能にする。
i)5’−ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT−3’(配列番号140)および5’−GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT−3’(配列番号141)、ならびに
ii)5’−AGTTATGGTTCGATGATCGACG−3’(配列番号142)および5’−TTGCTATACATATTGAAGGCACT−3(配列番号143)のプライマーのセットのうちの1つまたは両方を使用して、植物から得られたゲノムDNA上で増幅反応を行うことを含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、概して、互換的に使用される。
当技術分野で通常実施される技法を使用して、本発明の植物、特に種子によって生成された脂質を抽出、プロセス、精製、および分析することができる。そのような技法は、Fereidoon Shahidi,Current Protocols in Food Analytical Chemistry,John Wiley & Sons,Inc.(2001) D1.1.1−D1.1.11およびPerez−Vich et al.(1998)等の出典の文献にわたって記載され、説明される。
典型的に、植物種子は、調理、押圧、および/または抽出して、粗種子油を生成し、次いで、脱ガム、精製し、漂白し、脱臭する。一般に、種子を粉砕する技法は、当技術分野で知られている。例えば、油糧種子を、水分含量を例えば、8.5%に高め、0.23〜0.27mmのギャップ設定の平滑ローラを使用して薄片にすることができる。種子の種類に応じて、粉砕する前に、水を加えなくてもよい。加熱は、酵素を不活性化させ、さらなる細胞破壊を容易にし、脂肪滴を合体させ、タンパク質粒子を凝集させ、それらのすべてが、抽出プロセスを容易にする。
脱ガムは、油の精製における早期ステップであり、その主な目的は、油からのリン脂質のほとんどの除去であり、これは、全抽出脂質のうちの約1〜2%として表され得る。70〜80℃で、粗油への、典型的には、リン酸を含有する約2%の水の添加は、リン脂質の大部分、同時に微量金属および色素の分離をもたらす。除去される不溶性物質は、主に、リン脂質とトリアシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしても知られている。粗種子油に濃リン酸を添加することによって、脱ガムを実施して、非水和性リン脂質を水和性形態に変換させ、存在する微量の金属をキレート化させることができる。種子油からガム質を、遠心分離によって分離する。
アルカリ精製は、粗油を処理するための精製プロセスのうちの1つであり、場合によっては、中和とも称される。それは、通常、脱ガムに続き、脱色の前に来る。脱ガム後、十分な量のアルカリ溶液の添加によってその種子油を処理し、脂肪酸およびリン酸のすべてを滴定し、そのため、形成された石鹸を除去することができる。好適なアルカリ性物質には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、および水酸化アンモニウムが含まれる。このプロセスは、典型的には、室温で行われ、遊離脂肪酸の分画を除去する。石鹸は、遠心分離によって、または石鹸に対する溶媒への抽出によって除去され、中和された油は、水で洗浄される。必要であれば、油中の任意の過剰アルカリは、塩酸または硫酸等の好適な酸で中和され得る。
漂白は、油が、窒素もしくは蒸気で、または真空下で操作されることによって、漂白土(0.2〜2.0%)の存在下および酸素の不在下で、90〜120℃で10〜30分間加熱される精製プロセスである。油処理におけるこのステップは、望ましくない色素(カロテノド、クロロフィル、ゴシポール等)を除去するように設計され、この工程はまた、酸化生成物、微量金属、硫黄化合物、および石鹸の痕跡を除去する。
脱臭は、高温(200〜260℃)および低圧力(0.1〜1mm Hg)での油および脂肪の処理である。これは、典型的に、約0.1ml/分/100ml(種子油)の速度で、蒸気を種子油中に導入することによって達成される。散布から約30分後、種子油を、真空下で冷却させる。種子油は、典型的に、ガラス容器に移され、冷却下で保存される前にアルゴンを通気した。この処理は、種子油の色を改善し、あらゆる残留する遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール、および酸化生成物を含む、大部分の揮発性物質または臭気化合物を除去する。
脱ろうは、時折、周囲温度以下の温度(sub−ambient temperature)での結晶化によって、固体(ステアリン)および液体(オレイン)分画への油および脂肪の分離のために、油の商業的生産で使用されるプロセスである。それは、本来は、固体のない生成物を生成するために、綿実油に適用された。それは、典型的には、油の飽和脂肪酸含量を減少させるために使用される。
エステル交換反応は、初めに、遊離脂肪酸として、または脂肪酸エステル、通常、脂肪酸エチルエステルとして、TAGから脂肪酸を放出することによって、TAG内およびその間で脂肪酸を交換するプロセスである。分画プロセスと組み合わせる場合、エステル交換反応を使用して、脂質の脂肪酸組成を修飾することができる(Marangoni et al.,1995)。エステル交換反応は、化学的方法または酵素的方法のいずれかを使用することができ、後者は、TAG上の脂肪酸に対して位置特異的(sn−1/3またはsn−2特異的)であり得るリパーゼを使用するか、またはその他を上回るいくつかの脂肪酸に対する選択性を有する(Speranza et al,2012)。油中のLC−PUFAの濃度を増加させる脂肪酸分画は、例えば、凍結結晶化、尿素を用いた複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出法、および銀イオンの複合化のような、当技術分野で知られている方法のうちのいずれかによって達成することができる。尿素を用いた複合体形成は、油中の飽和および一価不飽和脂肪酸のレベルを低減させる際に、その簡易性および効率性において好ましい方法である(Gamez et al.,2003)。初めに、油のTAGが、脂肪酸を、多くの場合、脂肪酸エステルの形態で、加水分解によって、またはリパーゼによって、それらの成分に分割し、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを、複合体形成のために、尿素のエタノール溶液と混合する。飽和および一価不飽和脂肪酸は、尿素と容易に合成し、冷却し、晶出して、その後、濾過によって除去され得る。非尿素で複合化した分画は、それによって、LC−PUFAで富化される。
脂肪酸の水素化は、典型的に、触媒の存在下での水素による処理を含む。非触媒の水素化は、非常に高い温度でのみ行われる。
本明細書に記載される方法によって生成される脂質、例えば、種子油、好ましくは、ベニバナ種子油は、様々な用途を有する。いくつかの実施形態において、脂質は、食用油として使用される。他の実施形態において、脂質は、精製され、潤滑油として、またはプラスチック製品の合成等の他の工業的用途のために使用される。それは、化粧品、石鹸、柔軟剤、電気絶縁材、または合成洗剤の製造に使用され得る。それは、界面活性剤または乳化剤等の農業用化学物質を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、脂質を精製して、バイオディーゼルを生成する。本発明の油は、リノレン酸の不在が容易に変色しないことを意味するため、塗料またはワニス中に有利に使用され得る。
本明細書で使用される「バイオ燃料」という用語は、バイオディーゼルおよびバイオアルコールを含む。バイオディーゼルは、植物、藻類、および菌類に由来する油から作製することができる。バイオアルコールは、糖の発酵から生成される。この糖は、植物(例えば、サトウキビ)から直接抽出、植物デンプン(例えば、トウモロコシまたは小麦)に由来する、またはセルロース(例えば、木、葉、または茎)から作製され得る。
バイオディーゼル、またはアルキルエステルの生成がよく知られている。脂質からのエステル生成の3つの基本的な経路がある:1)アルコールによる脂質の塩基触媒されたエステル交換、2)メタノールによる脂質の直接酸化触媒されたエステル交換、および3)脂肪酸への脂質の変換、次いで、酸触媒作用によるアルキルエステルへの変換。
バイオ燃料の生成のための植物トリアシルグリセロールの使用は、Durrett et al.(2008)に概説されている。簡潔に言えば、植物油は、主に、様々なトリアシルグリセロール(TAG)から成り、分子は、グリセロールにエステル化された3つの脂肪酸鎖(通常、18または16個の炭素の長さ)から成る。脂肪酸アシル鎖は、ガソリンおよびディーゼルに見出される分子の大半を成す脂肪族炭化水素と化学的に類似している。ガソリン中の炭化水素は、分子あたり5〜12個の炭素原子を含有し、この揮発性燃料を、空気と混合し、従来型エンジンにおいて火花で発火させる。対照的に、ディーゼル燃料成分は、典型的に、分子あたり10〜15個の炭素原子を有し、ディーゼルエンジンにおいて得られた非常に高い圧縮によって発火させる。しかしながら、ほとんどの植物TAGは、それぞれ、1.9〜4.1mm2s−1と比較して、17.3〜32.9mm2s−1である従来型ディーゼルの粘度範囲よりもはるかに高い粘度範囲を有する(ASTM D975、Knothe and Steidley,2005)。この高い粘度は、最新ディーゼルエンジンにおいて不良な燃料微粒化をもたらし、炭素析出およびコークス化等の不完全燃焼から生じる問題を引き起こす(Ryan et al.,1984)。この問題を克服するために、第一級アルコール、通常、メタノールによるエステル化によって、TAGをより低粘度の脂肪酸エステルに変換する。得られた燃料は、通常、バイオディーゼルと称し、1.9〜6.0mm2s−1の動的粘度を有する(ASTM D6751)。バイオディーゼル中に見出される脂肪酸メチルエステル(FAME)は、従来型ディーゼルのものほど高くない場合、同様である燃焼の高熱によって反映される、高エネルギー密度を有する(Knothe,2005)。同様に、バイオディーゼル中に見出されるFAMEのセタン価(ディーゼル発火性の尺度)は、従来型ディーゼルのものを上回る(Knothe,2005)。
