CN104619164A - 高油酸油 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有高水平的油酸，例如90重量％至95重量％的油酸的提取脂质。本发明还提供可用于产生所述脂质的经遗传修饰的植物，尤其是油料种子，诸如红花。此外，本发明还提供对可用于产生所述脂质的植物进行基因分型和选择的方法。

Description

高油酸油
技术领域
本发明涉及具有高水平的油酸，例如90重量％至95重量％的油酸的提取脂质。本发明还提供可用于产生所述脂质的经遗传修饰的植物，尤其是油料种子，诸如红花。此外，本发明还提供对可用于产生所述脂质的植物进行基因分型和选择的方法。
发明背景
植物油是人类膳食脂肪的重要来源，在发达国家/地区占热量摄入的大约25％(Broun等人，1999)。世界植物油的产量为至少约1亿1千万吨/年，其中86％用于人类消耗。几乎所有这些油均得自油料种子作物，诸如大豆、低芥酸菜子、红花、向日葵、棉籽和落花生，或得自种植树木，诸如棕榈树、橄榄树和椰子树(Gunstone，2001；OilWorld Annual，2004)。关于食用油的各个脂肪酸成分对于人体健康各个方面的影响的日益增长的科学了解和社会共识推动了具有改良的营养价值而同时保留各种食物应用所需的功能性的经修饰的植物油的开发。这些修饰需要关于植物脂肪酸合成的代谢途径及编码这些途径的酶的基因的知识(Liu等人，2002a；Thelen和Ohlrogge，2002)。
对于各种脂肪和油的营养作用、特别是脂肪和油的组成成分对于心血管疾病、癌症和多种炎症性疾病的影响给予了很大关注。饮食中高水平的胆固醇和饱和脂肪酸被认为增加心脏病的风险，这个结果已经导致减少摄取胆固醇丰富的饱和动物脂肪而赞成摄取无胆固醇的不饱和植物油的营养学建议(Liu等人，2002a)。
虽然经膳食摄取动物脂肪中存在的胆固醇可以明显增加血液总胆固醇水平，但是也发现包含所述脂肪和油的脂肪酸自身对于血清胆固醇水平即可具有显著作用。特别感兴趣的是膳食脂肪酸对于血液中不希望的低密度脂蛋白(LDL)和希望的高密度脂蛋白(HDL)形式胆固醇的作用。通常，饱和脂肪酸、特别是在植物油中存在的主要饱和物豆蔻酸(14：0)和棕榈酸(16：0)具有增加血清LDL-胆固醇水平及随后增加心血管疾病风险的不希望的性质(Zock等人，1994；Hu等人，1997)。然而，已经充分确定在植物油中存在的另一种主要饱和物，硬脂酸(18：0)不增加LDL-胆固醇水平且也许实际上可降低总胆固醇水平(Bonanome和Grundy，1988；Dougherty等人，1995)。因此，通常认为硬脂酸对于心血管疾病的风险至少是中性的(Tholstrup，等人，1994)。另一方面，不饱和脂肪酸如单不饱和油酸(18：1)对于降低LDL-胆固醇有益处(Mensink和Katan，1989；Roche和Gibney，2000)，从而降低心血管疾病的风险。
高油酸油还具有许多工业用途，诸如但不限于通常为脂肪酸酯形式的润滑剂、生物燃料、脂肪醇的原料、增塑剂、蜡、金属硬脂酸盐、乳化剂、个人护理产品、肥皂和洗涤剂、表面活性剂、药物、金属加工添加剂、织物柔软剂的原料、油墨、透明皂、PVC稳定剂、醇酸树脂以及许多其他类型的下游油脂化工衍生物的中间体。
油加工商和食品制造商传统上依赖于氢化以降低油中不饱和脂肪酸的水平，从而增加其在油炸应用中的氧化稳定性且还提供了固体脂肪以用于人造黄油和起酥油中。氢化作用是一个化学过程，它通过将碳碳双键转变为碳碳单键而降低油的不饱和程度。完全氢化作用产生完全饱和脂肪。然而，部分氢化过程导致饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的水平均增加。在部分氢化过程中形成的一些单不饱和物是反式异构体形式(诸如反油酸，油酸的反式异构体)，而不是天然存在的顺式异构体(Sebedio等人，1994；Fernandez San Juan，1995)。与顺式不饱和脂肪酸相反，现在己知反式脂肪酸与棕榈酸在增加血清LDL胆固醇水平(Mensink和Katan，1990；Noakes和Clifton，1998)和降低血清HDL胆固醇(Zock和Katan，1992)方面具有同样效力，并因此导致心血管疾病风险增加(Ascherio和Willett，1997)。由于对于反式脂肪酸的反营养作用的了解日益增多，现在越来越多地倾向于在食品业中不使用氢化油，而赞成使用既具有营养益处且无需氢化而可提供需要的功能性的脂肪和油，特别是富含油酸(在需要液态油的情况中)或者硬脂酸(在优选固体或半固体脂肪的情况中)的那些脂肪和油。
对于具有高油酸含量的另外的脂质和油及其来源存在需要。
发明概要
本发明已产生了新的脂质组合物并建立了产生这些脂质的方法。
在第一方面，本发明提供从油料种子提取的脂质，该脂质包含由与甘油酯化的脂肪酸组成的三酰基甘油(TAG)，其中
i)该脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
ii)该脂质的至少95重量％为TAG，
iii)该脂质的总脂肪酸含量的约90重量％至约95重量％为油酸，
iv)该脂质的总脂肪酸含量的低于约3.1重量％为棕榈酸，并且
v)该脂质具有低于约0.037的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.063的棕榈酸-亚油酸-油酸值(PLO)。
在一个实施方案中，该脂质具有以下特征中的一个或多个或全部，
a)该脂质的总脂肪酸含量的约90重量％至约94重量％、或约91重量％至约94重量％、或约91重量％至约92重量％、或约92重量％、或约93重量％为油酸，
b)该脂质的总脂肪酸含量的低于约3重量％、或低于约2.75重量％、或低于约2.5重量％、或约3重量％、或约2.75重量％、或约2.5重量％、或约2.3重量％为棕榈酸，
c)该脂质的总脂肪酸含量的约0.1重量％至约3重量％、或约2重量％至约3重量％、或约3重量％、或约2重量％为多不饱和脂肪酸(PUFA)，
d)该脂质的总脂肪酸含量的低于约3重量％、或低于约2.5重量％、或低于约2.25重量％、或约3重量％、或约2.5重量％、或约2.25重量％为亚油酸，
e)该脂质的总脂肪酸含量的低于约1重量％、或低于约0.5重量％为α-亚麻酸(ALA)，
f)该脂质的总脂肪酸含量的约0.5重量％至约1重量％为18：1Δ11，
g)该脂质的脂肪酸含量的ODP为约0.033至约0.01、或约0.033至约0.016、或约0.033至约0.023，或为约0.03、或约0.02、或约0.01，
h)该脂质的脂肪酸含量的PLO值为约0.020至约0.063、或约0.020至约0.055、或约0.020至约0.050、或约0.050至约0.055、或约0.063、或约0.055、或约0.050、或约0.040、或约0.030、或约0.020，
i)该脂质的总脂肪酸含量的约90重量％至约96重量％、或约92重量％至约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，
j)该脂质具有低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)，
k)该脂质为纯化的油的形式，以及
l)该脂质为非氢化的。
在一个实施方案中，
1)该脂质的总脂肪酸含量的约91重量％至约94重量％为油酸，
2)该脂质的总脂肪酸含量的低于约2.75重量％为棕榈酸，
3)该脂质的总脂肪酸含量的低于约3重量％为亚油酸，
4)α-亚麻酸未在该脂质的脂肪酸含量中检出，
5)该脂质的脂肪酸含量的ODP为约0.033至约0.023、或约0.033至约0.018，
6)该脂质的脂肪酸含量的PLO值为约0.020至约0.063，
7)该脂质的总脂肪酸含量的约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，并且
8)该脂质具有低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)。
在又一个实施方案中，
1)该脂质的总脂肪酸含量的约91重量％至约94重量％为油酸，
2)该脂质的总脂肪酸含量的低于约2.75重量％为棕榈酸，
3)该脂质的总脂肪酸含量的低于约3重量％为亚油酸，
4)α-亚麻酸未在该脂质的脂肪酸含量中检出，
5)该脂质的总脂肪酸含量的约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，并且
6)该脂质具有低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)。
在一个实施方案中，PUFA为亚油酸。
在一个实施方案中，α-亚麻酸未在该脂质的脂肪酸含量中检出。
在又一个实施方案中，该脂质的TAG含量的约55％至约80％、或约60％至约80％、或约70％至约80％、或至少约60％、或至少约70％、或约60％、或约70％、或约80％为三油酸甘油酯。
在另一个实施方案中，该脂质的油酸含量的低于约5％、或低于约2％、或约0.1％至约5％为二酰基甘油(DAG)的形式。
在又一个实施方案中，脂质为油的形式，其中油的至少90％、或至少95％、至少约98重量％、或约95重量％至约98重量％为脂质。
在一个优选的实施方案中，油料种子为非光合作用油料种子。非光合作用油料种子的实例包括但不一定限于得自红花、向日葵、棉花或蓖麻的种子。在一个优选的实施方案中，非光合作用油料种子为红花种子。
在一个实施方案中，该脂质还包含一种或多种甾醇。
在又一个实施方案中，该脂质为油的形式，并且其包含低于约5mg甾醇/g油、或约1.5mg甾醇/g油至约5mg甾醇/g油。
在一个实施方案中，该脂质包括以下一个或多个方面或全部
a)总甾醇含量的约1.5％至约4.5％、或约2.3％至约4.5％为麦角甾-7-烯-3β-醇，
b)总甾醇含量的约0.5％至约3％、或约1.5％至约3％为三萜醇，
c)总甾醇含量的约8.9％至约20％为Δ7-豆甾醇/豆甾-7-烯-3β-醇，以及
d)总甾醇含量的约1.7％至约6.1％为Δ7-燕麦甾醇。
在又一个实施方案中，该脂质具有至少1升的体积和/或至少1kg的重量，和/或其从得自田间生长植物的油料种子提取而得。
在一个实施方案中，该脂质从油料种子通过压碎提取而得，并包含低于约7重量％的水。在另一个实施方案中，该脂质为经纯化的脂质(溶剂提取并精炼的)，并包含低于约0.1重量％、或低于约0.05重量％的水。
在另一个方面，本发明提供一种组合物，其包含为本发明的脂质的第一组分，和第二组分，优选地其中该组合物通过将脂质与第二组分混合而制得。
如本领域技术人员将认识到，第二组分可选自许多不同的化合物/组合物。在一个实例中，第二组分为非脂质物质，诸如酶、非蛋白(非酶促)催化剂或化学物质(例如氢氧化钠、甲醇或金属)或饲料的一种或多种成分。
本发明还提供生产油的工艺，该工艺包括
i)获得油料种子，该油料种子包含油和/或其能够长成产生含油油料种子的植物，其中油料种子的油含量为本文所定义的脂质，以及
ii)从油料种子提取油，从而产生油。
在一个优选的实施方案中，油料种子包含第一外源性多核苷酸，该第一外源性多核苷酸编码第一沉默RNA，该第一沉默RNA能够相对于不含该外源性多核苷酸的相应油料种子降低发育油料种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中该多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育油料种子中的表达。
在另一个方面，本发明提供一种生产油的工艺，该工艺包括：
i)获得红花种子，其油含量包含三酰基甘油(TAG)，和/或其能够长成产生油含量包含三酰基甘油的种子的植物，该三酰基甘油由与甘油酯化的脂肪酸组成，并且其中
a)该脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
b)该种子的油含量的至少95重量％为TAG，
c)该种子的油含量的总脂肪酸的约75重量％至约95重量％为油酸，
d)该种子的油含量的总脂肪酸的低于约5.1重量％为棕榈酸，并且
e)该种子的油含量具有低于约0.17的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.26的棕榈酸-亚油酸-油酸(PLO)值，以及
ii)从红花种子提取油，从而产生油，
其中红花种子包含第一外源性多核苷酸，其
编码第一沉默RNA，该第一沉默RNA能够相对于不含该外源性多核苷酸的相应红花种子降低发育红花种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中该多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育红花种子中的表达。
在一个实施方案中，油料种子或红花种子包含第二外源性多核苷酸，该第二外源性多核苷酸编码第二沉默RNA，该第二沉默RNA能够相对于不含该第二外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)基因的表达，并且其中该第二外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育油料种子或红花种子中的表达。
在另一个实施方案中，油料种子或红花种子包含第三外源性多核苷酸，该第三外源性多核苷酸编码第三沉默RNA，该第三沉默RNA能够相对于不含该第三外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中质体ω6脂肪酸去饱和酶(FAD6)基因的表达，并且其中该第三外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育油料种子或红花种子中的表达。
在一个实施方案中，
1)FAD2基因为CtFAD2-1基因、CtFAD2-2基因和CtFAD2-10基因、优选CtFAD2-1基因和/或CtFAD2-2基因中的一者或多者或每一着，和/或
2)FATB基因为CtFATB-3基因，和/或
3)FAD6基因为CtFAD6基因。
在一个实施方案中，该红花种子的油含量具有以下特征中的一个或多个或全部，
a)种子的油含量的总脂肪酸的约80重量％至约94重量％、或约85重量％至约94重量％、或约90重量％至约94重量％、或约91重量％至约94重量％、或约91重量％至约92重量％、或约92重量％、或约93重量％为油酸，
b)种子的油含量的总脂肪酸的低于约5重量％、或低于约4重量％、或低于约3重量％、或低于约2.75重量％、或低于约2.5重量％、或约3重量％、或约2.75重量％、或约2.5重量％为棕榈酸，
c)种子的油含量的总脂肪酸的约0.1重量％至约15重量％、或约0.1重量％至约10重量％、或约0.1重量％至约7.5重量％、或约0.1重量％至约5重量％、或约0.1重量％至约3重量％、或约2重量％至约3重量％、或约3重量％、或约2重量％为多不饱和脂肪酸(PUFA)，
d)种子的油含量的总脂肪酸的低于约15重量％、或低于约10重量％、或低于约5重量％、或低于约3重量％、或低于约2.5重量％、或低于约2.25重量％、或约3重量％、或约2.5重量％、或约2.25重量％为亚油酸(LA)，
e)脂质的总脂肪酸含量的约80重量％至约96重量％、或约90重量％至约96重量％、或约92重量％至约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，
f)脂质具有低于约0.05、或低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.05、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)，
g)种子的油含量的ODP为约0.17至约0.01、或约0.15至约0.01、或约0.1至约0.01、或约0.075至约0.01、或约0.050至约0.01、或约0.033至约0.01、或约0.033至约0.016、或约0.033至约0.023，或为约0.03、或约0.02、或约0.01，以及
h)种子的油含量的PLO值为约0.020至约0.026、或约0.020至约0.2、或约0.020至约0.15、或约0.020至约0.1、或约0.020和约0.075、或约0.050和约0.055，或为约0.05、或约0.040、或约0.030、或约0.020。
在一个实施方案中，提取油的步骤包括压碎油料种子或红花种子。
在再一个实施方案中，该工艺还包括纯化从油料种子或红花种子提取的油的步骤，其中纯化步骤包括由以下方面组成的组中的一个或多个或全部：脱胶、除臭、脱色、干燥和/或分馏提取的油，和/或从提取的油中除去至少一些、优选基本上全部蜡和/或蜡酯。
在另一个方面，本发明提供一种油料种子，其油含量包含三酰基甘油(TAG)，和/或其能够长成产生油含量包含三酰基甘油的油料种子的植物，该三酰基甘油由与甘油酯化的脂肪酸组成，并且其中
i)该脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
ii)该油料种子的油含量的至少95重量％为TAG，
iii)该油料种子的油含量的总脂肪酸的约90重量％至约95重量％为油酸，
iv)该油料种子的油含量的总脂肪酸的低于约3.1重量％为棕榈酸，并且
v)该油料种子的油含量具有低于约0.037的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.063的棕榈酸-亚油酸-油酸(PLO)值。
在一个实施方案中，该油料种子为非光合作用油料种子，优选得自红花、向日葵、棉花或蓖麻的种子。
在另一个实施方案中，油料种子包含第一外源性多核苷酸，该第一外源性多核苷酸编码第一沉默RNA，该第一沉默RNA能够相对于不含该外源性多核苷酸的相应油料种子降低发育油料种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中该第一外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育油料种子中的表达。
在再一个方面，本发明提供一种红花种子，其油含量包含三酰基甘油(TAG)，和/或其能够长成产生油含量包含三酰基甘油的种子的植物，该三酰基甘油由与甘油酯化的脂肪酸组成，并且其中
i)该脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
ii)该种子的油含量的至少95重量％为TAG，
iii)该种子的油含量的总脂肪酸的约75重量％至约95重量％为油酸，
iv)该种子的油含量的总脂肪酸的低于约5.1重量％为棕榈酸，并且
v)该种子的油含量具有低于约0.17的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.26的棕榈酸-亚油酸-油酸(PLO)值，并且
其中该红花种子包含第一外源性多核苷酸，该第一外源性多核苷酸编码第一沉默RNA，该第一沉默RNA能够相对于不含该外源性多核苷酸的相应红花种子降低发育红花种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中该第一外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育红花种子中的表达。
在一个实施方案中，该红花种子的油含量具有以下特征中的一个或多个：
a)种子的油含量的总脂肪酸的约80重量％至约94重量％、或约85重量％至约94重量％、或约90重量％至约94重量％、或约91重量％至约94重量％、或约91重量％至约92重量％、或约92重量％、或约93重量％为油酸，
b)种子的油含量的总脂肪酸的低于约5重量％、或低于约4重量％、或低于约3重量％、或低于约2.75重量％、或低于约2.5重量％、或约3重量％、或约2.75重量％、或约2.5重量％为棕榈酸，
c)种子的油含量的总脂肪酸的约0.1重量％至约15重量％、或约0.1重量％至约10重量％、或约0.1重量％至约7.5重量％、或约0.1重量％至约5重量％、或约0.1重量％至约3重量％、或约2重量％至约3重量％、或约3重量％、或约2重量％为多不饱和脂肪酸(PUFA)，
d)种子的油含量的总脂肪酸的低于约15重量％、或低于约10重量％、或低于约5重量％、或低于约3重量％、或低于约2.5重量％、或低于约2.25重量％、或约3重量％、或约2.5重量％、或约2.25重量％为亚油酸(LA)，
e)脂质的总脂肪酸含量的约80重量％至约96重量％、或约90重量％至约96重量％、或约92重量％至约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，
f)脂质具有低于约0.05、或低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.05、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)，
g)种子的油含量的ODP为约0.17至约0.01、或约0.15至约0.01、或约0.1至约0.01、或约0.075至约0.01、或约0.050至约0.01、或约0.033至约0.01、或约0.033至约0.016、或约0.033至约0.023，或为约0.03、或约0.02、或约0.01，以及
h)种子的油含量的PLO值为约0.020至约0.26、或约0.020至约0.2、或约0.020至约0.15、或约0.020至约0.1、或约0.020和约0.075、或约0.050和约0.055，或为约0.050、或约0.040、或约0.030、或约0.020。
在又一个实施方案中，该油料种子或红花种子的油含量为脂质，该脂质进一步由上述特征中的一个或多个表征。
在另一个实施方案中，油料种子或红花种子包含第二外源性多核苷酸，该第二外源性多核苷酸编码第二沉默RNA，该第二沉默RNA能够相对于不含该第二外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)基因的表达，并且其中该第二外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育油料种子或红花种子中的表达。
在又一个实施方案中，油料种子或红花种子包含第三外源性多核苷酸，该第三外源性多核苷酸能够相对于不含该第三外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中质体ω6脂肪酸去饱和酶(FAD6)基因的表达，并且其中该第三外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，该启动子指导该多核苷酸在发育油料种子或红花种子中的表达。
在另一个实施方案中，第一沉默RNA降低发育油料种子或红花种子中不止一种编码FAD2的内源性基因的表达，和/或其中第二沉默RNA降低发育油料种子或红花种子中不止一种编码FATB的内源性基因的表达。
在还一个实施方案中，第一外源性多核苷酸与第二外源性多核苷酸和第三外源性多核苷酸中的任一者或两者共价连接在单个DNA分子上，任选地连接性DNA序列位于第一、第二和/或第三外源性多核苷酸之间。
在另一个实施方案中，第一外源性多核苷酸与第二外源性多核苷酸和第三外源性多核苷酸中的任一者或两者受单个启动子的控制，使得当第一外源性多核苷酸和第二外源性多核苷酸和/或第三外源性多核苷酸在发育油料种子或红花种子中转录时，第一沉默RNA和第二沉默RNA和/或第三沉默RNA作为单个RNA转录物的一部分共价连接。
在另一个实施方案中，油料种子或红花种子包含整合到油料种子或红花种子的基因组中的单个转移DNA，并且其中该单个转移DNA包含第一外源性多核苷酸与第二外源性多核苷酸和第三外源性多核苷酸中的任一者或两者。
优选地，油料种子或红花种子为转移DNA纯合的。
在一个实施方案中，第一沉默RNA、第-二沉默RNA和第三沉默RNA各自独立地选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA和双链RNA。
在又一个实施方案中，所述启动子中的任一个或多个优选地全部为种子特异性的，并优选地优先在发育油料种子或红花种子的胚胎中表达。
在另一个实施方案中，油料种子或红花种子在一个或多个FAD2基因中包含一个或多个突变，其中该突变相对于不含该突变的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中该一个或多个FAD2基因的活性。
在另一个实施方案中，油料种子或红花种子相对于相应油料种子或红花种子中的野生型FAD2基因包含FAD2基因突变，该突变为缺失、插入、倒位、移码、翻译提前终止密码子、或一个或多个非保守氨基酸取代。
在又一个实施方案中，该突变为FAD2基因中的无效突变。
在另一个实施方案中，该突变中的至少一个位于FAD2基因中，该基因在不含该突变的发育油料种子或红花种子中编码比发育油料种子或红花种子中的任何其他FAD2基因更多的FAD2活性。
在另一个实施方案中，该种子为红花种子并且该FAD2基因为CtFAD2-1基因。在该实施方案中，还优选的是，第一沉默RNA至少能够降低CtFAD2-2基因的表达。
在另一个实施方案中，该种子为包含CtFAD2-1基因的ol等位基因或CtFAD2-1基因的ol1等位基因或两种等位基因的红花种子。在一个实施方案中，CtFAD2-1基因的ol等位基因或ol1等位基因以纯合状态存在。
在另一个实施方案中，FAD2蛋白未在该油料种子或红花种子中检出。
在另一个实施方案中，该种子为红花种子，并且第一沉默RNA降低CtFAD2-1和CtFAD2-2两种基因的表达。
在另一个实施方案中，该种子为红花种子，其中
1)FAD2基因为CtFAD2-1基因、CtFAD2-2基因和CtFAD2-10基因、优选CtFAD2-1基因和/或CtFAD2-2基因中的一者或多者，和/或
2)FATB基因为CtFATB-3基因，和/或
3)FAD6基因为CtFAD6基因。
本发明还提供能够产生本发明的种子的油料种子植物或红花植物。
在一个实施方案中，该植物为转基因的和每种外源性多核苷酸纯合的，和/或包含第一外源性多核苷酸与第二外源性多核苷酸或第三外源性多核苷酸中的任一者或两者。
在另一个方面，本发明提供一种基本上纯化的和/或重组的多肽，其包含具有如SEQ ID NO：27至37、44、45或48任一者所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO：27至37、44、45或48中任一者或多者至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
在一个实施方案中，该多肽为脂肪酸修饰酶，优选油酸Δ12去饱和酶、Δ12-乙炔酶、棕榈油酸Δ12去饱和酶或棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)。
在又一个方面，本发明提供包含以下一者或多者的分离的和/或外源性多核苷酸
i)具有如SEQ ID NO：1至25、40至43、46或47中任一者提供的序列的核苷酸，
ii)具有编码本发明多肽的序列的核苷酸，
iii)杂交到如SEQ ID NO：1至25、40至43、46或47中任一者提供的序列的核苷酸，以及
iv)所具有的序列使得当在油料种子植物的种子中表达时降低编码本发明至少一种多肽的基因的表达的核苷酸。
在一个尤其优选的实施方案中，多核苷酸包含这样的核苷酸，其具有的序列使得当在油料种子植物的种子中表达时降低编码本发明至少一种多肽的基因的表达。
在一个实施方案中，部分iv)的多核苷酸包含SEQ ID NO：49至51任一者所提供的核苷酸序列(其中胸腺嘧啶(T)为尿嘧啶(U))。
在一个实施方案中，部分iv)的多核苷酸选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、双链RNA(dsRNA)分子或其经加工的RNA产物。
在又一个实施方案中，该多核苷酸为dsRNA分子或其经加工的RNA产物，包含与SEQ ID NO：1至25、40至43、46、47或49至51中的任一者或多者的互补序列至少95％相同的至少19个连续核苷酸(其中胸腺嘧啶(T)为尿嘧啶(U))。
在另一个实施方案中，dsRNA分子为微RNA(miRNA)前体和/或其中其经加工的RNA产物为miRNA。
在还一个实施方案中，多核苷酸在单个启动子控制下在发育油料种子或红花种子中转录，其中dsRNA分子包含能够彼此杂交的通过单链RNA区域连接的互补有义和反义序列。
在还一个实施方案中，该多核苷酸当存在于发育红花种子中时
i)降低发育种子中编码油酸Δ12去饱和酶(FAD2)的内源性基因的表达，该FAD2具有如SEQ ID NO：27、28或36中任一者或多者、优选SEQ ID NO：27和28中至少一者或两者所提供的氨基酸序列；
ii)降低发育种子中编码棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)的内源性基因的表达，该FATB具有如SEQ ID NO：45提供的氨基酸序列；和/或
iii)降低发育种子中编码ω6脂肪酸去饱和酶(FAD6)的基因的表达，该FAD6具有如SEQ ID NO：48提供的氨基酸序列。
本发明还提供了一种嵌合载体，其包含可操作地连接到启动子的本发明的多核苷酸。
在一个实施方案中，该启动子在油料种子中为功能性的，或为种子特异性启动子，优选地优先在发育油料种子的胚胎中表达。
在另一个方面，本发明提供一种重组细胞，其包含本发明的外源性多核苷酸，和/或本发明的载体。
该细胞可以是任何细胞类型，诸如但不限于细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。
优选地，该细胞为植物细胞，优选地植物种子细胞。更优选地，该植物细胞为油料种子植物细胞。甚至更优选地，该植物细胞为非光合作用种子细胞，优选红花、向日葵、棉花或蓖麻种子细胞。
在另一个方面，本发明提供一种转基因非人类生物体，其包含本发明的多核苷酸中的一种或多种、本发明的载体和本发明的细胞。
优选地，该转基因非人类生物体为植物。更优选地，为油料种子植物。
在还一个方面，本发明提供一种产生本发明的细胞的方法，该方法包括将本发明的多核苷酸和/或本发明的载体引入细胞的步骤。
本发明还提供了本发明的多核苷酸和/或本发明的载体在产生重组细胞方面的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种长成产生本发明的种子的转基因油料种子植物或其种子的方法，该方法包括：
i)将本发明的至少一种多核苷酸和/或本发明的至少一种载体引入油料种子植物的细胞，
ii)通过该细胞再生转基因植物，以及
iii)任选地通过该转基因植物长出一棵或多棵子代植物或其种子，
从而产生该转基因油料种子植物或其种子。
在一个实施方案中，该种子为本发明的红花种子。
在又一个实施方案中，该一棵或多棵子代植物或其种子包含：
i)第一外源性多核苷酸，和/或
ii)第二外源性多核苷酸，和/或
iii)第三外源性多核苷酸，优选所有三种外源性多核苷酸。
在又一个实施方案中，该一棵或多棵子代植物或其种子包含如上文所定义的一个或多个突变。
在再一个方面，本发明提供一种获得油料种子植物的方法，该方法包括：
i)使第一亲本油料种子植物与第二亲本油料种子植物杂交，该第一亲本油料种子植物包含本发明的第一多核苷酸、或本发明的第一载体，该第二亲本油料种子植物包含本发明的第二多核苷酸、或本发明的第一载体，
ii)针对两种多核苷酸或两种载体的存在性从所述杂交株中筛选子代植物；以及
iii)选择以下子代植物：它们同时包含(a)该第一多核苷酸或该第一载体和(b)该第二多核苷酸或该第二载体，并且还在植物的种子的油含量中具有提高比例的油酸和降低比例的棕榈酸。
在又一个方面，本发明提供一种对红花植物进行基因分型的方法，该方法包括检测植物的核酸分子，其中该核酸分子连接到以下一者或多者和/或包含以下一者或多者的至少一部分：红花植物的CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因，优选地CtFAD2-1和CtFAD2-2基因的至少一者或两者，或至少CtFAD2-1基因。
在一个实施方案中，该方法包括测定植物CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因中的一者或多者的表达水平和/或序列。
在一个实施方案中，该方法包括：
i)将第二核酸分子杂交到植物的所述核酸分子，
ii)任选地将至少一个其他核酸分子杂交到植物的所述核酸分子；以及
iii)检测所述杂交步骤的产物或不存在得自所述杂交步骤的产物。
在还一个实施方案中，将第二核酸分子用作引物以逆转录或复制植物的核酸分子的至少一部分。
可使用多种熟知的技术检测核酸，诸如但不限于限制性片段长度多态性分析、扩增片段长度多态性分析、微卫星扩增、核酸测序和/或核酸扩增。
在一个实施方案中，该方法检测CtFAD2-1基因的等位基因、优选ol等位基因的存在与否。
在又一个方面，本发明提供从红花植物的种群中选择红花植物的方法，该方法包括：
i)使用本发明的方法对所述植物种群进行基因分型，其中所述植物种群得自两种植物之间的杂交株，其中至少一种植物包含CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因，优选CtFAD2-1和CtFAD2-2基因中的至少一者或两者，或至少CtFAD2-1基因的等位基因，该等位基因相对于不含所述等位基因的红花植物的相应种子在所述植物的种子发育时赋予降低水平的Δ12去饱和酶活性，以及
ii)基于所述等位基因的存在与否对红花植物进行选择。
在又一个方面，本发明提供一种将CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因的等位基因引入不含所述等位基因的红花植物的方法，该方法包括：
i)使第一亲本红花植物与第二亲本红花植物杂交，其中第二亲本植物包含CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因的所述等位基因，以及
ii)将步骤i)的杂交株的子代与作为第一亲本植物的相同基因型的植物回交足够多的次数，以产生具有第一亲本的大部分基因型但包含所述等位基因的植物，
其中该等位基因相对于不含所述等位基因的红花植物的相应种子在所述植物的种子发育时赋予降低水平的Δ12去饱和酶活性，并且其中使用本发明的方法针对所述等位基因的存在与否对子代植物进行基因分型。
本发明还提供了一种使用本发明的方法产生的转基因植物或其子代植物或其种子。
在又一个方面，本发明提供了一种产生种子的方法，该方法包括，
a)使本发明的植物生长，优选地作为至少1000棵此类植物的种群在田间生长，以及
b)收获种子。
在再一个方面，本发明提供从以下来源通过本发明的工艺中的一种或多种获得，或可通过本发明的工艺中的一种或多种获得的油：本发明的油料种子或红花种子，本发明的植物或其部分，本发明的细胞，和/或本发明的非人类转基因生物体或其部分。
在另一个方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明的脂质，本发明的油料种子或红花种子，本发明的多肽，本发明的多核苷酸，本发明的载体，本发明的宿主细胞或本发明的油中的一者或多者，以及一种或多种可接受的载剂。