本発明の脂質/油は、その非常に高いオレイン酸含量および低レベルのリノール酸(3.2%未満)、およびパルミチン酸等の飽和脂肪酸、ならびに本質的には、ゼロレベルのリノレン酸のため、食品用途に利点を有する。これは、酸敗臭が少ない、例えば、フライドポテト等の揚げ用途のような、加熱を必要とする食品用途を理想的にする、高い酸化安定性を有する油を提供する。油は、例えば、20または25時間より長く、好ましくは、30時間より長くまたは50時間より長く、油が110℃で保持され得る時間の長さとして測定される高いOSI(酸化安定性指数)を有する。飽和脂肪酸が健康への悪影響と関連しているため、他の植物油と比較して低レベルの飽和脂肪酸は、健康効果を提供する。また、それれらの油は、本来、ゼロトランス脂肪酸含量を有し、トランス脂肪酸が心臓の健康への悪影響と関連しているか、またはLDLコレステロールを上昇させるため、一部の市場において望ましい。さらに、その非常に低いレベルの多価不飽和脂肪酸により、それらの油は、PUFAのレベルを低下させ、トランス脂肪酸を生成する水素化を必要としない。それらの油はまた、肥満および糖尿病の発症または重症度を軽減させるのに有利である。それらはまた、天然の脂肪酸のみを含有するという点において食品用途に望ましい(Scarth and Tang,2006)。
本発明は、1つ以上の脂質または本発明の方法を使用して生成された油を含む組成物、具体的には、薬学的組成物も包含する。
植物材料および生育条件
ベニバナ植物(カルタムスチンクトリウス)遺伝子型SU、S−317、S−517、LeSaf496、CW99−OL、およびCiano−OLを、16時間(25℃)/8時間(22℃)の昼/夜サイクル下でパーライトおよび砂壌土の鉢植え用の混合物中で、温室内で種子から生育した。高リノール酸変種である野生型変種SUは、NSWのHeffernan Seedsから得られた。PI603208(LeSaf496,ATC120562)およびCW 99−OL(ATC120561)の種子は、Australian Temperate Field Crops Collectionから得られた。
迅速な脂肪酸組成分析のための単一種子からの脂質試料の単離
植物の成熟期に収穫した後、ベニバナ種子は、37℃で3日間、その後、すぐに分析されない場合には、室温で、種子を貯蔵することによって乾燥させた。単一種子またはプールした種子は、小さな濾紙の間で粉砕し、その紙に染み込んだ滲み出た種子油を、以下に記載されるGC方法によって脂肪酸組成について分析した。
例えば、トランスジェニック植物からの子孫種子に対するスクリーニングのために、ベニバナ種子は、ペトリ皿中の湿らせた濾紙上で1日間発芽させた。脂質分析のためにそれぞれ発芽させた種子から子葉を慎重に取り出した。それぞれの実生の残りは、土壌に移し、得られた植物は、成熟するまで生育させ、トランスジェニック系統を維持する種子を収穫した。
種子油の定量的な抽出のために、収穫したベニバナ種子を、105℃で一晩オーブン内で乾燥させ、Puck Mill中で1分間挽いた。挽いた種子材料(約250グラム)を予め計量したシンブル中に回収し、油抽出前に計量した。金属の上に一層の脱脂綿を添加した後、油を、初めに、70〜80℃で、ソックレー装置中で溶媒(Petroleum Spirit 40〜60C)により抽出した。次いで、混合物を、15〜20分ごとに抽出フラスコにサイフォンで吸い上げた溶媒で一晩還流した。溶解し、抽出した油を、真空下でロータリーエバポレーターを使用して溶媒から蒸発させることによって回収した。抽出した油の重量を測定し、油含有物を決定した。抽出した油の脂肪酸組成を決定するために、少量のアリコートを、クロロホルム中で希釈し、ガスクロマトグラフィーによって分析した。
Bligh and Dyer(1959)によって記載されるように、葉組織試料を凍結乾燥させ、計量し、総脂質を、約10mgの乾燥重量の試料から抽出した。
必要な場合には、予めコーティングしたシリカゲルプレート(Silica gel 60,Merck)上で、2相の薄膜クロマトグラフィー(TLC)システムを使用して、TAG分画を、他の脂質成分から分離した。10mgの乾燥重量の葉組織に相当する抽出した脂質試料を、第1の相でヘキサン/ジエチルエーテル(98/2 v/v)を用いて、非極性ワックスを除去し、次いで、第2の相でヘキサン/ジエチルエーテル/酢酸(70/30/1 v/v/v)を用いてクロマトグラフを行った。必要な場合には、第一の方向においては、クロロホルム/メタノール/水(65/25/4 v/v/v)であり、第二の方向においては、クロロホルム/メタノール/NH4OH/エチルプロピルアミン(130/70/10/1 v/v/v/v)を使用する、二次元TLC(Silica gel 60,Merck)を使用して、等量の5mgの乾燥重量の葉の等価物から抽出された脂質試料中において、極性脂質を、非極性脂質から分離した。脂質スポットおよび同じTLCプレート上で泳動させた適切な標準物を、ヨウ素蒸気への短期間の曝露により可視化し、バイアルに収集し、以下の通りにGC分析のためトランスメチル化してFAMEを生成した。
GCによる脂肪酸組成分析のために、上述のように調製された抽出した脂質試料を、ガラス管に移し、2mLのメタノール(Supelco)中1M HCl中で80℃で3時間トランスメチル化した。室温まで冷却した後、1.3mLの0.9% NaClおよび800μLのヘキサンをそれぞれの管に添加し、FAMEをヘキサン相に抽出した。脂肪酸組成を決定するために、温度上昇プログラムを、150℃の初期温度に変更し、1分間維持し、3℃/分で210℃まで、次いで、50℃/分で240℃まで上昇させ、最終的に、2分間維持することを除いては、Zhou et al.(2011)によって本質的に記載される、30m BPX70カラムを装備したAgilent Technologies 7890Aガスクロマトグラフ(Palo Alto,California,USA)を使用するガスクロマトグラフィー(GC)によって、FAMEを分離した。Agilent Technologies ChemStationソフトウェア(Rev B.03.01(317),Palo Alto,California,USA)を用いてピークを定量化した。ピーク応答は、キャリブレーションのために使用された18:1、18:0、20:0、および22:0を含む均等な比率の31の異なる脂肪酸メチルエステルを含む真正のNu−Check GLC standard−411(Nu−Check Prep Inc,MN,USA)の脂肪酸に類似した。試料中のそれぞれの脂肪酸の比率を、脂肪酸における個々および総ピーク面積に基づいて計算した。
2,4−ジメチルオキサゾリン(DMOX)の修飾およびGC−MS分析によるFAMEにおける二重結合の位置の確認を、30m BPX70カラムを装備したShimadzu GC−MS QP2010 Plusを用いることを除いて、前述のように行った(Zhou et al.,2011)。カラム温度は、150℃の初期温度で1分間、5℃/分で200℃まで、次いで、10℃/分で240℃まで上昇させ、5分間維持するようにプログラム化した。質量スペクトルを得て、GCMSsolutionソフトウェア(Shimadzu,Version 2.61)で処理した。遊離脂肪酸およびFAMEスタンダードをSigma−Aldrich(St. Louis, MO, USA)から購入した。
成熟した個々の単一種子を、School of Botany,University of Melbourneにおいて、LC−MSを使用して、脂質全代謝物(lipidomics)の分析に供した。Bligh and Dyer(1959)によって記載されるように、総脂質を抽出し、CHCl3中に溶解した。1mgの脂質のアリコートを、N2で乾燥させ、1mLのブタノール:メタノール(1:1 v/v)中10mM ブチル化ヒドロキシトルエン中に溶解し、Agilent 1200シリーズLCおよび6410B エレクトロスプレーイオン化三連四重極LC−MSを使用して分析した。Ascentis Express RP−Amideカラム(5cm×2.1mm,Supelco)および0.2mL/分の流速で、バイナリー勾配を使用して、脂質をクロマトグラフィーで分離した。移動相は、A、H2O:メタノール:テトラヒドロフラン(50:20:30、v/v/v)中の10mM ギ酸アンモニウム;B.H2O:メタノール:テトラヒドロフラン(5:20:75、v/v/v)中の10mM ギ酸アンモニウムであった。脂肪酸16:0、16:1 18:0、18:1、18:2、18:3を用いて、選択された中性脂質(TAGおよびDAG)ならびにホスホコリン(PC)を、25Vの衝突エネルギーおよび135Vのフラグメンターを使用して、多重反応モニタリング(MRM)によって分析した。個々のMRM TAGおよびDAGは、脂肪酸の中性損失からのアンモニア処理した前駆イオンおよびプロダクトイオンに基づいて特定された。10uM トリステアリン外部標準を用いて、TAGおよびDAGを定量化した。
内部標準としてC24:0 モノールのさらなるアリコートとともに約10mgの油の試料を、80% MeOH中の4mLの5% KOHを使用し、テフロンで裏打ちされたねじ蓋を取り付けたガラス管内で、80℃で2時間加熱して鹸化した。反応混合物を冷却した後、2mLのMilli−Q水を添加し、振とうし、ボルテックスすることによって、ステロールを、2mLのヘキサン:ジクロロメタン(4:1 v/v)に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽出物を除去し、2mLのMilli−Q水で洗浄した。次いで、振とうし、遠心分離した後、ステロール抽出物を除去した。窒素ガスの蒸気を使用して、抽出物を蒸着させ、200mLのBSTFAを使用し、80℃で2時間加熱して、ステロールをシリル化した。
1μLのそれぞれの植物抽出物を、TLC−FID Iatroscan(商標)(Mitsubishi Chemical Medience Corporation−Japan)用の1つのChromarod−SIIに充填した。次いで、Chromarodラックを、70mlのヘキサン/CHCl3/2−プロパノール/ギ酸(85/10.716/0.567/0.0567 v/v/v/v)溶媒系を含む平衡化した現像タンクに移した。30分間のインキュベーション後、Chromarodラックを、100℃で3分間乾燥させIatroscan MK−6s TLC−FID分析器(Mitsubishi Chemical Medience Corporation−Japan)上で直ちに走査した。DAGE内部標準およびTAGのピーク面積を、SIC−480II積分ソフトウェア(Version:7.0−E SIC System instruments Co.,LTD−Japan)を使用して積分する。
候補FAD2 cDNAの全オープンリーディングフレームを含むDNA断片を、EcoRI断片としてpGEMT−easyベクターから切除し、ベクターpENTR11(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)の対応する部位に挿入した。次いで、Gateway(登録商標)Cloning組み換え技術(Stratagene,LaJolla,CA,USA)を用いて、挿入物を、目的発現ベクターpYES2−DEST52にクローン化して、酵母細胞中において誘導的遺伝子発現のために、GAL1プロモーターの制御下でオープンリーディングフレームに置いた。得られたプラスミド中の遺伝子配列を、DNA配列決定によって確認した。得られたプラスミドおよび対照としてあらゆるcDNA挿入を欠いているpYES2−DEST52ベクターを、酢酸リチウム媒介形質転換によってサッカロマイセスセレヴィシエ株YPH499の細胞に導入した。外因性脂肪酸基質の供給を含む、または含まない酵母細胞中のこれらの候補FAD2遺伝子の発現は、本質的には、Zhou et al.(2006)によって前述される通りであった。それぞれの実験を三重に行った。
遺伝子は、Voinnet et al.(2003)およびWood et al.(2009)によって本質的に記載されるように、一過性発現システムを使用してニコチアナベンタミアーナ(Nicotiana benthamiana)葉細胞に発現された。CaMV 35Sプロモーターの制御下で、ウイルスサイレンシングサプレッサー発現P19の構成的発現のためのベクターが、Peter Waterhouse,CSIRO Plant Industry,Canberra,Australiaの実験室から得られた。キメラバイナリーベクター35S:P19を、アグロバクテリウムウメファシエンス株AGL1に導入した。また、プロモーター、多くの場合、35Sプロモーターから植物細胞中に発現されるコード領域を含むすべての他のバイナリーベクターを、アグロバクテリウムウメファシエンス株AGL1に導入した。組み換え細胞は、バイナリーベクターにおける選択可能なマーカー遺伝子により、28℃で、50mg/Lのリファンピシン、および50mg/Lのカナマイシンまたは80mg/Lのスペクチノマイシンのいずれかが追加された5mLのLB培養液において定常期になるように生育させた。5mMのMES、pH5.7、5mMのMgSO4、および100μMのアセトシリンゴンを含む1.0mlの浸潤緩衝液中に再懸濁する前に、室温で5分間、3000xgで遠心分離することによって、それぞれの培地からの細菌を、ペレット化した。次いで、再懸濁した細胞培地を、さらに3時間振とうしながら、28℃でインキュベートした。次いで、浸潤緩衝液中のそれぞれの培地の10倍の希釈物を、等体積の35S:P19倍地と混合し、同じ方法で希釈し、混合物を十分に膨張したN.ベンタミアーナ葉の裏面に浸潤させた。特に指定のない限り、発現すべき遺伝子を含む混合培地は、アグロバクテリウム中において35S:P19構築物を含んだ。対照浸潤物は、アグロバクテリウム中において35S:P19構築物のみを含んだ。
BIORAD CFX96(商標)リアルタイムPCR検出システムおよびiQTM SYBR(登録商標)Green Supermix(BioRad, Hercules,CA,USA)を用いて、定量RT−PCRによって遺伝子発現分析を行った。19〜23ヌクレオチド長で、約65℃の融解温度(Tm)を有し、約100〜200bpの増幅生成物をもたらす遺伝子に特異的な増幅のために設計されたプライマー。PCR反応は、96ウェルプレート中で行った。RT−PCR反応はすべて、三重で行われた。反応混合物は、1×iQTM SYBR(登録商標)Green Supermix(BioRad,Hercules,CA,USA)、5μM 順方向および逆方向プライマー、ならびに400ngのcDNAを含み、1ウェルあたり10μLの体積で使用した。熱サイクル条件は、95℃で3分間、続いて、95℃で10秒間、60℃で30秒間、68℃で30秒間の40サイクルであった。60℃から95℃で0.1°C/秒のPCRの最終ステップ後に、融解曲線分析によって、PCR増幅の特異性をモニタリングした。さらに、PCR生成物はまた、アガロースゲル電気泳動によって純度を確認し、シークエンスによっても確認された。構造的に発現した遺伝子KASIIは、発現レベルを正規化する内因性参照として使用された。データは、対応する遺伝子発現レベルに対して較正され、その後、相対定量のために2−ΔΔCt方法を行った(Schmittgen,2008)。このデータは、独立した96ウェルプレート上で行われた3つの反応の平均±標準偏差として示された。
ベニバナの実生のゲノムDNA、遺伝子型「SU」を、CTAB緩衝液を使用し、Paterson et al.(1993)によって記載される方法に従って、十分に膨張した葉から単離した。前述(Liu et al.,1999)のように、CsCl勾配を用いて、さらなる精製を行った。10μgのアリコートのベニバナゲノムDNAを、8つの異なる制限酵素、すなわちAccI、BglII、BamHI、EcoRI、EcoRV、HindIII、XbaI、およびXhoIで消化した。それぞれの制限酵素で消化されたゲノムDNAは、1%のアガロースゲル上で電気泳動させた。0.5M NaOH、1.5M NaCl中に、ゲルを30分間浸し、DNAをHybond−N+ナイロン膜(Amersham,UK)上にブロットした。フィルターは、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、CtFAD2遺伝子ファミリーの代表としてベニバナCtFAD2−6遺伝子の全コード領域に対応するα−P32 dCTP−標識DNA断片でプローブした。6x SSPE、10% デンハルト溶液、0.5% SDS、および100μg/mLの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、ハイブリダイゼーションを、65℃で一晩行った。ハイブリダイゼーションを行い、50℃で2x SSC/0.1% SDS中で短時間洗浄した後、オートラジオグラフィー前に、フィルターを、0.2xSSC/0.1% SDS中で、50℃で毎回20分間3回洗浄した。
アラビドプシスを形質転換するために使用される遺伝子を含むキメラベクターを、A.ツメファシエンス株AGL1に導入し、形質転換されたアグロバクテリウムの培地からの細胞を形質転換のためにフローラルディップ(floral dip)法(Clough and Bent,1998)を用いて、A.サリアナ(生態型Columbia)植物を処理するために使用した。形質転換されたアグロバクテリウム培地を使用して、Belide et al.(2011)によって記載されるように、形質転換されたベニバナ植物を導入した
総RNA抽出およびcDNA合成
ベニバナからcDNAを生成するために、発育中の胚、葉、根、および胚軸を含む、100mgの冷凍ベニバナ組織試料から総RNAを単離した。これは、供給者のプロトコルに従って、RNeasy(登録商標)Plant総RNAキット(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して、別々にそれぞれの組織に対して行った。調製物中のRNA濃度は、NanoDrop(商標)分光光度計ND1000(Thermo Fisher Scientific,Victoria,Australia)を用いて決定し、RNA濃度は、分析前に均一にした。それぞれの調製物中のRNAの質および相対量は、ホルムアルデヒドを含む1%(w/v)アガロースゲルを通じて試料のゲル電気泳動によって可視化した。RNA調製物を、RQ1 RNase−free DNase(Qiagen,Hilden,Germany)で処理して、汚染されているゲノムDNAを除去した。First−strand cDNAを、製造業者の取扱説明書に従って、オリゴ(dT)20プライマーを用いてSuperScript III First−Strand Synthesis System(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して、400ngのそれぞれのDNA−free RNA調製物から合成した。
初めに、ベニバナ遺伝子型「SU」(野生型、高リノール酸レベル)の発育中の胚に由来するcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、種子を発現したベニバナFAD2 cDNAを得た。ライブラリー構築は、収穫し、液体窒素中で挽いて粉末にした、異なる発育段階の未成熟の胚の混合物からのRNA抽出から始め、製造業者の取扱説明書に従って、TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用してRNA抽出を行った。Qiagen mRNA精製キット(Qiagen,Hilden,Germany)を使用して、ポリ(A)を含有するRNAを単離した。
さらなる候補FAD2cDNAを特定するために、ベニバナのCompositae Genome Project(CGP)の発現配列タグ(EST)データベース(cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2.)を、A.サリアナ(thaliana)FAD2(GenBankアクセッション番号L26296)と類似性を有するポリペプチドをコードしたESTのためのプログラムBLASTpを使用して精査した。少なくとも11の、別個のFAD2 cDNA配列コンティグが特定され、この中で、2つのコンティグがベニバナ種子cDNAライブラリーから単離されたCtFAD2−1およびCtFAD2−2を有する同一の配列を示した。加えて、9つの異なるcDNAを特定し、それぞれ、CtFAD2−3からCtFAD2−11として表記した。
9つのコンティグ(CtFAD2−3からCtFAD2−11)のそれぞれの最も長いESTクローンが、対応する完全長cDNA配列の単離の出発点として選択された。プロセスは、発育中の胚、葉、根、胚軸、および花を含む様々なベニバナ組織から得たRNAから生成したcDNAを使用した3’−および5’−のcDNA末端の迅速増幅(RACE)を使用した。遺伝子特異的プライマー(GSP)を、それぞれのコンティグの最も長いESTクローンから設計した。3’−RACEは、製造業者の取扱説明書に従って、ワンステップRT−PCRキット(Bioline, London, UK)を使用して行った。遺伝子特異的プライマー(GSP)は、その3’末端でNotI部位でのポリ(dT)プライマーと組み合わせて選択されたESTのそれぞれのPCR増幅の第1ラウンドに使用された。PCRの第2ラウンドは、ポリ(dT)プライマーと組み合わせてネスト化されたGSPを使用して第1ラウンドの生成物において行った。3’RACEに対するGSPを表2中に列記する。