本发明还提供了本发明的脂质、本发明的组合物、本发明的工艺、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油中的一者或多者在制造工业产品方面的用途。
在另一个方面，本发明提供一种生产工业产品的工艺，该工艺包括以下步骤：
i)获得本发明的脂质、本发明的组合物、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油中的一者或多者，
ii)任选地对步骤i)的本发明的脂质、本发明的组合物、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油中的一者或多者进行物理加工，
ii)通过向工业产品应用热、化学、或酶手段或其任意组合而将本发明的脂质、或本发明组合物中的一种或多种中的脂质、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油、或步骤ii)的物理加工产品中的至少一些转化成脂质，以及
iii)回收该工业产品，从而产生工业产品。
在再一个方面，本发明提供了一种生产燃料的方法，该方法包括：
i)使本发明的脂质、或本发明组合物中的一种或多种中的脂质、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油中的一者或多者与醇任选地在存在催化剂的情况下反应，以产生烷基酯，以及
ii)任选地将该烷基酯与基于石油的燃料共混。
在一个实施方案中，烷基酯为甲基酯。
在又一个方面，本发明提供一种生产饲料的方法，该方法包括将本发明的脂质、本发明的组合物、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油中的一者或多者与至少一种其他食品成分配混。
本发明还提供了包含本发明的脂质、本发明的组合物、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油中的一者或多者的饲料、化妆品或化学品。
在再一个方面，本发明提供了通过或使用本发明的脂质、本发明的组合物中的一种或多种中的脂质、本发明的工艺、本发明的油料种子或红花种子、本发明的植物或其部分、本发明的宿主细胞、本发明的非人类转基因生物体或其部分、或本发明的油中的一者或多者生产的产品。
除非另外具体规定，否则本文的任何实施方案加以必要的变更应当适用于任何其他实施方案。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围，这些实施方案仅旨在用于举例说明目的。功能上等效的产物、组合物和方法显然地在本发明的范围内，如本文所述。
贯穿本说明书，除非另外明确地说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质构成、步骤的组或物质构成的组应当被理解成包括这些步骤、物质构成、步骤的组或物质构成的组的一个和多个(即一个或更多个)。
下文将通过以下非限制性实施例并参照附图描述本发明。
附图简述
图1.由红花FAD2样基因家族编码的氨基酸序列与得自其他植物的相异FAD2样酶的系统发育比较。所示的系统发育树通过使用Vector NTI(invitrogen)而生成。比对中包括了FAD2去饱和酶(DES)、羟化酶(OH)、表氧化酶(EPOX)、乙炔酶(ACET)和轭合酶(CONJ)。在系统发育树中所示的氨基酸序列的GeneBank登录号为：coCONJ，AAK26632.1；caACET，ABC00769.1；cpEPOX，CAA76156.1；haACET，ABC59684.1；dsACET，AA038036.1；dcACET，AA038033.1；hhACET，AA038031.1；haDES-2，AAL68982.1；haDES-3，AAL68983.1；luDES，ACF49507；haDES-1，AAL68982.1；ntDES，AAT72296.2；oeDES，AAW63040；siDES，AAF80560.1；ghDES-1，CAA65744.1；rcOH，AAC49010.1；atDES，AAM61113.1；pfOH：DES，AAC32755.1；plOH，ABQ01458.1；ghDES-4，AAQ16653.1；ghDES-2，CAA71199.1。(co，金盏花(Calendula officinalis)；ca，高山还阳参(Crepis alpine)；cp，巴勒斯坦还阳参(Crepis palaestina)；ha，向日葵(Helianthusannuus)；ds，大花异果菊(Dimorphotheca sinuate)；dc，胡萝卜(Daucus carota)；hh，洋常春藤(Hedera helix)；lu，亚麻(Linum usitatissimum)；nt，烟草(Nicotiana tabacum)；oe，油橄榄(Olea europaea)；si，芝麻(Sesamum indicum)；rc，蓖麻(Ricinus communis)；at，拟南芥(Arabidopsis thaliana)；pf，Physaria fendleri；pl，Physaria lindheimeri。
图2.红花基因型SU中CtFAD2样基因组结构的Southern印迹杂交分析。在琼脂糖凝胶上分离前，将基因组DNA用八种不同的限制酶消化。这些酶是AccI(泳道1)、BglII(2)、BamHI(3)、EcoRI(4)、EcoRV(5)、HindIII(6)、XbaI(7)和XhoI(8)。将印迹用放射标记的CtFAD2-6的整个编码区探测，并在低严格性条件下洗涤。
图3.表达CtFAD2-1(B)、CtFAD2-2(C)、CtFAD2-9(D)、CtFAD2-10(E)和CtFAD2-11(F)的酵母的脂肪酸组成的GC-MS脂肪酸分析。空载体(A)，和C18：2异构体的混合物的GC曲线(G)。
图4.在CtFAD2-11于本氏烟(N.benthamiana)叶子中瞬时表达后脂肪酸组成的GC-MS脂肪酸分析。
图5.红花CtFAD2基因的RT-qPCR表达分析。
图6.得自野生型SU和三种高油酸基因型(即S-317、CW99-OL和Lesaf496)的CtFAD2-1等位基因的区域的核苷酸比较，表明了在突变体中的CtFAD2-1编码区的中间存在核苷酸缺失。
图7.在野生型品种SU和高油酸基因型S-317中CtFAD2-15’UTR内含子的DNA序列比较。将盒式DNA序列用于设计高油酸特异性和野生型特异性PCR产物的完美PCR标记。
图8.在三个发育阶段的发育胚胎中CtFAD2-1和CtFAD2-2mRNA水平的实时q-PCR分析：早期(7DPA)、中期(15DPA)和后期(20DPA)。红花品种包括野生型SU和三种高油酸品种：S-317、CW99-OL和Lesaf496。
图9.红花品种SU的叶子、根部和发育胚胎中CtFatB基因的实时qPCR分析。Em-1(早期阶段)、Em-2(中期阶段)和Em-3(后期阶段)。
图10.显示了红花FAD6序列与在高等植物中鉴定的代表性FAD6质体Δ12去饱和酶之间的系统发育关系的系统树图。麻风树(Jatropha curcas)(EU106889)；油橄榄(AY733075)；毛果杨(Populus trichocarpa)(EF147523)；拟南芥(AY079039)；播娘蒿(Descuriana sophia)(EF524189)；大豆(Glycine max)(AK243928)；甘蓝型油菜(Brassica napus)(L29214)；马齿苋(Portulaca oleracea)(EU376530)；花生(Arachis hypogaea)(FJ768730)；银杏(Ginkgo biloba)(HQ694563)。
图11.通过对单粒种子的LC-MS分析得到的S317与S317+603.9中的二酰基甘油(DAG)组成(mol％)。
图12.通过对单粒种子的LC-MS分析得到的S317与S317+603.9中的三酰基甘油(TAG)组成(mol％)。
图13.在2011/2012年澳大利亚的夏季在纳拉布里田间条件下的红花品种的油酸含量。
图14.(A)具有环和侧链编号的基本植物甾醇结构。(B)一些植物甾醇的化学结构。
序列表检索表
SEQ ID NO：1-编码红花FAD2-1的cDNA。
SEQ ID NO：2-编码红花FAD2-2的cDNA。
SEQ ID NO：3-编码红花FAD2-3的cDNA。
SEQ ID NO：4-编码红花FAD2-4的cDNA。
SEQ ID NO：5-编码红花FAD2-5的cDNA。
SEQ ID NO：6-编码红花FAD2-6的cDNA。
SEQ ID NO：7-编码红花FAD2-7的cDNA。
SEQ ID NO：8-编码红花FAD2-8的cDNA。
SEQ ID NO：9-编码红花FAD2-9的cDNA。
SEQ ID NO：10-编码红花FAD2-10的cDNA。
SEQ ID NO：11-编码红花FAD2-11的cDNA。
SEQ ID NO：12-编码红花FAD2-1的开放阅读框。
SEQ ID NO：13-编码红花FAD2-2的开放阅读框。
SEQ ID NO：14-编码红花FAD2-3的开放阅读框。
SEQ ID NO：15-编码红花FAD2-4的开放阅读框。
SEQ ID NO：16-编码红花FAD2-5的开放阅读框。
SEQ ID NO：17-编码红花FAD2-6的开放阅读框。
SEQ ID NO：18-编码红花FAD2-7的开放阅读框。
SEQ ID NO：19-编码红花FAD2-8的开放阅读框。
SEQ ID NO：20-编码红花FAD2-9的开放阅读框。
SEQ ID NO：21-编码红花FAD2-10的开放阅读框。
SEQ ID NO：22-编码红花FAD2-11的开放阅读框。
SEQ ID NO：23-红花FAD2-1基因的内含子序列。
SEQ ID NO：24-红花FAD2-2基因的内含子序列。
SEQ ID NO：25-红花FAD2-10基因的内含子序列。
SEQ ID NO：26-编码截短的红花FAD2-1(HO突变体)的cDNA。
SEQ ID NO：27-红花FAD2-1。
SEQ ID NO：28-红花FAD2-2。
SEQ ID NO：29-红花FAD2-3。
SEQ ID NO：30-红花FAD2-4。
SEQ ID NO：31-红花FAD2-5。
SEQ ID NO：32-红花FAD2-6。
SEQ ID NO：33-红花FAD2-7。
SEQ ID NO：34-红花FAD2-8。
SEQ ID NO：35-红花FAD2-9。
SEQ ID NO：36-红花FAD2-10。
SEQ ID NO：37-红花FAD2-11。
SEQ ID NO：38-截短的红花FAD2-1(HO突变体)。
SEQ ID NO：39-红花FATB-1的cDNA。
SEQ ID NO：40-编码红花FATB-2的cDNA。
SEQ ID NO：41-编码红花FATB-3的cDNA。
SEQ ID NO：42-编码红花FATB-2的开放阅读框。
SEQ ID NO：43-编码红花FATB-3的开放阅读框。
SEQ ID NO：44-红花FATB-2。
SEQ ID NO：45-红花FATB-3。
SEQ ID NO：46-编码红花FAD6的cDNA。
SEQ ID NO：47-编码红花FAD6的开放阅读框。
SEQ ID NO：48-红花FAD6。
SEQ ID NO：49-用于RNA沉默构建体的CtFAD2-2序列。
SEQ ID NO：50-用于RNA沉默构建体的CtFATB-3序列。
SEQ ID NO：51-用于RNA沉默构建体的CtFAD6序列。
SEQ ID NO：52-拟南芥属油体蛋白启动子。
SEQ ID NO：53-亚麻核丝启动子。
SEQ ID NO：54-Nos聚腺苷酸化信号。
SEQ ID NO：55-Ocs聚腺苷酸化信号。
SEQ ID NO：56-对应于ol等位基因的区域的野生型CtFAD2-1序列。
SEQ ID NO：57-具有移码(与S-317、CW99-OL和LeSaf496相同)的ol等位基因CtFAD2-1序列。
SEQ ID NO 58至158-寡核苷酸引物。
SEQ ID NO 159至169-CtFAD2酶的基序。
SEQ ID NO：170-野生型红花品种SU CtFAD2-15’UTR内含子。
SEQ ID NO：171-高油酸红花品种S-317CtFAD2-15’UTR内含子。
发明详述
一般技术和定义
除非另外明确地定义，本文使用的所有技术和科学术语应当认为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另外指明，否则本发明所用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术为本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在诸如以下文献来源中有所描述和阐释：J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(编者)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNACloning：A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)；和F.M.Ausubel等人(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988年，包括迄今的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编者)Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，以及J.E.Coligan等人(编者)Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括迄今的所有更新)。
术语“和/或”例如“X和/或Y”应被理解为表示“X和Y”或“X或Y”，并且应当用来明确支持两种含义或任一种含义。
如本文所用，除非相反地指出，否则术语约是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-4％，更优选+/-3％，更优选+/-2％，更优选+/-1.5％，更优选+/-1％，甚至更优选+/-0.5％。
在本说明书全文中，词语“包含”或变型形式诸如“包括”或“含有”将被理解为意在包含所述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。
如本文所用，术语“提取的脂质”是指包含至少60％(w/w)的脂质并且已例如通过压碎而从转基因生物体或其部分提取的脂质组合物。此外，如本文所用，术语“提取的油”是指包含至少60％(w/w)的油并从转基因生物体或其部分提取的油组合物。
如本文所用，术语“纯化的”当结合本发明的脂质或油使用时通常意指提取的脂质或油已经受提高脂质/油组分纯度的一个或多个加工步骤。例如，纯化步骤可包括由以下组成的组中的一者或多者或全部：脱胶、除臭、脱色、干燥和/或分馏所提取的油。然而，如本文所用，术语“纯化的”不包括改变本发明的脂质或油的脂肪酸组成以便提高油酸含量(作为总脂肪酸含量的百分比)的酯交换过程或其他过程。换句话讲，经纯化的脂质或油的脂肪酸组成基本上与未经纯化的脂质或油相同。提取的脂质或油的脂肪酸组成(诸如油酸、亚油酸和棕榈酸含量)基本上与获取该脂质或油的植物种子中的脂质或油的脂肪酸组成相同。在此背景下，“基本上相同”意指+/-1％，或优选+/-0.5％。
如本文所用，术语“油酸去饱和比例”或″ODP″是指涉及以下方面的计算：将以脂质脂肪酸组合物的百分比表示的亚油酸和α-亚麻酸的相对量除以均以百分比表示的油酸、亚油酸和α-亚麻酸的相对量之和。公式为：
ODP＝(％亚油酸+％α-亚麻酸)/(％油酸+％亚油酸+％α-亚麻酸)
例如，实施例15的TG603.12(5)具有2.15％的总亚油酸和α-亚麻酸含量与93.88％的亚油酸、α-亚麻酸和油酸含量，使得ODP等于0.0229。
如本文所用，术语″棕榈酸-亚油酸-油酸值″或″PLO″是指涉及以下方面的计算：将以脂质脂肪酸组合物的百分比表示的亚油酸和棕榈酸的相对量除以以百分比表示的油酸的相对量。公式为：
PLO＝(％棕榈酸+％亚油酸)/％油酸
例如，实施例15的TG603.12(5)具有4.71％的总亚油酸和棕榈酸含量与91.73％的油酸含量，使得PLO等于0.0513。
如本文所用，术语″油酸单不饱和比例″或″OMP″是指涉及以下方面的计算：将以脂质脂肪酸组合物的百分比表示的非油酸单不饱和脂肪酸的相对量除以以百分比表示的油酸的相对量。公式为：
OMP＝(％单不饱和脂肪酸-％油酸)/％油酸
例如，实施例15的TG603.12(5)具有1.13％的不包括油酸的总单不饱和脂肪酸含量(0.84％C18：1Δ11+0.29％C20：1)与91.73％的油酸含量，使得OMP等于0.0123。
术语“相应的”是指与本发明的细胞、或植物或其部分(种子)具有相同或相似遗传背景但未如本文所述进行修饰的细胞、或植物或其部分(诸如种子)(例如，该细胞或植物或其部分不含本发明的外源性多核苷酸)。相应的细胞或植物或其部分(种子)可用作对照以与如本文所述修饰的细胞或植物或其部分(种子)比较例如所产生的油酸的量、FAD2活性、FATB活性或FAD6活性中的一者或多者。本领域技术人员能够容易地确定用于这种比较的合适的“相应”细胞、植物或其部分(种子)。
如本文所用，术语“种子油”是指从包含至少60％(w/w)脂质的植物的种子获得的或者在种子油仍存在于种子中时可从种子获得的组合物。也就是说，本发明的种子油或使用本发明获得的种子油包括存在于种子或其部分诸如子叶或胚胎中的种子油，除非提及“提取的种子油”或类似的术语，在此情况下，其为已从种子中提取出来的油。种子油优选地为提取的种子油。种子油在室温下通常为液体。优选地，种子油中的总脂肪酸(TFA)含量为＞70％的C18脂肪酸，优选＞90％的油酸(C18：1Δ9)。脂肪酸通常为酯化形式，诸如TAG、DAG、酰基辅酶A或磷脂。除非另外规定，否则脂肪酸可以为游离脂肪酸和/或酯化的形式。在一个实施方案中，本发明的种子油中脂肪酸的至少50重量％、更优选地至少70重量％、更优选地至少80重量％、更优选地至少90重量％、更优选地至少91重量％、更优选地至少92重量％、更优选地至少93重量％、更优选地至少94重量％、更优选地至少95重量％、更优选地至少96重量％、更优选地至少97重量％、更优选地至少98重量％、更优选地至少99％可作为TAG存在。在一个实施方案中，本发明的种子油为已从在种子中或粗提取物中与其相关的一种或多种其他脂质、核酸、多肽或其他污染分子分离的“基本上纯的”或“纯的”油。优选的是，基本上纯的种子油至少60重量％、更优选地至少75重量％、更优选地至少90％不含在种子或提取物中与其相关的其他组分。本发明的种子油可进一步包含非脂肪酸分子，诸如但不限于甾醇(参见实施例17)。在一个实施方案中，种子油为红花油(红花(Carthamus tinctorius))、向日葵油(向日葵(Helianthus annus))、棉籽油(陆地棉(Gossypium hirsutum))、蓖麻油(蓖麻(Ricinuscommunis))、低芥酸菜子油(甘蓝型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa ssp.))、芥子油(荠菜型油菜(Bpassica juncea))、其他芸苔属植物油(例如芜青甘蓝(Brassica napobrassica)、亚麻荠油菜(Brassicacamelina))、亚麻籽油(亚麻(Linum usitatissimum))、大豆油(大豆(Glycine max))、玉米油(玉米(Zea mays))、烟草油(烟草(Nicotianatabacum))、花生油(花生(Arachis hypogaea))、棕榈油(油棕(Elaeisguineensis))、椰子油(椰子(Cocos nucifera))、鳄梨油(鳄梨(Perseaamericana))、橄榄油(油橄榄(Olea europaea))、腰果油(腰果(Anacardium occidentale))、澳洲坚果油(澳洲坚果(Macadamiaintergrifolid)、杏仁油(杏仁(Prunus amygdalus))、燕麦籽油(燕麦(Avenasativa))、稻米油(亚洲栽培稻(Oryza sativa)或非洲栽培稻(Oryzaglaberrima))、亚麻荠油(亚麻荠(Camelina sativa))、海甘蓝油(海甘蓝(Crambe abyssinica))或拟南芥属种子油(拟南芥(Arabidopsisthaliana))。种子油可通过本领域已知的任何方法从种子提取而得。这通常涉及使用通常与种子的第一次破碎或滚压相关的非极性溶剂诸如己烷、乙醚、石油醚、氯仿/甲醇或丁醇混合物进行提取。粮食中与淀粉相关的脂质可使用水饱和的丁醇提取。种子油可以通过本领域已知的方法“脱胶”以除去多糖和/或磷脂，或以其他方式处理以除去污染物或改善纯度、稳定性或色泽。可使种子油中的TAG和其他酯水解而释放出游离脂肪酸，诸如通过酸或碱处理或通过脂肪酶的作用，或将种子油氢化、进行化学或酶法处理，如本领域所已知。然而，一旦对种子油进行加工使得其不再含有TAG后，其不再视为如本文所提及的种子油。
纯化的和/或提取的脂质或油中的游离和酯化甾醇(例如，谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、Δ5-燕麦留醇、谷甾烷醇、菜油甾烷醇和胆固醇)浓度可如Phillips等人(2002)和/或如实施例17中所述。植物油中的甾醇作为游离醇、与脂肪酸的酯(酯化的甾醇)、甾醇的糖苷和酰化糖苷而存在。天然存在的植物油(种子油)中的甾醇浓度的范围最高达约1100mg/100g。氢化的棕榈油是天然存在的植物油中浓度最低之一，为约60mg/100g。本发明的回收的或提取的种子油优选地具有约100至约1000mg总甾醇/100g油。对于作为食品或饲料的用途，优选的是，甾醇主要作为游离的或酯化的形式而非糖基化的形式存在。在本发明的种子油中，优选地油中甾醇的至少50％作为酯化甾醇存在，但大豆种子油例外，其具有约25％的酯化甾醇。本发明的红花种子油优选地具有约150至约400mg总甾醇/100g，通常约300mg总甾醇/100g种子油，其中谷甾醇是主要的甾醇。本发明的低芥酸菜子种子油和油菜籽油优选地具有约500至约800mg总甾醇/100g，其中谷甾醇为主要的甾醇，菜油甾醇的丰度其次。本发明的玉米种子油优选地具有约600至约800mg总甾醇/100g，其中谷甾醇为主要的甾醇。本发明的大豆种子油优选地具有约150至约350mg总甾醇/100g，其中谷甾醇是主要的甾醇，豆甾醇的丰度其次，并且游离甾醇多于酯化甾醇。本发明的棉籽油优选地具有约200至约350mg总甾醇/100g，其中谷甾醇为主要的甾醇。本发明的椰子油和棕榈油优选地具有约50至约100mg总甾醇/100g，其中谷甾醇为主要的甾醇。本发明的花生种子油优选地具有约100至约200mg总甾醇/100g，其中谷甾醇为主要的甾醇。本发明的芝麻种子油优选地具有约400至约600mg总甾醇/100g，其中谷甾醇为主要的甾醇。本发明的向日葵种子油优选地具有约200至400mg总甾醇/100g，其中谷甾醇为主要的甾醇。
如本文所用，术语“脂肪酸”是指饱和或未饱和的具有长度为至少8个碳原子的长脂族尾部的羧酸。通常，脂肪酸具有长度为至少12个碳的碳-碳键合链。最多的天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子，因为它们的生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以为游离状态(非酯化)或酯化形式，诸如TAG、DAG、MAG、酰基辅酶A(硫代酯)键合或其他共价键合形式的一部分。当以酯化形式共价键合时，脂肪酸在本文称为“酰基”基团。脂肪酸可以酯化为磷脂，诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷酸酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或双磷脂酰甘油。饱和脂肪酸沿着链不含任何双键或其他官能团。术语“饱和的”是指氢，因为所有的碳(除了羧酸[-COOH]基团)都包含尽可能多的氢。换句话讲，omega(ω)端含3个氢(CH3-)，链内的每个碳含2个氢(-CH2-)。不饱和脂肪酸具有与饱和脂肪酸相似的形式，不同的是一个或多个烯烃官能团沿着链存在，而每个烯烃用双键的″-CH＝CH-″部分(即，以双键结合到另一个碳的碳)取代链的单键″-CH2-CH2-″部分。结合到双键任一侧的链中的接下来的两个碳原子可以按顺式或反式构型存在。
如本文所用，术语“多不饱和脂肪酸”或″PUFA″是指包含其碳链中的至少12个碳原子以及至少两个烯烃基团(碳-碳双键)的脂肪酸。
如本文所用，术语“单不饱和脂肪酸”是指在其酰基链中具有单个双键的脂肪酸，诸如油酸(C18：1Δ9)、C18：1D11和C20：1。
“三酰基甘油酯”或″TAG″是其中甘油用三个脂肪酸酯化的甘油酯。在TAG合成的Kennedy途径中，DAG如上所述形成，然后通过DGAT的活性将第三酰基酯化到甘油主链。形成TAG的可供选择的途径包括酶PDAT催化的途径和MGAT途径(PCT/AU2011/000794)。
“二酰基甘油酯”或″DAG″是其中甘油用两个脂肪酸酯化的甘油酯。如本文所用，DAG包含位于sn-1，3或sn-1，2/2，3位的羟基，因此DAG不包括磷酰化分子，诸如PA或PC。DAG因此为细胞中中性脂质的组分。在DAG合成的Kennedy途径中，前体sn-甘油-3-磷酸(G-3-P)在sn-1位通过甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化的第一反应中酯化到两个酰基(每一个来自脂肪酸辅酶A酯)形成LysoPA，然后在通过溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)催化的sn-2位的第二酰化形成磷脂酸(PA)。该中间体然后去磷酰化形成DAG。在可供选择的合成代谢途径中，DAG可通过MGAT催化的sn-1MAG或优选sn-2MAG的酰化形成。DAG也可通过用脂肪酶移除酰基而由TAG形成，或通过CPT、PDCT或PLC任一种酶移除胆碱头基而基本上由PC形成。
如本文所用，术语“去饱和酶”是指这样的酶，其能够在脂肪酸底物的酰基中引入碳-碳双键，所述脂肪酸底物典型地为酯化的形式，例如脂肪酸辅酶A酯。酰基可与磷脂诸如磷脂酰胆碱(PC)发生酯化，或与酰基载体蛋白(ACP)发生酯化，或与CoA发生酯化，或在一个优选的实施方案中与PC发生酯化。相应地，去饱和酶通常可分为三类。在一个实施方案中，去饱和酶为前端去饱和酶。
如本文所用，术语″Δ12去饱和酶″和″FAD2″是指执行将油酸(18：1A9)转化成亚油酸(C18：2Δ9，12)的去饱和酶反应的膜结合的Δ12脂肪酸去饱和酶。因此，术语″Δ12去饱和酶活性″是指将油酸转化成亚油酸。这些脂肪酸可以为酯化的形式，诸如作为磷脂的一部分，优选地为PC的形式。在一个实施方案中，如本文所定义的FAD2酶包含三个富含组氨酸的基序(组氨酸框)(有关本发明的酶的组氨酸框的实例，参见表5)。此类富含组氨酸的基序在FAD2酶中是高度保守的，并涉及用于生物化学分析的二铁-氧复合物的形成(Shanklin等人，1998)。
如本文所用，术语″FAD2-1″和″CtFAD2-1″及其变型形式是指氨基酸序列如SEQ ID NO：27所提供的红花FAD2多肽，诸如由具有如SEQID NO：12所提供的序列的核苷酸编码的多肽。如本文所用，FAD2-1基因是编码这样的多肽的基因或其突变等位基因。这些术语也包括所提供的序列的天然存在的或人工诱导的或产生的变体。在一个实施方案中，本发明的FAD2-1包含与SEQ ID NO：27所提供的序列至少95％相同、更优选地至少99％相同的氨基酸序列。CtFAD2-1基因包括为突变体的等位基因，也就是说，编码具有改变的去饱和酶活性(诸如降低的活性)的等位基因或不编码功能性多肽的等位基因(无效等位基因)。此类等位基因可以是天然存在的或通过人工诱变而诱导的。这样的等位基因的实例为如本文所述的FAD2-1 ol等位基因。
如本文所用，术语″FAD2-2″和″CtFAD2-2″及其变型形式是指氨基酸序列如SEQ ID NO：28所提供的红花FAD2多肽，诸如由具有如SEQID NO：13所提供的序列的核苷酸编码的多肽。如本文所用，FAD2-2基因是编码这样的多肽的基因或其突变等位基因。这些术语也包括所提供的序列的天然存在的或人工诱导的或产生的变体。在一个实施方案中，本发明的FAD2-2包含与SEQ ID NO：28所提供的序列至少95％相同、更优选地至少99％相同的氨基酸序列。CtFAD2-2基因包括为突变体的等位基因，也就是说，编码具有改变的去饱和酶活性(诸如降低的活性)的等位基因或不编码功能性多肽的等位基因(无效等位基因)。此类等位基因可以是天然存在的或通过人工诱变而诱导的。
如本文所用，术语″FAD2-10″和″CtFAD2-10″及其变型形式是指氨基酸序列如SEQ ID NO：36所提供的红花FAD2多肽，诸如由具有如SEQ ID NO：21所提供的序列的核苷酸编码的多肽。如本文所用，FAD2-10基因是编码这样的多肽的基因或其突变等位基因。这些术语也包括所提供的序列的天然存在的或人工诱导的或产生的变体。在一个实施方案中，本发明的FAD2-10包含与SEQ ID NO：36所提供的序列至少95％相同、更优选地至少99％相同的氨基酸序列。CtFAD2-10基因包括为突变体的等位基因，也就是说，编码具有改变的去饱和酶活性(诸如降低的活性)的等位基因或不编码功能性多肽的等位基因(无效等位基因)。此类等位基因可以是天然存在的或通过人工诱变而诱导的。
如本文所用，术语″棕榈酰-ACP硫酯酶″和″FATB″是指水解棕榈酰-ACP而产生游离棕榈酸的蛋白。因此，术语″棕榈酰-ACP硫酯酶活性″是指水解棕榈酰-ACP而产生游离棕榈酸。
如本文所用，术语″FATB-3″和″CtFATB-3″及其变型形式是指氨基酸序列如SEQ ID NO：45所提供的红花FATB多肽，诸如由具有如SEQID NO：43所提供的序列的核苷酸编码的多肽。如本文所用，FATB-3基因是编码这样的多肽的基因或其突变等位基因。这些术语也包括所提供的序列的天然存在的或人工诱导的或产生的变体。在一个实施方案中，本发明的FATB-3包含与SEQ ID NO：45所提供的序列至少95％相同、更优选地至少99％相同的氨基酸序列。CtFATB-3基因包括为突变体的等位基因，也就是说，编码具有改变的棕榈酰-ACP硫酯酶活性(诸如降低的活性)的等位基因或不编码功能性多肽的等位基因(无效等位基因)。此类等位基因可以是天然存在的或通过人工诱变而诱导的。
如本文所用，″质体ω6脂肪酸去饱和酶″、其变型形式和″FAD6″是指在所有含16：1或18：1的叶绿体膜脂质上使16：1和18：1脂肪酸分别去饱和成16：2和18：2的叶绿体酶，包括磷脂酰甘油、单半乳糖基二酰基甘油、双半乳糖二酰基甘油和磺酸基异鼠李糖基二脂酰基甘油。
如本文所用，术语″FAD6″和″CtFAD6″及其变型形式是指氨基酸序列如SEQ ID NO：48所提供的红花FAD6多肽，诸如由具有如SEQID NO：47所提供的序列的核苷酸编码的多肽。如本文所用，FAD6基因是编码这样的多肽的基因或其突变等位基因。这些术语也包括所提供的序列的天然存在的或人工诱导的或产生的变体。在一个实施方案中，本发明的FAD6包含与SEQ ID NO：48所提供的序列至少95％相同、更优选地至少99％相同的氨基酸序列。CtFAD6基因包括为突变体的等位基因，也就是说，编码具有改变的去饱和酶活性(诸如降低的活性)的等位基因或不编码功能性多肽的等位基因(无效等位基因)。此类等位基因可以是天然存在的或通过人工诱变而诱导的。
如本文所用，术语“乙炔酶”或“脂肪酸乙炔酶”是指将三键引入脂肪酸，从而导致产生炔脂肪酸的酶。
术语″Ct″在本文用在诸如FAD2、FATB和FAD6的术语之前以表示该酶/基因得自红花。
如本文所用，术语“能够降低...的表达的沉默RNA”及其变体是指编码能降低(下调)内源性酶的产生和/或活性的RNA分子(例如编码siRNA、hpRNAi)的多核苷酸，或其自身下调内源性酶的产生和/或活性(例如，为可直接递送到例如细胞的siRNA)，所述内源性酶例如Δ12去饱和酶、棕榈酰-ACP硫酯酶、质体ω6脂肪酸去饱和酶或其两者或更多者或所有三者的组合。在一个实施方案中，沉默RNA是一种外源性RNA，其通过细胞中的转基因而产生，并转录和/或转录后降低在细胞中产生的内源性酶的量，诸如通过降低编码内源性酶的mRNA的量或减少其翻译。沉默RNA通常为21-24个核苷酸长的RNA，其与内源性mRNA互补并且可与细胞中称为RISC的沉默复合体相关。
如本文所用，术语“降低...的活性的突变”是指天然存在的或人造的突变体(诸如通过化学诱变或位点特异性诱变而产生的)，其与表型正常的种子(例如，产生包含如SEQ ID NO：27、28和36所提供的氨基酸序列的FAD2酶的种子)相比时具有更低水平的限定酶活性(例如，种子中的FAD2酶活性)。表型正常的红花品种的实例包括但不限于Centennial、Finch、Nutrasaff和Cardinal。在红花中最早鉴定出的高油酸性状(存在于从印度引进的一种红花中)受单个基因座OL处称为ol的部分隐性等位基因的控制(Knowles和Hill，1964)。如本文所述，OL基因座对应于CtFAD2-1基因。olol基因型中的种子油的油酸含量对于温室生长的植物而言通常为71-75％(Knowles，1989)。Knowles(1968)将ol等位基因并入红花育种程序，并在1966年在美国发布了第一个高油酸(HO)红花品种″UC-1″，随后发布了改良的品种″Oleic Leed″和Saffola系列(包括Saffola 317(S-317)、S-517和S-518)。高油酸(olol)基因型在田间在不同的温度下生长时在油酸水平方面相对稳定(Bartholomew，1971)。此外，Knowles(1972)还描述了相同基因座的不同等位基因ol1，其在纯合条件下产生了35％至50％的油酸。与olol基因型形成鲜明的对比，ol1ol1基因型显示出对温度的强烈反应(Knowles，1972)。如本文所确定，在红花种子中赋予降低的FAD2-1活性(和总体FAD2活性)的ol突变的等位基因是图6所示(另见实施例7以及SEQ ID NO：26与38)的包含移码突变(由于单个核苷酸的缺失)的突变型FAD2-1基因。
如本文所用，短语“能够长成产生油含量包含...的种子的植物”或“能够长成产生油含量...的油料种子的植物”或其变型形式意指由种子长成的植物、优选油料种子植物、更优选红花植物能够在最佳条件下(例如在温室条件下，诸如在实施例中提及的那些)生长时产生具有限定的组分的油。当具有得自植物的种子时，一般在合适的温室条件下由该种子中的至少一粒长出子代植物，并使用标准程序(诸如本文所述的那些)测试得自子代植物的种子油中的油含量和脂肪酸组成。因此，如技术人员将会理解的是，虽然在田间生长的种子由于在特定年份的不利条件(诸如热、冷、干旱、洪涝、霜冻、害虫胁迫等)可能不会完全满足本文所定义的要求，但是尽管如此，此类种子仍在本发明的范畴内，因为该种子能够在更有利的条件下生长时长成子代植物，该子代植物能产生限定的油含量或脂肪酸组成。
如本文所用，术语“重量”是指作为在组合物中包含某物质或组分的组合物的重量百分比的该物质的重量(例如，油酸、棕榈酸或PUFA，诸如亚油酸或亚麻酸)。例如，特定脂肪酸(诸如油酸)的重量可作为脂质或种子油或种子的总脂肪酸含量的重量百分比而测定。
如本文所用，术语“生物燃料”是指其能量来源于生物固碳作用而非化石燃料的任何类型的燃料，其通常用于动力机械，诸如汽车、卡车或石油驱动的发动机。生物燃料包括来源于生物质转化的燃料、以及固体生物质、液体燃料和生物气体。生物燃料的实例包括生物醇、生物柴油、合成柴油、植物油、生物醚、生物气体、合成气、固体生物燃料、来源于藻类的燃料、生物氢、生物甲醇、2，5-二甲基呋喃(DMF)、生物二甲醚(bioDME)、费托柴油(Fischer-Tropsch diesel)、生物氢柴油、混合醇和木料柴油。
如本文所用，术语“工业产品”是指主要由碳和氢制成的烃类产品，诸如脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯或烷烃(诸如甲烷)、在环境温度下通常为液体的长链烷烃的混合物、生物燃料、一氧化碳和/或氢气、或生物醇(诸如乙醇、丙醇或丁醇)或生物炭。术语“工业产品”旨在包括可转化成其他工业产品的中间产品，例如，合成气本身被视为一种工业产品，其可用于合成可被视为工业产品的烃类产品。如本文所用的术语“工业产品”包括上述化合物的纯形式，或更常见的是各种化合物和组分的混合物，例如烃类产品可包含一系列碳链长度，如本领域熟知的。
多核苷酸
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的聚合物形式的核苷酸，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。本发明的多核苷酸可以具有基因组、cDNA、半合成或合成起源，可为双链或单链的，并且通过其起源或操纵：(1)不与其在自然界中相关的多核苷酸的全部或一部分相关，(2)连接到其在自然界中所连接的多核苷酸之外的多核苷酸，或(3)不存在于自然界中。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、通过键合分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、嵌合的任何序列的DNA、核酸探针和引物。本发明的优选多核苷酸包括能够在植物细胞中转录并沉默RNA分子的双链DNA分子。
如本文所用，术语“基因”将采取其最广泛的含义，并包括以下脱氧核糖核苷酸序列，它含有结构基因的转录区以及发生翻译时的蛋白编码区并包括位于5′和3′两个末端上的编码区附近的序列，它们在任一末端上距离末端的距离为至少约2kb并涉及到基因的表达。就这一点而言，该基因包含与给定基因天然相关的控制信号，诸如启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷酸化信号，或包含异源控制信号，在此情况下，该基因称为“嵌合基因”。位于蛋白编码区5′并存在于mRNA上的序列称为5′非翻译序列。位于蛋白编码区3′或下游并存在于mRNA上的序列称为3′非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组两种形式。基因的基因组形式或克隆包含可通过称为“内含子”、“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(nRNA)的基因片段。内含子可包含调控元件，诸如增强子。内含子从核或初级转录物中移除或“剪除”；因此内含子不存在于mRNA转录物中。mRNA在翻译过程中起到指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序的作用。术语“基因”包括编码本文所述的本发明蛋白质全部或一部分的合成或融合分子以及与上文任何一种序列互补的核苷酸序列。
“等位基因”是指细胞、个体植物或种群内的遗传序列(诸如基因)的一种特定形式，该特定形式在序列上与相同基因的其他形式不同，在基因的序列内具有至少一个、通常不止一个变异位点。在不同的等位基因之间不同的这些变异位点的序列称为“变异”、“多态性”或“突变”。
如本文所用，“嵌合DNA”是指不是天然存在于自然界中的任何DNA分子；本文也称为“DNA构建体”。通常，嵌合DNA包含一起时不是天然存在于自然界中的调控和转录或蛋白编码序列。因此，嵌合DNA可包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自相同来源的调控序列和编码序列但以不同于自然界中所存在的方式排列。开放阅读框可以或可以不连接到其天然上游和下游调控元件。开放阅读框可以结合到(例如)植物基因组中、处于非天然位置或处于复制子或载体中，在其中它在天然状态下不存在，诸如细菌质粒或病毒载体。术语“嵌合DNA”不限于能在宿主中复制的DNA分子，而是包括能够通过(例如)特定的衔接子序列连接到复制子中的DNA。
“转基因”是已通过转化程序引入基因组中的基因。转基因可存在于由转化的植物细胞再生而产生的初始转化植物中，或存在于通过自花受精或从初始转化体杂交而产生的子代植物中，或存在于植物部分中，诸如种子中。术语“遗传修饰的”及其变型形式包括通过转化或转导将基因引入细胞，使细胞中的基因突变以及从遗传学上改变或调节细胞中的基因调控，或如上所述进行修饰的任何细胞的子代。
如本文所用的“基因组区”是指基因组内的位置，其中已经将一个转基因或一组转基因(本文也称为簇)插入细胞内或其前身细胞中，使得它们在减数分裂后在子代细胞中共同遗传。
本发明的“重组多核苷酸”或“外源性多核苷酸”是指已通过人工重组方法构建或修饰的核酸分子。重组多核苷酸可按与其天然状态相比改变的量存在于细胞中或以改变的表达率表达(例如，就mRNA而言)。外源性多核苷酸是已引入天然不含该多核苷酸的细胞中的多核苷酸。通常，将外源DNA用作mRNA转录的模板，然后在转化的细胞内翻译成编码本发明的多肽的氨基酸残基的连续序列。在另一个实施方案中，外源性多核苷酸的一部分是细胞内源性的，并且其表达通过重组手段而改变，例如，将外源性控制序列引入内源性多核苷酸的上游，以使得转化的细胞能表达该多核苷酸编码的多肽。例如，外源性多核苷酸可将反义RNA表达成内源性多核苷酸。
本发明的重组多核苷酸包括已与其所存在的基于细胞的或不含细胞的表达系统的其他组分分离的多核苷酸，以及在所述基于细胞的或不含细胞的系统中产生随后从至少某些其他组分中纯化的多核苷酸。多核苷酸可以是存在于自然界中的核苷酸的连续延伸(contiguousstretch)，或者接合形成单个多核苷酸的包含不同来源(天然存在的和/或合成的)的核苷酸的两个或更多个连续延伸。通常，此类嵌合多核苷酸包含至少一个编码本发明多肽的开放阅读框，它可操作地连接至适合促使该开放阅读框在所关注的细胞中转录的启动子。
至于所定义的多核苷酸，应当理解，高于上文所提供的那些值的％同一性数值将涵盖优选的实施方案。因此，适用时，按照最低％同一性数值，优选的是，多核苷酸所含的多核苷酸序列与相关的命名SEQ ID NO至少50重量％、更优选地至少60重量％、更优选地至少65重量％、更优选地至少70重量％、更优选地至少75重量％、更优选地至少80重量％、更优选地至少85重量％、更优选地至少90重量％、更优选地至少91重量％、更优选地至少92重量％、更优选地至少93重量％、更优选地至少94重量％、更优选地至少95重量％、更优选地至少96重量％、更优选地至少97重量％、更优选地至少98重量％、更优选地至少99重量％、更优选地至少99.1重量％、更优选地至少99.2重量％、更优选地至少99.3重量％、更优选地至少99.4重量％、更优选地至少99.5重量％、更优选地至少99.6重量％、更优选地至少99.7重量％、更优选地至少99.8重量％、甚至更优选地至少99.9％相同。
本发明的多核苷酸或可用于本发明的多核苷酸可在严格条件下选择性杂交到本文所定义的多核苷酸。如本文所用，严格条件为以下这些：(1)在42℃下在杂交期间采用诸如甲酰胺的变性剂，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％(w/v)牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、含750mM NaCl、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)；或(2)在42℃下在0.2xSSC和0.1％SDS中采用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt′s溶液、超声处理的鲑精DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖；和/或(3)在50℃下采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS。
本发明的多核苷酸当与天然存在的分子相比时可具有一个或多个突变，它们为核苷酸残基的缺失、插入或取代。相对于参考序列具有突变的多核苷酸可以是天然存在的(也就是说，从天然来源中分离)或合成的(例如，通过对如上所述的核酸进行定点诱变或DNA改组)。
用于降低内源性蛋白的表达水平的多核苷酸
在一个实施方案中，本发明的细胞/种子/植物/生物体包含下调内源性酶的产生和/或活性的引入的突变或外源性多核苷酸，这通常导致与不含引入的突变或外源性多核苷酸的相应细胞相比时油酸的产生增加，并优选地导致棕榈酸和诸如亚油酸的PUFA的产生减少。此类多核苷酸的实例包括反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、编码结合所述内源酶的多肽的多核苷酸，以及双链RNA。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)对于特异性抑制特定蛋白的产生特别有用。该技术依赖于dsRNA分子的存在，所述dsRNA分子包含与所关注基因的mRNA或其一部分基本上相同的序列以及与其互补的序列。便利地，dsRNA可以从重组载体或宿主细胞中的单个启动子产生，其中有义和反义序列通过一个序列(优选无关序列)共价连接，所述序列使得相应转录物中的有义和反义序列能够杂交形成dsRNA分子，而所述连接序列则形成环结构，但与目标RNA或其互补序列具有同一性的序列也可形成环状结构。通常，dsRNA由双链DNA构建体编码，该构建体具有排列成中断回文的反向重复结构形式的有义和反义序列，其中重复序列被转录以产生dsRNA分子中的杂交序列，而中断序列被转录以形成dsRNA分子中的环。合适的dsRNA分子的设计和制备完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是考虑Waterhouse等人(1998)、Smith等人(2000)、WO 99/32619、WO 99/53050、WO99/49029和WO 01/34815。
在一个实例中，引入指导至少部分双链RNA产物的合成的DNA，该产物与待活化的靶RNA的某区域具有同源性，优选地与该区域至少19个连续核苷酸互补。该DNA因此包含有义和反义序列，当转录成RNA时，这些序列可杂交形成双链RNA区域。在本发明的一个实施方案中，有义和反义序列由间隔子区域分开，该间隔子区域包含在转录成RNA时被剪掉的内含子。已表明，这种排列导致更高的基因沉默效率。双链RNA区域可包含从一个或两个DNA区域转录的一个或两个RNA分子。据认为，存在双链分子会触发内源性系统的反应，该反应将破坏双链RNA，还会破坏来自靶基因的同源RNA转录物，从而有效降低或消除靶基因的活性。
杂交的有义和反义序列的长度应各自为至少19个连续核苷酸，对应于靶mRNA的一部分。可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。有义和反义序列与靶转录物的同一性程度应为至少85％、至少90％、或至少95％至100％。RNA分子当然可以包含可起到使分子稳定的作用的不相关序列。RNA分子可在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的控制下表达。后者的实例包括tRNA或snRNA启动子。
优选的小干扰RNA(″siRNA″)分子包含与靶mRNA的约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。优选地，siRNA序列从二核苷酸AA开始，包含约30-70％(优选30-60％，更优选40-60％，更优选约45％-55％)的GC含量，并且不具有与其将引入的生物体基因组中的靶标之外的任何核苷酸序列的高百分比同一性，如通过标准BLAST搜索所确定。
例如，本发明的dsRNA包含如SEQ ID NO：49至51任一者所提供的核苷酸序列(其中各T为U)。
微RNA
微RNA(缩写为miRNA)通常为19-25个核苷酸(在植物中一般为约20-24个核苷酸)的非编码RNA分子，其衍生自形成不完美茎环结构的较大前体。
miRNA结合到靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列，通常导致翻译抑制或靶降解和基因沉默。
在植物细胞中，据信miRNA前体分子将最初在细胞核中加工。初级miRNA(pri-miRNA)(包含一个或多个局部双链或“发夹”区域以及mRNA的常见5′“帽”和多聚腺苷酸化尾)被加工成更短的miRNA前体分子，其也包括茎环结构或折回结构并称为″pre-miRNA″(前miRNA)。在植物中，pre-miRNA由不同的DICER样(DCL)酶尤其是DCL-1裂解，从而产生miRNA：miRNA*双链体。在转运出细胞核之前，这些双链体发生甲基化。相比之下，具有更长dsRNA区域的发夹RNA分子尤其通过DCL-3和DCL-4加工。
在细胞质中，来自miRNA：miRNA双链体的miRNA链被选择性并入活性RNA诱导的沉默复合体(RISC)以进行靶识别。RISC复合体包含在转录后发挥序列特异性基因抑制作用的Argonaute蛋白的特定亚组(参见例如Millar和Waterhouse，2005；Pasquinelli等人，2005；Almeida和Allshire，2005)。
共抑制
基因可抑制已存在于基因组中的相关内源性基因和/或转基因的表达，这是一种称为同源性依赖性基因沉默的现象。大多数同源性依赖性基因沉默情况均落入以下两类：在转基因的转录水平上发挥作用的那些，以及在转录后工作的那些。
转录后同源性依赖性基因沉默(即，共抑制)描述了转基因植物中转基因和相关内源性或病毒基因的表达的损失。共抑制通常但并非始终在转基因转录物丰度较高时发生，且通常认为其将在mRNA加工、定位和/或降解水平上触发。已有若干模型来解释共抑制的工作原理(参见Taylor，1997)。
共抑制涉及将额外的基因拷贝或其片段相对于其表达的启动子以有义取向引入植物。技术人员将认识到，有义片段的大小、其与靶基因区域的对应性及其与靶基因的序列同一性程度可有所变化。在一些情况下，该另外的基因序列拷贝干扰靶植物基因的表达。有关执行共抑制方法的方法，参考WO 97/20936和EP 0465572。
表达载体
如本文所用，“表达载体”是能够转化宿主细胞并实现一种或多种指定多核苷酸表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体还能够在宿主细胞内复制或整合进宿主细胞基因组中。表达载体通常为病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的宿主细胞中发挥作用(即，指导基因表达)的任何载体，包括在真菌、藻类和植物细胞中。
如本文所用的“可操作地连接”是指两个或更多个核酸(如DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录序列的转录调控元件(启动子)的功能关系。例如，将启动子可操作地连接到本文所定义的多核苷酸的编码序列，如果它在合适的细胞中刺激或调节该编码序列的转录。通常，可操作地连接到转录序列的启动子转录调控元件与转录序列在物理上连续，即，它们为顺式作用的。然而，某些转录调控元件诸如增强子不需要与它们增强转录的编码序列在物理上连续或在位置上紧邻。
本发明的表达载体包含调控序列，诸如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点以及与宿主细胞相容并控制本发明多核苷酸表达的其他调控序列。具体地讲，本发明的表达载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、伸长和终止的序列。尤其重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，诸如启动子、增强子、操纵子和阻遏序列。合适的转录控制序列包括能在本发明的重组细胞的至少一者中发挥作用的任何转录控制序列。所用调控序列的选择取决于所关注的目标生物诸如植物和/或目标器官或组织。此类调控序列可得自任何真核生物诸如植物或植物病毒，或者可以化学合成。多种此类转录控制序列是本领域技术人员已知的。尤其优选的转录控制序列为在植物中具有转录指导活性的启动子，或为组成型的或为阶段和/或组织特异性的，具体取决于植物或其部分的使用。
许多适合植物细胞稳定转染或适合建立转基因植物的载体已在(例如)Pouwels等人，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，增刊1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989；和Gelvin等人，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990中有所描述。通常，植物表达载体包含(例如)受5′和3′调控序列的转录控制的一个或多个克隆植物基因以及优势选择标记。此类植物表达载体还可以包含启动子调控区域(如，控制诱导型或组成型、受环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区域)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。
许多在植物细胞中具有活性的组成型启动子已得到了描述。在植物中组成型表达的合适启动子包括但不限于：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子、得自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子、水稻细胞质丙糖磷酸异构酶启动子、拟南芥属腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1基因启动子、甘露氨酸合酶及章鱼碱合酶启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、R基因复合启动子和叶绿素α/β结合蛋白基因启动子。这些启动子已用于构建已在植物中表达的DNA载体，参见例如WO 84/02913。所有这些启动子已用于构建各种类型的植物表达性重组DNA载体。
为了在植物的源组织诸如叶子、根部或茎干中表达，优选的是，用于本发明的启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。为此，可以由多种启动子选择具有组织或细胞特异性表达或增强表达的基因。在文献中报导的此类启动子的实例包括：得自豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、得自小麦的叶绿体果糖-1，6-二磷酸酶启动子、得自马铃薯的核光合作用ST-LS1启动子、得自拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡萄糖淀粉酶(CHS)启动子。
响应环境、激素、化学和/或发育信号而调控的多种植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达RNA结合蛋白基因，包括受以下因素调控的启动子：(1)热；(2)光(如豌豆RbcS-3A启动子、玉米RbcS启动子)；(3)激素，诸如脱落酸；(4)创伤(如WunI)；或(5)化学剂，诸如茉莉酸甲酯、水杨酸、甾类激素、醇、安全剂(WO 97/06269)，或者也可有利地采用(6)器官特异性启动子。
如本文所用，术语“植物贮藏器官特异性启动子”是指当与其他植物组织相比时优先地指导植物贮藏器官中的基因转录的启动子。植物贮藏器官优选地为种子。优选地，该启动子只指导贮藏器官中所关注基因的表达，和/或植物其他部分诸如叶子中所关注基因的表达不能通过Northern印迹分析和/或RT-PCR检测。通常，启动子在贮藏器官的生长和发育期间促使基因表达，尤其是贮藏器官中贮藏化合物的合成和蓄积阶段。此类启动子可促使整个植物贮藏器官或仅其部分诸如双子叶植物种子的种皮、胚芽或子叶或单子叶植物种子的胚乳或糊粉层中的基因表达。
其他启动子也可用于在特定组织诸如种子或果实中表达蛋白。可以使用β-伴球蛋白的启动子或其他种子特异性启动子，诸如油菜籽蛋白(napin)、玉米蛋白、核丝(linin)和菜豆蛋白启动子。在一个实施方案中，启动子指导发生脂质生物合成的组织和器官中的表达。此类启动子在合适的时间作用于种子发育以改变种子中的脂质组成。在一个实施方案中，植物贮藏器官特异性启动子为种子特异性启动子。在一个更优选的实施方案中，启动子相对于植物其他器官(诸如叶子)中的表达优先地指导双子叶植物的胚胎和/或子叶中或单子叶植物的胚乳中的表达。种子特异性表达的优选启动子包括：1)编码与种子中脂质生物合成和蓄积有关的酶(诸如去饱和酶和延长酶)的基因的启动子；2)编码种子贮藏蛋白的基因的启动子；和3)编码与种子中碳水化合物生物合成和蓄积有关的酶的基因的启动子。合适的种子特异性启动子为亚麻核丝启动子(例如Cnl1或Cnl2启动子)、油料种子油菜napin基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baumlein等人，1991)、拟南芥属油体蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔Bce4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(Baumlein等人，1992)以及导致单子叶植物诸如玉米、大麦、小麦、裸麦、水稻等种子特异性表达的启动子。值得注意的合适启动子为大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中所述的启动子(大麦大麦醇溶蛋白(hordein)基因、大米谷蛋白基因、大米水稻素(oryzin)基因、大米醇溶蛋白(prolamin)基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米玉米醇溶蛋白(zein)基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因、黑麦secalin基因的启动子)。其他启动子包括Broun等人(1998)、Potenza等人(2004)、US 20070192902和US 20030159173所述的那些。在一个实施方案中，种子特异性启动子优先地在种子的限定部分诸如胚胎、子叶或胚乳中表达。子叶特异性启动子的实例包括但不限于：FP1启动子(Ellerstrom等人，1996)、豌豆豆球蛋白启动子(Perrin等人，2000)和菜豆植物凝集素启动子(Perrin等人，2000)。在进一步的实施方案中，种子特异性启动子在胚芽中和/或种子发芽后不表达或仅以低水平表达。
当存在多个启动子时，每个启动子可以独立地为相同的或不同的。
5′非翻译前导序列可衍生自所选的启动子以表达多核苷酸的异源基因序列，或可相对于待产生的酶的编码区为异源的，并可根据需要进行特异性修饰以便增强mRNA的翻译。
转录的终止通过在表达载体中可操作地连接到所关注多核苷酸的3′非翻译DNA序列而完成。重组DNA分子的3′非翻译区包含在植物中作用以使腺苷酸核苷酸加成到RNA的3′端的多聚腺苷酸化信号。3′非翻译区可得自在例如植物细胞中表达的多种基因。胭脂碱合酶3′非翻译区、豌豆小亚基Rubisco基因的3′非翻译区、大豆7S种子贮藏蛋白基因的3′非翻译区常用于此能力。包含农杆菌属(Agrobacterium)肿瘤诱导(Ti)质粒基因的多聚腺苷酸化信号的3′转录非翻译区也是合适的。
重组DNA技术可用于通过操纵(例如)宿主细胞内多核苷酸的拷贝数、这些多核苷酸的转录效率、所得转录物的翻译效率以及转录后修饰的效率而改善转化的多核苷酸的表达。
为了有利于鉴定转化体，重组载体有利地包含作为本文所定义的多核苷酸的核酸序列或除了本文所定义的多核苷酸的核酸序列外的选择或筛选标记基因。所谓“标记基因”是指使表达该标记基因的细胞具有不同的表型并因此允许将此类转化细胞与不具有该标记的细胞进行区分的基因。选择标记基因赋予一种性状，可以根据对选择剂(如，除草剂、抗生素、辐射、热或对非转化细胞的其他处理伤害)的抗性对其加以选择。筛选标记基因(或报告基因)赋予可通过观察或测试，也就是说，通过“筛选”进行鉴定的性状(如，不存在于非转化细胞中的β-葡糖醛酸酶、荧光素酶、GFP或其他酶活性)。标记基因和所关注的核苷酸序列不必连接，因为如(例如)US 4,399,216中所述的非连接基因的共转化也是(例如)植物转化中的有效过程。标记的实际选择不是决定性的，只要与所选的细胞诸如植物细胞组合时为双官能的(即，选择性的)即可。
用于选择植物转化体的示例性选择标记包括但不限于：编码潮霉素B抗性的hyg基因；赋予卡那霉素、巴龙霉素、G418抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因；赋予谷胱甘肽源除草剂抗性的得自大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因，如(例如)EP 256223中所述；过表达时赋予谷氨酰胺合成酶抑制剂诸如草胺膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因，如(例如)WO 87/05327中所述；赋予选择剂草胺膦抗性的得自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰基转移酶基因，如(例如)EP 275957中所述；编码赋予N-膦酰基甲基甘氨酸耐受性的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因，如(例如)Hinchee等人(1988)所述；赋予双丙氨磷抗性的bar基因，如(例如)WO91/02071中所述；赋予溴苯腈抗性的得自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的腈水解酶基因，诸如bxn(Stalker等人，1988)；赋予甲氨蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet等人，1988)；赋予咪唑啉酮类、磺酰脲类或其他ALS抑制性化学品的突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)(EP 154,204)；赋予5-甲基色氨酸抗性的突变邻氨基苯甲酸合成酶基因；或赋予除草剂抗性的茅草枯脱卤素酶基因。
优选的筛选标记包括但不限于：编码已知其各种生色底物的β-葡糖醛酸酶(GUS)的uidA基因；编码已知其生色底物的酶的β-葡糖醛酸酶基因；可用于钙敏感生物发光检测的水母发光蛋白基因(Prasher等人，1985)；绿荧光蛋白基因(Niedz等人，1995)或其衍生物；或允许生物发光检测的荧光素酶(luc)基因(Ow等人，1986)。所谓“报告基因”是指这样一种分子，通过其化学性质，提供有利于通过参考蛋白产物测定启动子活性的能通过分析而鉴定的信号。
优选地，重组载体稳定地结合到细胞诸如植物细胞的基因组中。因此，重组载体可包含允许载体结合到细胞基因组或染色体组中的合适元件。
转移核酸
转移核酸可用于将外源多核苷酸递送到细胞，并包含一个、优选两个边界序列和一个所关注的多核苷酸。转移核酸可以或可以不编码选择标记。优选地，转移核酸在细菌中形成双元载体的一部分，其中该双元载体进一步包含这样的元件，它们允许载体在细菌中复制、选择或维持包含该双元载体的细菌细胞。转移到真核细胞后，双元载体的转移核酸成分能够整合到真核细胞的基因组中。
如本文所用，术语“染色体外转移核酸”是指能够从细菌诸如农杆菌属某种(Agrobacterium sp.)转移到真核细胞诸如植物细胞的核酸分子。染色体外转移核酸是一种遗传元件，它作为能够被转移、随后将其边界内所含的核苷酸序列整合到受体细胞基因组中的元件而广为人知。在这方面，转移核酸的侧翼通常为两个“边界”序列，但在某些情况下，可以使用一个末端的单个边界，而转移核酸的第二末端则在转移过程中随机生成。所关注的多核苷酸通常位于转移核酸的左边界样序列与右边界样序列之间。转移核酸内所含的多核苷酸可以可操作地连接到多种不同的有利于其表达(即，多核苷酸的转录和/或翻译)的启动子和终止子调控元件。得自农杆菌属某种诸如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的转移DNA(T-DNA)及其人造变体/突变体可能是转移核酸中研究最为透彻的实例。另一个实例是得自植物的包含T-DNA边界样序列的P-DNA(“植物DNA”)。
如本文所用，″T-DNA″是指(例如)根癌农杆菌Ti质粒或发根农杆菌Ri质粒的T-DNA，或其作为T-DNA发挥作用的人造变体。T-DNA可以包括同时包含左右边界序列的整个T-DNA，但只需要包含转移所需的顺式最小序列，即右侧T-DNA边界序列。本发明的T-DNA已插入它们之间，位于所关注多核苷酸的左右侧边界序列(如果存在)之间的任何位置。编码将T-DNA转移到植物细胞所需的反式因子的序列诸如vir基因可以插入T-DNA，或者可以存在于与T-DNA相同的复制子上，或优选地以反式存在于农杆菌属宿主的相容复制子上。此类“双元载体系统”在本领域是熟知的。
如本文所用，″P-DNA″是指从植物基因组分离的转移核酸或其人造变体/突变体，并在每个末端或只在一个末端包含T-DNA边界样序列。边界样序列优选地与得自农杆菌属某种诸如根癌农杆菌或发根农杆菌的T-DNA边界序列共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、或至少95％但低于100％的序列同一性。因此，可以使用P-DNA代替T-DNA来将得自例如农杆菌属的P-DNA内所含的核苷酸序列转移到另一细胞。P-DNA在插入待转移的外源多核苷酸之前可以进行修饰以有利于克隆并且应当优选地不编码任何蛋白质。P-DNA的特征在于至少包含右侧边界序列并优选地也包含左侧边界序列。
如本文所用，转移核酸的“边界”序列可从所选的生物体诸如植物或细菌中分离，或者可以为其人造变体/突变体。边界序列促进并有利于其所连接的多核苷酸的转移，并可有利于其在受体细胞基因组中的整合。在一个实施方案中，边界序列的长度介于5-100个碱基对(bp)之间、10-80 bp之间、15-75 bp之间、15-60 bp之间、15-50 bp之间、15-40 bp之间、15-30 bp之间、16-30 bp之间、20-30 bp之间、21-30 bp之间、22-30 bp之间、23-30 bp之间、24-30 bp之间、25-30 bp之间或26-30 bp之间。得自农杆菌属某种的T-DNA的边界序列在本领域中是熟知的，并包括Lacroix等人(2008)，Tzfira和Citovsky(2006)以及Glevin(2003)中所述的那些。
虽然在传统上仅将农杆菌属某种用于将基因转移到植物细胞，但是目前已有大量已被鉴定/开发的作用方式类似于农杆菌属某种的系统。已对若干非农杆菌属种类进行遗传修饰而能够用于基因转移(Chung等人，2006；Broothaerts等人，2005)。它们包括根瘤菌属某种(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和百脉根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium loti)。通过向细菌提供转化过程所需的机制使细菌能够用于基因转移，该机制即一组通过农杆菌属Ti质粒编码的毒力基因以及位于单独的小双元质粒上的T-DNA片段。以此方式工程化的细菌能够转化不同的植物组织(叶盘、愈伤组织和椭圆形组织)，单子叶植物或双子叶植物，以及各种不同的植物物种(如烟草、水稻)。
如本文所用，术语“转染”、“转化”及其变型形式通常可互换使用。“转染的”或“转化的”细胞可经过操纵引入所关注的多核苷酸，或者可以为从其衍生的后代细胞。
重组细胞
本发明还提供重组细胞，例如，重组植物细胞，其为通过本文所定义的一种或多种多核苷酸或载体或它们的组合转化的宿主细胞。术语“重组细胞”与术语“转基因细胞”在本文可互换使用。本发明的合适细胞包括可通过编码(例如)本文所述的多肽或酶的本发明多核苷酸或重组载体转化的任何细胞。该细胞优选地为因此能够用于产生脂质的细胞。重组细胞可以是培养中的细胞、体外或生物体(诸如植物)中或器官(诸如种子或叶子)中的细胞。优选地，细胞在植物中，更优选地在植物种子中，更优选地在油料种子植物诸如红花的种子中。在一个实施方案中，植物细胞包含具有如本文所述的脂肪酸组成的脂质或油。
向其中引入多核苷酸的宿主细胞可以是非转化细胞或已通过至少一种核酸转化的细胞。此类核酸可以与脂质合成相关，或不相关。本发明的宿主细胞可以内源性地(即，天然地)能够产生本文所定义的多肽，在此情况下，从其衍生的重组细胞具有增强的产生所述多肽的能力，或者仅在用本发明的至少一种多核苷酸转化后才能产生所述多肽。在一个实施方案中，本发明的重组细胞具有增强的产生非极性脂质的能力。细胞可以是原核或真核的。优选的宿主细胞为酵母、藻类和植物细胞。在一个优选的实施方案中，植物细胞为种子细胞，具体地讲，为种子子叶或胚乳中的细胞。可用作本发明的宿主细胞的藻类细胞的实例包括例如南极冰藻属某种(Chlamydomonas sp.)(例如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))、杜氏藻属某种(Dunaliella sp.)、红球藻属某种(Haematococcus sp.)、小球藻属某种(Chlorella sp.)、破囊壶菌属某种(Thraustochytrium sp.)、裂殖壶菌属某种(Schizochytriumsp.)和团藻属某种(Volvox sp.)。