9つのCtFAD2遺伝子に対する完全長タンパク質のコード領域を単離するために、発育中の胚、葉、根、胚軸、および花を含むいくつかのベニバナ組織由来の総RNAを使用して、ワンステップRT−PCRキットを使用して、ORFを増幅した(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。ORFを増幅するために使用されたプライマー(表3)は、それぞれのcDNAの5’および3’UTRに位置するDNA配列に基づいた。増幅したPCR生成物を、ベクターpGEM−Teasy(登録商標)にクローン化し、DNAシークエンシングによってそれらのヌクレオチド配列を得た。
11のcDNAの特徴を表4中に要約し、ポリペプチドの特徴を表5中に要約した。
11の候補CtFAD2の予測されたポリペプチドはそれぞれ、C末端の最末端で芳香族アミノ酸リッチなモチーフを含有した。そのようなモチーフは、他の植物FAD2ポリペプチドにおいて特定されており、ERにおいて局在性を維持するために必要であると考えられる(McCartney et al.,2004)。他の植物膜結合型脂肪酸デサチュラーゼ酵素と一致して、予測されたCtFAD2ポリペプチドはそれぞれ、3つのヒスチジンリッチなモチーフ(Hisボックス)を含有した。そのようなHisリッチモチーフは、FAD2酵素において高度に保存され、生化学的触媒作用において使用される酸化二鉄複合体の形成に関与することが示されている(Shanklin et al.,1998)。ほとんどの候補CtFAD2ポリペプチド配列において、第一のヒスチジンモチーフは、HECGHHであり、例外は、それぞれ、HDCGHHおよびHDLGHHを有するCtFAD2−5および−6であった。CtFAD2−8における第1のHisボックスの最後のアミノ酸(HECGHQ)は、HよりはむしろQであった。本発明者らは、55の既知の植物FAD2酵素においてこのモチーフを探し求め、また、HからQへの変換も、主に脂肪酸ヒドロキシラーゼ活性を有するLesquerella lindheimeri由来の分岐したFAD2同族体に存在する(Genbankアクセッション番号EF432246、Dauk et al.,2007)。第2のヒスチジンモチーフは、CtFAD2−1、−2、−8、−9、および−10を含むいくつかの候補ベニバナFAD2において、アミノ酸配列HRRHHとして高度に保存された。アミノ酸Nが、モチーフの+3位でCtFAD2−11に見出され、クレピスアルピナ(Crepis alpina)CREP1、クレピスパラエスチナ(Crepis palaestina)Cpal2、およびヒマワリvFAD2(AY166773.1)、カレンデュラオフィキナリスFAC2(AF343064.1)、ルドベッキアヒルタ(Rudbeckia hirta)アセチレナーゼ(AY166776.1)を含む、多数の機能的に分岐したFAD2型酵素にも見出されたことは注目に値した。CtFAD2−3、−4、−5、−6、および−7におけるこの位置でのアミノ酸は、SまたはTのいずれかであった。
候補CtFAD2遺伝子の5’UTRイントロンの単離
FAD2遺伝子のイントロン−エクソン構造は、多くの開花植物において保存されている。第1のATG翻訳開始コドンの直後に、大豆FAD2−1のイントロンがコード領域に位置する1つの例外はあるが、研究されたすべてのFAD2遺伝子は、これまでのところ、5’UTRで位置される1つのイントロンのみを含有する(Liu et al.,2001、Kim et al.,2006、Mroczka et al.,2010)。イントロン配列の分岐は、分類学的に密接に関係した種間の進化の尺度として使用され得る(Liu et al.,2001)。
ベニバナにおいて、FAD2様遺伝子ファミリーの複雑性を、サザンブロットハイブリダイゼーション分析によって試験した。低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション分析は、ベニバナにおいて、FAD2が複合多重遺伝子ファミリーによってコードされたことを示した(図2)。ゲノムDNAを切断する様々制限酵素を使用することによって得られたハイブリダイズする断片を計数することによって、ベニバナにおいて、10を超えるFAD2またはFAD2様遺伝子があったことが推測された。異なる断片に対してハイブリダイゼーションの強度に見られる差異は、恐らくは、配列同一性の相対的レベルと使用されたプローブDNAとの相関性がある。ベニバナは、2倍体種であり、単一の野生子孫種C.パラエスチヌス(palaestinus)を有すると考えられる(Chapman and Burke,2007)。本発明者らは、ベニバナにおける異常に大きいFAD2遺伝子ファミリーが、恐らく、いくつかの古代遺伝子の複製由来であり、遺伝子ファミリーの異なるメンバーの特殊化および特異的な活性をもたらすと推測する。
酵母における候補CtFAD2遺伝子の発現−機能的分析
都合の良い宿主細胞として、いくつかの植物FAD2 Δ12オレイン酸塩脂肪酸デサチュラーゼの機能的発現を研究するために、酵母S.セレヴィシエが、使用されている(Covello and Reed 1996、Dyer et al.,2002、Hernandez et al.,2005)。S.セレヴィシエは、比較的に単純な脂肪酸プロファイルを有し、FAD2酵素の基質として使用することができるそのリン脂質内に十分なオレイン酸を含有する。それはまた、内因性FAD2活性を欠いている。したがって、実施例1に記載されるように、11の候補CtFAD2遺伝子を、pYES2由来の構築物、GAL1プロモーターの制御下でそれぞれのオープンリーディングフレームを使用して、酵母株YPH499において試験した。
植物細胞において、具体的には、植物葉において構造的様式で遺伝子を発現するために、CtFAD2 ORFのそれぞれを、増強されたCaMV−35Sプロモーターとポリアデニル化シグナル配列を含むnos3’ターミネーターとの間の修飾されたpORE04バイナリーベクター中にセンス方向に挿入した(Coutu et al.,2007)(配列番号54)。先行研究は、導入遺伝子の発現がウイルスサイレンシングサプレッサータンパク質P19の共発現によって有意に増強され、N.ベンタミアーナ葉に基づいた一過性アッセイにおいて、宿主導入遺伝子サイレンシングを誘導したことを示した(Voinnet et al.,2003、Wood et al.,2009、Petrie et al.,2010)。実施例1に記載されるように、これらの実験を行った。
ベニバナにおいて特定された上述の11の候補CtFAD2遺伝子は、今まで試験されたあらゆる植物種に観察された最大のFAD2遺伝子ファミリーを表す。単一のFAD2遺伝子のみがアラビドプシス(Okuley et al.,1994)において特定されたが、FAD2は、今までに研究されたほとんどの他の植物ゲノムにおいて同義遺伝子によってコードされるように思われる。2つの別個のFAD2遺伝子が、大豆(Heppard et al.,1996)、亜麻(Fofana et al.,2004、Khadake et al.,2009)、およびオリーブ(Hernanze et al.,2005)、ヒマワリにおける3つの遺伝子(Martinez−Rivas et al.,2001)およびカメリナサティバ(Kang et al.,2011)、綿実における5つの遺伝子(Liu et al.,1998)において記載されている。アンフィテトラプロイド(amphitetraploid)種のブラシカナプスにおいて、4〜6つの異なるFAD2遺伝子が、それぞれの2倍体のサブゲノムに特定されている(Scheffler et al.,1997)。候補CtFAD2遺伝子のすべては、これらの配列がcDNAから単離されたため、ベニバナ植物において発現された。このことは、実施例6に記載されるように、さらに試験された。
異なる組織におけるFAD2遺伝子の発現プロファイル
様々な候補CtFAD2遺伝子の組織発現パターンを決定するために、実施例1に記載されるような、RT−PCR分析を行った。総RNAは、10 DAGの高リノール酸遺伝子型SUのベニバナ実生由来の子葉、胚軸、根、および葉組織、ならびに開花植物由来の花組織および発生中の胚から抽出され、これらのアッセイに使用した。分析のために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーを表11に列記する。
インドからのベニバナ導入において見出されたベニバナにおける最初に特定された高オレイン酸の特徴は、単一遺伝子座OLでolと表記される部分的に劣性な対立遺伝子によって支配された(Knowles and Hill,1964)。olol遺伝子型のオレイン酸含量は、通常、温室栽培された植物において、71〜75%であった(Knowles,1989)。Knowles(1968)は、ol対立遺伝子をベニバナ繁殖プログラムに組み入れ、米国では、1966年に最初の高オレイン酸(HO)ベニバナ変種「UC−1」を公開し、これに続いて、改善された変種「Oleic Leed」、ならびにSaffola317(S−317)、S−517、およびS−518を含むSaffolaシリーズを公開した。高オレイン酸(olol)遺伝子型は、異なる温度で比較的安定していた(Bartholomew,1971)。さらに、Knowles(1972)はまた、35〜50%のオレイン酸のホモ接合条件で生成された同じ遺伝子座での異なる対立遺伝子ol1も説明した。olol遺伝子型とは対照的に、ol1ol1遺伝子型は、温度に対して強い応答を示した(Knowles,1972)。
Stymne and Appelqvist(1978)によって記載されるように、ベニバナミクロソームを、開花後(DPA)約15日目の中期の成熟段階で高オレイン酸遺伝子型S−317の発育中の種子から新たに調製した。標準的な90μLの反応混合物は、0.1mmolのリン酸カリウム緩衝液pH7.2中に、40μgのミクロゾームタンパク質、2nmol[14C]オレオイル−CoAを含有した。次いで、10μLの50mM NADHを添加し、さらに5、10、または20分間インキュベーションを継続した。90μLの0.15M 酢酸を添加することによって、反応を停止し、脂質は、500μLのCHCl3:MeOH(1:1)で抽出した。より低いCHCl3相を回収し、それからの極性脂質を、CHCl3/MeOH/HAc/H2O(90:15:10:3 v/v/v/v)の溶媒系を使用して、薄膜クロマトグラフィー(TLC)によって分離した。PCに対応するスポットを、プレートから削り取り、会合した脂肪酸基を、2mlのMeOH中2%硫酸中、90℃で30分間トランスメチル化した。得られたFAMEを、ヘキサン:DEE:HAc(85:15:1 v/v/v)でAgNO3処理したTLCプレート上で分離した。14C標識したオレイン酸塩およびリノール酸メチルエステル標準物質を、参照としてプレート上にスポッティングした。プレートを曝露し、Fujifilm FLA−5000 phosphorimagerによって分析した。それぞれの試料の放射をFujifilm Multi Gaugeソフトウェアで定量化した。