宿主细胞可以是适合发酵工艺的生物体，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或其他酵母。
转基因植物
本发明还提供包含本发明的外源多核苷酸或多肽、本发明的细胞、本发明的载体或它们的组合的植物。术语“植物”是指整个植株，而术语“其部分”是指植物器官(如叶子、茎干、根部、花朵、果实)、单个细胞(如花粉)、种子、种子部分(诸如胚芽、胚乳、盾片或种皮)、植物组织(诸如脉管组织)、植物细胞及其子代。如本文所用，植物部分包括植物细胞。
如本文所用，术语“植物”以其最广泛的含义使用。这包括但不限于草、观赏或装饰性植物、农作物或谷类(如油料种子植物、玉米、大豆)、秣料或草料、水果或蔬菜植物、草药植物、木本植物、花卉植物或树的任何物种。这不表示将植物限制到任何特定的结构。它还指单细胞植物(如微藻)。关于植物的术语“其部分”是指植物细胞及其子代，大量分化成集落的多个植物细胞(如团藻属)、在植物发育的任何阶段存在的结构、或植物组织。此类结构包括但不限于叶子、茎干、花朵、果实、坚果、根部、种子、种皮、胚芽。术语“植物组织”包括植物的分化和未分化组织，包括存在于叶子、茎干、花朵、果实、坚果、根部、种子中的那些，例如胚性组织、胚乳、皮组织(如表皮、周皮)、脉管组织(如木质部、韧皮部)或基本组织(包括薄壁组织、厚角组织和/或厚壁组织细胞)以及培养中的细胞(如单细胞、原生质体、愈伤组织、胚芽等)。植物组织可以在原位，在器官培养、组织培养或细胞培养中。
“转基因植物”、“遗传修饰的植物”或其变型形式是指包含不存在于相同物种、品种或品系的野生型植物中的转基因的植物。在本发明背景下定义的转基因植物包括使用重组技术进行遗传修饰以导致在所需的植物或其部分中产生本文所定义的至少一种多核苷酸的植物及其子代。“转基因植物部分”具有相应的含义。
术语“种子”和“粮食”是如本文所用的相关术语，并具有重叠的含义。“粮食”是指成熟的粮食，诸如收获的粮食或仍在植物上但已准备收获的粮食，但根据上下文也可以指吸胀或发芽后的粮食。成熟的粮食通常具有低于约18-20％的含水量。“种子”包括“发育的种子”以及为成熟的粮食但非吸胀或发芽后的粮食的粮食。如本文所用的“发育种子”是指成熟前的种子，通常存在于受精或开花后的植物生殖结构中，但也可以指从植物中分离的成熟前的此类种子。植物中的种子发育通常分为发育的早期、中期和后期阶段。
如本文所用，术语“植物贮藏器官”是指专门贮藏(例如)蛋白质、碳水化合物、脂质形式的能量的植物部分。植物贮藏器官的实例为种子、果实、块状根和块茎。本发明的优选植物贮藏器官为种子。
如本文所用，术语“营养组织”或“营养植物部分”或其变体是不包括以下方面的任何植物组织、器官或部分：植物有性繁殖器官或具有种子的器官或密切相关的组织或器官，诸如花、果实和种子。营养组织和部分包括至少植物叶子、茎干(包括茎轴(bolt)和茎蘖但不包括茎头)、块茎和根部，但不包括花、花粉、包括种皮的种子、胚胎和胚乳、包括中果皮组织的果实、结种荚和结种头(seed-bearing head)。在一个实施方案中，植物的营养部分为气生植物部分。在另一个或又一个实施方案中，营养植物部分为绿色部分，诸如叶子或茎干。营养部分包括主要涉及提供或支持植物的光合作用能力或相关功能，或固定植物的那些部分。
如本文所用，术语“表型正常的”是指遗传修饰的植物或其部分，尤其是贮藏器官，诸如本发明的种子，它们与未修饰的植物或其部分相比时生长和繁殖能力无明显降低。在一个实施方案中，在表型上正常的经遗传修饰的植物或其部分包含至少一种如本文所定义的外源性多核苷酸，并能够基本上与不含所述多核苷酸的相应植物或其部分相同地生长或繁殖。优选地，生物质、生长速率、发芽速率、贮藏器官大小、种子大小和/或所产生的活力种子的数量不低于不含所述外源性多核苷酸的植物在于相同的条件下生长时的上述指标的90％。这个术语不涵盖可以不同于野生型植物但不影响将植物用于商业用途的植物特征。
本发明提供的或设想用于实践本发明的植物既包括单子叶植物也包括双子叶植物。在优选的实施方案中，本发明的植物为农作物(例如谷类和豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯、水稻、高粱、小米、大麦或豌豆)或其他豆科植物。植物可以生长产生可食用的根部、块茎、叶子、茎干、花朵或果实。植物可以是蔬菜或观赏植物。本发明的植物可以为：红花(Carthamus tinctorius)、玉米(Zea mays)、低芥酸菜子(甘蓝型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa ssp.))、其他芸苔属植物诸如芜菁甘蓝(Brassica napobrassica)、芥菜(Brassicajuncea)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、海甘蓝(Crambe abyssinica)、亚麻荠(Camelina sativa)、甜菜(Beta vulgaris)、三叶草属某种(Trifoliumsp.)、亚麻(Linum usitatissimum)、苜蓿(Medicago sativa)、稻(亚洲栽培稻(Oryza sativa))、黑麦(Secale cerale)、高粱(两色高梁(Sorghumbicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、向日葵(Helianthus annus)、小麦(Tritium aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Lopmoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡属某些种(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Anana comosus)、柑橘树(柑橘属某些种(Citrus spp.))、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasenensis)、香蕉(芭蕉属某些种(Musa spp.))、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangiferindica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(番木瓜(Carica papaya))、腰果(Anacardium occidentale)、夏威夷果(Macadamia intergrifolia)、杏仁(巴旦杏(Prunus amygdalus))、麻风树属(麻风树(Jatropha curcas))、羽扇豆、桉树、棕榈、坚果、鼠尾草(sage)、水黄皮属、燕麦或大麦。
其他优选的植物包括C4草类植物，诸如大须芒草(Andropogongerardi)、垂穗草(Bouteloua curtipendula)、细格兰马草(B.gracilis)、野牛草(Buchloe dactyloides)、柳枝稷(Panicum virgatum)、裂稃草(Schizachyrium scoparium)、芒属(Miscanthus)种类例如芒草奇岗(Miscanthus x giganteus)和芒(Miscanthus sinensis)、黄假高粱(Sorghastrum nutans)、沙鼠尾粟(Sporobolus cryptandrus)、柳枝稷(Panicum virgatum)、甘蔗属(甘蔗(Saccharum officinarum))、臂形草属(Brachyaria)；C3草类植物，诸如加拿大披碱草(Elymus canadensis)、豆科植物头状胡枝子(Lespedeza capitata)和Petalostemum villosum、非禾本草本植物Aster azureus；以及木本植物，诸如Quercus ellipsoidalis和大果栎(Q.macrocarpa)。
在一个优选的实施方案中，植物为被子植物。
在一个优选的实施方案中，植物为油料种子植物，优选地为油料种子农作物。如本文所用，“油料种子植物”是用于从植物种子商业生产脂质的植物物种。“商业生产”在本文意指生产用于销售以换取收入的脂质，优选油。油料种子植物可以是油菜籽(诸如低芥酸菜子)、玉米、向日葵、红花、大豆、高粱属、亚麻(亚麻籽)或甜菜。此外，油料种子植物可以是其他芸苔属植物、棉花、花生、罂粟、芜菁甘蓝、芥菜、蓖麻、芝麻、红花或产坚果植物。植物可以在其果实中产生高水平的脂质，诸如橄榄、油棕或椰子。本发明适用的园艺植物为莴苣、菊苣或蔬菜类芸苔属植物，包括卷心菜、西兰花或菜花。本发明可应用于烟草属植物、葫芦科植物、胡萝卜、草莓、番茄或胡椒。更优选的植物是其发育种子为非光合作用的油料种子植物，也称为“白色种子”植物，诸如红花、向日葵、棉花和蓖麻。
在一个优选的实施方案中，转基因植物对于已引入的每一个基因(转基因)为纯合的，使得其子代不发生所需表型的分离。转基因植物也可对于引入的转基因为杂合的，优选地对于转基因为均匀杂合的，诸如在通过杂交种子生长的F1子代中。此类植物可提供本领域熟知的多种优点，诸如杂种优势。
植物的转化
转基因植物可使用本领域已知的技术而产生，诸如通常在Slater等人，Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants，OxfordUniversity Press(2003)以及Christou和Klee，Handbook of PlantBiotechnology，John Wiley and Sons(2004)中所述的那些技术。
如本文所用，术语“稳定转化”、“稳定转化的”及其变型形式是指多核苷酸整合到细胞基因组中使得它们在细胞分裂过程中转移到后代细胞而无需对它们的存在进行阳性选择。稳定的转化体或其子代可通过本领域已知的任何手段进行选择和/或鉴定，诸如对染色体DNA的Southern印迹或基因组DNA的原位杂交。
农杆菌属介导的转移是将基因引入植物细胞的广泛使用的系统，因为可以将DNA引入整个植物组织、植物器官或植物培养中的外植体中的细胞，从而瞬时表达或将DNA稳定整合到植物细胞基因组中。使用农杆菌属介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞在本领域是熟知的(参见例如US 5177010、US 5104310、US 5004863或US5159135)。待转移的DNA区域通过边界序列限定，并且通常将间插DNA(T-DNA)插入植物基因组。进一步地，T-DNA的整合是相对精确的过程，很少导致重排。在其中农杆菌属介导的转化是有效的那些植物品种中，这是首选的方法，原因在于基因转移的容易性和确定性。优选的农杆菌属转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌属中复制，从而允许方便地操纵，如文献所述(Klee等人，于：Plant DNA InfectiousAgents，Hohn和Schell编辑，Springer-Verlag，New York，第179-203页(1985))。
可用的加速方法包括(例如)微弹轰击法(microprojectilebombardment)等。将转化核酸分子递送进植入细胞的方法的一个实例为微弹轰击法。该方法在Yang等人，Particle Bombardment Technologyfor Gene Transfer，Oxford Press，Oxford，England(1994)中进行了综述。非生物性粒子(微弹)可用核酸包被并通过推进力递送进细胞。此类方法在本领域中是熟知的。在另一个实施方案中，可以稳定转化质粒。针对在高等植物中进行质粒转化所公开的方法包括含有选择标记并通过同源重组将DNA靶向质粒基因组的DNA的粒子枪递送(US5,451,513、US 5,545,818、US 5,877,402、US 5,932479和WO99/05265)。
植物原生质体的转化可使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法而实现。将这些系统应用于不同的植物品种取决于从原生质体再生该特定植物菌株的能力。从原生质体再生谷物的示例性方法已有所描述(Fujimura等人，1985；Toriyama等人，1986；Abdullah等人，1986)。
其他细胞转化方法也可使用，并且包括但不限于通过将DNA直接转移进花粉、通过将DNA直接注射进植物的生殖器官、或通过将DNA直接注射进未成熟胚的细胞且然后通过将干燥胚再水合而将DNA引入植物。
通过单个植物原生质体转化株或通过各种转化的外植体实现植物的再生、发育和培养在本领域是熟知的(Weissbach等人，于：Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，San Diego，Calif.，(1988))。该再生和生长过程通常包括选择转化细胞、培养那些个体化细胞通过胚发育的常见阶段、通过生根植株阶段的步骤。使转基因胚和种子相似地再生。之后，将所得的转基因生根芽植入合适的植物生长培养基中，诸如土壤。
包含异体外源基因的植物的发育或再生在本领域是熟知的。优选地，使再生的植物自花受粉以提供纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉杂交到在农学上重要谱系的由种子长成的植物。反之，将得自这些重要谱系的植物的花粉用于对再生植物授粉。将本发明包含所需多核苷酸的转基因植物用本领域技术人员熟知的方法进行培养。
用于转化双子叶植物(主要通过使用根癌农杆菌)并获得转基因植物的方法已有公布，如棉花(US 5,004,863，US 5,159,135，US5,518,908)、大豆(US 5,569,834，US 5,416,011)、芸苔属植物(US5,463,174)、花生(Cheng等人，1996)和豌豆(Grant等人，1995)。
用于转化谷类植物诸如小麦和大麦以通过引入外源核酸而将遗传变异引入植物以及通过原生质体或未成熟植物胚再生植物的方法在本领域是熟知的，参见例如CA 2,092,588、AU 61781/94、AU667939、US 6,100,447、PCT/US97/10621、US 5,589,617、US 6,541,257。可再生的小麦细胞优选地得自未成熟胚的盾片、成熟胚、由它们衍生的愈伤组织、或分生组织。
为了确认转基因在转基因细胞和植物中的存在性，可使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。一旦得到转基因植物后，可让它们生长以产生具有所需表型的植物组织或部分。可以收获植物组织或植物部分，和/或收集种子。种子可用作长成其组织或部分具有所需特性的另外植物的来源。
使用农杆菌属或其他转化方法形成的转基因植物通常在一条染色体上包含单个转基因基因座。此类转基因植物对于添加的基因可称为半合子的。更优选的是对于添加的基因为纯合的转基因植物，即包含两个添加的基因的转基因植物，一个基因位于染色体对每条染色体上的相同基因座。纯合的转基因植物可通过自株传粉半合子转基因植物、使产生的其中一些种子发芽以及分析所得植物的所关注基因而获得。
还应当了解，包含两种独立分离外源基因或基因座的两种不同的转基因植物也可杂交(配育)以产生包含两组基因或基因座的后代。合适的F1子代的自花受精可产生对于两种外源基因或转座子为纯合的植物。还可以设想亲本植株的回交以及与非转基因植物的异交，如营养繁殖。常用于不同性状和农作物的其他育种方法的描述可见于Fehr，于：Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox J.编辑，American Society of Agronomy，Madison Wis.(1987)。
对于红花的转化，尤其有用的方法由Belide等人(2011)进行了描述。
TILLING
在一个实施方案中，TILLING(定向诱导基因组局部突变技术)可用于产生其中内源性基因被敲除的植物，例如，编码Δ12去饱和酶、棕榈酰-ACP硫酯酶、ω6或Δ6去饱和酶活性或其两种或更多种的组合的基因。
在第一步骤中，通过以下方法在植物种群中诱导引入的突变，诸如新的单一碱基对变化：用化学诱变剂处理种子(或花粉)，然后使植物生长到突变将稳定遗传的世代。提取DNA，并从种群的所有成员保存种子，以形成可随时间反复获取的资源。
对于TILLING分析，设计PCR引物以特异性扩增所关注的单个基因靶标。如果靶标是基因家族的成员或多倍体基因组的成员，则特异性特别重要。接下来，可用染料标记的引物从多个个体的混合DNA扩增PCR产物。使这些PCR产物变性和再次退火以允许形成错配的碱基对。错配或异源双链体代表了均天然存在的单核苷酸多态性(SNP)(即，种群的数种植株可能携带相同的多态性)和诱导SNP(即，只有极少的单独植株可能显示突变)。形成异源双链后，使用识别和裂解错配DNA的内切酶诸如CelI是发现TILLING种群内的新型SNP的关键。
使用该方法，可以筛选数千种植物以鉴定在基因组的任何基因或特定区域中具有单碱基变化以及小插入或缺失(1-30bp)的任何个体。进行分析的基因组片段的大小可以为0.3至1.6kb之间的任何值。每次分析在8倍混合(pooling)、1.4kb片段(略去片段的末端，在末端中SNP检测会因噪音而存在问题)和96个条带时，这一组合允许单次分析可筛选基因组DNA的高达一百万个碱基对，从而使得TILLING成为一种高通量技术。TILLING进一步见述于Slade和Knauf(2005)以及Henikoff等人(2004)。
除了实现突变的高效检测外，高通量TILLING技术是检测自然多态性的理想选择。因此，通过与已知序列构建异源双链来探查未知的同源DNA可揭示多态位点的数量和位置。核苷酸变化以及小插入和缺失均进行鉴定，包括至少一些重复数多态性。这称为Ecotilling(Comai等人，2004)。
每个SNP通过其在一些核苷酸内的大致位置被记录。因此，各单倍型可基于其迁移率进行归档。序列数据可通过用于错配裂解分析的相同扩增DNA的等分试样以相对小的增量努力获得。用于单一反应的左端或右端测序引物通过其与多态性的接近度来选择。Sequencher软件执行多重比对并发现碱基变化，这在每种情况下确认了凝胶带。
Ecotilling的执行可比完整测序(当前用于大多数SNP发现的方法)更加便宜。可对包含生态型DNA阵列的平板进行筛选，而不是得自经诱变处理的植物的DNA池。由于检测在近乎碱基对分辨率的凝胶上进行，并且背景图案是均匀交叉的泳道，具有相同大小的条带可以匹配，从而在单个步骤中发现SNP并进行基因分型。以此方式，SNP的终极测序简单而高效，基于用于筛选的相同PCR产物的等分试样也可用来进行DNA测序这一事实而尤其如此。
诱变程序
产生突变植物株系的技术是本领域已知的。可用于产生突变植物的诱变剂的实例包括辐射和化学诱变。突变体也可以通过诸如T-DNA插入和转座子诱导的诱变而产生。可将植物中任何所需基因中的突变通过如本领域已知的人工锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子(TALEN)或CRISPR技术(使用Cas9型核酸酶)以位点特异性方式引入。诱变程序可对植物的任何亲本细胞进行，例如种子或组织培养中的亲本细胞。
化学诱变剂可通过化学性质分类，例如垸化剂、交联剂等。可用的化学诱变剂包括但不限于N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、盐酸甲基苄肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、三亚乙基三聚氰胺(TEM)、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG)、7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)、环氧乙垸、六甲基磷酰胺，以及白消安。
诱导突变的合适辐射的实例是通过γ射线辐射，诸如由铯137源提供。γ辐射优选以大约60至200千拉德的剂量，最优选以大约60至90千拉德的剂量提供给植物细胞。
通常将植物暴露于诱变剂持续足够的时间以达到所需的遗传修饰，但不足以完全破坏细胞的活力及其再生为植物的能力。
上述诱变程序通常导致在所关注的基因中以1000棵植物至少1棵的频率生成突变体，这意味着筛选诱变后的植物种群是鉴定任何所关注基因中的突变体的可行手段。突变体的鉴定也可通过大规模并行核苷酸测序技术来实现。
标记辅助选择
当在传统培育程序中与回归亲本回交时，标记辅助选择是选择所需的杂合植物的一种公认方法。每个回交世代中的植物种群对于在回交种群中通常以1∶1的比率存在的所关注基因而言将是杂合的，并且分子标记可用于区分基因的两个等位基因。通过从例如幼苗中提取DNA并用特异性标记检测渐渗的希望性状，初步选择植物进行进一步回交，同时将精力和资源集中于少数植物上。为了进一步加速回交程序，可以从不成熟的种子(开花后25天)中切除胚胎，并使其在无菌条件下在营养培养基中生长，而不是使全部种子成熟。在三叶阶段中组合应用这种称作“胚肽拯救”的方法与DNA提取方法，并分析所需的基因型，可以快速选择携带所需性状的植物，该植物可以在温室或田野中培育至成熟，随后与回归亲本进一步回交。
在本发明的方法中可以使用能够检测FAD2、FATB或FAD6基因的本领域已知的任何分子生物学技术。此类方法包括但不限于使用核酸扩增、核酸测序、核酸与适当标记的探针杂交、单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链体分析(HET)、化学裂解分析(CCM)、催化性核酸裂解或其组合(参见例如Lemieux，2000；Langridge等人，2001)。本发明也包括使用分子标记技术检测连接到(例如)赋予所需基因型的FAD2、FATB或FAD6基因的等位基因的多态性。此类方法包括检测或分析限制片段长度多态性(RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性(AFLP)和微卫星(简单序列重复，SSR)多态性。紧密连接的标记可易于通过本领域熟知的方法获得，诸如Langridge等人(2001)综述的分离群体分组分析法(Bulked SegregantAnalysis)。
“聚合酶链反应(PCR)”是这样的反应，其中复制的拷贝使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”以及聚合反应催化剂(诸如DNA聚合酶，通常为热稳定的聚合酶)由靶多核苷酸制成。PCR方法是本领域已知的，并例如在″PCR″(编者M.J.McPherson和S.GMoller(2000)BIOS Scientific Publishers Ltd，Oxford)中有所教导。可以对得自从植物细胞中分离的逆转录mRNA的cDNA进行PCR。然而，如果对从植物中分离的基因组DNA进行PCR，则其通常更简单。
引物是寡核苷酸序列，其能够以序列特异性方式与靶序列杂交并在PCR期间延伸。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是包含所述引物和新合成的靶序列拷贝的延伸产物。多重PCR系统含有多组引物，导致同时产生不止一个扩增子。引物可与靶序列完美匹配，或其可以含有内部错配碱基，这可导致在特定靶序列中引入限制酶或催化性核酸识别/裂解位点。引物也可以含有另外的序列和/或含有修饰或标记的核苷酸以便于捕获或检测扩增子。DNA热变性、引物与其互补序列退火以及用聚合酶延伸退火的引物的重复循环导致靶序列的指数式扩增。术语靶或靶序列或模板是指被扩增的核酸序列。
核苷酸序列的直接测序方法是本领域技术人员熟知的，并可见于例如Ausubel等人(同上)以及Sambrook等人(同上)。可以通过任何合适的方法进行测序，例如双脱氧测序法、化学测序法或其变型形式。直接测序具有测定特定序列任何碱基对中的变化的优势。
基于杂交的检测系统包括但不限于TaqMan测定和分子信标测定(US 5,925,517)。TaqMan测定(US 5,962,233)使用等位基因特异性(ASO)探针，在其一端具有供体染料，在另一端具有受体染料，使得该染料对通过荧光共振能量转移(FRET)而相互作用。
在一个实施方案中，将实施例7中所述的方法用于选择和育种程序以鉴定并选择具有ol突变的红花植物。例如，该方法包括使用以下引物组中的一者或两者对得自植物的基因组DNA进行扩增反应：
i)5’-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3’(SEQ ID NO：140)和5’-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3’(SEQ ID NO：141)，以及
ii)5’-AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3’(SEQ ID NO：142)和5’-TTGCTATACATATTGAAGGCACT-3(SEQ ID NO：143)。
多肽
术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换使用。
一种多肽或一类多肽可通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性程度(百分比同一性)或通过与一个参考氨基酸序列比与另一个参考氨基酸序列具有更高的百分比同一性而限定。多肽与参考氨基酸序列的百分比同一性通常通过GAP分析(Needleman和Wunsch，1970；GCG程序)以空位形成罚分＝5和空位延伸罚分＝0.3的参数而确定。查询序列的长度为至少100个氨基酸，GAP分析在至少100个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度为至少250个氨基酸，GAP分析在至少250个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在整个长度上比对两个序列。所述一种多肽或一类多肽可具有与参考多肽相同的酶活性、或不同的活性或无活性。优选地，多肽的酶活性为参考多肽的活性的至少10％。
如本文所用，“生物活性片段“是本发明的多肽的一部分，其保持了全长参比多肽例如Δ12去饱和酶、棕榈酰-ACP硫酯酶或Δ6去饱和酶活性的限定活性。如本文所用的生物活性片段不包括全长多肽。生物活性片段可以为任何大小的部分，只要它们保持限定的活性即可。优选地，生物活性片段保持全长多肽活性的至少10％。
至于限定的多肽或酶，应当理解高于本文所提供的那些数值的百分比同一性数值将涵盖优选的实施方案。因此，适用时，按照最低百分比同一性数值，优选的是，多肽/酶所含的氨基酸序列与相关的命名SEQ ID NO至少50％、更优选地至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、更优选地至少93％、更优选地至少94％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、更优选地至少99.1％、更优选地至少99.2％、更优选地至少99.3％、更优选地至少99.4％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少99.8％甚至更优选地至少99.9％相同。
本文所限定的多肽的氨基酸序列突变体可通过将合适的核苷酸变化引入本文所限定的核酸或通过体外合成所需的多肽来制备。此类突变体包括(例如)氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。可使缺失、插入和取代的组合出现在最终构建体中，前提条件是最终多肽产物具有所需的特性。
突变(改变)的多肽可使用本领域已知的任何技术、例如使用定向进化或合理设计策略(见下文)来制备。衍生自突变/改变的DNA的产物可容易地用本文所述的技术进行筛选以确定它们是否具有或不具有Δ12去饱和酶、棕榈酰-ACP硫酯酶或ω6Δ6去饱和酶活性。
在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的特性。突变位点可例如通过以下方式单独地或连续地进行修饰：(1)根据实现的结果首先通过保守氨基酸选择、然后通过更激进的选择进行取代，(2)使目标残基缺失，或(3)邻近定位的位点插入其他残基。如技术人员将会认识到，非保守性取代可在产生具有降低的酶活性的突变体时使用。
氨基酸序列缺失通常在约1至15个残基、更优选约1至10个残基并通常约1至5个连续残基的范围内，但也可以长得多，尤其是在对突变体进行设计以降低酶活性时。
取代突变体具有至少一个在多肽中移除的氨基酸残基以及在其位置插入的不同残基。使酶失活的置换突变的最关注位点包括鉴定为一个或多个活性位点的位点。所关注的其他位点为其中得自各种品系或物种的特定残基为相同的那些位点。这些位置可以对生物活性具有重要意义。保守性取代在表1中示出，而非保守性取代则是不为保守性取代的取代。
在一个实施方案中，本发明的多肽为Δ12去饱和酶，并且其包含具有如SEQ ID NO：27至34、36或37任一者所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO：NO：27至34、36或37中任一者或多者至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为存在于油料种子植物的种子(油料种子)中的油酸Δ12去饱和酶，其包含具有如SEQ ID NO：27、28或36任一者所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO：27、28或36中任一者或多者至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为Δ12-乙炔酶，其包含具有如SEQ ID NO：37所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ IDNO：37至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为棕榈油酸Δ12去饱和酶，其包含具有如SEQ ID NO：35所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO：35至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)，其包含具有如SEQ ID NO：44或45任一者所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO：44或45中任一者或多者至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
表1.保守性取代。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为存在于油料种子植物的种子中的棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)，其包含具有如SEQ ID NO：45所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO：45至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为Δ6去饱和酶，其包含具有如SEQ ID NO：48所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO：48至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
本发明的酶的优选特征在实施例章节中提供，尤其是与红花FAD2相关的实施例2。
如本文所述的多肽可作为与至少一种其他多肽的融合体而表达。在一个优选的实施方案中，所述至少一种其他多肽选自：增强融合蛋白稳定性的多肽和有助于纯化融合蛋白的多肽。
产生脂质和/或高油酸油
在本领域经常用于实践的技术可用于提取、加工、纯化和分析本发明的植物(尤其是种子)所产生的脂质。此类技术在诸如以下文献资源中有所描述和解释：Fereidoon Shahidi，Current Protocols in FoodAnalytical Chemistry，John Wiley&Sons，Inc.(2001)D1.1.1-D1.1.11以及Perez-Vich等人(1998)。
种子油的产生
通常，将植物种子煮熟、压榨和/或提取以产生粗制种子油，然后脱胶、精炼、漂白和除臭。一般来讲，破碎种子的技术是本领域已知的。例如，可通过向油料种子喷水以将含水量提高到(例如)8.5％而使油料种子缓和，然后使用间隙设为0.23至0.27mm的平滑辊压成薄片。取决于种子的类型，在破碎前可不加水。施热使酶失活、有利于进一步破碎细胞、合并脂质液滴以及聚集蛋白颗粒，所有这些都有利于提取过程。
在一个实施方案中，大部分种子油通过螺旋榨油机而释出。螺旋榨油机排出的油饼然后使用伴热柱通过溶剂提取，例如通过己烷提取。可选地，可使通过压榨作业产生的粗制种子油通过具有槽线排放盖的沉降槽，以除去在压榨作业期间与种子油榨出的固体。在除去己烷后，得自压榨和提取的固体残余物为种子饼粕，其通常用作动物饲料。可使澄清的种子油通过板框压滤机以除去任何剩余的细固体颗粒。如果需要，可将通过提取过程回收的种子油与澄清的种子油合并以产生混合的粗制种子油。
将溶剂从粗制种子油除去后，将压榨和提取的部分合并，然后接受正常的脂质加工工序，诸如脱胶、碱炼、漂白和除臭。可以根据生产路线的性质(例如用于饲料级油)而省去一些或全部步骤，可以只需要有限的处理，而对于油化工应用，需要更多的纯化步骤。
脱胶
脱胶是精炼油的早期步骤，其主要目的是从油中除去大部分磷脂，这些磷脂可占总提取脂质的大约1-2％。在70-80℃下向粗油中添加约2％的水(通常含有磷酸)导致大部分磷脂伴随痕量金属和色素的分离。除去的不溶性材料主要是磷脂和三酰基甘油的混合物并且也称为卵磷脂。脱胶可通过以下方法进行：将浓磷酸加入粗制种子油以将不可水化的磷脂转化成可水化的形式以及螯合存在的微量金属。通过离心将胶从种子油中分离。
碱炼
碱炼是用于处理粗油的精炼工艺之一，有时也称为中和。其通常在脱胶之后，漂白之前。在脱胶之后，通过添加足量的碱溶液处理种子油，以滴定所有的脂肪酸和磷酸，并移除因而形成的皂。合适的碱性材料包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化锂、氢氧化钙、碳酸钙和氢氧化铵。该过程通常在室温下进行并除去游离脂肪酸部分。将皂通过离心而除去或将皂萃取到溶剂中，然后将中和的油用水洗涤。需要时，可将油中任何过量的碱用合适的酸诸如盐酸或硫酸中和。
漂白
漂白是一个精炼过程，其中将油在90-120℃下在存在漂白粘土(0.2-2.0％)而不存在氧(通过用氮气或蒸汽或在真空中操作)的情况下加热10-30分钟。油加工中的该步骤被设计为除去不想要的色素(类胡萝卜素、叶绿素、棉子酚等)，并且该过程还除去氧化产物、痕量金属、硫化合物和少量皂。
除臭
除臭是在高温(200-260℃)和低压(0.1-1mmHg)下处理油和脂肪。这通常通过将蒸汽以约0.1毫升/分钟/100毫升种子油的速率引入种子油而实现。鼓泡约30分钟后，让种子油在真空下冷却。通常将种子油转移到玻璃容器中，用氩气吹扫，然后冷藏。该处理改善种子油的色泽，并除去大部分挥发性物质或异味化合物，包括任何剩余的游离脂肪酸、单酰基甘油和氧化产物。
冬化
冬化是一个有时用于商业生产油以在亚环境温度下通过结晶而将油和脂肪分离成固体(硬脂精)和液体(油精)馏分的过程。其最初应用于棉籽油以产生无固体的产品。其通常用于降低油的不饱和脂肪酸含量。
酯交换
酯交换是一个在TAG之内和之间交换脂肪酸的过程，最初通过从TAG中作为游离脂肪酸或作为脂肪酸酯(通常为脂肪酸乙酯)而释放出脂肪酸。当与分流过程相结合时，酯交换可用于修改脂质的脂肪酸组成(Marangoni等人，1995)。酯交换可使用化学或酶手段，后者使用可以为对于TAG上的脂肪酸而言为位置特异性(sn-1/3或sn-2特异性)的脂肪酶，或相比于其他氨基酸对某些脂肪酸更偏好的脂肪酶(Speranza等人，2012)。脂肪酸分馏以提高油中LC-PUFA的浓度可通过本领域已知的任何方法实现，诸如冷冻结晶、使用尿素形成复合物、分子蒸馏、超临界流体萃取和阴离子络合。用尿素形成复合物因其简单并能有效降低油中饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸的水平而为优选的方法(Gamez等人，2003)。最初，通过水解或通过脂肪酶而将油的TAG分成其组成性脂肪酸，通常为脂肪酸酯的形式，然后将这些游离脂肪酸或脂肪酸酯与尿素的乙醇溶液混合以形成复合物。饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸容易地与尿素复合并在冷却时结晶出来，并随后可通过过滤而移除。非尿素复合的馏分从而通过LC-PUFA富集。
氢化
脂肪酸氢化涉及用氢处理，通常在存在催化剂的情况下。非催化性氢化仅在极高温度下发生。
氢化通常用于加工植物油。氢化将不饱和脂肪酸转化成饱和脂肪酸，在一些情况下转化成反式脂肪。氢化导致液体植物油转化成固体或半固体转化，诸如存在于人造黄油中的那些。改变脂肪的饱和度将改变一些重要的物理性质，诸如熔化范围，这是液体油变成半固体的原因。固体或半固体脂肪对于烘焙是优选的，因为脂肪与面粉混合的方式将在烘焙产品中产生更理想的纹理。由于部分氢化的植物油比动物源脂肪更便宜，可以多种多样的稠度存在，并具有其他理想的特性(例如，提高的氧化稳定性/更长的储存寿命)，因此它们是用作大部分商业烘烤品中的起酥的主要脂肪。
在一个实施方案中，本发明的脂质/油未氢化。脂质或油未氢化的指标是在其TAG中不存在任何反式脂肪酸。
脂质的用途
通过本文所述的方法产生的脂质(诸如种子油，优选红花种子油)具有多种用途。在一些实施方案中，将脂质用作食用油。在其他实施方案中，将脂质精炼并用作润滑剂或用于其他工业用途，诸如塑料合成。其可用于制造化妆品、肥皂、织物软化剂、电绝缘材料或洗涤剂。其可用于生产农用化学品，诸如表面活性剂或乳化剂。在一些实施方案中，将脂质精炼以生产生物柴油。本发明的油可有利地用于油漆或清漆，因为不存在亚麻酸意味着其不会轻易褪色。
使用本发明的方法生产的工业产品可以是烃类产品，诸如脂肪酸酯，优选脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯；烷烃，诸如甲烷、乙烷或长链烷烃；长链烷烃的混合物；烯烃；生物燃料；一氧化碳和/或氢气；生物醇，诸如乙醇、丙醇或丁醇；生物炭；或一氧化碳、氢气和生物炭的组合。工业产品可以是任何这些组分的混合物，诸如烷烃的混合物、或烷烃与烯烃的混合物，优选主要(＞50％)为C4-C8烷烃或主要为C6至C10烷烃或主要为C6至C8烷烃的混合物。工业产品不是二氧化碳也不是水，但这些分子可与工业产品一起产生。工业产品可以在大气压/室温下为气体，或优选地为液体或固体(诸如生物炭)，或者工艺可产生气体组分、液体组分和固体组分(诸如一氧化碳、氢气、烷烃和生物炭)的组合，其随后可加以分离。在一个实施方案中，烃类产品主要为脂肪酸甲酯。在一个可供选择的实施方案中，烃类产品为脂肪酸甲酯之外的产品。
在工艺中可施加热，诸如通过热解、燃烧、气化或与酶消化(包括无氧消化、堆肥、发酵)一起。较低温度的气化在例如约700℃至约1000℃之间发生。更高温度的气化在例如约1200℃至约1600℃之间发生。较低温度的热解(缓慢热解)在约400℃下发生，而更高温度的热解在约500℃下发生。中温消化在约20℃与约40℃之间发生。高温消化在约50℃至约65℃发生。
化学手段包括但不限于催化裂化、无氧消化、发酵、堆肥和酯交换。在一个实施方案中，化学手段使用与热一起应用的催化剂或催化剂混合物。工艺可使用均相催化剂、非均相催化剂和/或酶催化剂。在一个实施方案中，催化剂为过渡金属催化剂、分子筛类型的催化剂、活化的氧化铝催化剂或作为催化剂的碳酸钠。催化剂包括酸催化剂，诸如硫酸，或碱催化剂，诸如氢氧化钾或氢氧化钠或其他氢氧化物。化学手段可包括脂质中脂肪酸的酯交换，该工艺可使用均相催化剂、非均相催化剂和/或酶催化剂。转化可以包括施加热且可以施加化学手段的热解，并且可以使用过渡金属催化剂、分子筛类型的催化剂、活化的氧化铝催化剂或作为催化剂的碳酸钠。
酶手段包括但不限于在例如无氧消化、发酵或堆肥中通过微生物消化，或通过重组酶蛋白消化。
生物燃料
如本文所用，术语“生物燃料”包括生物柴油和生物醇。生物柴油可由衍生自植物、藻类和真菌的油制成。生物醇由糖的发酵产生。该糖可以直接从植物(例如甘蔗)中提取、衍生自植物淀粉(例如玉米或小麦)或由纤维素(例如木材、叶子或茎干)制成。
生物燃料的生产成本目前比石油燃料高。除了加工成本之外，生物燃料作物还需要种植、施肥、应用杀虫剂和除草剂、收获和运输。本发明的植物、藻类和真菌可降低生物燃料的生产成本。
生产生物柴油的一般方法可见于例如Maher和Bressler(2006)，Maher和Bressler(2007)，Greenwell等人(2011)，Karmakar等人(2010)，Alonso等人(2010)，Lee和Mohamed(2010)，Liu等人(2010)，Gong和Jiang(2011)，Endalew等人(2011)以及Semwal等人(2011)。
生物柴油
生物柴油或烷基酯的生产是熟知的。有三种通过脂质产生酯的基本路线：1)通过醇进行脂质的碱催化酯交换反应；2)通过甲醇进行脂质的直接酸催化酯化反应；以及3)将脂质转化成脂肪酸，然后通过酸催化形成烷基酯。
可以使用制备脂肪酸烷基酯和甘油醚(其中使甘油上的一个、两个或三个羟基醚化)的任何方法。例如，可以例如通过以下方式制备脂肪酸：分别用酸或碱催化剂水解或皂化三甘油酯，或使用诸如脂肪酶或酯酶的酶。可通过使脂肪酸与醇在存在酸催化剂的情况下反应来制备脂肪酸烷基酯。也可通过使甘油三酯与醇在存在酸或碱催化剂的情况下反应来制备脂肪酸烷基酯。可例如通过使甘油与卤化烷在存在碱的情况下反应或与烯烃或醇在存在酸催化剂的情况下反应来制备甘油醚。
在一些优选的实施方案中，使脂质发生酯交换反应以产生甲基酯和甘油。在一些优选的实施方案中，使脂质与醇(诸如甲醇或乙醇)在存在催化剂(例如氢氧化钾或氢氧化钠)的情况下反应以产生烷基酯。烷基酯可用于生物柴油或与基于石油的燃料共混。
可将烷基酯与柴油燃料直接共混，或用水或其他水溶液洗涤以除去杂质(包括催化剂)，然后再共混。可能的是用碱中和酸催化剂。然而，该过程将产生盐。为避免发动机腐蚀，优选的是使燃料添加剂组合物中的盐浓度降至最低。可例如通过将组合物用水洗涤而将盐基本上从组合物中除去。
在另一个实施方案中，将组合物在洗涤后干燥，例如通过使组合物经过干燥剂，诸如硫酸钙。
在再一个实施方案中，通过使用为含有磺酸基团的树脂的聚合酸(诸如Dowex 50TM)，在不产生盐或不使用洗涤步骤的情况下获得中性燃料添加剂。在完成酯化和醚化反应后，通过过滤而容易地除去催化剂。
作为生物燃料来源的植物三酰基甘油
植物三酰基甘油生产生物燃料的用途在Durrett等人(2008)中进行了综述。简而言之，植物油主要由各种三酰基甘油(TAG)组成，三酰基甘油是由与甘油酯化的三条脂肪酸链(长度通常为18或16个碳)组成的分子。脂肪酰基链在化学上类似于构成存在于汽油和柴油中的分子主体的脂族烃。石油中的烃每个分子含有5至12个碳原子，并且在常规发动机中将这种挥发性燃料与空气混合并通过火花点燃。相比之下，柴油燃料组分通常每个分子具有10-15个碳原子，并通过在柴油机中获得的极高压缩而点燃。然而，大多数植物TAG所具有的粘度范围比常规柴油高得多：分别为17.3-32.9mm2s-1与1.9-4.1mm2s-1(ASTM D975；Knothe和Steidley，2005)。这种更高的粘度会导致在现代柴油机中不良的燃料雾化，从而产生源自燃烧不完全的问题，诸如碳沉积和焦化(Ryan等人，1984)。为解决这一问题，通过用伯醇(最常见的是甲醇)酯化而将TAG转化成粘度更低的脂肪酸酯。所得的燃料通常称为生物柴油并具有1.9至6.0mm2s-1的动态粘度范围(ASTM D6751)。存在于生物柴油中的脂肪酸甲酯(FAME)具有通过其高燃烧热所反映的高能量密度，其与常规柴油类似(即使不是更高)(Knothe，2005)。相似地，存在于生物柴油中的FAME的十六烷值(柴油点火性能的度量)超过常规柴油(Knothe，2005)。
植物油主要由五种常见的脂肪酸组成，即棕榈酸(16：0)、硬脂酸(18：0)、油酸(18：1)、亚油酸(18：2)和亚麻酸(18：3)，但根据特定的物质，更长或更短的脂肪酸也可以是主要的成分。这些脂肪酸在酰基链长度和双键数量方面彼此不同，从而导致不同的物理性质。因此，衍生自脂肪酸混合物的生物柴油的燃料性质取决于该组成。改变脂肪酸分布可因此改善生物柴油的燃料性质，诸如低温流动性、氧化稳定性和NOx排放。改变TAG的脂肪酸组成可降低植物油的粘度，无需进行化学改性，从而改善生物燃料的成本效益。
饲料
本发明的脂质/油在食品应用中具有优势，因为其具有极高的油酸含量和低水平的亚油酸(＜3.2％)与饱和脂肪酸(诸如棕榈酸)，以及几乎为零的亚麻酸水平。这为油提供高氧化稳定性，从而产生更少的酸败并使其成为需要加热的食品应用的理想之选，诸如油炸应用，例如用于炸薯条。该油具有高OSI(氧化稳定性指数)，这作为油可保持在110℃的时长来测量，诸如大于20或25小时，优选地大于30小时或大于50小时。相对于其他植物油而言，低水平的饱和脂肪酸提供健康益处，因为饱和脂肪酸已与对健康的有害作用相关。该油还具有几乎为零的反式脂肪酸含量，这在一些市场是可取的，因为反式脂肪酸也已与对心脏健康的负面影响或LDL胆固醇升高相关。此外，由于其极低水平的多不饱和脂肪酸，该油不需要氢化以降低PUFA的水平，而这种氢化会产生反式脂肪酸。该油还对降低肥胖和糖尿病的发生率或严重性有利。它们对食品应用也是理想的，因为它们只含有天然存在的脂肪酸(Scarth和Tang，2006)。
出于本发明的目的，“饲料”包括供人或动物消耗(包括供肠道和/或非肠道消耗)的任何食物或制剂，当进入体内时其：(1)起到滋养或增长组织或供能的作用，和/或(2)维持、恢复或支持足够的营养状况或代谢功能。本发明的饲料包括针对婴儿和/或幼儿的营养组合物。
本发明的饲料包含(例如)本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明方法的产物、或与合适载剂一起的组合物。术语“载剂”以其最广泛的含义使用以涵盖可以或可以不具有营养价值的任何组分。如本领域技术人员将会知道，载剂必须适用于(或以足够低的浓度用于)饲料，使得其对消耗饲料的生物不产生有害作用。
本发明的饲料包含通过使用本文所公开的方法、细胞或生物直接或间接产生的脂质。组合物可以为固体或液体形式。另外，组合物可以包含特定用途所需量的可食用大量营养素、维生素和/或矿物质。这些或其他成分的量将随组合物是旨在用于正常个体还是用于具有特殊需求的个体诸如患有代谢疾病等的个体而变化。
食品可通过将油与一种或多种其他成分混合以使得食品含有油来制备，或与一种或多种其他成分混合以制备食品添加剂，诸如沙拉酱或蛋黄酱。食品或食品添加剂可包含1重量％-10重量％或更多的油。可将油与其他植物油共混以提供最佳的组成或与固体脂肪或与棕榈油共混以提供半固体起酥。由油生产的食品或食品添加剂包括沙拉酱、蛋黄酱、人造黄油、面包、蛋糕、饼干(曲奇)、牛角面包、烘烤品、薄煎饼或松饼粉(pancake mixes)、奶油冻、冷冻甜食、非乳制食品。
无营养价值的合适载剂的实例包括但不限于诸如食用脂肪、碳水化合物和蛋白质的大量营养素。此类食用脂肪的实例包括但不限于椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑醋栗油、大豆油以及单甘油酯和二甘油酯。此类碳水化合物的实例包括但不限于葡萄糖、食用乳糖和水解淀粉。另外，可用于本发明的营养组合物的蛋白质的实例包括但不限于大豆蛋白、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清或这些蛋白质的水解产物。
关于维生素和矿物质，可将以下成分添加到本发明的饲料组合物中：钙、磷、钾、钠、氯化物、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和微生素A、E、D、C和B族。也可以添加其他此类维生素和矿物质。
用于本发明的饲料组合物的组分可以具有半纯化或纯化起源。所谓半纯化或纯化是指通过天然材料的纯化来制备的材料。
本发明的饲料组合物还可以添加到食物中，甚至在不需要膳食补充时。例如，可将该组合物添加到任何类型的食物中，包括但不限于人造黄油、改性黄油、奶酪、牛奶、酸奶、巧克力、糖果、小吃、色拉油、烹调用油、烹调用脂肪、肉类、鱼肉和饮料。
另外，根据本发明产生的脂质或经转化以包含和表达主题基因的宿主细胞也可用作动物食物补充剂以改变动物组织或牛奶脂肪酸组成或蛋脂肪酸组成以更适合人或动物消耗，或更利于动物健康和安乐。此类动物的实例包括羊、牛、马、家禽、宠物(诸如狗和猫)等。
此外，本发明的饲料可用于水产养殖以提高鱼中的脂肪酸水平供人或动物消耗。
本发明的优选饲料为可直接用作人或其他动物的食物或饲料的植物、种子和其他植物部分诸如叶子、果实和茎干。例如，动物可直接吃在田野中生长的此类植物或以控制摄食的方式喂养更加定量的量。
组合物
本发明还涵盖包含使用本发明的方法产生的一种或多种脂质或油的组合物，尤其是药物组合物。
药物组合物可包含与标准、熟知、无毒药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物诸如磷酸盐缓冲盐水、水、乙醇、多元醇、蔬菜油、润湿剂或乳剂诸如水/油乳剂相结合的一种或多种脂质。组合物可以为液体或固体形式。例如，组合物可以为片剂、胶囊、可摄取液体、粉末、外用膏剂或霜剂的形式。适当的流动性可(例如)通过就分散剂而言维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂而维持。还可能可取的是包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。除了此类惰性稀释剂外，组合物还可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂及助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。
混悬剂除了活性化合物外还可包含助悬剂，诸如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、琼脂和黄芪胶或这些物质的混合物。
固体剂型诸如片剂和胶囊剂可使用本领域熟知的技术制备。例如，根据本发明产生的脂质可和与粘合剂诸如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶，崩解剂诸如马铃薯淀粉或藻酸以及润滑剂诸如硬脂酸或硬脂酸镁相结合的常规片剂基质诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉一起压片。胶囊可通过将这些赋形剂与抗氧化剂和相关脂质一起装入明胶胶囊中来制备。
对于静脉内给药，根据本发明产生的脂质或其衍生物可掺入商业制剂中。
特定脂肪酸的典型剂量为0.1mg至20g，每天使用一至五次(每天最多100g)，并优选地在每天约10mg至约1、2、5或10g的范围内(以一个或多个剂量使用)。如本领域所已知，最低约300mg/天的脂肪酸是可取的。然而，应当理解任何量的脂肪酸将有益于受试者。
本发明的药物组合物的可能给药途径包括(例如)肠道和非肠道。例如，可经口给予液体制剂。另外，均匀混合物可完全分散于水中，在无菌条件下与生理上可接受的稀释剂、防腐剂、缓冲剂或推进剂配混以形成喷雾剂或吸入剂。
待施用于受试者的组合物的剂型可由本领域的普通技术人员决定，并取决于多种因素，诸如受试者的体重、年龄、总体健康状况、既往史、免疫状态等。
另外，本发明的组合物可用于美容目的。该组合物可加到现有美容组合物中使得形成混合物，或者可将根据本发明产生的脂肪酸用作美容组合物中唯一的“活性”成分。
实施例
实施例1.一般材料和方法
植物材料和生长条件
使红花植物(Carthamus tinctorius)基因型SU、S-317、S-517、LeSaf496、CW99-OL和Ciano-OL由种子在温室中的珍珠岩和沙壤土盆栽混土中在16小时(25℃)/8小时(22℃)的日/夜循环下生长。为高亚油酸品种的野生型品种SU得自NSW(新南威尔士)的HeffernanSeeds。PI 603208(LeSaf496，ATC 120562)和CW 99-OL(ATC 120561)的种子得自Australian Temperate Field Crops Collection。
在发芽后10天，从红花幼苗收获用于DNA和RNA提取的植物组织，包括叶子、根部、子叶和下胚轴。在开花第一天获取花序，在三个发育阶段即开花后(DPA)7天(早期)、15天(中期)和20天(后期)收获发育的胚胎。将样品立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃下直至执行DNA和RNA提取。
红花小花为管状的并主要为自花传粉的，其中异型杂交通常小于10％(Knowles 1969)。昆虫而非风可提高田间的异型杂交水平。未授粉的柱头可保持接受花粉数天。各头状花序(红花头)含有约15-30个瘦果。在开花后前15天中植物发育种子的种子质量快速增加。油含量在10-15DAP期间提高5至10倍，在约28DPA时达到最高水平(Hill和Knowles 1968)。红花种子和植物在开花后约5周在生理上成熟，当大部分叶子变成棕色并且在最晚开花的花头的苞片上只有一点绿色时即可收获种子。用手搓揉花头即可容易地收获种子。
脂质分析
从单粒种子分离脂质样品用于快速脂肪酸组成分析在植物成熟时收获后，将红花种子通过在37℃下储存3天而干燥，随后如果不立即分析则储存在室温下。将单粒种子或混合的种子在小滤纸之间压碎，如下所述通过GC方法分析浸入滤纸的挤出种子油样品的脂肪酸组成。
从发芽后的一半子叶分离总脂质
出于筛选目的，例如从转基因植物中筛选子代种子，使红花种子在培养皿中的湿滤纸上发芽1天。将子叶小心地从每粒发芽的种子移除以进行脂质分析。将每棵幼苗的其余部分转移到土壤中，所得的植物长至成熟，然后收获种子以保持转基因谱系。
使用索氏装置从种子提取油
对于种子油的定量提取，将收获的红花种子在105℃的烘箱中干燥过夜，然后在圆盘碾磨机(Puck Mill)中研磨1分钟。将研磨后的种子材料(约250克)收集到预先称重的套管中，然后称重，再进行油提取。在将一层棉绒加到粗粉的顶部后，在索氏提取装置中用溶剂(石油精40-60C)最初在70-80℃下提取油。然后将混合物回流过夜，其中每15-20分钟将溶剂虹吸到抽提烧瓶中。通过使用旋转蒸发仪在真空下蒸发掉溶剂而回收溶解的、提取的油。测量提取的油的重量，并测定油含量。为了测定提取的油的脂肪酸组成，将小的等分试样在氯仿中稀释，然后通过气相色谱分析。
从叶子材料分离总脂质
将叶子组织样品冷冻干燥，称重，然后从大约10mg干重的样品提取总脂质，如Bligh和Dyer(1959)所述。
脂质的分馏
当需要时，在预先涂布的硅胶板(Silica gel 60，Merck)上使用2相薄层色谱(TLC)系统从其他脂质组分中分离TAG馏分。将相当于10mg叶片组织干重的提取脂质样品在使用己烷/乙醚(98/2v/v)的第一相中进行色谱分离，然后在使用己烷/乙醚/乙酸(70/30/1v/v/v)的第二相中进行色谱分离。当需要时，在从相当于5mg叶片干重的样品中提取的脂质样品中，使用二维TLC(Silica gel 60，Merck)从非极性脂质分离极性脂质，其中将氯仿/甲醇/水(65/25/4v/v/v)用于第一方向，将氯仿/甲醇/NH4OH/乙基丙胺(130/70/10/1v/v/v/v)用于第二方向。将脂质斑点和在相同TLC板上运行的合适标准品通过短暂暴露于碘蒸气而显色，收集到小瓶中，然后转甲基化产生FAME以用于如下的GC分析。
脂肪酸甲酯(FAME)制备和气相色谱(GC)分析
对于通过GC进行的脂肪酸组成分析，将如上所述制备的提取脂质样品转移到玻璃管中，然后在2mL 1M的HCl的甲醇(Supelco)溶液中在80℃下进行3小时的转甲基化。在冷却到室温后，将1.3mL 0.9％NaCl和800μL己烷加入各管中，然后将FAME提取到己烷相中。为了测定脂肪酸组成，除了以下方面外，基本上如Zhou等人(2011)所述，通过配有30-m BPX70柱的Agilent Technologies 7890A气相色谱仪(GC)(Palo Alto，California，USA)分离FAME：升温程序变为150℃的初始温度，保持1min，以3℃/min升至210℃，然后以50℃/min升至240℃，最后保持2min。通过Agilent Technologies ChemStation软件(Rev B.03.01(317)，Palo Alto，California，USA)对峰进行定量。峰值响应类似于可信的Nu-Check GLC standard-411(Nu-Check Prep Inc，MN，USA)的脂肪酸，其含有等比例的31种不同的脂肪酸甲基酯，包括用于校准的18：1、18：0、20：0和22：0。每种脂肪酸在样品中的比例基于脂肪酸的单峰和总峰的面积进行计算。
通过气相色谱-质谱分析FAME
除了使用配有30-m BPX70柱的Shimadzu GC-MS QP2010 Plus外，如先前所述(Zhou等人，2011)进行了通过2，4-二甲基噁唑啉(DMOX)改性和GC-MS分析确认于FAME中的双键位置。将柱温编程为：150℃的初始温度维持1min，以5℃/min升至200℃，然后以10℃/min升至240℃保持5min。获取质谱，并通过GCMSsolution软件(Shimadzu，2.61版)处理。游离脂肪酸和FAME标准品购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。
通过LC-MS分析脂质物质
使成熟的每一粒种子在School of Botany，University of Melbourne接受使用LC-MS的脂质组学分析。如Bligh和Dyer(1959)所述提取总脂质，并溶于CHCl3。将一毫克脂质的等分试样用N2干燥，溶于1mL 10mM的丁基化羟基甲苯的丁醇∶甲醇(1∶1v/v)溶液，然后使用Agilent 1200系列液相色谱仪和6410B电喷雾电离三重四极杆LC-MS分析。将脂质用Ascentis Express RP-Amide柱(5cmx2.1mm，Supelco)和二元梯度以0.2mL/min的流速进行色谱分离。流动相为：A，10mM的甲酸铵的H2O∶甲醇∶四氢呋喃(50∶20∶30，v/v/v)溶液；B，10mM的甲酸铵的H2O∶甲醇∶四氢呋喃(5∶20∶75，v/v/v)溶液。通过使用25V碰撞能量和135V碎裂电压的多反应监测(MRM)分析了具有脂肪酸16：0、16：1、18：0、18：1、18：2、18：3的所选中性脂质(TAG和DAG)和磷酸胆碱(PC)。基于来自脂肪酸中性丢失的氨化前体离子和产物离子鉴定了各个MRM TAG和DAG。使用10uM三硬脂酸甘油酯外标对TAG和DAG定量。
油样品的甾醇含量的分析
将大约10mg油与外加的C24：0单醇等分试样(作为内标)的样品通过以下方式皂化：使用4mL 5％于80％MeOH中的KOH溶液，在80℃下在具有特氟龙内衬的螺旋盖玻璃管中加热2h。在将反应混合物冷却后，将2mL Milli-Q水加入，并通过振荡和涡旋将甾醇提取到2mL己烷∶二氯甲烷(4∶1v/v)中。将混合物离心，移除甾醇提取物，并用2mL Milli-Q水洗涤。然后在振荡并离心后移除甾醇提取物。使用氮气流蒸发提取物，并用200mL BSTFA且在80℃下加热2h将甾醇甲烷硅基化。
对于甾醇的GC/GC-MS分析，将甾醇-OTMSi衍生物在40℃的加热块上在氮气流下干燥，然后重新溶于氯仿或己烷，然后立即进行GC/GC-MS分析。使用配有Supelco EquityTM-1熔融石英毛细管柱(15mx0.1mm内径，0.1μm膜厚)、FID、分流/不分流进样器以及Agilent Technologies 7683B系列自动样品器和进样器的AgilentTechnologies 6890A GC(Palo Alto，California，USA)对甾醇-OTMS衍生物进行气相色谱(GC)分析。氦气为载气。在120℃的柱箱温度下以不分流模式进样。进样后，将柱箱温度以10℃min-1升至270℃，最后以5℃min-1升至300℃。通过Agilent Technologies ChemStation软件(Palo Alto，California，USA)对峰进行定量。GC结果存在各个组分面积±5％的误差。
在Finnigan Thermoquest GCQ GC-MS和Finnigan ThermoElectron Corporation GC-MS上进行了GC质谱(GC-MS)分析；两系统均配有柱上进样器和Thermoquest Xcalibur软件(Austin，Texas，USA)。每台GC均配有与上述相似极性的毛细管柱。使用质谱数据并将保留时间数据与可信的实验室标准品所得的那些数据进行比较而鉴定各个组分。与样品批次并行地进行了完全的程序性空白分析。
经由Iatroscan对TAG定量
将一微升各植物提取物上样到一个TLC-FID IatroscanTM的Chromarod-SII(Mitsubishi Chemical Medience Corporation-Japan)。然后将Chromarod支架转移到含有70ml己烷/CHCl3/2-丙醇/甲酸(85/10.716/0.567/0.0567v/v/v/v)溶剂体系的平衡展开槽中。在温育30min后，将Chromarod支架在100℃干燥3min，然后立即在IatroscanMK-6s TLC-FID分析仪(Mitsubishi Chemical Medience Corporation-Japan)上扫描。对DAGE内标和TAG的峰面积用SIC-480II积分软件(版本：7.0-E SIC System instruments Co.，LTD-Japan)进行积分。
TAG定量分两步进行。首先，在所有样品中扫描DAGE内标以校准提取收率，然后选择并稀释浓缩的TAG样品。接下来，根据使用甘油三亚油酸酯作为外标(Sigma-Aldrich)的外标校准法，通过第二次扫描对稀释样品中的TAG的量进行定量。
候选FAD2基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达
将含有候选FAD2cDNA的整个开放阅读框的DNA片段作为EcoRI片段从pGEMT-easy载体切下，并插入载体pENTR11(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的相应位点。然后使用克隆重组技术(Stratagene，La Jolla，CA，USA)将插入物克隆进目标表达载体pYES2-DEST52，以将开放阅读框置于GAL1启动子控制下以在酵母细胞中进行诱导型基因表达。所得质粒中的基因序列通过DNA测序进行验证。将所得的质粒和作为对照的不含任何cDNA插入物的pYES2-DEST52载体通过乙酸锂介导的转化引入酿酒酵母菌株YPH499的细胞。这些候选FAD2基因在给予或不给予外源性脂肪酸底物的情况下在酵母细胞中的表达基本上如Zhou等人(2006)在之前所述。各实验一式三份地进行。
以瞬时表达系统在植物细胞中表达基因
使用基本上如Voinnet等人(2003)和Wood等人(2009)所述的瞬时表达系统使基因在本氏烟烟叶细胞中表达。受CaMV 35S启动子控制的病毒沉默抑制蛋白P19的组成型表达的载体得自laboratory of PeterWaterhouse，CSIRO Plant Industry，Canberra，Australia。将嵌合二元载体35S：P19引入根癌农杆菌菌株AGL1。将含有待在植物细胞中从启动子(通常为35S启动子)表达的编码区的所有其他二元载体也引入根癌农杆菌菌株AGL1。根据二元载体上的选择性标记基因，使重组细胞在28℃下在5mL补充了50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素或80mg/L壮观霉素的LB肉汤中生长到静止期。使得自各培养物的细菌通过以3000x g在室温下离心5min而沉淀，然后重悬在1.0ml浸润缓冲液中，该缓冲液含有5mM MES(pH 5.7)、5mM MgSO4和100μM乙酰丁香酮。然后将重悬的细胞培养物在28℃下再振荡温育3小时。然后将各培养物在浸润缓冲液中的10倍稀释样与等体积的以相同方式稀释的35S：P19培养物混合，并且混合物浸润到完全展开的本氏烟烟叶的下侧。除非另外指明，否则包含待表达的基因的混合培养物包含农杆菌属中的35S：P19构建体。对照浸润仅包含农杆菌属中的35S：P19构建体。
将叶子用农杆菌属细胞混合物浸润，在浸润后通常使植物再生长五天，然后回收叶盘进行总脂质分离和脂肪酸分析。使本氏烟植物在生长室中在24℃恒温下生长，其中使用14/10小时的光/暗循环，光强度为约200勒克斯，并用‘Soft White’荧光直接照射在植物上。通常，将6周大的植物用于实验，并使几乎完全展开的真实叶子浸润。将所有未浸润的叶子在浸润后摘除以避免遮荫。
实时定量PCR(RT-qPCR)
使用BIORAD CFX96TM实时PCR检测系统和iQTMGreen Supermix(BioRad，Hercules，CA，USA)通过定量RT-PCR进行了基因表达分析。设计了长度为19-23个核苷酸并且解链温度(Tm)为约65℃的引物用于基因特异性扩增，该扩增将产生约100-200bp的扩增产物。PCR反应在96孔板中进行。所有RT-PCR反应均一式三份地进行。反应混合物含有1x iQTMGreen Supermix(BioRad，Hercules，CA，USA)、5μM正向和反向引物以及400ng cDNA，并以每孔10uL的体积使用。热循环条件为95℃3min，然后为95℃10s、60℃30s和68℃30s的40个循环。在以0.1℃/s从60℃到95℃的最终PCR步骤后，通过解链曲线分析监测PCR扩增的特异性。另外，还通过琼脂糖凝胶电泳检查了PCR产物的纯度，并通过测序加以确认。将组成型表达的基因KASII用作归一化表达水平的内源性参照。在法后将数据相对于相应的基因表达水平进行校准以进行相对定量(Schmittgen，2008)。将数据表示为在独立的96孔板上进行的三次反应的平均值±SD。
DNA分离和Southern印迹分析
将红花幼苗(基因型“SU”)的基因组DNA从完全展开的叶子用CTAB缓冲液并按照Paterson等人(1993)所述的方法分离。如先前所述(Liu等人，1999)使用CsCl梯度进行了进一步的纯化。将10μg红花基因组DNA的等分试样单独地用八种不同的限制酶消化，即AccI、BglII、BamHI、EcoRI、EcoRV、dIII、HindIII、XbaI和XhoI。将通过各种限制酶消化的基因组DNA通过1％琼脂糖凝胶进行电泳。将凝胶浸泡在0.5M NaOH、1.5M NaCl中30min，然后将DNA吸到Hybond-N+尼龙膜(Amersham，UK)上。将滤膜用对应于红花CtFAD2-6基因(作为CtFAD2基因家族的代表)的整个编码区的α-P32dCTP标记的DNA片段在低严格性杂交条件下探测。杂交在含有6x SSPE、10％Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/mL变性鲑精DNA的溶液中在65℃下过夜。在杂交后并在2x SSC/0.1％SDS中在50℃下短暂洗涤后，将滤膜在50℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤三次，每次20min，然后进行放射自显影。
红花和拟南芥的转化
将包含待用于转化拟南芥的基因的嵌合载体引入根癌红杆菌菌株AGL1中，将得自转化的农杆菌属的培养物的细胞用于处理拟南芥(Columbia生态型)植物，其中使用用于转化的花序浸渍法(Clough和Bent，1998)。使用转化的农杆菌属培养物如Belide等人(2011)所述产生了转化的红花植物。
实施例2.分离作为编码FAD2的候选物的红花cDNA
总RNA提取和cDNA合成
为了由红花产生cDNA，从100mg冷冻的红花组织(包括发育胚胎、叶子、根部和下胚轴)样品分离了总RNA。使用植物总RNA提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)根据供应商的方案单独地对各组织进行了此项工作。对制备物中的RNA浓度用NanoDropTM分光光度计ND 1000(Thermo Fisher Scientific，Victoria，Australia)进行了测定，并平衡了RNA浓度再进行分析。各制备物中的RNA的质量和相对量通过用含有甲醛的1％(w/v)琼脂糖凝胶进行凝胶电泳而可视化。将RNA制备物用RQ1不含RNA酶的DNA酶(Qiagen，Hilden，Germany)处理以除去污染性基因DNA。使用SuperScript III第一链合成系统(Qiagen，Hilden，Germany)根据制造商的说明用oligo(dT)20引物从400ng各种无DNA的RNA制备物合成了第一链cDNA。
从发育种子cDNA文库分离种子表达的FAD2cDNA
最初，通过筛选衍生自红花基因型“SU”(野生型，高亚油酸水平)的发育胚胎的cDNA文库获得了种子表达的红花FAD2cDNA。文库构建以从未成熟的不同发育阶段的胚胎混合物提取RNA开始，收获这些胚胎并在液氮中碾成粉末，并且RNA提取使用TRIzol根据制造商的说明(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行。使用Qiagen mRNA纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)分离了含有Poly(A)的RNA。