ベニバナにおける高オレイン酸遺伝子型(olol)の分子基盤を理解するために、2つの種子により発現したFAD2 cDNA、すなわち、CtFAD2−1およびCtFAD2−2を、3つの高オレイン酸変種:S−317、LeSaf 496、およびCW99−OLからのPCRによって増幅し、配列決定した。3つの高オレイン酸変種のすべてからのCtFAD2−1遺伝子の全コード領域を網羅するcDNAは、互いにヌクレオチド配列において特定され、野生型変種SU由来のCtFAD2−1 cDNAと約98%配列同一性を共有し、これには、野生型と比較して、HO遺伝子型において、1つのヌクレオチド欠失と、22のヌクレオチド置換とを含んだ。単一の塩基対欠失は、CtFAD2−1コード領域のほぼ中央にある第1のATGから計数してヌクレオチド606で見出された。この欠失は、欠失直後に停止コドンを作製した翻訳後リーディングフレーム中にシフトを生じ、そのため、第3のヒスチジンボックスを含まない、予測された切断型ポリペプチドをコードした3つのolol変種の突然変異遺伝子が、野生型タンパク質中に存在した(図6)。さらなる突然変異が突然変異遺伝子中において蓄積されたことを示唆するol対立遺伝子の欠失した単一のヌクレオチド部位付近のDNA配列中に比較的高いレベルの配列変異があったことは、注目に値した。。
HO表現型に関与する原因となる突然変異体であると結論付けられる突然変異CtFAD2−1対立遺伝子における単一のヌクレオチド欠失配列多型は、突然変異ol対立遺伝子を追跡するために高効率の分子マーカーの分子基盤として開発された。したがって、本発明者らは、それが異型接合状態中に存在した場合でさえ、繁殖目的または変種の特定目的のために突然変異ol対立遺伝子の特定および選択を可能にした分子マーカーアッセイを開発した。それによって、分子マーカー支援選抜は、脂肪酸表現型に対してスクリーニングされなければならない植物の余分な世代を生成する必要をなくす。完全な分子マーカーアッセイと組み合わせた単純な遺伝学は、ベニバナ育種家が、繁殖プログラムに高オレイン酸の特質を迅速に組み込むことを可能にするであろう。
上の節において、CtFAD2−1が発育中の種子においてのみ発現され、若いベニバナ実生由来の葉、根、花、子葉、および胚軸を含む試験した様々な他の組織には検出されなかったことを示した。CtFAD2−1は、脂肪酸の代謝速度が高い発育中の種子中において高度に発現され、比較的短期間に大部分はC18:2を有する活性な油蓄積をもたらした。CtFAD2−1は、種子発育時にほぼ中間の地点でその最高の発現レベルを有し、種子発育の早期および晩期段階の両方でより中度の発現レベルを有した。
HO胚内のCtFAD2−1転写物の劇的に減少したレベルは、未成熟停止コドンが単一のヌクレオチド欠失直後にコード配列の中央に見られたため、CtFAD2−1 mRNAの非センス媒介mRNA分解(NMD)によって引き起こされた可能性がある。NMD系は、ゲノムの突然変異、転写エラー、およびミススプライシング等の想定外のエラーを生じる未成熟終止コドン(PTC)を含む異常なmRNAの分解に関与する機構であると考えられる。それは、広く真核生物中に存在する機構であり、特に、酵母菌および哺乳動物において広く研究されている。高等植物においては、少ししか研究されていないが、大豆Kunitz型トリプシン阻害剤遺伝子(Kti3)、インゲンマメ由来のフィトヘムアグルチニン遺伝子(PHA)(Jofuku et al.,1989、Voelker et al.,1990)、エンドウフェレドキシン遺伝子(FED1)(Dickey et al.,1994)、およびイネwaxy遺伝子(Isshiki et al.,2001)を含むいくつかの報告がある。
NMD現象をさらに調査するために、本発明者らは、N.ベンタミアーナ葉における野生型および高オレイン酸遺伝子型の両方に由来するCtFAD2−1の一過的発現についての実験を行った。
ベニバナFATB cDNA配列の単離
ベニバナ種子油は、約7%のパルミチン酸を含有する。この脂肪酸は、発育中の種子細胞のプラスチドで合成され、そこからそれを、トリアシルグリセロールへのその組み込みのために細胞の細胞質ゾルに輸出される。パルミチン酸輸出のための主要な酵素は、パルミトイル部分とアシル担体タンパク質(ACP)との間のチオエステル結合を加水分解するパルミトイル−ACPチオエステラーゼであり、ここに、アシル基を共有結合するが、それはプラスチドで合成される。酵素パルミトイル−ACPチオエステラーゼは、FATBと表される一連の溶解性プラスチドを標的とする酵素に属する。種子油植物において、この酵素は、基質として短鎖飽和アシル−ACPに対して特異性を示す。初めに、FATB酵素をコードする遺伝子を、California月桂樹(ウンベルラリアカリフォルニカ(Umbellularia californica))由来のラウリン酸(C12:0)等の中鎖長飽和脂肪酸を蓄積する植物種から単離した。その後の研究は、FATB相同分子種が、すべての植物組織中、主に種子中に存在し、C8:0−ACPからC18:0−ACPの範囲に及ぶ基質特異性を有することを示した。アラビドプシスおよびベニバナを含むほとんどの温暖な油糧種子作物において、パルミチン酸は、種子油中において主要な飽和脂肪酸である。
実施例1に概説されるように、3つのCtFATB遺伝子の遺伝子発現プロファイルを、リアルタイムqPCRを用いて研究した。3つの遺伝子のそれぞれの独自の領域に対応するオリゴヌクレオチドプライマーが設計され、これには、CtFATB−A、センスプライマー:5’−AGAGATCATTGGAGACTAGAGTG−3’(配列番号148);アンチセンスプライマー:5’−CCCATCAAGCACAATTCTTCTTAG−3’(配列番号149);CtFATB−B、センスプライマー:5’−CTACACAATCGGACTCTGGTGCT−3’(配列番号150);アンチセンスプライマー:5’−GCCATCCATGACACCTATTCTA−3’(配列番号151);CtFATB−C、センスプライマー:5’−CCTCACTCTGGGACCAAGAAAT−3’(配列番号152);アンチセンスプライマー:5’−TTCTTGGGACATGTGACGTAGAA−3’(配列番号153)が含まれた。実施例1に記載されるように、PCR反応は、3重で行われた。
ベニバナFAD6 cDNA配列の単離
ミクロソームおよび葉緑体膜脂質および種子貯蔵油に見出される、明確に異なる脂肪酸組成は、脂肪酸生合成を調節することによって、この組成を制御するように操作する複雑な代謝ネットワークの結果であり、いわゆる、原核生物および真核生物の経路の両方を通じて流動する。ミクロソームFAD2酵素は、細胞質中において、プラスチドからオレイン酸の輸出、およびCoAエステルへの変換後に、ERにおいて、オレイン酸塩をリノール酸塩に変換する際に重要な役割を有することは明らかである。葉緑体オメガ−6デサチュラーゼ(FAD6)はそれぞれ、ホスファチジルグリセロール、モノガラクトシルジアシルグリセロール、ジガラクトシルジアシルグリセロール、およびスルホギノボシルジアシルグリセロールを含むすべての16:1−または18:1−を含有する葉緑体膜脂質上で、16:1および18:1脂肪酸を16:2および18:2に不飽和化する酵素である。アラビドプシスfad6突然変異はそれぞれ、すべての葉緑体脂質上で、16:1および18:1の16:2および18:2への不飽和化において欠失していることが報告された(Browse et al.,1989)。fad6突然変異体が低温(5℃)で生育された場合、葉は退緑し、生育速度は、野生型と比較して、著しく減少した(Hugly and Somerville,1992)。FAD6をコードするcDNA配列は、初めに、Falcone et al.(1994)によってアラビドプシスから単離された。それ以来、FAD6およびFAD6遺伝子をコードするcDNAは、ブラシカナプス、ポルチュラカオレラセア、大豆、およびリシヌスコミュニスを含むいくつかの植物種から単離されている。
CtFAD6の発現プロファイルは、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix−UDG(Invitrogen)を使用して行われたリアルタイムRT−qPCRによって調べられ、実施例1に記載されるように、デフォルトパラメータを用いてABI 7900HT配列検出システム上で操作した。使用されたプライマーは、ctFAD6−S2:5’−CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG−3’(配列番号155)およびctFAD6−a2:5’−GTTCCAACAATATCTTCCACCAGT−3’(配列番号156)であった。反応は、20ngの総RNA鋳型、800mMのそれぞれのプライマー、0.25μLの逆転写酵素、および5μLのワンステップRT−PCRマスターミックス試薬を含む10μLの全容積で3重で行われた。RTおよび増幅のための条件は、48℃で30分間、次いで、95℃で10分間、続いて、95℃で15秒間、および60℃で60秒間を40サイクルであった。参照遺伝子ベニバナCtkasIIの発現を使用して、FAD6発現レベルを正規化した。実施例1に記載されるように、計算を行った。
ヘアピンRNA(hpRNA)は、植物における遺伝子発現を減少させるために広く使用されている一種のRNA分子である。ヘアピンRNAは、一般に、植物細胞において、サイレンシングされる遺伝子に由来する逆方向反復の配列を含むDNA構築物から転写される。hpRNA転写物は、それによって、ハイブリダイズして、ループ配列によって結合される二本鎖RNA(dsRNA)領域を形成する相補的センスおよびアンチセンス配列を有する。そのようなdsRNA構造は、植物細胞において、内因性サイレンシング機構によって処理されて、配列において活性が減少される遺伝子に対応する約21〜24のヌクレオチドの小RNA分子を形成する。これらの小RNAは、対象となる遺伝子を特異的にサイレンシングする内因性タンパク質で複合体を形成することができる。そのようなサイレンシングは、標的遺伝子部分のDNAメチル化によって媒介される転写レベルで、標的mRNAの分解による転写後のレベルで、またはそのmRNAに結合し、その翻訳を阻害し、それによって遺伝子によってコードされるタンパク質合成を減少させることによって生じ得る。hpRNAが遺伝子ファミリーのメンバー間で共通の配列を含む場合、hpRNAは、配列を有するこれらの遺伝子のそれぞれにサイレンシングし得る。