合成了第一链oligo(dT)引物引发的cDNA，并使用StratagenecDNA合成试剂盒根据制造商的说明转化成双链DNA(Stratagen，LaJolla，CA，USA)。将钝端cDNA用EcoRI衔接子连接，磷酰化，并通过在Chroma spin+TE-400柱(Clontech，CA，USA)中进行凝胶过滤而按大小分离。使用Stratagene Predigested Lambda ZAP II/EcoRI/CIAP克隆试剂盒，使重组cDNA在大肠杆菌(E.coli)菌株XL-1Blue MRF’中繁殖。
为了鉴定FAD2克隆，使用对应于拟南芥属FAD2(GenBank登录号L26296)的编码区的DNA片段根据先前所述的方案(Liu等人，1999)对文库进行筛选。通过连续两轮筛选而纯化阳性菌斑，将纯化的含有推定FAD2cDNA的噬菌粒如Stratagene λZAPII cDNA合成试剂盒说明手册中所述进行切割。通过NCBI Blast程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行了FAD2序列的序列分析。通过使用VectorNTI预测开放阅读框。从发育种子cDNA文库分离了两种不同的全长cDNA，并分别命名为CtFAD2-1和CtFAD2-2。
候选FAD2基因的EST的鉴定
为了鉴定另外的候选FAD2cDNA，对于编码与拟南芥属FAD2(GenBank登录号L26296)具有相似性的多肽的表达序列标签(EST)，使用程序BLASTp查询了红花的菊科植物基因组项目(Compositae Genome Project，CGP)表达序列标签(EST)数据库(cgpdb.ucdavis.edu/cgp db2.)。鉴定了至少十一种不同的FAD2cDNA序列重叠群，其中两种重叠群显示出与从红花种子cDNA文库分离的CtFAD2-1和CtFAD2-2相同的序列。此外，鉴定了九种不同的cDNA，并分别命名为CtFAD2-3至CtFAD2-11。
3’-和5’RACE
将9种重叠群(CtFAD2-3至CtFAD2-11)每一种的最长EST克隆选择为分离相应全长cDNA序列的起点。该方法使用3’-和5’-cDNA末端快速扩增(RACE)，其中使用从得自各种红花组织的RNA产生的cDNA，这些组织包括发育的胚胎、叶子、根部、下胚轴和花。从每个重叠群的最长EST克隆设计了基因特异性引物(GSP)。使用一步RT-PCR试剂盒根据制造商的说明(Bioline，London，UK)进行了3’-RACE。与在其3’端具有NotI位点的poly(dT)引物相结合，将基因特异性引物(GSP)用于每种所选EST的第一轮PCR扩增。使用与poly(dT)引物相结合的巢式GSP，对第一轮产物进行第二轮PCR。3’RACE的GSP在表2中列出。
通过5’RACE System试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行CtFAD2-6cDNA的5’端的克隆。使用基因特异性引物GSP1，5′-ACCTAACGACAGTCATGAACAAG-3′(SEQ ID NO：76)仅将CtFAD2-6mRNA转录成了cDNA。将巢式基因特异性引物GSP2，5′-GTGAGGAAAGCGGAGTGGACAAC-3′(SEQ ID NO：77)用于第一次PCR扩增。反应条件使用95℃下4min的热启动，然后添加聚合酶，进行94℃下45s的变性、55℃下1min的退火和72℃下2min的延伸的33个循环。
将扩增的3’和5’片段亚克隆进载体pGEM-Teasy，然后从两个方向测序。克隆片段的3’和5’末端与相应EST的序列比较显示出彼此匹配的重叠区，从而提供了每个基因的3’和5’序列并允许组装11种cDNA每一种的推定全长序列。
候选CtFAD2基因的全长cDNA序列的分离
为了分离九种CtFAD2基因的全长蛋白编码区，使用一步RT-PCR试剂盒用衍生自若干红花组织的总RNA扩增ORF，这些组织包括发育的胚胎、叶子、根部、下胚轴和花(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。用于扩增ORF的引物(表3)是基于位于每个cDNA的5’和3’UTR中的DNA序列。将扩增的PCR产物克隆到载体并通过DNA测序获得其核苷酸序列。
得自红花的候选FAD2序列的特性
11种cDNA的特性在表4中汇总，多肽的特性在表5中汇总。
编码多肽CtFAD2-1至CtFAD2-11的预测氨基酸序列共有较高的序列同一性，彼此之间的同一性为约44％至86％。它们显示出与拟南芥属FAD253％至62％的序列同一性。预测的多肽的大小在372至388个氨基酸的范围内，也就是说，它们的长度均为约380个残基。cDNA具有独特的5’和3’未翻译区(UTR)序列，因此内源性基因可容易地由其UTR序列识别。对得自红花基因组DNA的蛋白编码区的扩增产生了与11种基因的每一种的相应cDNA相同的DNA序列，从而表明不存在中断其蛋白编码区的内含子。
表2.用于红花中多种FAD2基因的3’RACE的寡核苷酸引物。
表3.用于扩增红花中的FAD2基因的整个编码区的寡核苷酸引物。
表4.得自红花的候选FAD2cDNA的特性。
表5.候选CtFAD2多肽的特性。
为了研究红花候选FAD2多肽与已知FAD2酶的关系，将11种推导的多肽序列与植物FAD2序列比对，并使用Vector NTI构建了邻接进化树(图1)。如图1所示，CtFAD2-1和CtFAD2-10的氨基酸序列首先与彼此最密切相关，然后与得自其他物种的种子表达的FAD2相关。CtFAD2-2与得自其他物种的组成型表达基因比与红花中的其他候选FAD2更密切相关。CtFAD2-3、-4、-5、-6和-7在邻接进化树中形成了新的分支，最可能是因为最近分化的基因在红花中变为多重化的进化结果。令人感兴趣的是，在与其他物种的亲缘关系中，与得自金盏花(Calendula officinalis)的功能相异FAD2轭合酶最密切相关。FAD2-11与得自若干植物物种的乙炔酶更密切相关，包括由真菌激发子诱导的红花vFAD2(Cahoon等人，2003)。似乎CtFAD2-8和-9比得自红花的其他候选FAD2差异更大。然而，该分析也表明，序列比较虽然给出一些关于可能的功能的提示，但是本身无法提供关于不同FAD2候选物的功能的可靠结论。因此，需要进行功能分析以作出关于各种基因/多肽的功能的结论。
序列比较表明，红花候选FAD2多肽与得自其他物种的已知FAD2酶共有约50％-60％的序列同一性和52％-65％的相似性。在红花CtFAD2基因之中DNA序列差异的程度反映它们的系统发育关系，因为CtFAD2-3、-4和-5彼此之间均比CtFAD2-1或CtFAD2-10相似，反之亦然。这些数值在氨基酸同一性矩阵中具有密切的相似之处(表6)。
表6.红花FAD2基因中的编码区DNA和推导氨基酸的序列同一性。
候选CtFAD2多肽的特性
11种候选CtFAD2的预测多肽各自在C端的最末端包含富含芳族氨基酸的基序。此类基序已在其他植物FAD2多肽中得到鉴定，并认为是维持ER中的定位所必需的(McCartney等人，2004)。与其他植物膜结合的脂肪酸去饱和酶一致，预测的CtFAD2多肽各自包含三个富含组氨酸的基序(组氨酸盒)。此类富含组氨酸的基序在FAD2酶中是高度保守的，并涉及用于生物化学分析的二铁-氧复合物的形成(Shanklin等人，1998)。在大多数候选CtFAD2多肽序列中，第一个组氨酸基序为HECGHH，但CtFAD2-5和-6例外，它们分别具有HDCGHH和HDLGHH。CtFAD2-8中的第一个组氨酸盒(HECGHQ)的最后一个氨基酸为Q而非H。发明人在55种已知的植物FAD2酶中寻找了该基序，并且H与Q取代也存在于来自Lesquerellalindheimeri的相异FAD2同源物中，该同源物主要具有脂肪酸羟化酶活性(Genbank登录号EF432246；Dauk等人，2007)。第二个组氨酸基序在若干候选红花FAD2(包括CtFAD2-1、-2、-8、-9和-10)中作为氨基酸序列HRRHH为高度保守的。值得注意的是，氨基酸N存在于CtFAD2-11中该基序的+3位，其也见于许多功能相异的FAD2型酶，包括高山还阳参CREP1、巴勒斯坦还阳参Cpal2和红花vFAD2(AY166773.1)、金盏花FAC2(AF343064.1)、黑心金光菊(Rudbeckiahirta)乙炔酶(AY166776.1)。在CtFAD2-3、-4、-5、-6和-7中该位置的氨基酸为S或T。
在CtFAD2-1、-2、-9和-10多肽的每一者中，就在第一个组氨酸盒之前的氨基酸为丙氨酸，与其他植物脂肪酸Δ12-去饱和酶的相同。非丙氨酸的氨基酸缬氨酸(V)在CtFAD2-5中存在于该位置，而其他六种CtFAD2多肽在该位置具有甘氨酸。Cahoon等人(2003)提出，在该位置甘氨酸取代丙氨酸已存在于功能相异的FAD2酶中，但不包括脂肪酸Δ12-羟化酶。如在以下实施例中所述，测试候选物功能的后续异源表达实验表明，CtFAD2-1、-2和-10多肽的每一者均为油酸Δ12-去饱和酶，而CtFAD2-9表现出对棕榈油酸(C16：1)而非油酸的去饱和酶特异性。
应注意，在11种候选CtFAD2中，只有CtFAD2-11多肽在第三个组氨酸盒的-5至-2位置中具有DVTH序列，这与提出的存在于所有植物乙炔酶中的(D/N)VX(H/N)基序一致(Blacklock等人，2010)。就在CtFAD2-1、-2和-10多肽的第三个组氨酸盒之后的五个氨基酸为LFSTM，与其他已知植物FAD2油酸去饱和酶的相同。相比之下，CtFAD2-9(棕榈油酸特异性脂肪酸去饱和酶)在该位置具有LFSYI基序，在+4和+5位置具有两个氨基酸取代。在CtFAD2-3、-4和-5多肽中，+3位置处的S被P取代，其也仅存在于其他FAD2脂肪酸轭合酶中，包括得自金盏花(FAC2，登录号AAK26632)和栝楼(Trichosanthes kirilowii)(登录号AAO37751)的那些酶。
已表明，大豆FAD2-1酶的丝氨酸-185在种子发育期间磷酰化，作为其酶活性的调控机理(Tang等人，2005)。在11种候选CtFAD2多肽之中，仅CtFAD2-1在相对于大豆FAD2-1的相应位置具有丝氨酸(丝氨酸-181)。可以得出结论，相同的翻译后调控机理可能在红花种子发育和通过丝氨酸-185磷酰化而蓄积油的过程中发挥作用，从而在发育的种子中调节微粒体Δ12油酸去饱和。
实施例3.分离FAD2候选物的基因组序列
分离候选CtFAD2基因的5’UTR内含子
FAD2基因的内含子-外显子结构在许多开花植物中是保守的。迄今研究的所有FAD2基因都只含有一个位于5’UTR的内含子，一个例外是大豆FAD2-1，其内含子位于就在第一个ATG之后的编码区(翻译起始密码子)中(Liu等人，2001；Kim等人，2006；Mroczka等人，2010)。内含子序列差异可用作在分类学上密切相关的物种之间的进化距离的量度(Liu等人，2001)。
为了分离位于候选CtFAD2基因的5’-UTR中的可能内含子的DNA序列，在每个CtFAD2cDNA序列的5’UTR中预测了典型的内含子剪接位点(AG：GT)，并基于预测的剪接位点的侧翼序列设计了PCR引物。引物在表7中列出。将从红花基因型SU中分离的基因组DNA用作PCR反应中的模板，以扩增对应于5’UTR的基因组区域。在50μL反应物中进行了扩增，该反应物具有100ng基因组DNA、20pmol各引物和由制造商提供的Hotstar(Qiagen，Hilden，Germany)。使用Kyratec supercycler SC200(Kyratec，Queensland，Australia)如下进行PCR温度循环：94℃15min一个循环，94℃30s、55℃1min、72℃2min共35个循环；72℃10min。将PCR产物克隆进pGEM-TEasy中，然后测序。
发明人能够从11种候选CtFAD2基因中的8种获得预测的5’内含子，即CtFAD2-1、-2、-3、-4、-5、-7、-10和-11。这些内含子的主要特征在表8中给出。未从CtFAD2-6、-8和-9成功扩增内含子，这可能是由于内含子所处的5’UTR的长度不够。似乎未报道内含子较少的FAD2，但从核基因的内含子损失已常常在高等植物中观察到(Loguercio等人，1998；Small等人，2000a；b)。
表7.用于在红花中扩增候选FAD2基因的5’UTR区的寡核苷酸引物。
在八种基因每一种中的内含子序列位于每种基因的5’-UTR内，在推定翻译起始密码子(每个开放阅读框中的第一个ATG)上游的11至38bp范围内的位置。内含子长度在104bp(CtFAD2-11)至3,090bp(CtFAD2-2)的范围内(表8)。对于CtFAD2-1，内含子大小为1,144bp，在大小上类似于在得自拟南芥属(The Arabidopsis InformationResource，http：//www.arabidopsis.org)、棉花(Liu等人，2001)和芝麻(Sesamum indicum)(Kim等人，2006)的FAD2基因中鉴定的内含子。在推定的剪接位点的二核苷酸AG和GT在所有八种研究的CtFAD2基因中均是保守的，但相反的是，内含子序列在序列上全然不同，在它们之间无任何明显的同源性。内含子均为富A/T的，其中A/T含量在61％与75％之间，这与得自双子叶植物的许多其他内含子序列一致。在得自其他双子叶植物的基因中，拟南芥属FAD2基因具有位于其ATG翻译起始密码子上游刚好5bp的1,134-bp内含子。棉花属(Gossypium)FAD2-1基因的5’-UTR内含子的大小为1,133bp，位于翻译起始密码子上游9bp。相比之下，棉花属FAD2-4和FAD2-3基因具有分别为2,780bp和2,967bp的更大的5’-UTR内含子，其位于翻译起始密码子上游12bp。各候选CtFAD2基因可通过每个基因中5’-UTR内含子的位置和大小的差异加以区分。这些差异在提供基因的差异表达方面也可能具有重要意义。已报道，此类内含子对报告基因在芝麻中的表达具有积极作用(Kim等人，2006)。已表明，相应的内含子是FAD2在大豆中的转录后基因沉默的有效靶标(Mroczka等人，2010)。
已知的是，内含子可对基因表达谱具有显著的影响。通过PLACE程序(www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析内含子序列鉴定了多个推定的顺式调控元件。例如，通常存在于种子特异性启动子中的一些基序(诸如ABRE和SEF4)位于种子特异性CtFAD2-1中。通常存在于由各种应急诸如创伤或激发子处理所诱导的防御相关基因的启动子中的AG基序位于在红花小苗的下胚轴和子叶中特异性表达的CtFAD2-3。
实施例4.候选红花FAD2基因的Southern印迹杂交分析
通过Southern印迹杂交分析研究了红花中FAD2-样基因家族的复杂性。低严格性杂交分析表明，在红花中，FAD2由复杂的多基因家族编码(图2)。通过对使用各种限制酶裂解基因组DNA片段所得的杂交片段计数，据估计，在红花中存在10种以上的FAD2或FAD2-样基因。在不同片段的杂交强度中所见的差异据推测与所用探针DNA的序列同一性相对水平相关。红花是二倍体物种，并认为具有单个野生先驱种巴勒斯坦红花(C. palaestinus)(Chapman和Burke，2007)。发明人推断，红花中异常巨大的FAD2基因家族可能衍生自一些古老的基因复制，从而导致该基因家族不同成员的特化和差异活性。
实施例5.酵母和植物细胞中候选基因的功能性分析
候选CtFAD2基因在酵母中的表达-功能分析
作为一种便利的宿主细胞，酿酒酵母已用于研究若干植物FAD2Δ12油酸脂肪酸去饱和酶的功能性表达(Covello和Reed 1996；Dyer等人，2002；Hernández等人，2005)。酿酒酵母具有相对简单的脂肪酸分布，并且在其可用作FAD2酶底物的磷脂中含有丰富的油酸。它还不含内源性FAD2活性。因此，使用衍生自pYES2的构建体在酵母菌株YPH499中测试了11种候选CtFAD2基因，每个开放阅读框均处于GAL1启动子的控制下，如实施例1中所述。
如图3所示，当对含有“空载体”pYES2的酵母细胞的脂肪酸组成进行分析时，未检测到亚油酸(18：2)或十六碳二烯酸(16：2)，这与预期一致，因为酵母不含内源性FAD2。相比之下，得自表达CtFAD2-1、CtFAD2-2和CtFAD2-10开放阅读框的酵母细胞的脂肪酸的气相色谱均显示出保留时间为11.293min的脂肪酸峰，其对应于亚油酸(C18：2)，并且CtFAD2-9和CtFAD2-10的气相色谱显示出保留时间为8.513min的脂肪酸峰，其对应于C16：2。这些数据表明CtFAD2-1、CtFAD2-2和CtFAD2-10能够将油酸转化成亚油酸，并因此为Δ12油酸去饱和酶。然而，所产生的18：2的水平低于用作阳性对照的拟南芥属AtFAD2构建体。
CtFAD2-10分别使用油酸(C18：1)和棕榈油酸(C16：1)作为底物产生了亚油酸(C18：2)和十六碳二烯酸(C16：2)，而CtFAD2-9使棕榈油酸去饱和，因此为Δ12棕榈油酸去饱和酶。出现在得自表达CtFAD2-11的酵母细胞的FAME色谱图中的两个新的小峰通过其吡咯烷加合物和DMOX的GC-MS而鉴定为亚油酸(18：2Δ9(Z)，12(Z))及其反式异构体(18：2Δ9(Z)，12(E))(图3H)。表9汇总了表达CtFAD2编码区的酵母细胞的脂肪酸组成。在表达CtFAD2-3、-4、-5、-6、-7和-8的酵母细胞中未检出新的峰。
为了研究任何候选CtFAD2多肽是否具有脂肪酸羟化酶活性，使由表达每个CtFAD2开放阅读框的酵母细胞制备的FAME与甲硅烷基化试剂反应，该试剂将羟基残基转化成TMS-醚衍生物，通过该衍生物可研究质谱。然而，在表达候选CtFAD2开放阅读框的任何酵母细胞系中均未检出常见脂肪酸诸如油酸的羟基衍生物。这表明11种CtFAD2基因均未编码在酵母中具有脂肪酸羟化酶活性的多肽。
通过以下方式开展了另外的实验以检测Δ12-表氧化酶和Δ12-乙炔酶(两者均使用亚油酸作为脂肪酸底物)活性：将相同酵母细胞系的生长培养基补充游离亚油酸，然后分析脂肪酸组成。在向培养物添加半乳糖后进行了该补充，以表达构建体。在气相色谱中未检测到新的脂肪酸峰，包括代表环氧和炔脂肪酸衍生物的那些峰。这些新型脂肪酸在酵母中通过补充外源性游离脂肪酸而进行的异源表达在展示活性方面遇到了一些困难(Lee等人，1998；Cahoon等人，2003)。因此，如下进行了植物细胞中的功能分析。
候选CtFAD2基因在本氏烟中的瞬时表达
为了在植物细胞中、尤其是在植物叶子中以组成型方式表达基因，将每个CtFAD2 ORF以有义方向插入修饰的pORE04二元载体在增强的CaMV-35S启动子与含有多聚腺苷酸化信号序列(Coutu等人，2007)(SEQ ID NO：54)的nos3’终止子之间。之前的研究表明，转基因的表达可通过病毒沉默抑制蛋白P19的共抑制而显著增强，以降低在基于本氏烟叶子的瞬时测定中的宿主转基因沉默(Voinnet等人，2003；Wood等人，2009；Petrie等人，2010)。这些实验如实施例1中所述而进行。
如上所述，CtFAD2-11的功能最初通过在酿酒酵母中表达而评估，并通过GC-MS鉴定了两种新型脂肪酸，分别为18：2Δ9(Z)，12(Z)和18：2Δ9(Z)，12(E)。与得自酵母的结果一致，CtFAD2-11在本氏烟烟叶中的表达得到了新型18：2反式异构体。该异构体的甲基酯显示出与甲基18：2Δ9(Z)，12(E)相同的GC保留时间(图4B)。该新型18：2Δ9(Z)，12(E)占瞬时表达CtFAD2-11后的叶子中脂肪酸的0.35％(表10)。此外，检测到了未在酵母培养物中观察到的另一新的峰。该新的脂肪酸的总离子色谱图和质谱与还阳参油酸(18：2Δ9(Z)，12(c))一致(图4B和C)，从而表明CtFAD2-11多肽具有Δ12-乙炔酶活性。如表10所示，还阳参油酸占总脂肪酸的0.51％。
据观察，CtFAD2-11在本氏烟细胞中的瞬时表达导致了18：2Δ9(Z)，12(Z)的含量相对于未转化的对照降低(表10)。这可能是由于CtFAD2-11与内源性顺式-Δ12油酸去饱和酶在本氏烟细胞中竞争可用的油酸库，而油酸正是这两种酶的底物。总之，得自酵母和本氏烟表达实验的结果表明CtFAD2-11主要作为缺乏立体特异性的油酸Δ12-去饱和酶发挥作用，从而同时产生亚油酸及其反式-Δ12异构体。此外，其还可以进一步使亚油酸的Δ12双键去饱和，以形成还阳参油酸的炔键。
也以相同的方式使其他十种候选CtFAD2多肽在本氏烟烟叶中瞬时表达，但我们未观察到未内源性存在于本氏烟烟叶中的任何新的脂肪酸，而本氏烟烟叶已具有高水平的FAD2。
讨论
在红花中鉴定的上述11种候选CtFAD2基因代表了在迄今已进行研究的任何植物物种中观察到的最大FAD2基因家族。虽然在拟南芥属中只鉴定了单个FAD2基因(Okuley等人，1994)，但是FAD2在迄今所研究的大多数其他植物基因组中似乎由多种基因编码。已在大豆(Heppard等人，1996)、亚麻(Fofana等人，2004；Khadake等人，2009)和橄榄(Hernanze等人，2005)中描述了两种不同的FAD2基因；在红花(Martinez-Rivas等人，2001)和亚麻荠(Kang等人，2011)中描述了三种基因；以及在棉花中描述了五种基因(Liu等人，1998)。在双四倍体(amphitetraploid)物种甘蓝型油菜中，已在每个二倍体亚基因组中鉴定了4-6种不同的FAD2基因(Scheffler等人，1997)。所有的候选CtFAD2基因均在红花植物中表达，因为序列从cDNA分离而得。如实施例6中所述对此进行了进一步的研究。
虽然缺乏比较研究，但明显的是，红花对于FAD2基因家族进化是不寻常的。红花是一种自花传粉二倍体植物物种，其与野生二倍体物种巴勒斯坦红花最密切相关，并且还不清楚具有大量的基因组复制或重排(Chapman和Burke，2007)。已鉴定的多种FAD2cDNA不能归因于可变剪接，因为候选FAD2基因在编码区序列中不含内含子。相反，基因复制更可能负责形成红花中的FAD2家族复杂性。系统发育树的拓扑结构表明基因复制可能已在若干层级发生。例如，CtFAD2-3、_4和-5多肽在该进化枝中与其他多肽比它们与其他红花FAD2序列更密切相关，从而表明最近的基因复制可能负责该进化枝的出现。
实施例6.FAD2候选基因在红花中的表达水平
FAD2基因在不同组织中的表达谱
为了确定各种候选CtFAD2基因的组织表达模式，如实施例1中所述进行了RT-PCR分析。从衍生自高油酸基因型SU的10DAG的红花幼苗的子叶、下胚轴、根部和叶子组织以及从开花植物的花组织和发育配体提取了总RNA，并用于测定。用于分析的寡核苷酸引物在表11中列出。
11种CtFAD2基因的时间和空间表达模式在图5中示出。RT-qPCR测定表明CtFAD2-1仅在发育的种子中表达。相比之下，CtFAD2-2以低水平在种子中以及所研究的其他组织中表达。另外，在发育胚胎中未观察到CtFAD2-4、-5、-6、-7、-8、-9的表达。在发育种子中观察到了低但可检测的CtFAD2-10和-11表达水平，在红花种子接近成熟时的后期发育阶段更是如此。CtFAD2-4、-6、-7、-9和-11均在包括子叶和下胚轴的小苗组织中显示出高表达水平。CtFAD2-5和-8似乎为根特异性的，而CtFAD2-10优先在花组织中表达，在所研究的各种其他组织中检测到相对低的水平，包括发育的种子和十天大的幼苗组织。
在采用总RNA模板但无逆转录酶的对照反应中在40个扩增循环后未检测到扩增产物，从而表明在RNA制备物中不存在污染性基因组DNA。
实施例7.展示红花谱系S317中的基因突变
存在于从印度引进的红花中的在红花中最早鉴定出的高油酸性状受单个基因座OL处称为ol的部分隐性等位基因的控制(Knowles和Hill，1964)。olol基因型的油酸含量对于温室生长的植物而言通常为71-75％(Knowles，1989)。Knowles(1968)将ol等位基因并入红花育种程序，并在1966年在美国发布了第一个高油酸(HO)红花品种“UC-1”，随后发布了改良的品种“Oleic Leed”和Saffola系列，包括Saffola 317(S-317)、S-517和S-518。高油酸(olol)基因型在不同的温度下相对稳定(Bartholomew，1971)。此外，Knowles(1972)还描述了在相同基因座的不同等位基因ol1，其在纯合条件下产生了35％至50％的油酸。与olol基因型形成鲜明的对比，ol1ol1基因型显示出对温度的强烈响应(Knowles，1972)。
已报道了另外的具有更高油酸含量(＞85％)的种质(Fernandez-Martinez等人，1993；Bergman等人，2006)。红花中高达89％的油酸含量由Fernandez-Martinez等人(1993)在最初源于孟加拉国的种质登录号P1401472中予以了报道。由Bergman等人(2006)开发的Montola系列含有高于80％的油酸，明显超过含有olol等位基因的“UC-1”品种中的最高油酸水平，如Knowles和Hill(1964)所述。通过杂交和分离进行遗传分析，高油酸和极高油酸的谱系表明这两种谱系在OL基因座共有相同的等位基因。极高油酸含量(85％)通过ol等位基因和对油酸具有轻微积极影响的修饰基因的组合而产生(Hamdan等人，2009)。
高油酸突变型谱系S-317的体外生物化学表征
由中期成熟阶段(大约在开花后(DPA)15天)的高油酸基因型S-317的发育种子现制红花微粒体，如Stymne和Appelqvist(1978)所述。标准90μL反应混合物在pH7.2的0.1mmol磷酸钾缓冲液中含有40μg微粒体蛋白、2nmol[14C]油酰辅酶A。然后，将10μL 50mMNADH加入，并继续再温育5、10或20min。通过添加90μL 0.15M乙酸而终止反应，然后用500μL CHCl3∶MeOH(1∶1)提取脂质。回收下面的CHCl3相，通过薄层色谱(TLC)使用溶剂体系CHCl3/MeOH/HAc/H20(90∶15∶10∶3v/v/v/v)从其分离极性脂质。将对应于PC的斑点从板上刮下，在2ml 2％硫酸的MeOH溶液中在90℃下将相关的脂肪酰基转甲基化30min。将所得的FAME在AgNO3处理过的TLC板上用己烷∶DEE∶HAc(85∶15∶1v/v/v)分离。将14C标记的油酸和亚油酸甲酯标准品点在板上作为参照。将板曝光并通过FujifilmFLA-5000磷相仪分析。对各样品的放射性通过Fujifilm Multi Gauge软件定量。
在向具有野生型微粒体的反应物中添加NADH后，据观察，添加的[14C]油酰辅酶A在10min内快速消失，同时出现[14C]亚油酸，从而表明在野生型红花微粒体中油酸有效转化成了亚油酸。相比之下，对于高油酸基因型S-317而言，在体外反应的整个反应进程中发现了明显更高的[14C]油酸与[14C]亚油酸比率(表12)，从而表明经由微粒体对油酸的去饱和而生物合成亚油酸在该基因型中大大减少。
表12.在红花微粒体中衍生自C18：1的C18：2产物的百分比。
n＝2
高油酸等位基因ol的分子表征
为了理解红花中高油酸基因型(olol)的分子基础，将两种种子表达的FAD2cDNA即CtFAD2-1和CtFAD2-2通过PCR从三种高油酸品种S-317、LeSaf496和CW99-OL扩增，然后测序。来自所有三种高油酸品种的覆盖CtFAD2-1基因的整个编码区的cDNA在核苷酸序列上彼此相同，并与衍生自野生型品种SU的CtFAD2-1cDNA共有约98％的序列同一性，包括相对于野生型在HO基因型中的一个核苷酸缺失和22个核苷酸取代。在从第一个ATG计的核苷酸606处(大约在CtFAD2-1编码区的中间)发现了单个碱基对缺失。该缺失导致了在缺失后立即形成终止密码子的翻译阅读框的偏移，使得在三个olol品种中的突变基因编码预测的、截短的多肽，该多肽不具有存在于野生型蛋白中的第三个组氨酸盒(图6)。值得注意的是，在ol等位基因的缺失的单个核苷酸位点附近的DNA序列中存在相对高水平的序列变化，从而表明在突变基因中蓄积了另外的突变。
还从olol突变型S-317中分离了包含CtFAD2-1和CtFAD2-2的5’UTR内含子的DNA区域，并与野生型内含子进行了比较。得自S-317的CtFAD2-1内含子为1144bp长，比为1083bp长的野生型SU内含子长61bp。CtFAD2-1内含子的核苷酸序列的比较显示出76.8％的总体序列同一性，内含子的差异在于27个插入缺失和95个单核苷酸取代(图7)。
令人感兴趣的是，在突变基因中的核苷酸取代未在对应于缺陷型CtFAD2-1的编码区的1142bp长区域中均匀分布，因为22个置换中的14个(63.6％)存在于核苷酸缺失附近，大部分在单核苷酸缺失正下游的123bp内。相比之下，野生型和突变基因型中的CtFAD2-2内含子共有99.5％的总体序列同一性，只有12个核苷酸取代和一个2-nt插入缺失。这表明，一些选择压力存在于HO突变体的缺陷型CtFAD2-1基因中，或者更可能的是，CtFAD2-1突变具有远古起源并可能源自诸如巴勒斯坦红花的红花先驱种。
衍生自商业高油酸品种S-518的EMS突变体(S-901)已在US5,912,416进行了描述。虽然遗传研究表明，在该新的基因型中所谓的ol2等位基因不同于OL基因座中的ol和ol1等位基因，但Weisker(US 5,912,416)未确定其分子性质。S-901基因型的特征在于在成熟种子中油酸水平增加到总脂肪酸的89.5-91.5％。存在饱和脂肪酸的减少，即棕榈酸降至约4％，硬脂酸降至约2.5％。然而，S-901未显示出正常的植物表型，并遭受一定的生长和产量降低。在形态学上其更短，并且花头与其亲本谱系S-518相比更小。其开花时间也更晚，种子中所含的油更少。
设计用于高油酸育种的完美PCR标记物
作为跟踪突变ol等位基因的高效分子标记物的分子基础，开发了在突变CtFAD2-1等位基因中的单核苷酸缺失-序列多态性(可以得出结论是负责HO表型的成因性突变)。发明人因此开发了分子标记物测定法，该测定法允许鉴定和选择用于育种目的或品种鉴定目的的突变ol等位基因，甚至当其以杂合状态存在时。分子标记物辅助选择因而无需再产生另外一代必须筛选脂肪酸表型的植物。与完美分子标记物测定法相结合的简单遗传学将使得红花育种者可能将高油酸性状快速纳入其育种计划。
似乎在野生型SU与高油酸基因型S-317之间在CtFAD2-1外显子中的序列变化不足以容易地生成基于PCR反应的差异标记物。然而，发明人可利用OL与ol等位基因之间在CtFAD2-1的5’UTR内含子中相对高的序列差异。在这两个等位基因之间存在高变序列段，其使得能够设计独特的PCR引物。设计了以下示例性引物以从携带olol突变等位基因(但不在野生型SU中)的高油酸基因型扩增特定的315bp长的产物。HO-有义：5’-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3’(SEQID NO：140)；和HO-反义：5’-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3’(SEQ ID NO：141)(图7)。产生603bp PCR产物的对品种SU中的野生型基因而言为特异性的另一对示例性引物如下：HL-有义：5’-AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3’(SEQ ID NO：142)，和HL-反义：5’-TTGCTATACATATTGAAGGCACT-3’(SEQ ID NO：143)(图7)。将衍生自红花KASII基因的一对引物用作阳性对照以确保模板DNA相等的上样和良好的PCR性能：ctkasII-有义：5’-CTGAACTGCAATTATCTAGG-3’(SEQ ID NO：144)和ctkasII-反义：5’-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3′(SEQ ID NO：145)。
PCR反应条件为94℃下2min，然后为94℃下30s、58℃下30s和72℃下30s的40个循环。通过电泳在1％琼脂糖凝胶上分离反应产物，并在对凝胶进行溴化乙锭染色后在紫外光下显色。在扩增反应中针对所研究的所有五种高油酸基因型(即S-317、S-517、CW99-OL、LeSaf496和Ciano-OL)均观察到了约300bp的片段，而这样的片段对于野生型基因型SU而言则不存在。反之，约600bp的片段存在于野生型红花SU的扩增中，但不存在于所测试的任何高油酸品种中。作为阳性对照，针对所有测试的谱系，使衍生自KASII基因的198bp条带在反应中扩增。通过DNA测序对扩增子的种类进行了确认。
在高油酸与野生型红花等位基因之间的在CtFAD2-1基因的5’UTR内含子区域中的序列差异因此有利于开发诊断CtFAD2-1突变存在与否的PCR标记物。其完全连接到ol等位基因而不论遗传背景如何，也就是说，其为完美连接的标记物。然而，该分子标记物是显性标记物，因此单独使用该标记物无法区分ol等位基因的纯合与杂合基因型。为了解决这一问题，设计了另一对PCR引物，其只扩增野生型Ol等位基因。因此，与高油酸特异性PCR引物相结合使用此类野生型特异性引物允许在CtFAD2-1基因座区分纯合与杂合基因型。
CtFAD2-1表达在高油酸基因型中剧烈降低
在以上章节中，已表明，CtFAD2-1仅在发育种子的发育胚胎中表达，而不能在所研究的各种其他组织中检出，包括来源于红花小苗的叶子、根部、花、子叶和下胚轴。CtFAD2-1在发育种子中高表达，在其中脂肪酸代谢速率较高，并导致在相对短的时期内蓄积主要具有C18：2的活性油。CtFAD2-1在种子发育的大约中点处具有其最高表达水平，在种子发育的早期和后期阶段均具有更温和的表达水平。
使用RT-qPCR测定方法，在三种高油酸品种(即S-317、Lesaff496和CW99-OL)中测量了CtFAD2-1基因的归一化基因表达水平，并与野生型基因型SU的发育种子中的表达水平进行了比较。如在图8中可以看出，CtFAD2-1表达在野生型红花基因型SU中在胚胎发育的所有三个阶段均检出，其中在中期成熟阶段观察到了最高的表达水平，与之前的结果一致并确认了该关键FAD2基因的时间转录模式。然而，CtFAD2-1转录物在三个高油酸品种S-317、Lesaff496和CW99-OL中几乎无法检出(图8)，从而表明来自该基因的RNA转录物在突变胚胎中的高度不稳定性。
相比之下，来自CtFAD2-2的转录物的水平对于野生型和高油酸基因型而言相似，从而表明CtFAD2-2表达在HO胚胎中不受影响，并且表明RNA制备物的纯度适用于测定。因此，可以得出结论，CtFAD2-2表达也可有助于发育红花种子中贮藏脂质的脂肪酸的Δ12-去饱和，但水平比野生型种子中的CtFAD2-1低得多，以及涉及根部、叶子和茎干中膜脂质的脂肪酸的Δ12-去饱和。无证据表明CtFAD2-2表达响应于以下方面或作为以下方面的补偿而在高油酸突变体中升高：CtFAD2-1活性在CtFAD2-1突变体的发育红花种子中的损失。
在HO谱系中大大减少的CtFAD2-1转录物由无义介导的RNA降 解(NMD)导致。