植物バイナリー発現ベクターが、種子内の導入遺伝子の発現のために設計され、アラビドプシスOlesoin1遺伝子(TAIRウェブサイト遺伝子の注釈At4g25140)のプロモーター(配列番号52)を使用した。単離されたプロモーターは、1192bpの長さであり、アクセッション番号NC003075.7のヌクレオチド12899298から開始したが、1198bpの配列内で、通常の制限消化配列を避け、後続のクローニングステップを支援するために、6bpを削除した。AtOleosinプロモーターは、以前、ベニバナおよびブラシカ種における導入遺伝子の強力な種子特異的発現に使用されていた(Nykiforuk et al.,1995、Vanrooijen and Moloney,1995)。このプロモーターは、プロモーター断片の両末端に結合したコード領域の強力な種子特異的発現を誘導する双方向性プロモーターである可能性が高かった。アラビドプシスオレオシンプロモーターは、双機能性を有することを特徴とするブラシカナプスオレオシンプロモーターと特徴を共有する(Sadanandom et al.,1996)。このプロモーターは、化学的に合成され、pGEMT−EasyおよびKlenow断片酵素充填反応によって平滑化されたプロモーターを含むEcoRI断片にクローン化され、pCW265(Belide et al.,2011)のKlenowによって平滑化されたHindIII部位に連結し、pCW600(AtOleosinP::空)を生成した。このベクターは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)をコードする選択可能なマーカー遺伝子を有し、それによって、形質転換プロセス中、組織培養中のハイグロマイシン(hygomycin)への耐性のための選択を可能にした。また、このベクターには、紫外線照射下で、蛍光による形質転換した細胞または組織の選択を可能にした35S::GFP遺伝子が含まれた。AtOleosinプロモーターを挿入することによって、このベクターは、複数のクローニング部位に位置しているプロモーターの下流およびnosポリアデニル化シグナル(nos3’)の上流に挿入され得る対象となるコード領域の発現のために設計された。このベクターは、以下に記載される構築物pCW602およびpCW603の骨格ベクターとして作用した。
亜麻リニンプロモーター(米国特許第US7,642,346号)(配列番号53)が、NotI−XhoI断片として、バイナリーベクターpT7−HELLSGATE12(Wesley et al.,2001)に挿入され、GatewayサイレンシングバイナリーベクターpXZP410を生成した。ベクターpXZP410は、組織培養中、カナマイシンへの耐性を付与した選択可能なマーカー遺伝子を有し、リニンプロモーターの制御下でヘアピンRNA構築物の種子特異的発現を可能にした。このベクターは、プロモーターに対して、1つはセンス方向に、もう1つはアンチセンス方向にある2つのイントロンを有し、イントロンに隣接するAttL1およびAttL2組み換え部位を有した。
CtFATB−3 cDNAのヌクレオチド485〜784に対応するベニバナ遺伝子CtFATB−3の領域と同一である300bpの配列(配列番号50)が、化学的に合成され、製造業者の取扱説明書に従って、pENTR/D topo(Invitrogen)中に挿入され、pCW569と表されたGateway侵入クローンを生成した。ヌクレオチド427〜1182に対応するCtFAD2−2のcDNAの756bpの断片(配列番号49)は、合成され、発育中のベニバナ種子から単離されたRNAからのRT−PCRによって増幅された。このプライマーはそれぞれ、D28−PstI−5(5’−CCTGCAGGTACCAATGGCTCGACGACACTG−3’)(配列番号157)およびD28−AscI−3(5’−CGGCGCGCCTTCACCTCCTCATCTTTATCC−3’)(配列番号158)であった。プライマーは、5’PstIおよび3’AscI制限酵素部位を含み、それによって、増幅された断片をpCW569の対応する部位中に挿入することができ、pCW570を生成した。このベクターは、組み換え部位AttL1およびAttL2によって隣接された1080bpの断片として、CtFATBおよびCtFAD2−2遺伝子からの融合領域を含んだ。ついで、2コピーのこのFATB−FAD2−2断片が、pXZP410中に挿入され、供給者の取扱説明書に従ってLRクロナーゼ(Invitrogen,Carlsbad,USA)を使用して、2番目のコピーを1番目のコピーに挿入した。得られたプラスミドpCW571は、種子中においてCtFATBおよびCtFAD2−2遺伝子の発現を減少させるためにhpRNAを生成するために、種子特異的な方法で逆方向反復領域を転写するための亜麻リニンプロモーターを有した。
2つの介在するイントロンとともに逆方向反復のCtFATB−CtFAD2−2断片を含むpCW571からのDNA断片は、SpeIで切断され、DNAポリメラーゼのKlenow I断片を使用して平滑化され、pCW600のEcoRV部位に連結されて、pCW603を生成した。この構築物pCW603は、ベニバナの種子中において、AtOleosinプロモーターの制御下でhpRNAを発現し、CtFATBおよびCtFAD2−2の発現を減少させることができた。
pCW571に関しては、CtFAD6のcDNAのヌクレオチド451〜750に対応するCtFAD6の290bpの断片およびCtFATBの300bpの断片から作製されるDNAの590bpの断片(配列番号51)が、化学的に合成され、pENTR/D topo中に挿入されて、pCW579を生成した。pCW570に関して上述のように、CtFAD2−2の780bpの断片は、pCW579のAscI部位中にクローン化されて、pCW580を生成した。この構築物は、隣接する組み換え部位AttL1およびAttL2とともに、1370bpのDNA断片として、CtFATB、CtFAD6、およびCtFAD2−2遺伝子の順番で結合された配列を含む侵入クローンベクターであった。次いで、2コピーのこのFATB−FAD6−FAD2−2断片が、LRクロナーゼを使用して、逆方向反復としてpXZP410中に挿入され、pCW581を生成した。この構築物pCW581は、逆方向反復に作動可能に連結された亜麻リニンプロモーターを有するバイナリーベクターであり、発育中のベニバナ種子の転写時に、細胞は、CtFATB、CtFAD6、およびCtFAD2−2遺伝子の発現を減少させるためにhpRNAを発現することができた。
2つの介在するイントロンとともに、逆方向反復の結合されたCtFATB−CtFAD6−CtFAD2−2領域を含むDNA断片は、pCW571から酵素的にNot1で切断され、Klenow I断片を使用して平滑化され、次いで、pCW600のEcoRV部位に連結されて、pCW602を生成した。リニンプロモーターを用いることを除いては同じ設計および遺伝子断片を有したpCW581とは対照的に、pCW602は、AtOleosinプロモーターの制御下でCtFATB−CtFAD6−CtFAD2−2配列を有した。
リニンプロモーターは、種子中においてhpRNAを発現するのに有用であったが、pCW571およびpCW581はともに、カナマイシン耐性を付与した選択可能なマーカーを有した。予備のベニバナ形質転換実験において、外植体がカナマイシンに十分に影響を受けなかったことを観察した。したがって、pCW571およびpCW581のカナマイシン耐性カセットは、選択可能なマーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性カセットに置き換えられた。enCUPプロモーター:ハイグロマイシン:nos3’ポリアデニル化領域からなるハイグロマイシン耐性遺伝子は、pCW265からSpeI−AvrII制限消化で切断され、pCW571およびpCW581において、カナマイシン耐性カセットを置き換えるために使用されて、それぞれ、pCW631および632を生成した。
ベクター プロモーター 逆方向反復での遺伝子断片
pCW631 リニン CtFAD2-2およびCtFATB
pCW632 リニン CtFAD2-2、CtFAD6、およびCtFATB
pCW602 AtOleosin CtFAD2-2、CtFAD6、およびCtFATB
pCW603 AtOleosin CtFAD2-2およびCtFATB
遺伝的構築体は、接木を使用して再生された芽を救助するアグロバクテリウムによる方法を使用して、ベニバナ変種S317の切除された子葉および胚軸を形質転換するために使用された(Belide et al.,2011)。非形質転換台木(以下、T0植物と称される)上に生育している30を超える独立して形質転換された芽は、ベクターpCW603に対して再生され、実施例1に記載されるように、成熟するまで生育させた。T0ベニバナ若枝におけるT−DNAの組み込みは、Belide et al.(2011)によって記載されるように、T−DNAベクターに特異的なプライマーを使用するPCRによって確認された。特定の形質転換に使用されるT−DNAを欠いていることが見出され、組織培養中の再生中、ハイグロマイシン選択からの「エスケープ」であると推定されるほとんどの植物が廃棄された。しかしながら、一部は、形質転換された植物との比較のための「ヌル」植物または陰性対照として維持された。これらの対照植物は、組織培養中において形質転換された材料と同じ条件、接木、および温室条件下で処理された。
脂肪酸分析が、以下の通りに、形質転換されたベニバナ植物から得られた個々のT1種子において行われた。S317遺伝的背景において、pCW603で形質転換された30の個々のT0植物が、温室中で生育され、自家受精して、種子を生成した。それぞれのT0植物からの単一の種子の頭部から10個もの成熟種子が、実施例1に記載されるように、GC分析を使用して、脂質組成について分析された。pCW603で形質転換されたベニバナS317の種子からの脂肪酸組成分析の結果を表13中に要約する。それぞれの形質転換したT0ベニバナ植物が、T−DNAに対してヘテロ接合であり、そのため、T1種子の分離集団を生じることが予測されたため、それぞれの植物からの5〜10個の種子の分析が、いくつかのヌル(分離個体)の種子を含み得ることが予測された。そのようなヌル分離個体の種子は、同じ植物からの形質転換された種子と同じ種子頭部内で生育し、発育したため、この実験において良好な陰性対照であった。表13中のデータから見られ得るように、(全脂肪酸含量の重量%として)87%を超えるオレイン酸のレベルが、30の生成された株のうちの6つの独立した株(株9、12、14、20、34、および36)において観察された。多くの形質転換された種子は、87〜91.7%の範囲のオレイン酸含量を有し、2.15〜5.9%のリノール酸レベルおよび2.32〜3.45%のパルミチン酸レベルを有した。種子中の他の脂肪酸レベルは、非形質転換対照とは有意に異ならなかった。pCW603で形質転換されたT1ベニバナ種子において観察された最大のオレイン酸含量が、91.7%であったのに対して、非形質転換S317対照種子およびヌル分離個体の種子では、約77%であった。とりわけ、種子脂質はまた、16:0のレベルで有意に減少し、4.5%から2.3%まで下がって減少した。TLCプレート上で精製される場合、種子油のTAG画分の脂肪酸のプロファイルは、種子から抽出された総脂質のものとは有意に異ならなかった。