在HO胚胎中大大降低的CtFAD2-1转录物水平可能由CtFAD2-1mRNA的无义介导的mRNA降解(NMD)导致，因为提前终止密码子存在于就在单核苷酸缺失之后的编码区的中间。NMD系统被视为在包含因意外错误(诸如基因组突变、转录错误和错剪接)产生的提前终止密码子(PTC)的异常mRNA的降解中所涉及的机理。它是一种普遍存在于真核细胞中的机理，尤其是其已在酵母和哺乳动物中得到了广泛的研究。其在高等植物中的研究相当少，但有一些报道，包括大豆Kunitz trypsin抑制基因(Kti3)、得自菜豆的植物凝集素基因(PHA)(Jofuku等人，1989；Voelker等人，1990)、豌豆铁氧还蛋白基因(FED1)(Dickey等人，1994)和水稻蜡质基因(Isshiki等人，2001)。
在这些实验中已表明，导致红花种子油中高油酸性状的ol突变与在发育种子中低水平的CtFAD2-1mRNA蓄积相关。之间的研究表明，ol等位基因是半隐性的，这与小RNA介导的转录后基因沉默机理不符。基因沉默涉及由得自反义或发夹RNA转录的双链RNA产生的21至24nt siRNA，并且在遗传学上可充当显性或半显性基因座(Brodersen和Voinnet，2006)。为了确认ol突变机理不同于RNAi相关的基因沉默，我们如下进行了小RNA测序。
使用从中等成熟的发育胚胎分离的混合RNA，生成了衍生自高油酸基因型S-317和野生型SU的两个小RNA文库。通过Solexa技术进行了小RNA文库的大量测序(bulk sequencing)(Hafner等人，2008)。这两个文库的测序在Illumina的Solexa测序仪上进行，并且样品以并行方式运行。SU和S-317小RNA文库的测序分别生成了总共23,160,261和21,696,852个原始读取结果。对这些读取结果的分析导致分别鉴定出长度在18至30个核苷酸(nt)范围内的22,860,098和21,427,392个序列。测定了SU和S-317文库中对应于CtFAD2-1的小RNA的存在和分布。从两个小RNA文库中仅检出了较低、几乎不可检测的对应于CtFAD2-1的小RNA水平，它们几乎在CtFAD2-1基因的编码区上均匀地分布。在野生型与高油酸文库之间无明显的差异。
从该数据中可以得出结论，小RNA介导的转录后基因沉默不是防止突变CtFAD2-1转录物蓄积所依赖的主要机理。
本氏烟烟叶中的瞬时表达研究
为了进一步研究NMD现象，发明人对衍生自野生型和高油酸基因型的CtFAD2-1在本氏烟烟叶中的瞬时表达开展了实验。
将每一个CtFAD2-1ORF以有义取向插入处于CaMV-35S启动子控制下的修饰的pORE04二元载体。将具有35S：CtFAD2-1或其突变形式35S：CtFAD2-1Δ的根癌农杆菌菌株AGL1与35S：P19一起浸润到完全展开的本氏烟烟叶的下侧，如实施例5中所述。在24℃下为期5天的进一步生长后，将浸润区切下，并使用RNeasy小量提取试剂盒(Qiagen)从样品获得总RNA。为了测量CtFAD2-1RNA水平，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)一式三份地进行了实时qPCR测定，并在ABI 7900HT序列检测系统上运行，如实施例1中所述。PCR在以下条件下进行：最初48℃30min，然后95℃10min，再是95℃15s和60℃60s的40个循环。用于外源性CtFAD2-1基因的引物为：有义：5’-GTGTATGTCTGCCTCCGAGA-3’(SEQ ID NO：146)；反义：5’-GCAAGGTAGTAGAGGACGAAG-3’(SEQ ID NO：147)。将参考基因红花CtKASII用于归一化表达水平；其特异性引物为：有义：5’-CTGAACTGCAATTATCTAGG-3’(SEQ IDNO：144)，和反义：5’-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3’(SEQ ID NO：145)。从衍生自野生型SU品种的35S-CtFAD2-1基因，在本氏烟烟叶中观察到了高水平的CtFAD2-1表达。相比之下，对于衍生自高油酸基因型的35S-CtFAD2-1Δ基因，观察到了低得多的表达水平。
根据Clough和Bent(1998)的方法将拟南芥属生态型Col-0植物用根癌农杆菌菌株AGL1转化，该菌株携带有具有驱动CtFAD2-1或CtFAD2-1Δ编码区的种子特异性启动子Fp1的二元载体。使用RNeasy小量提取试剂盒(Qiagen)从所得转化植物的子代的含有中等成熟阶段胚胎的长角果中分离了总RNA。通过如上所述一式三份执行的实时RT-qPCR测定法，使用RNA制备物进行了基因表达研究。在表达衍生自SU的Fp1-CtFAD2-1的拟南芥长角果中观察到了高水平的CtFAD2-1表达，然而，衍生自高油酸基因型的Fp1-CtFAD2-1Δ的表达相比之下则大大降低。
已证实，与得自野生型基因的小RNA相比，CtFAD2-1特异性小RNA在发育的高油酸红花种子中未以明显更高的水平产生，即使突变CtFAD2-1转录物的量大大降低。因此可以得出结论，在高油酸基因型中CtFAD2-1RNA的降低是由于NMD，其与小RNA介导的转录后基因沉默机理不同。NMD现象也在该突变编码区在本氏烟烟叶或拟南芥长角果中外源性表达时观察到。
实施例8.分离作为编码FATB的候选物的红花cDNA
红花FATB cDNA序列的分离
红花种子油含有大约7％的棕榈酸。该脂肪酸在发育的种子细胞的质粒中合成，其从质粒中输出到细胞的胞质液以并入三酰基甘油。棕榈酸输出的关键酶是棕榈酰-ACP硫酯酶，其水解棕榈酰部分与在质粒中合成时酰基共价键合到其上的酰基载体蛋白(ACP)之间的硫酯键。棕榈酰-ACP硫酯酶属于一组称为FATB的可溶性质粒靶向酶。在种子油植物中，该酶显示出对作为底物的短链饱和酰基-ACP的特异性。最初从蓄积中等链长度的饱和脂肪酸(诸如加利福利亚月桂树(Umbellularia californica)中的月桂酸(C12：0))的植物物种中分离了编码FATB酶的基因。后续研究证实了FATB直系同源物存在于所有植物组织中，主要在种子中，其中底物特异性在C8：0-ACP到C18：0-ACP的范围内。在拟南芥属和大多数温带油料种子作物(包括红花)中，棕榈酸是种子油中的主要饱和脂肪酸。
为了分离编码FATB的候选物的红花cDNA，如实施例1中所述，使用由得自棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))的FATB cDNA片段组成的异源探针对发育红花种子的cDNA文库进行了筛选。从红花种子cDNA文库分离了一个名为CtFATB-T12的全长cDNA。该cDNA含有长度为1029个核苷酸的开放阅读框，其编码343个氨基酸的多肽。其5’和3’UTR分别为236nt和336nt长。据预测，CtFATB-T12多肽具有预测的约60个氨基酸的转运肽和210个氨基酸残基的芯，该芯含有两个螺旋重复和所谓的热狗折叠蛋白共有的多链片层折叠。
从红花的菊科植物基因组项目(CGP)表达序列标签(EST)数据库(cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2)，鉴定了与CtFATB-T12具有同源性的三种不同的EST，即EL379517、EL389827和EL396749。每一种均为部分长度。将相应的基因分别命名为CtFATB-A、CtFATB-B和CtFATB-C。从红花种子cDNA文库分离的全长cDNA CtFATB-T12在核苷酸序列上与得自CtFATB-C的EST在其重叠区中相同。似乎CtFATB-A在其核苷酸序列上与其他两种CtFATB序列相比差异更大。
通过实时qPCR分析CtFATB基因的表达谱
如实施例1中所述，通过实时qPCR研究了三种CtFATB基因的基因表达谱。设计了对应于三种基因每一个的独特区的寡核苷酸引物，包括：CtFATB-A，有义引物：5’-AGAGATCATTGGAGACTAGAGTG-3’(SEQ ID NO：148)，反义引物：5’-CCCATCAAGCACAATTCTTCTTAG-3’(SEQ ID NO：149)；CtFATB-B，有义引物：5’-CTACACAATCGGACTCTGGTGCT-3’(SEQ ID NO：150)，反义引物：5’-GCCATCCATGACACCTATTCTA-3’(SEQ ID NO：151)；CtFATB-C，有义引物：5’-CCTCACTCTGGGACCAAGAAAT-3’(SEQ ID NO：152)，反义引物：5’-TTCTTGGGACATGTGACGTAGAA-3’(SEQ ID NO：153)。如实施例1中所述一式三份地进行PCR反应。
如图9所示，CtFATB-A在叶子、根部以及在研究的所有三个阶段的发育胚胎中均显示出低表达水平。CtFATB-B在叶子和根部具有活性，但显示出在发育胚胎中的表达水平低于在叶子和根部中的表达水平。这表明，该基因在发育种子的脂肪酸生物合成中可能仅发挥次要的作用(如果有的话)。相比之下，CtFATB-C在研究的所有组织中均展示出高表达水平，尤其是在发育胚胎中。这表明CtFATB-C是编码FATB以在红花种子油中产生棕榈酸的关键基因。这与我们从种子胚胎文库仅回收一种FATB cDNA一致，即在序列上与CtFATB-C相同的CtFATB-T12。基于这些数据，选择了衍生自CtFATB-T12(CtFATB-C)的大约300bp的DNA片段作为用于制备hpRNA构建体以在红花种子中下调FATB的基因序列，如以下实施例中所述。
实施例9：编码FAD6的红花cDNA的分离和表达
红花FAD6cDNA序列的分离
存在于微粒体和叶绿体膜脂质以及种子贮藏油中的不同脂肪酸组成是复杂代谢网络的结果，该网络的作用是通过调节脂肪酸生物合成以及通过所谓的原核和真核途径的流量而控制该组成。显然的是，微粒体FAD2酶在油酸从质粒输出后在ER中将油酸转化成亚油酸以及在细胞质中转化成CoA酯中发挥着重要作用。叶绿体ω-6去饱和酶(FAD6)是对所有含16：1-或18：1-的叶绿体膜脂质使16：1和18：1脂肪酸分别去饱和成16：2和18：2的酶，这些脂质包括磷脂酰甘油、单半乳糖基二酰基甘油、二半乳糖基二酰基甘油和磺酸基异鼠李糖基二脂酰基甘油。据报道，拟南芥属fad6突变体在对所有叶绿体脂质使16：1和18：1分别去饱和成16：2和18：2中为缺陷型的(Browse等人，1989)。当fad6突变体在低温(5℃)下生长时，叶子变成褪绿的，并且生长速率相对于野生型明显降低(Hugly和Somerville，1992)。编码FAD6的cDNA序列最初从拟南芥属中由Falcone等人(1994)进行了分离。从那时起，已从包括甘蓝型油菜、马齿苋、大豆和蓖麻的若干植物物种中分离了编码FAD6的cDNA以及FAD6基因。
为了从红花中分离编码叶绿体ω6去饱和酶(由FAD6基因编码)的cDNA克隆，在CPG数据库中搜索了同源序列。鉴定了八种EST序列，即EL378905、EL380564、EL383438、EL385474、EL389341、EL392036、EL393518、EL411275，并组装成808nt的单个重叠群序列。该序列具有完整的5’末端，但在3’-末端不完整。随后使用从红花(SU)发育种子制备的λcDNA文库提取的DNA作为模板通过3’RACE PCR扩增得到了全长cDNA。PCR条件如实施例2中所述。将单个寡核苷酸引物(命名为ctFAD6-s2)与M13正向引物相结合用于扩增反应，因为该正向引物的序列存在于cDNA文库的载体中。ctFAD6-s2引物的序列为：5’-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG-3’(SEQ ID NO：154)。获得了1545bp的cDNA，其具有1305bp的开放阅读框，该开放阅读框编码435个氨基酸的候选FAD6多肽。该多肽与其他克隆的植物FAD6多肽共有60-74％的氨基酸序列同一性。通过Vector NTI生成了显示红花FAD6序列与在高等植物中鉴定的代表性FAD6质体Δ12去饱和酶之间的系统发育关系的系统树图(图10)。
通过实时qPCR分析CtFAD6的表达谱
通过实时RT-qPCR研究了CtFAD6的表达谱，该实时RT-qPCR使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)进行并在ABI 7900HT序列检测系统上以默认参数运行，如实施例1中所述。所用的引物为：ctFAD6-S2：5’-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG-3’(SEQ ID NO：155)和ctFAD6-a2：5’-GTTCCAACAATATCTTCCACCAGT-3’(SEQ ID NO：156)。在含有以下物质的10μL总体积中一式三份地进行反应：20ng总RNA模板、800mM各种引物、0.25μL逆转录酶和5μL一步RT-PCR主混合物试剂。RT和扩增条件为：48℃30min，然后95℃10min，再是95℃15s和60℃60s的40个循环。将参考基因红花CtkasII的表达用于归一化FAD6表达水平。如实施例1中所述进行计算。
分析表明，CtFAD6在叶子、根部和三个连续阶段的发育胚胎中以相对低的水平表达。在发育种子中观察到的低表达水平与以下见解一致：FAD6可能在种子中使油酸去饱和方面具有相对次要的作用。
实施例10.在红花中使脂肪酸生物合成基因沉默的基因构建体 的设计和制备
发夹RNA(hpRNA)是一类已广泛用于降低植物中的基因表达的RNA分子。发夹RNA通常在植物细胞中从DNA构建体转录，该构建体含有衍生自待沉默的基因的序列的反向重复。hpRNA转录物因而具有互补的有义和反义序列，它们杂交形成通过环状序列连接的双链RNA(dsRNA)区域。此类dsRNA结构在植物细胞中由内源性沉默机制加工以形成约21至24个核苷酸的小RNA分子，其在序列上对应于待降低活性的基因。这些小RNA可与特异性沉默所关注基因的内源性蛋白形成复合体。此类沉默可在由靶基因的一部分的DNA甲基化所介导的转录水平上发生，通过靶mRNA的降解在转录后水平上发生，或通过结合到mRNA以抑制其翻译，从而减少该基因编码的蛋白合成。当hpRNA包含在基因家族成员之间共有的序列时，hpRNA可沉默具有该序列的那些基因中的每一个。
红花具有大的FAD2基因家族，其中至少11个成员如本文所述得到了鉴定(实施例2至6)。红花还具有多个编码FATB多肽的基因，其中至少三个成员得到了鉴定(实施例8)，以及具有至少一个FAD6基因(实施例9)。实际上，上述实验可能并未鉴定出红花基因家族的所有成员。为了确定FAD2和FATB基因家族的哪些成员涉及存在于红花种子油中的亚油酸或饱和脂肪酸(尤其是棕榈酸)的生物合成，并且确定FAD6是否也有涉及，制备了若干基因构建体以在红花种子中表达hpRNA分子，从而沉默FAD2、FATB和FAD6基因的各种组合。对这些hpRNA构建体的每一个进行设计，以在油合成期间在发育红花种子中特异性表达。这通过使用外来启动子或从红花中分离的启动子以表达构建体而完成，这些启动子通过植物转化引入红花。
pCW600的构建
使用拟南芥属Olesoin1基因(TAIR网站基因注释At4g25140)(SEQ ID NO：52)的启动子设计了植物二元表达载体以在种子中表达转基因。分离的启动子的长度为1192bp，其始于登录号NC003075.7中的核苷酸12899298，但在1198bp序列内，省略了6bp以避免共同的限制性消化序列从而有助于随后的克隆步骤。AtOleosin启动子之前以用于在红花和芸苔物种中以强、种子特异性方式表达转基因(Nykiforuk等人，1995；Vanrooijen和Moloney，1995)。该启动子可能是双向启动子，从而指导连接到启动子片段两个末端的编码区的强种子特异性表达。拟南芥属油体蛋白启动子与甘蓝型油菜油体蛋白启动子共有某些特征，特性是具有双功能性(Sadanandom等人，1996)。以化学方式合成了该启动子，克隆进pGEMT-Easy，将含有EcoRI片段的启动子经由Klenow片段酶填补反应钝化，然后连接到pCW265的Klenow钝化HindIII位点(Belide等人，2011)，从而产生pCW600(AtOleosinP：：empty)。该载体具有编码潮霉素磷酸转移酶(HPT)的选择性标记基因，从而允许在转化过程中在组织培养中选择潮霉素耐性。该载体还包含35S：：GFP基因，该基因允许在紫外光照射下通过荧光选择转化的细胞或组织。通过插入AtOleosin启动子，设计了载体以表达所关注的编码区，该编码区可插入位于启动子下游和nos多聚腺苷酸化信号(nos3’)上游的多克隆位点。该载体用作下述构建体pCW602和pCW603的骨架载体。
pXZP410的构建
将亚麻核丝启动子(US 7,642,346)(SEQ ID NO：53)作为NotI-XhoI片段插入二元载体pT7-HELLSGATE12(Wesley等人，2001)，从而产生Gateway沉默二元载体pXZP410。载体pXZP410具有在组织培养期间赋予卡那霉素抗性并允许在核丝启动子控制下进行发夹RNA构建体的种子特异性表达的选择性标记基因。载体具有两个内含子，一个相对于启动子处于有义取向，另一个处于反义取向；并具有位于内含子侧翼的AttL1和AttL2重组位点。
为了从pXZP410制备沉默构建体，将得自待沉默的Gateway入门载体中的靶基因的序列的两个拷贝插入载体，一个插入两个内含子的5’另一个插入3’，彼此成反向取向以形成反向重复。通过使用Gateway重组酶克隆系统(Invitrogen，Carlsbad，USA)，重组位点容易地使得可插入两个拷贝，如先前所述(Wesley等人，2001)。该载体pXZP410用作如下所述产生pCW631和pCW632的骨架载体。
pCW571的构建
化学合成了与红花基因CtFATB-3中对应于CtFATB-3cDNA的核苷酸485-784的区域相同的300bp序列(SEQ ID NO：50)，然后根据制造商的说明插入pENTR/D topo(Invitrogen)，从而生成命名为pCW569的Gateway入门克隆。合成了对应于核苷酸427-1182的CtFAD2-2的cDNA的756bp片段(SEQ ID NO：49)，并通过RT-PCR从分离自发育红花种子的RNA扩增。引物分别为D28-PstI-5(5’-CCTGCAGGTACCAATGGCTCGACGACACTG-3’)(SEQ ID NO：157)和D28-AscI-3(5’-CGGCGCGCCTTCACCTCCTCATCTTTATCC-3’)(SEQ ID NO：158)。引物包含5’PstI和3’AscI限制酶位点，从而允许将扩增的片段插入pCW569的相应位点，从而生成pCW570。该载体含有来自CtFATB和CtFAD2-2基因的融合区域，作为侧翼为重组位点AttL1和AttL2的1080bp片段。然后使用LR克隆酶根据供应商的说明(Invitrogen，Carlsbad，USA)将该FATB-FAD2-2片段的两个拷贝插入pXZP410，第二个拷贝相对于第一个反向。所得的质粒pCW571具有亚麻核丝启动子以按种子特异性方式转录反向重复区域，以便产生hpRNA以降低CtFATB和CtFAD2-2基因在种子中的表达。
pCW603的构建
将得自含有CtFATB-CtFAD2-2片段(具有两个居间内含子)的反向重复的pCW571的DNA片段用SpeI切出，用DNA聚合酶的KlenowI片段钝化，再连接到pCW600的EcoRV位点中，从而生成pCW603。该构建体pCW603能够在红花种子中在AtOleosin启动子控制下表达hpRNA，以降低CtFATB和CtFAD2-2表达。
pCW581的构建
化学合成了590bp的DNA片段(SEQ ID NO：51)并插入pENTR/D topo，从而生成pCW579，该DNA片段由290bp的CtFAD6片段(对应于CtFAD6的cDNA的核苷酸451至750)和300bp的CtFATB片段(与pCW571一样)构成。将780bp的CtFAD2-2片段(如上文针对pCW570所述)克隆进pCW579的AscI位点，从而生成pCW580。该构建体为含有得自CtFATB、CtFAD6和CtFAD2-2基因的序列的入门克隆载体，这些基因以该顺序连接作为具有侧翼重组位点AttL1和AttL2的1370bp的DNA片段。然后使用LR克隆酶将该FATB-FAD6-FAD2-2片段的两个拷贝作为反向重复插入pXZP410，从而生成pCW581。该构建体pCW581为具有可操作地连接到反向重复的亚麻核丝启动子的二元载体，其在发育的红花种子中转录时能够表达hpRNA而降低CtFATB、CtFAD6和CtFAD2-2基因的表达。
pCW602的构建
将含有连接的CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2区域(具有两个居间内含子)的反向重复的DNA片段用Not1以酶法从pCW571切出，用Klenow I片段钝化，然后连接到pCW600的EcoRV位点中，从而生成pCW602。pCW602具有处于AtOleosin启动子控制下的CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2序列，相比之下，pCW581除了核丝启动子外具有相同的设计和基因片段。
pCW631和pCW632的构建
虽然核丝启动子可用于在种子中表达hpRNA，但是pCW571和pCW581均具有赋予卡那霉素抗性的选择性标记。在初步红花转化实验中，我们观察到外植体不足以受到卡那霉素的影响。因此，将pCW571和pCW581的卡那霉素抗性盒用作为选择性标记基因的潮霉素抗性盒替代。通过SpeI-AvrII限制性消化将由enCUP启动子：潮霉素：nos3’多聚腺苷酸化区域构成的潮霉素抗性基因从pCW265切出，并用于替代pCW571和pCW581中的卡那霉素抗性盒，从而分别生成pCW631和632。
总之，用于该第一组红花转化的构建体含有以下主要元件：
将这些构建体引入农杆菌属菌株AGL1并用于如实施例1中所述转化红花，结果如下。
实施例11.用基因沉默构建体转化红花
使用农杆菌属介导的方法将基因构建体用于转化红花品种S317的切下的子叶和下胚轴，其中使用嫁接法通过再生芽的补救而进行(Belide等人，2011)。对于载体pCW603而言，在非转化根砧上生长的超过30棵独立的转化芽(下文称为T0植物)得以再生，并如实施例1中所述长至成熟。如Belide等人(2011)所述，使用T-DNA载体特异性引物通过PCR检查了在T0红花接穗中的T-DNA整合。将据发现缺乏用于特定转化的T-DNA的大部分植物丢弃，这可能是在组织培养的再生期间从潮霉素选择中“逃逸”。然而，将一些保持为“无效”植物或阴性对照以与转化的植物进行比较。将这些对照植物在与组织培养、嫁接和温室条件中的转化材料相同的条件下处理。
实施例12.转基因红花的种子油的脂肪酸组成分析
如下对得自转化的红花植物的单独T1种子进行脂肪酸分析。使在S317遗传背景中用pCW603转化的30棵独立T0植物在温室中生长，自花受精以产生种子。如实施例1中所述使用GC分析对多达10粒得自各T0植物的单个种球的成熟种子分析了脂质组成。得自用pCW603转化的红花S317的种子的脂肪酸组成分析结果在表13中汇总。由于预计各转化的T0红花植物对于T-DNA而言是杂合的并因此产生T1种子的分离群，因此预计对得自各植物的5-10粒种子的分析将包括一些无效(分离)种子。此类无效的分离种子在该实验中是良好的阴性对照，因为它们已经在与得自相同植物的转化种子相同的种球内生长和发育。如从表13中的数据中可以看出，在30个生成的谱系中的6个独立谱系(谱系9、12、14、20、34和36)中观察到了高于87％(作为总脂肪酸含量的重量％)的油酸水平。许多转化的种子具有在87-91.7％范围内的油酸含量，而亚油酸水平为2.15至5.9％，棕榈酸水平为2.32-3.45％。种子中其他脂肪酸的水平与未转化的对照明显不同。与在非转化S317对照种子和无效分离种子中的约77％相比，在用pCW603转化的T1红花种子中观察到的最大油酸含量为91.7％。值得注意的是，在16：0的水平上，种子脂质也明显减少，从4.5％降到低至2.3％。如在TLC板上纯化的种子油的TAG馏分的脂肪酸分布与从种子油提取的总脂质的脂肪酸分布无明显不同。
考虑到种子油中最重要的脂肪酸，基于红花种子的总脂肪酸组成计算了两个指标。它们是油酸去饱和比例(ODP)和棕榈酸+亚油酸与油酸比例(PLO)。对各种子计算这两个指标，数据在表13中示出。野生型种子(S317，未转化的)和无效分离子具有约0.1500的ODP比率和约0.2830的PLO值。用得自pCW603的T-DNA转化的种子表现出了ODP和PLO值的明显减小。从6个独立事件产生的13粒种子具有小于0.1的PLO值和小于0.06的ODP。一个转化的谱系具有0.0229的ODP和0.0514的PLO。
使一个精选谱系(用pCW603转化S317)、谱系9和未转化的亲本S317的成熟单粒种子接受LC-MS脂质组学分析。这些分析清楚地表明，得自用AtOleosinp：CtFATB-CtFAD2-2RNAi发夹构建体转化的种子的油明显改变了TAG和DAG组成(图11和12)。在TAG(54：3)水平上存在明显的升高，而TAG(54：5)则降低，它们分别主要为18：1/18：1/18：1-TAG(三油酸甘油酯)和18：1/18：2/18：2-TAG。在通过LC-MS分析的种子之中，TAG中的三油酸甘油酯(＝54：3)含量对于得自RNAi沉默谱系的种子而言在最高的油酸水平(＞90％，表14)下高达64.6％(mol％)，相比之下，未转化的(S-317)亲本具有47％至53％范围内的三油酸甘油酯水平。丰度第二高的含油酸的TAG为18：0/18：1/18：1，然后是18：1/18：1/18：2。这些红花油之间最清楚的差异也可在DAG脂质分类中观察到。DAG(36：1)水平与亲本种子相比在得自转化种子的种子油中加倍，而DAG(36：4)的降低高达10％。DAG(36.1)主要是18：0/18：1-DAG，而DAG(36：4)是18：2/18：2-DAG(二亚油酸)。种子脂质中的DAG是唯一的次要组分，因为总TAG的水平为约总DAG的100倍(表15)。
转基因植物的生长和形态
含有得自pCW603的T-DNA的T0红花转化体生成了T-DNA发生分离的T1种子，从而产生一组纯合子、半合子和无效分离子。这些亚群的比率取决于T0植物中T-DNA插入事件的数量和联系，如根据Mendelian genetics所预期的。因此，单独地分析了得自各T0植物的T1种子。对各粒种子的脂质分布分析清楚地表明，单个种球同时含有无效和转基因事件。
*按以下惯例标记的样品：TS603.12(5)表示用载体pCW603转化的植物、事件12、种子5。标记为“无效”的样品通过PCR分析作为植物转化中的未转化逃逸而确定。
**按(16：0+18：2)/18：1计算的PLO指标
***按(18：2+18：3)/(18：1+18：2+18：3)计算的ODP指标
表14.单粒种子总脂质的脂肪酸组成(总脂肪酸的％)。
表15.相对TAG和DAG量。
使得自一些转基因谱系的种子在受控的条件(温度、土壤、最佳浇水和施肥，但在自然光照下)下在温室中生长，以观察植物形态和生长速率。在转化的T1植物与其无效分离同科之间未观察到表型差异。转化的种子以与未转化的种子相同的速率发芽并产生了具有相同的早期幼苗生长速率(活力)的幼苗。所有播下的种子均存活并长成完全可育株。从T1世代的各棵植物的真实叶子的顶端制备DNA，并进行了PCR分析以确定无效与转基因植物的比率。正如预期，鉴定出了无效分离子。
该表型分析表明，用pCW603的T-DNA转化并表达转基因的红花植物与无效分离子相比未遭受任何有害影响。
测试了T2世代的红花种子的油组成。使得自具有高油酸水平的若干植物的种子(表13)长成成熟的植物，从而产生第二代种子(T2种子)。当成熟时收获这些种子并分析其油的脂肪酸组成。数据在表16中给出。虽然T1种子显示出高达92％的油酸，但T2种子达到了94.6％的油酸。相对于T1世代观察到的T2世代的增加可能是由于转基因的纯合性，或只是由于分析的谱系的高数量。
将Southern印迹杂交分析用于测定各转化谱系中T-DNA插入的数量，并选择具有单个T-DNA插入的谱系。T2种子的油含量与相同遗传背景并在相同条件下生长的对照、未转化种子中的油含量无明显不同。
对用得自pCW631的T-DNA转化的红花种子的分析
对用pCW631转化的红花品种S-317的T1种子相似地分析了其脂肪酸组成。表17显示了这些种子的数据以及ODP和PLO指标。这些种子的脂质中的油酸含量高达94.19％。具有最高油酸水平的种子TS631-01 T1(21)的棕榈酸含量为2.43％，ODP为0.0203而PLO为0.0423。这些分析表明，在转化进S-317遗传背景的红花时，在pCW631中的发夹RNA构建体通常产生了比pCW603中的构建体更高的油酸水平。这一观察结果表明，用于pCW631的核丝启动子相对于用于pCW603的AtOleosin启动子更强地或以更好的表达时间或这两者的组合表达了发夹RNA。
通过GC分析了用得自pCW631的T-DNA转化的红花品种S-317的T2种子。观察到了高达94.95％的油酸水平，而ODP为0.01，PLO为0.035。
以与用pCW603和pCW631转化的种子和植物相同的方式分析了用得自构建体pCW632和pCW602的T-DNA转化的红花种子和植物。用pCW632转化的红花品种S-317的T1种子的GC分析显示出高达94.88％的油酸水平，而ODP为0.0102，PLO为0.0362。其T2种子显示出高达93.14％的油酸，而ODP为0.0164，PLO为0.0452。
更大体积的红花种子油的提取
收获得自命名为TS603-22.6的纯合转基因谱系的T4种子，使用索氏装置如实施例1中所述提取了总种子油。通过GC分析了提取的油的等分试样(表18)。回收了总共643克油。将提取物2、3、5和6混合，而将提取物4、7和8以单独的批次混合。通过GC进一步分析混合物的脂肪酸组成。数据在表18中示出。
实施例13.另外的基因沉默构建体的设计和制备
基于实施例10-12中所述的结果，如下制备了其他基因沉默构建体以提高红花种子油的油酸含量并降低ODP或PLO比率。这些基因沉默构建体包括合并来自非红花来源以及红花来源的不同启动子，以实现红花FAD2-2、FATB-3和FAD6基因表达的最大降低，并且除了FAD2-2外进一步沉默不止一种FAD2基因。这些构建体用于转化具有失活形式的内源性CtFAD2-1基因的红花品种，诸如S-317、Ciano-OL和Lesaff496。
pCW700的构建
该植物二元表达载体具有两个不同但在红花种子中表达模式重叠的外来(非红花)启动子，而不是一个启动子，以产生发夹RNA而降低内源性CtFATB和CtFAD2-2的表达。这两个启动子为AtOleosin启动子和亚麻核丝启动子，并且两个hpRNA表达盒位于相同的T-DNA分子中。该载体通过得自pCW631(具有核丝启动子以及沉默CtFAD2-2和CtFATB的hpRNA编码区)的hpRNA基因表达盒的限制性消化而构建，并将其插入pCW603的T-DNA，从而生成针对这两种红花基因编码发夹RNA的构建体。该构建体用于转化红花品种，诸如Lesaff496、Ciano-OL和S-317。
pCW701-pCW710的构建
使用DNA测序技术分离了预计在红花种子中具有最佳活性的衍生自红花的启动子，该技术提供所表达基因上游和下游的DNA区域的准确序列信息。如实施例2至6中所述的之前结果已表明，CtFAD2-1基因在红花种子发育期间高表达。因此，该基因的启动子区域是在红花种子中驱动有效的转基因表达的出色候选物。如实施例6中所示，CtFAD2-2在遗传背景中具有活性，而CtFAD2-1因突变而失活。因此，将CtFAD2-2的启动子用于红花以驱动在其他基因之中靶向CtFAD2-2活性的发夹RNA的表达。可用于在红花种子中表达转基因的其他启动子元件包括在油体蛋白(CtOleosin)和种子贮藏蛋白诸如2S和11S蛋白(Ct2S和Ct11S)的基因的上游部分中的内源性(即，红花)启动子元件。使用基于标准PCR的技术，基于红花基因组序列分离了CtFAD2-1、CtOleosin、Ct2S和Ct11S的启动子元件，然后并入植物二元表达载体。将这些启动子元件用于在构建体pCW701-pCW710中或与其他表达相同或不同hpRNA基因的非红花启动子(诸如在pCW602、pCW603、pCW631或pCW632中)相结合来表达hpRNA沉默分子，还通过将转化的植物与各个基因杂交而产生了hpRNA基因与不同启动子的组合，通常其中hpRNA基因为未连接的。
为了分离CtFAD2-1启动子，使用基于PCR的技术分离了在CtFAD2-1翻译起始ATG密码子上游约3000bp的基因组DNA片段，并用于替换来自pCW603和pCW602的AtOleosin启动子，从而分别生成构建体pCW701和pCW702。
为了分离CtFAD2-2启动子，使用基于PCR的技术分离了在CtFAD2-2翻译起始ATG密码子上游约3000bp的基因组DNA片段，并用于替换来自pCW603和pCW602的AtOleosin启动子，从而分别生成构建体pCW703和pCW704。
为了分离CtOleosin-1启动子，使用基于PCR的技术分离了在CtOleosin翻译起始ATG密码子上游约1500个碱基对的基因组DNA片段，并用于替换来自pCW603和pCW602的AtOleosin启动子，从而分别生成构建体pCW705和pCW706。
为了分离Ct2S启动子，分离了在Ct2S翻译起始ATG密码子上游约1500个碱基对的基因组DNA片段，并用于替换来自pCW603和pCW602的AtOleosin启动子，从而分别生成构建体pCW707和pCW708。
为了分离Ct11S启动子，使用基于PCR的技术从红花基因组DNA分离了在Ct11S翻译起始ATG密码子上游约1500个碱基对的基因组DNA片段，并用于替换来自pCW603和pCW602的AtOleosin启动子，从而分别生成构建体pCW709和pCW710。
将这些载体的每一个如实施例1中所述转化进红花品种。
实施例14.红花品种的田间表现
使一系列未转化的红花品种和品系在2011-2012年夏天在位于新南威尔士州纳拉布(Narrabri，New South Wales)的试验田生长。将种子播种到5m x 3m田野样区的重粘土(常见于纳拉布地区)中。将植物暴露于自然光线和降雨，但在生长4周后灌溉一次。收获成熟的种子，并分析了约50粒种子样品的种子油中的脂质含量和脂肪酸组成。各品种和品系的种子油中的油酸含量在表19和图13中示出。
得自田间试验的数据表明，存在一系列的红花种子油酸含量，在所观察到的范围程度方面令人惊讶。最值得注意的是，称为“高油酸”并且之前报道称提供含有至少70％油酸的种子油的各种品系(诸如Ciano-OL)仅产生了约42-46％的油酸。基于之前的报道，亚油酸水平远高于预期。相比之下，据报道得到高油酸含量的其他品系确实在田间条件下在种子油中产生了高油酸水平(60％-76％)，诸如品系PI-5601698和PI-560169。在一些品系中与预期相比油酸水平相当低的原因据信与存在CtFAD2-1等位基因而不是ol等位基因(诸如对温度敏感的ol1等位基因)有关，以及与2011-12年季节不够理想的生长条件有关。将开展对得自田间生长的红花的种子的进一步脂肪酸分析以确认在一些品系的油酸含量中所观察到的变化。