pCW603由来のT−DNAを含有するT0ベニバナ形質転換細胞は、T−DNAに対して分離したT1種子を生成し、一組のホモ接合体、ヘテロ接合体、およびヌル分離個体を得た。これらのサブ集団の比は、メンデル遺伝学により期待されるように、T0植物におけるT−DNA挿入事象の数および連結に応じて異なった。したがって、それぞれのT0植物由来のT1種子が、独立して分析された。個々の種子からの脂質プロファイルの分析は、単一種子頭部がヌルおよびトランスジェニック事象の両方を含んだことを明らかに示した。
pCW631で形質転換されたベニバナ変種S−317のT1種子が、それらの脂肪酸組成について同様に分析された。表17は、これらの種子についてのデータならびにODPおよびPLOの測定基準を示す。これらの種子の脂質中のオレイン酸含量は、最大94.19%であった。最高レベルのオレイン酸を有する種子TS631−01 T1(21)のパルミチン酸含量は2.43%であり、ODPは0.0203であり、PLOは0.0423であった。これらの分析は、S−317遺伝的背景のベニバナに形質転換された場合、pCW603の構築物であるpCW631のヘアピンRNA構築物が、一般に、より高いオレイン酸レベルを生成したことを示した。この観察は、pCW631で使用されたリニンプロモーターが、pCW603に使用されたAtOleosinプロモーターと比較して、より強力なもしくはより良好な発現の時期、または両方の組み合わせを有するヘアピンRNAを発現したことを示した。
TS603−22.6と表されたホモ接合型トランスジェニック株由来のT4種子が収穫され、全種子油は、実施例1に記載されるような、ソックスレー装置を使用して抽出された。抽出された油のアリコートが、GCによって分析された(表18)。合計643グラムの油が回収された。抽出物2、3、5、および6はプールされたが、抽出物4、7、および8は、別々のロット中にプールされた。これらの混合物は、GCによって、脂肪酸組成についてさらに分析された。このデータを表18中に示す。
実施例10〜12に記載された結果に基づいて、他の遺伝子サイレンシング構築物を以下の通りに調製して、ベニバナ種子油のオレイン酸含量を増加させ、ODPまたはPLO比を減少させた。これらの遺伝子サイレンシング構築物は、非ベニバナ源、ならびにベニバナ源由来の異なるプロモーターを合わせて、ベニバナFAD2−2、FATB−3、およびFAD6遺伝子発現において最大限の減少を達成することと、FAD2−2に加えて1つを超えるFAD2遺伝子をさらにサイレンシングすることを含んだ。これらの構築物は、、内因性CtFAD2−1遺伝子の不活性変形を有するベニバナの変種、例えば、S−317、Ciano−OL、およびLesaff496を形質転換するために使用された。
この植物バイナリー発現ベクターは、内因性CtFATBおよびCtFAD2−2の発現を減少させるために、ヘアピンRNAを生成する、1つのプロモーターというよりもむしろ、ベニバナ種子中において異なるが、重複する発現パターンを有する2つの外来(非ベニバナ)プロモーターを有する。2つのプロモーターは、AtOleosinプロモーターおよび亜麻リニンプロモーターであり、2つのhpRNA発現カセットは、同じT−DNA分子中にある。このベクターは、リニンプロモーターならびにCtFAD2−2およびCtFATBのサイレンシングのためのhpRNAコード領域を有するpCW631由来のhpRNA遺伝子発現カセットの制限消化によって構築され、それをpCW603由来のT−DNAに挿入し、そのようにして、これらの2つのベニバナ遺伝子に対してヘアピンRNAをコードする構築物を生成する。この構築物は、Lesaff496、Ciano−OL、およびS−317等のベニバナ変種を形質転換するために使用される。
ベニバナ種子中において最適活性を有することを期待されるベニバナ由来のプロモーターは、発現された遺伝子の上流および下流DNA領域についての正確な配列情報を提供するDNA配列決定技術を使用して単離される。実施例2〜6に記載される、先行の結果は、CtFAD2−1遺伝子がベニバナにおける種子発育時に高度に発現されることを示す。したがって、この遺伝子のプロモーター領域は、ベニバナ種子中において、効率的な導入遺伝子発現を活発にするための卓越した候補である。実施例6に示されるように、CtFAD2−2は、CtFAD2−1が突然変異によって不活性化された遺伝的背景において活性であった。したがって、CtFAD2−2のプロモーターを、ベニバナにおいて使用して、他の遺伝子の間でCtFAD2−2活性を標的とするヘアピンRNAの発現を活発にする。ベニバナ種子中において導入遺伝子の発現に有用な他のプロモーター要素には、オレオシン(CtOleosin)および種子貯蔵タンパク質、例えば、2Sおよび11Sタンパク質(Ct2SおよびCt11S)に対する遺伝子の上流部分に内因性(すなわち、ベニバナ)プロモーター要素が含まれる。CtFAD2−1、CtOleosin、Ct2S、およびCt11Sのプロモーター要素を、ベニバナゲノム配列に基づく標準的なPCRベースの手法を使用して単離し、植物バイナリー発現ベクターに組み込む。これらのプロモーター要素を使用して、構築物pCW701−pCW710中、あるいは、同じまたは異なるhpRNA遺伝子を発現する他の非ベニバナプロモーター、例えば、pCW602、pCW603、pCW631、またはpCW632と組み合わせて、hpRNAサイレンシング分子を発現する。異なるプロモーターとのhpRNA遺伝子の組み合わせはまた、形質転換した植物を個々の遺伝子と交配することによっても生成され、そこでは一般的に、hpRNA遺伝子は連結されない。
一連のベニバナの非形質転換変種およびアクセッションを、New South Wales州のNarrabriに位置する野外農場で、2011〜2012年の夏に生育させた。5m×3mの野外プロット内で、Narrabri領域内で一般に見られる重粘土に、種子を植え付けた。生育から4週間後に一度かんがいしたことを除いては、植物は天然光および降雨にさらした。成熟種子が収穫され、約50個の種子の試料が、種子油中の脂質含量および脂肪酸組成について分析された。様々な変種およびアクセッションの種子油中のオレイン酸含量を表19および図13に示す。
ベニバナ変種は、例えば、Mundel and Bergman(2009)に記載されるような確立した方法を使用して、手作業で交配される。上述の構築物を含む最良の形質転換した株、具体的には、単一のT−DNA挿入のみを含む形質転換された株が選択され、ベニバナの他の変種の、異なる構築物で形質転換されない、または既に形質転換された、最適な農業生産力を有する植物で交差される。例えば、4または5回の戻し交配に対して、反復親と戻し交配する反復ラウンドを使用して、最適な農業生産力の遺伝的背景において、所望の構築物(複数を含む)に対してホモ接合である自殖植物が生成される。マーカー利用選抜は、実施例7に記載されるような、ol対立遺伝子に対する完全なマーカーの使用等の繁殖プロセスに使用され得る。
マイクロRNA(miRNA)は、内因性遺伝子の活性を調節する植物および動物の両方に対して内因性である一種の20〜24ヌクレオチド(nt)の調節小RNA(sRNA)である。修飾されたmiRNA前駆体RNA(人工のmiRNA前駆体)のトランスジェニック発現は、内因性遺伝子をサイレンシングする近年開発されたRNAベースの配列特異的な戦略を表す。人工のmiRNA前駆体を作製するためのmiRNA前駆体配列内のいくつかのヌクレオチドの置換は、前駆体のステムループ内でマッチおよびミスマッチの位置が影響を受けないままである限り、miRNAの反復発生に影響を及ぼさないことが示されている。
オーストラリアにおいて商業的供給源から購入された12の植物油試料からの植物ステロールが、実施例1に記載されるように、O−トリメチルシリルエーテル(OTMSi−エーテル)誘導体としてGCおよびGC−MS分析によって特徴付けられた。ステロールは、保持データ、質量スペクトルの解釈、ならびに文献および実験の標準質量スペクトルデータによる比較によって特定された。ステロールは、5β(H)−コラン−24−オールの内部標準の使用によって定量化された。特定されたステロールのうちのいくつかの基本的な植物ステロール構造および化学構造を、図14および表21に示す。
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Claims (18)
- 油含有物がグリセロールにエステル化された脂肪酸から成るトリアシルグリセロール(TAG)を含む、および/または油含有物がグリセロールにエステル化された脂肪酸から成るトリアシルグリセロール(TAG)を含む種子を生成する植物を生成することができ、
i)前記脂肪酸がパルミチン酸およびオレイン酸を含み、
ii)前記種子の油含有物の少なくとも95重量%がTAGであり、
iii)前記種子の油含有物の全脂肪酸の90重量%〜95重量%がオレイン酸であり、
iv)前記種子の油含有物の全脂肪酸の3重量%未満がパルミチン酸であり、
v)前記種子の油含有物が0.037未満のオレイン酸不飽和率(ODP)および/または0.063未満のパルミチン酸−リノール酸−オレイン酸(PLO)値を有し、
a)第1の外因性ポリヌクレオチドを欠失している対応するベニバナ種子と比較して、発育中のベニバナ種子においてΔ12デサチュラーゼ(FAD2)遺伝子の発現を減少させることができる第1のサイレンシングRNAをコードする第1の外因性ポリヌクレオチドであって、前記第1の外因性ポリヌクレオチドが、前記発育中のベニバナ種子において前記ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結されるもの、および
b)第2の外因性ポリヌクレオチドを欠失している対応するベニバナ種子と比較して、発育中のベニバナ種子においてパルミトイル−ACPチオエステラーゼ(FATB)遺伝子の発現を減少させることができる第2のサイレンシングRNAをコードする第2の外因性ポリヌクレオチドであって、前記第2の外因性ポリヌクレオチドが、前記発育中のベニバナ種子において前記ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結されるものを含む、ベニバナ種子。 - 前記種子の油含有物が、全脂肪酸の2.25重量%未満のリノール酸を含む、請求項1に記載のベニバナ種子。
- 前記種子の油含有物が、以下の特徴のうちの1つ以上を有する、
a)前記種子の油含有物の全脂肪酸の90重量%〜94重量%、91重量%〜94重量%、または91重量%〜92重量%が、オレイン酸である、
b)前記種子の油含有物の全脂肪酸の2.75重量%未満、または2.5重量%未満が、パルミチン酸である、
c)前記種子の油含有物の全脂肪酸の0.1重量%〜3重量%、または2重量%〜3重量%が、多価不飽和脂肪酸(PUFA)である、
d)前記種子の油含有物の全脂肪酸の1重量%未満または0.5重量%未満が、α−リノレン酸(ALA)である、
e)前記油含有物の全脂肪酸含有量の90重量%〜96重量%、または92重量%〜96重量%が、一価不飽和脂肪酸である、
f)前記油含有物が、0.02未満、0.015未満、0.005〜0.05、または0.005〜0.02のオレイン酸一価不飽和率(OMP)を有する、
g)前記種子の油含有物のODPが、0.01〜0.033、0.016〜0.033、または0.023〜0.033である、および
h)前記種子の油含有物のPLO値が、0.020〜0.063、0.020〜0.055、0.020〜0.050、または0.050〜0.055である、
請求項1または2に記載のベニバナ種子。 - 前記種子の油含有物が、以下の特徴のうちの1つ以上をさらに特徴とする脂質である、
(a)α−リノレン酸が前記脂質の脂肪酸中で検出不能である、
(b)前記脂質のTAG含量の55%〜80%、60%〜80%、70%〜80%、または少なくとも60%もしくは少なくとも70%が、トリオレインである、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のベニバナ種子。 - 第3の外因性ポリヌクレオチドを欠失している対応するベニバナ種子と比較して、発育中のベニバナ種子において色素体ω6脂肪酸デサチュラーゼ(FAD6)遺伝子の発現を減少させることができる第3の外因性ポリヌクレオチドであって、前記第3の外因性ポリヌクレオチドが、前記発育中のベニバナ種子において前記ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結されるもの、
をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のベニバナ種子。 - 以下の特徴
a)前記第1のサイレンシングRNAが、発育中のベニバナ種子においてFAD2をコードする1つを超える外因性遺伝子の発現を減少させる、および/または前記第2のサイレンシングRNAが、発育中のベニバナ種子においてFATBをコードする1つを超える外因性遺伝子の発現を減少させる、
b)前記第1の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第2の外因性ポリヌクレオチドが、単一のDNA分子に、任意に、前記第1および前記第2の外因性ポリヌクレオチド間の連結するDNA配列と共に共有結合する、
c)前記第1の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第2の外因性ポリヌクレオチドが、単一のプロモーターの制御下にあり、そのため、前記第1の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第2の外因性ポリヌクレオチドが前記発育中のベニバナ種子において転写される場合、第1のサイレンシングRNAおよび第2のサイレンシングRNAが単一のRNA転写物の一部として共有結合する、
d)前記種子がベニバナ種子のゲノムに組み込まれた単一のトランスファーDNAを含み、前記単一のトランスファーDNAが、前記第1の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第2の外因性ポリヌクレオチドを含む、
e)前記種子がd)のトランスファーDNAに対してホモ接合である、
f)前記第1のサイレンシングRNAおよび前記第2のサイレンシングRNAがそれぞれ独立して、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロRNA、および二本鎖RNAから成る群から選択される、
g) 前記プロモーターが、種子特異的であり、発育中のベニバナ種子の胚内において選択的に発現される、
h)前記種子が1つ以上のFAD2遺伝子において、1つ以上の突然変異体を含み、前記突然変異体が、前記突然変異体を欠失している対応するベニバナ種子と比較して、発育中のベニバナ種子において前記1つ以上のFAD2遺伝子の活性を減少させ、前記突然変異が、欠失、挿入、逆位、フレームシフト、早期翻訳終止コドン、または1つ以上の非保存アミノ酸置換、FAD2遺伝子またはCtFAD2−1遺伝子のヌル突然変異体である、
i)FAD2タンパク質が、前記種子において検出不能である、ならびに
j)前記第1のサイレンシングRNAがCtFAD2−1およびCtFAD2−2遺伝子の両方の発現を減少させる、
を1つ以上をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のベニバナ種子。 - 1)前記FAD2遺伝子が、CtFAD2−1遺伝子、CtFAD2−2遺伝子、およびCtFAD2−10遺伝子のうちの1つ以上である、
2)前記FATB遺伝子が、CtFATB−3遺伝子である、ならびに/または
3)前記FAD6遺伝子が、CtFAD6遺伝子である、
請求項5または6に記載のベニバナ種子。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の種子を生成することが可能である、ベニバナ植物。
- i)請求項1〜7のいずれか一項に記載のベニバナ種子を得ること、および
ii)前記ベニバナ種子から油を抽出し、それによって油を生成すること、
を含む、油を生成するための方法。 - 前記ベニバナ種子から抽出された油を精製するステップをさらに含み、前記精製するステップは、前記抽出された油を脱ガム、脱臭、脱色、乾燥、および/または分留すること、ならびに/あるいは前記抽出された油からの少なくとも一部の、好ましくは実質的にはすべてのワックスおよび/もしくはワックスエステルを除去すること、から成る群のうちの1つ以上またはすべてを含む、請求項9に記載の方法。
- グリセロールにエステル化された脂肪酸から成るトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
i)前記脂肪酸がパルミチン酸およびオレイン酸を含み、
ii)脂質の少なくとも95重量%がTAGであり、
iii)脂質の全脂肪酸含量の90重量%〜95重量%がオレイン酸であり、
iv)脂質の全脂肪酸含量の3重量%未満がパルミチン酸であり、
v)脂質が0.037未満のオレイン酸不飽和率(ODP)および/または0.063未満のパルミチン酸−リノール酸−オレイン酸の値(PLO)を有する、ベニバナ種子抽出脂質。 - 全脂肪酸含有量の2.25重量%未満の量のリノール酸を含む、請求項11に記載の脂質。
- 以下の特徴
a)前記脂質の全脂肪酸含量の90重量%〜94重量%、91重量%〜94重量%、または91重量%〜92重量%がオレイン酸である、
b)前記脂質の全脂肪酸含量の2.75重量%未満、または2.5重量%未満がパルミチン酸である、
c)前記脂質の全脂肪酸含量の0.1重量%〜3重量%、または2重量%〜3重量%が多価不飽和脂肪酸(PUFA)である、
d)前記脂質の全脂肪酸含量の1重量%未満、または0.5重量%未満がα−リノレン酸(ALA)である、
e)前記脂質の全脂肪酸含量の0.5重量%〜1重量%が18:1Δ11である、
f)前記脂質の脂肪酸含量のODPが、0.01〜0.033、0.016〜0.033、または0.023〜0.033である、
g)前記脂質の脂肪酸含量のPLO値が、0.020〜0.063、0.020〜0.055、0.020〜0.050、または0.050〜0.055である、
h)前記脂質の全脂肪酸含量の90重量%〜96重量%、または92重量%〜96重量%が、一価不飽和脂肪酸である、
i)前記脂質が、0.02未満、0.015未満、または0.005〜0.02のオレイン酸一価不飽和率(OMP)を有する、
j)前記脂質が、精製油の形態である、
k)前記脂質が水素化されていない、ならびに
l)少なくとも1リットルの体積および/もしくは少なくとも1kgの重量を有する、ならびに/または野外生育植物から得られた種子から抽出された、
のうちの1つ以上またはすべてを有する、請求項11または12に記載の脂質。 - 1つ以上のステロールをさらに含み、
油の形態であり、5mg未満のステロール/g(油)、または1.5mgのステロール/g(油)〜5mgのステロール/g(油)を含み、
a)全ステロール含量の2.3%〜4.5%がエルゴスト−7−エン−3β−オールである、及び
b)全ステロール含量の1.5%〜3%がトリテルペノイドアルコールである、
のうちの1つ以上を含む、
請求項11〜13のいずれか一項に記載の脂質。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載のベニバナ種子から抽出された種子粉末。
- 請求項11〜14のいずれか一項に記載の脂質である第1の成分と、第2の成分とを含み、前記第2の成分が非脂質物質、例えば、酵素、非タンパク質触媒もしくは化学物質、または食餌の1つ以上の成分である、組成物。
- i)請求項11〜14のいずれか一項に記載の脂質、請求項16に記載の組成物、または請求項1〜7のいずれか一項に記載のベニバナ種子を得るステップと、
ii)ステップi)の、請求項11〜14のいずれか一項に記載の脂質、請求項16に記載の組成物、または請求項1〜7のいずれか一項に記載のベニバナ種子を任意に物理的に処理するステップと、
iii)請求項11〜14のいずれか一項に記載の脂質、請求項16に記載の組成物のうちの脂質、請求項1〜7のいずれか一項に記載のベニバナ種子またはステップii)の物理的に処理された生成物の少なくとも一部を、熱、化学、もしくは酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを脂質に適用することによって、工業生成物に変換するステップと、
iv)前記工業生成物を回収するステップと、
を含み、それによって工業生成物を生成する、工業生成物を生成するための方法。 - i)請求項11〜14のいずれか一項に記載の脂質、または請求項16に記載の組成物のうちの脂質、または請求項1〜7のいずれか一項に記載のベニバナ種子を、アルコールと任意に触媒の存在下で反応させて、アルキルエステルを生成するステップ、および
ii)任意に、前記アルキルエステルを石油燃料と混合するステップ、
を含む、燃料を生成する方法。
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