表19.在田间生长的红花品种的脂质脂肪酸组成。
该实验还表明，得自在田间生长的植物的种子油中的油酸水平通常比在温室中生长的植物低约5-10％，即使对于在田间表现最好的品系而言。其原因据认为是田间生长条件不如温室理想。
在进一步的实验中，使红花栽培品种S317的植物在田间或温室中生长以比较种子油的脂肪酸组成。即使田间条件在生长季节中比2011-12季节更有利，得自在田间生长的植物的20粒种子的重量为0.977g，相比之下在温室中生长的植物为1.202g。通过GC分析法对每组的18至20粒种子分析了脂肪酸组成。田间生长种子的油酸水平在74.83至80.65的范围内，平均值(+/1s.d.)为78.52+/-1.53，相比之下温室生长的种子的范围为75.15-78.44，平均值为76.33+/-1.00。其他脂肪酸以表20中的水平存在。
表20.在田间或温室生长的S317种子油的脂肪酸组成。
实施例15.将转基因杂交到其他红花品种中
使用成熟的方法例如如Mündel和Bergman(2009)中所述对红花品种进行人工杂交。选择了含有上述构建体的最好的转化谱系，尤其是只含单个T-DNA插入的转化谱系，并与具有最佳农学表现的未转化的或已用不同构建体转化的其他红花品种杂交。使用与轮回亲本的数轮重复回交，例如4或5次回交，然后自交，在最佳农学表现的遗传背景下产生了为所需构建体纯合的植物。可将标记辅助选择用于育种过程，诸如使用如实施例7中所述的ol等位基因的完美标记。
实施例16.通过人工微RNA介导的基因沉默修饰种子油组合 物
微RNA(miRNA)是一类调控内源性基因活性的对植物和动物均为内源性的20-24个核苷酸(nt)的调控小RNA(sRNA)。修饰的miRNA前体RNA(人工miRNA前体)的转基因表达代表了最近开发的基于RNA的且为序列特异性的沉默内源性基因的策略。已证实，在miRNA前体序列内取代若干核苷酸以制备人工miRNA前体不影响miRNA的生物合成，只要在前体茎环内的匹配和错配位置不受影响。
将CSIRO软件包MatchPoint(www.pi.csiro.au/RNAi)(Horn和Waterhouse，2010)用于鉴定拟南芥属FAD2、FATB和FAE1基因中的特异性21-mer序列，这些基因在拟南芥属基因组中是独特的并因此在作为人工miRNA表达时不太可能导致非靶基因的沉默(基因脱靶)。针对3种基因的每一种选择独特的21-mer序列，21-mer在每种情况下均与相应基因的转录物的区域完全互补(反义)。基于拟南芥属ara-miR159b前体序列，设计了每一个的人工miRNA前体分子。在每种情况下，将miR159b前体序列在其茎中进行修饰，以适应反义21-mer序列。制备了各自编码前体RNA之一的三个构建体，每一个都处于种子特异性FP1启动子的控制下，并克隆进二元表达载体以生成命名为pJP1106、pJP1109和pJP1110的构建体。
通过电穿孔将这些构建体独立地转化进根癌农杆菌菌株AGL1，并将转化的菌株用于通过花序浸渍法(实施例1)将基因构建体引入拟南芥(生态型Columbia)。将得自处理后的植物的种子(T1种子)铺到补充了3.5mg/L PPT以选择转化幼苗的MS培养基上，然后转移到土壤中以建立确认的T1转基因植物。预计这些T1植物中的大部分对于引入的基因构建体而言都为杂合的。在成熟时收集得自转基因植物的T2种子，并分析其脂肪酸组成。这些T2种子包含对基因构建体而言为纯合的谱系以及为杂合的谱系。纯合的T2植物自花授粉以产生T3种子，将得自这些种子的T3子代植物继而用于获得T4子代植物。这因而使得可以分析基因沉默在三代子代植物中的稳定性。
如实施例1中所述通过GC分析了得自T2、T3和T4种子批次的种子油的脂肪酸分布。观察到了通过基于FAD2的转基因的作用所导致的Δ12-去饱和酶活性的改变，因为种子油分布中油酸的量增加。评估Δ12-去饱和酶活性在种子脂肪酸合成期间的累积作用的相关方法是通过计算各种子油的油酸去饱和比例(ODP)参数，该参数通过使用以下公式而获得：ODP＝％18：2+％18：3/％18：1+％18：2+％18：3。野生型拟南芥属种子油通常具有约0.70至0.79的ODP值，这意味着70％至79％的在脂肪酸合成期间在种子中形成的18：1随后转化成了多不饱和C18脂肪酸，其中首先通过Δ12-去饱和酶的作用产生18：2，然后通过进一步的去饱和产生18：3。因此，ODP参数可用于在内源性Δ12-去饱和酶活性水平上确定FAD2基因沉默的程度。
用pJP1106构建体(FAD2靶)转化的T2种子中C18：1Δ9(油酸)的水平在30个转基因事件中与14.0％±0.2的平均野生型C18：1水平相比在32.9％至62.7％的范围内。使通过植物选择性标记(PPT)的分离比率(3∶1)所确定的具有单个转基因插入的高度沉默谱系(植物ID-30)生长到下一代(T3)。在T3种子中观察到了18：1Δ9的类似高水平，范围为46.0％至63.8％，平均值为57.3±5.0％。在下一代中，T4种子也显示出18：1Δ9的类似高水平，范围为61％至65.8％，平均值为63.3±1.06％。T2转基因种子油中的总PUFA含量(18：2+18：3)在6.1％至38％的范围内，但在得自纯合谱系ID-30的种子油中，总PUFA含量进一步降低并在4.3至5.7％的范围内。对照拟南芥属生态型Columbia种子油具有0.75-0.79范围内的ODP值，这意味着在发育种子中产生的油酸的75％以上随后转化成了18：2或18：3。相比之下，得自拟南芥属fad2-1突变体的种子油具有0.17的ODP值，从而表明Δ12-去饱和因fad2-1突变而降低了约75％。ODP值在T2转基因种子油中在0.08至0.48的范围内，在T3种子油中在0.07-0.32的范围内，以及在T4种子油中在0.06-0.08的范围内，相比之下，在对照拟南芥属种子油中的值为0.75。在转基因谱系中ODP值的剧烈减小清楚地表明使用人工微RNA方法有效地沉默了内源性FAD2基因。该实验还表明基因沉默在三代中的稳定性。对于其他两个构建体观察到了相似的基因沉默程度，从而下调其相应基因。
在使用人工微RNA的该研究中观察到的FAD2基因沉默的程度和18：1Δ9的量(63.3±1.06％)高于研究透彻的FAD2-2突变体(59.4％)、使用发夹RNA方法的FAD2沉默谱系(56.9±3.6％)以及使用发夹反义方法的谱系(61.7±2.0％)。在使用amiRNA的FAD2沉默种子油中的平均18：2+18：3％含量为4.8±0.37％，其低于之前报道的FAD2-2突变体(7.5±1.1％)和使用发夹反义方法的FAD2沉默谱系(7.2±1.4％)。这些数据因此表明人工微RNA在沉默程度以及沉默在多个子代世代上的稳定性中的优势。
实施例17.测定油中的甾醇含量和组成
如实施例1中所述作为O-三甲基甲硅烷基醚(OTMSi-醚)衍生物，通过GC和GC-MS分析法表征了购自澳大利亚商业来源的12种植物油样品中的植物甾醇。通过保留数据、对质谱的解读以及与文献和实验室标准质谱数据的比较鉴定甾醇。通过使用5β(H)-胆烷-24-醇内标对甾醇定量。一些鉴定出的甾醇的基础植物甾醇结构和化学结构在图14和表21中示出。
表21.所鉴定的甾醇的IUPAC/系统名。
甾醇编号 通用名 IUPAC/系统名
1 胆固醇 胆甾-5-烯-3β-醇
2 芸苔甾醇 24-甲基胆甾-5，22E-二烯-3β-醇
3 海绵甾醇/24-亚甲基胆固醇 24-甲基胆甾-5，24(28)E-二烯-3β-醇
4 菜油甾醇/24-甲基胆固醇 24-甲基胆甾-5-烯-3β-醇
5 菜油甾烷醇/24-甲基胆甾烷醇 24-甲基胆甾烷-3β-醇
7 Δ5-豆甾醇 24-乙基胆甾-5，22E-二烯-3β-醇
9 麦角甾-7-烯-3β-醇 24-甲基胆甾-7-烯-3β-醇
11 齿孔醇 4，4，14-三甲基麦角甾-8，24(28)-二烯-3β-醇
12 β-谷甾醇/24-乙基胆固醇 24-乙基胆甾-5-烯-3β-醇
13 Δ5-燕麦甾醇/异岩藻甾醇 24-乙基胆甾-5，24(28)Z-二烯-3β-醇
19 Δ7-豆甾醇/豆甾-7-烯-3b-醇 24-乙基胆甾-7-烯-3β-醇
20 Δ7-燕麦甾醇 24-乙基胆甾7，24(28)-二烯-3β-醇
分析了得自以下植物的植物油：芝麻(Sesamum indicum)、橄榄(Olea europaea)、向日葵(Helianthus annus)、蓖麻(Ricinus communis)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、红花(Carthamus tinctorius)、花生(Arachishypogaea)、亚麻(Linum usitatissimum)和大豆(Glycine max)。以降低的相对丰度，在所有油样品中，主要的植物甾醇为：β-谷甾醇(范围为总脂肪酸含量的28-55％)、Δ5-燕麦甾醇(异岩藻甾醇)(3-24％)、菜油甾醇(2-33％)、□5-豆甾醇(0.7-18％)、Δ7-豆甾醇(1-18％)和Δ7-燕麦甾醇(0.1-5％)。鉴定了若干其他次要的甾醇，它们是：胆固醇、芸苔甾醇、海绵甾醇、菜油甾烷醇和齿孔醇。还检测到了四种C29：2和两种C30：2甾醇，但需要进一步的研究以完全鉴定这些次要组分。此外，若干其他未鉴定的甾醇存在于一些油中，但由于其丰度极低，质谱不够强以至于不能鉴定其结构。
以降低的量表示为mg/g油的甾醇含量为：低芥酸菜子油(6.8mg/g)、芝麻油(5.8mg/g)、亚麻油(4.8-5.2mg/g)、向日葵油(3.7-4.1mg/g)、花生油(3.2mg/g)、红花油(3.0mg/g)、大豆油(3.0mg/g)、橄榄油(2.4mg/g)、蓖麻油(1.9mg/g)。％甾醇组成和总甾醇含量在表22中给出。
在所有种子油样品之中，主要的植物甾醇通常为β-谷甾醇(范围为总甾醇含量的30-57％)。在油之中在其他主要甾醇的比例方面存在较宽的范围：菜油甾醇(2-17％)、Δ5-豆甾醇(0.7-18％)、Δ5-燕麦甾醇(4-23％)、Δ7-豆甾醇(1-18％)。得自不同物种的油具有不同的甾醇分布，一些具有相当不同的分布。低芥酸菜子油具有最高的菜油甾醇比例(33.6％)，而其他物种样品通常具有较低的水平，例如在花生油中最多17％。红花油具有相对高的Δ7-豆甾醇比例(18％)，而该甾醇在其他物种油中通常较低，在红花油中最多9％。由于对于各物种而言它们存在差异，因此甾醇分布可用于帮助鉴定特定的蔬菜或植物油并检查它们的真实性或用其他油掺假。
比较了向日葵和红花每一者的两个样品，在每种情况下，一种通过种子冷压而产生且不精炼，而另一种不冷压但精炼。虽然观察到了一些差异，但是两种油来源具有相似的甾醇组成和总甾醇含量，从而表明加工和精炼对这两个参数的影响甚微。在样品之中的甾醇含量差异三倍并在1.9mg/g至6.8mg/g的范围内。低芥酸菜子油具有最高的甾醇含量，而蓖麻油具有最低的甾醇含量。
对得自温室来源的对照种子(S系列)、经遗传修饰的高油酸种子(T系列)的红花油和两种商业红花油进行了单独的分析。观察到了多种特征(表23)。首先，在对照与修饰种子之间存在甾醇分布的高相似度，其次商业红花油在单独的分组中并因此显示出具有明显不同的植物甾醇分布。对植物甾醇分布的进一步研究还显示出对照和修饰的红花种子样品的植物甾醇分布相似性。
本领域技术人员将会认识到，在不脱离广义描述的本发明精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的发明进行多种变型和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应视为示例性而非限制性的。
本专利申请要求2012年4月25日提交的US 61/638,447和2012年9月11日提交的AU 2012903992的优先权，这两份专利申请均以引用方式并入本文。
本文所讨论和/或参考的所有出版物以整体并入本文。
已包括在本说明书中的对文件、行动、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了向本发明提供背景。不应视作承认任何或所有这些事项构成了现有技术基础的一部分，它们只是本领域中与本发明相关的常见性一般知识，因为它在本申请各权利要求项的优先权日之前已存在。
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Claims (94)

1.一种从油料种子中提取的脂质，所述脂质包含由与甘油酯化的脂肪酸组成的三酰基甘油(TAG)，其中
i)所述脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
ii)所述脂质的至少95重量％为TAG，
iii)所述脂质的总脂肪酸含量的约90重量％至约95重量％为油酸，
iv)所述脂质的总脂肪酸含量的低于约3.1重量％为棕榈酸，并且
v)所述脂质具有低于约0.037的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.063的棕榈酸-亚油酸-油酸值(PLO)。
2.根据权利要求1所述的脂质，其具有以下特征中的一个或多个或全部：
a)所述脂质的总脂肪酸含量的约90重量％至约94重量％、或约91重量％至约94重量％、或约91重量％至约92重量％、或约92重量％、或约93重量％为油酸，
b)所述脂质的总脂肪酸含量的低于约3重量％、或低于约2.75重量％、或低于约2.5重量％、或约3重量％、或约2.75重量％、或约2.5重量％、或约2.3重量％为棕榈酸，
c)所述脂质的总脂肪酸含量的约0.1重量％至约3重量％、或约2重量％至约3重量％、或约3重量％、或约2重量％为多不饱和脂肪酸(PUFA)，
d)所述脂质的总脂肪酸含量的低于约3重量％、或低于约2.5重量％、或低于约2.25重量％、或约3重量％、或约2.5重量％、或约2.25重量％为亚油酸，
e)所述脂质的总脂肪酸含量的低于约1重量％、或低于约0.5重量％为α-亚麻酸(ALA)，
f)所述脂质的总脂肪酸含量的约0.5重量％至约1重量％为18:1Δ11，
g)所述脂质的脂肪酸含量的ODP为约0.033至约0.01、或约0.033至约0.016、或约0.033至约0.023，或为约0.03、或约0.02、或约0.01，
h)所述脂质的脂肪酸含量的PLO值为约0.020至约0.063、或约0.020至约0.055、或约0.020至约0.050、或约0.050至约0.055、或约0.063、或约0.055、或约0.050、或约0.040、或约0.030、或约0.020，
i)所述脂质的总脂肪酸含量的约90重量％至约96重量％、或约92重量％至约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，
j)所述脂质具有低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)，
k)所述脂质为纯化油的形式，以及
l)所述脂质为非氢化的。
3.根据权利要求2所述的脂质，其中所述PUFA为亚油酸。
4.根据权利要求1至3任一项所述的脂质，其中α-亚麻酸无法在所述脂质的脂肪酸含量中检出。
5.根据权利要求1至4任一项所述的脂质，其中所述脂质的TGA含量的约55％至约80％、或约60％至约80％、或约70％至约80％、或至少约60％、或至少约70％、或约60％、或约70％、或约80％为三油酸甘油酯。
6.根据权利要求1至5任一项所述的脂质，其中所述脂质的油酸含量的低于约5％、或低于约2％、或约0.1％至约5％为二酰基甘油(DAG)的形式。
7.根据权利要求1至6任一项所述的脂质，其为油的形式，其中所述油的至少90％、或至少95％、至少约98重量％、或约95重量％至约98重量％为脂质。
8.根据权利要求7所述的脂质，其中所述油料种子为非光合作用油料种子，优选得自红花、向日葵、棉花或蓖麻的种子。
9.根据权利要求1至8任一项所述的脂质，其还包含一种或多种甾醇。
10.根据权利要求9所述的脂质，其为油的形式，并且其包含低于约5mg甾醇/g油、或约1.5mg甾醇/g油至约5mg甾醇/g油。
11.根据权利要求10所述的脂质，其包括以下一个或多个方面或全部：
a)总甾醇含量的约1.5％至约4.5％、或约2.3％至约4.5％为麦角甾-7-烯-3β-醇，
b)总甾醇含量的约0.5％至约3％、或约1.5％至约3％为三萜醇，
c)总甾醇含量的约8.9％至约20％为Δ7-豆甾醇/豆甾-7-烯-3β-醇，以及
d)总甾醇含量的约1.7％至约6.1％为Δ7-燕麦甾醇。
12.根据权利要求1至11任一项所述的脂质，其具有至少1升的体积和/或至少1kg的重量，和/或其从得自田间生长植物的油料种子提取而得。
13.一种包含为根据权利要求1至12任一项所述的脂质的第一组分和第二组分的组合物，优选地其中所述组合物通过将所述脂质与所述第二组分混合而制得。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述第二组分为非脂质物质，诸如酶、非蛋白催化剂或化学物质，或饲料的一种或多种成分。
15.一种生产油的工艺，所述工艺包括：
i)获得油料种子，所述油料种子包含油，和/或其能够长成产生含油油料种子的植物，其中所述油料种子的油含量为权利要求1至12任一项所定义的脂质，以及
ii)从所述油料种子提取油，从而产生所述油。
16.根据权利要求15所述的工艺，其中所述油料种子包含第一外源性多核苷酸，所述第一外源性多核苷酸编码第一沉默RNA，所述第一沉默RNA能够相对于不含所述外源性多核苷酸的相应油料种子降低发育油料种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中所述多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育油料种子中的表达。
17.一种生产油的工艺，所述工艺包括：
i)获得红花种子，其油含量包含三酰基甘油(TAG)，和/或其能够长成产生油含量包含三酰基甘油的种子的植物，所述三酰基甘油由与甘油酯化的脂肪酸组成，并且其中
a)所述脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
b)所述种子的油含量的至少95重量％为TAG，
c)所述种子的油含量的总脂肪酸的约75重量％至约95重量％为油酸，
d)所述种子的油含量的总脂肪酸的低于约5.1重量％为棕榈酸，并且
e)所述种子的油含量具有低于约0.17的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.26的棕榈酸-亚油酸-油酸(PLO)值，以及
ii)从所述红花种子提取油，从而产生所述油，其中所述红花种子包含第一外源性多核苷酸，
所述第一外源性多核苷酸编码第一沉默RNA，所述第一沉默RNA能够相对于不含所述外源性多核苷酸的相应红花种子降低发育红花种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中所述多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育红花种子中的表达。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的工艺，其中所述油料种子或红花种子包含第二外源性多核苷酸，所述第二外源性多核苷酸编码第二沉默RNA，所述第二沉默RNA能够相对于不含所述第二外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)基因的表达，并且其中所述第二外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育油料种子或红花种子中的表达。
19.根据权利要求16至18任一项所述的工艺，其中所述油料种子或红花种子包含第三外源性多核苷酸，所述第三外源性多核苷酸编码第三沉默RNA，所述第三沉默RNA能够相对于不含所述第三外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中质体ω6脂肪酸去饱和酶(FAD6)基因的表达，并且其中所述第三外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育油料种子或红花种子中的表达。
20.根据权利要求17至19任一项所述的工艺，其中
1)所述FAD2基因为CtFAD2-1基因、CtFAD2-2基因和CtFAD2-10基因中的一者或多者，和/或
2)所述FATB基因为CtFATB-3基因，和/或
3)所述FAD6基因为CtFAD6基因。
21.根据权利要求17至20任一项所述的工艺，其中所述红花种子的油含量具有以下特征中的一个或多个或全部，
a)所述种子的油含量的总脂肪酸的约80重量％至约94重量％、或约85重量％至约94重量％、或约90重量％至约94重量％、或约91重量％至约94重量％、或约91重量％至约92重量％、或约92重量％、或约93重量％为油酸，
b)所述种子的油含量的总脂肪酸的低于约5重量％、或低于约4重量％、或低于约3重量％、或低于约2.75重量％、或低于约2.5重量％、或约3重量％、或约2.75重量％、或约2.5重量％为棕榈酸，
c)所述种子的油含量的总脂肪酸的约0.1重量％至约15重量％、或约0.1重量％至约10重量％、或约0.1重量％至约7.5重量％、或约0.1重量％至约5重量％、或约0.1重量％至约3重量％、或约2重量％至约3重量％、或约3重量％、或约2重量％为多不饱和脂肪酸(PUFA)，
d)所述种子的油含量的总脂肪酸的低于约15重量％、或低于约10重量％、或低于约5重量％、或低于约3重量％、或低于约2.5重量％、或低于约2.25重量％、或约3重量％、或约2.5重量％、或约2.25重量％为亚油酸(LA)，
e)所述脂质的总脂肪酸含量的约80重量％至约96重量％、或约90重量％至约96重量％、或约92重量％至约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，
f)所述脂质具有低于约0.05、或低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.05、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)，
g)所述种子的油含量的ODP为约0.17至约0.01、或约0.15至约0.01、或约0.1至约0.01、或约0.075至约0.01、或约0.050至约0.01、或约0.033至约0.01、或约0.033至约0.016、或约0.033至约0.023，或为约0.03、或约0.02、或约0.01，以及
h)所述种子的油含量的PLO值为约0.020至约0.26、或约0.020至约0.20、或约0.020至约0.15、或约0.020至约0.1、或约0.020和约0.075、或约0.050和约0.055，或为约0.05、或约0.040、或约0.030、或约0.020。
22.根据权利要求17至21任一项所述的工艺，其中所述油为脂质，所述脂质进一步由权利要求3至7或9至11所述的特征中的一个或多个表征。
23.根据权利要求16至22任一项所述的工艺，其中提取所述油的步骤包括压碎所述油料种子或所述红花种子。
24.根据权利要求16至23任一项所述的工艺，还包括纯化从所述油料种子或所述红花种子提取的所述油的步骤，其中所述纯化步骤包括由以下方面组成的组中的一个或多个或全部：脱胶、除臭、脱色、干燥和/或分馏所述提取的油，和/或从所述提取的油中除去至少一些、优选基本上全部的蜡和/或蜡酯。
25.一种油料种子，所述油料种子的油含量包含三酰基甘油(TAG)，和/或所述油料种子能够长成产生油含量包含三酰基甘油的油料种子的植物，所述三酰基甘油由与甘油酯化的脂肪酸组成，并且其中
i)所述脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
ii)所述油料种子的油含量的至少95重量％为TAG，
iii)所述油料种子的油含量的总脂肪酸的约90重量％至约95重量％为油酸，
iv)所述油料种子的油含量的总脂肪酸的低于约3.1重量％为棕榈酸，并且
v)所述油料种子的油含量具有低于约0.037的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.063的棕榈酸-亚油酸-油酸(PLO)值。
26.根据权利要求25所述的油料种子，其为非光合作用油料种子，优选红花、向日葵、棉花或蓖麻。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的油料种子，所述油料种子包含第一外源性多核苷酸，所述第一外源性多核苷酸编码第一沉默RNA，所述第一沉默RNA能够相对于不含所述外源性多核苷酸的相应油料种子降低发育油料种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中所述第一外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育油料种子中的表达。
28.一种红花种子，所述红花种子的油含量包含三酰基甘油(TAG)，和/或所述红花种子能够长成产生油含量包含三酰基甘油的种子的植物，所述三酰基甘油由与甘油酯化的脂肪酸组成，并且其中
i)所述脂肪酸包含棕榈酸和油酸，
ii)所述种子的油含量的至少95重量％为TAG，
iii)所述种子的油含量的总脂肪酸的约75重量％至约95重量％为油酸，
iv)所述种子的油含量的总脂肪酸的低于约5.1重量％为棕榈酸，并且
v)所述种子的油含量具有低于约0.17的油酸去饱和比例(ODP)和/或低于约0.26的棕榈酸-亚油酸-油酸(PLO)值，以及
其中所述红花种子包含第一外源性多核苷酸，所述第一外源性多核苷酸编码第一沉默RNA，所述第一沉默RNA能够相对于不含所述外源性多核苷酸的相应红花种子降低发育红花种子中Δ12去饱和酶(FAD2)基因的表达，并且其中所述第一外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育红花种子中的表达。
29.根据权利要求28所述的红花种子，其中所述种子的油含量具有以下特征中的一个或多个：
a)所述种子的油含量的总脂肪酸的约80重量％至约94重量％、或约85重量％至约94重量％、或约90重量％至约94重量％、或约91重量％至约94重量％、或约91重量％至约92重量％、或约92重量％、或约93重量％为油酸，
b)所述种子的油含量的总脂肪酸的低于约5重量％、或低于约4重量％、或低于约3重量％、或低于约2.75重量％、或低于约2.5重量％、或约3重量％、或约2.75重量％、或约2.5重量％为棕榈酸，
c)所述种子的油含量的总脂肪酸的约0.1重量％至约15重量％、或约0.1重量％至约10重量％、或约0.1重量％至约7.5重量％、或约0.1重量％至约5重量％、或约0.1重量％至约3重量％、或约2重量％至约3重量％、或约3重量％、或约2重量％为多不饱和脂肪酸(PUFA)，
d)所述种子的油含量的总脂肪酸的低于约15重量％、或低于约10重量％、或低于约5重量％、或低于约3重量％、或低于约2.5重量％、或低于约2.25重量％、或约3重量％、或约2.5重量％、或约2.25重量％为亚油酸(LA)，
e)所述脂质的总脂肪酸含量的约80重量％至约96重量％、或约90重量％至约96重量％、或约92重量％至约96重量％、或约93重量％、或约94重量％为单不饱和脂肪酸，
f)所述脂质具有低于约0.05、或低于约0.02、或低于约0.015、或约0.005至约0.05、或约0.005至约0.02的油酸单不饱和比例(OMP)，
g)所述种子的油含量的ODP为约0.17至约0.01、或约0.15至约0.01、或约0.1至约0.01、或约0.075至约0.01、或约0.050至约0.01、或约0.033至约0.01、或约0.033至约0.016、或约0.033至约0.023，或为约0.03、或约0.02、或约0.01，以及
h)所述种子的油含量的PLO值为约0.020至约0.26、或约0.020至约0.2、或约0.020至约0.15、或约0.020至约0.1、或约0.020和约0.075、或约0.050和约0.055，或为约0.05、或约0.040、或约0.030、或约0.020。
30.根据权利要求25至29任一项所述的油料种子或红花种子，其中所述种子的油含量为脂质，所述脂质进一步由权利要求3至7或9至11所述的特征中的一个或多个表征。
31.根据权利要求27至30任一项所述的油料种子或红花种子，所述油料种子或红花种子包含第二外源性多核苷酸，所述第二外源性多核苷酸编码第二沉默RNA，所述第二沉默RNA能够相对于不含所述第二外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)基因的表达，并且其中所述第二外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育油料种子或红花种子中的表达。
32.根据权利要求27至31任一项所述的油料种子或红花种子，其中所述油料种子或红花种子包含第三外源性多核苷酸，所述第三外源性多核苷酸能够相对于不含所述第三外源性多核苷酸的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中质体ω6脂肪酸去饱和酶(FAD6)基因的表达，并且其中所述第三外源性多核苷酸可操作地连接到启动子，所述启动子指导所述多核苷酸在所述发育油料种子或红花种子中的表达。
33.根据权利要求27至32任一项所述的油料种子或红花种子，其中所述第一沉默RNA降低发育油料种子或红花种子中不止一种编码FAD2的内源性基因的表达，和/或其中所述第二沉默RNA降低发育油料种子或红花种子中不止一种编码FATB的内源性基因的表达。
34.根据权利要求27至33任一项所述的油料种子或红花种子，其中所述第一外源性多核苷酸与所述第二外源性多核苷酸和所述第三外源性多核苷酸中的任一者或两者共价连接在单个DNA分子上，任选地连接性DNA序列位于所述第一、第二和/或所述第三外源性多核苷酸之间。
35.根据权利要求34所述的红花种子，其中所述第一外源性多核苷酸与所述第二外源性多核苷酸和所述第三外源性多核苷酸中的任一者或两者受单个启动子的控制，使得当所述第一外源性多核苷酸和所述第二外源性多核苷酸和/或所述第三外源性多核苷酸在所述发育油料种子或红花种子中转录时，所述第一沉默RNA和所述第二沉默RNA和/或所述第三沉默RNA作为单个RNA转录物的一部分共价连接。
36.根据权利要求27至35任一项所述的油料种子或红花种子，其包含整合到所述油料种子或红花种子的基因组中的单个转移DNA，并且其中所述单个转移DNA包含所述第一外源性多核苷酸与所述第二外源性多核苷酸和所述第三外源性多核苷酸中的任一者或两者。
37.根据权利要求36所述的油料种子或红花种子，其为所述转移DNA纯合的。
38.根据权利要求27至37任一项所述的油料种子或红花种子，其中所述第一沉默RNA、所述第二沉默RNA和所述第三沉默RNA各自独立地选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA和双链RNA。
39.根据权利要求27至38任一项所述的油料种子或红花种子，其中所述启动子中的任一个或多个、优选全部为种子特异性的，并优选地优先在发育油料种子或红花种子的胚胎中表达。
40.根据权利要求25至39任一项所述的油料种子或红花种子，其在一个或多个FAD2基因中包含一个或多个突变，其中所述突变相对于不含所述突变的相应油料种子或红花种子降低发育油料种子或红花种子中所述一个或多个FAD2基因的活性。
41.根据权利要求40所述的油料种子或红花种子，其相对于相应油料种子或红花种子中的野生型FAD2基因包含FAD2基因突变，所述突变为缺失、插入、倒位、移码、翻译提前终止密码子、或一个或多个非保守氨基酸取代。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的油料种子或红花种子，其中所述突变为所述FAD2基因中的无效突变。
43.根据权利要求40至42任一项所述的油料种子或红花种子，其中所述突变中的至少一个位于FAD2基因中，所述基因在不含所述突变的发育油料种子或红花种子中编码比发育油料种子或红花种子中的任何其他FAD2基因更多的FAD2活性。
44.根据权利要求40至43任一项所述的油料种子或红花种子，其为红花种子，其中FAD2基因为CtFAD2-1基因。
45.根据权利要求40至44任一项所述的油料种子或红花种子，其为包含CtFAD2-1的ol等位基因或CtFAD2-1的ol1等位基因或两种等位基因的红花种子。
46.根据权利要求45所述的油料种子或红花种子，其中所述CtFAD2-1的所述ol等位基因或所述ol1等位基因以纯合状态存在。
47.根据权利要求25至46任一项所述的油料种子或红花种子，其中FAD2蛋白无法在所述种子中检出。
48.根据权利要求27至47任一项所述的油料种子或红花种子，其为红花种子，并且其中所述第一沉默RNA降低CtFAD2-1和CtFAD2-2两种基因的表达。
49.根据权利要求27至48任一项所述的油料种子或红花种子，其为红花种子，并且其中
1)所述FAD2基因为CtFAD2-1基因、CtFAD2-2基因和CtFAD2-10基因中的一者或多者，和/或
2)所述FATB基因为CtFATB-3基因，和/或
3)所述FAD6基因为CtFAD6基因。
50.一种能够产生根据权利要求25至49任一项所述的种子的油料种子植物或红花植物。
51.根据权利要求50所述的植物，其为转基因的和每种外源性多核苷酸纯合的，和/或包含所述第一外源性多核苷酸与所述第二外源性多核苷酸或所述第三外源性多核苷酸中的任一者或两者。
52.一种基本上纯化的和/或重组的多肽，其包含具有如SEQ IDNO:27至37、44、45或48任一者所提供的序列，其生物活性片段，或与SEQ ID NO:27至37、44、45或48中任一者或多者至少40％相同的氨基酸序列的氨基酸。
53.根据权利要求52所述的多肽，其为脂肪酸修饰酶，优选油酸Δ12去饱和酶、Δ12-乙炔酶、棕榈油酸Δ12去饱和酶或棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)。
54.一种分离的和/或外源性多核苷酸，包含以下一者或多者：
i)具有如SEQ ID NO:1至25、40至43、46或47中任一者提供的序列的核苷酸，
ii)具有编码权利要求52或权利要求53的多肽的序列的核苷酸，
iii)杂交到如SEQ ID NO:1至25、40至43、46或47中任一者提供的序列的核苷酸，以及
iv)所具有的序列使得当在油料种子植物的种子中表达时降低编码权利要求52或权利要求53的至少一种多肽的基因的表达的核苷酸。
55.根据权利要求54的部分iv)所述的多核苷酸，其选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、双链RNA(dsRNA)分子或其经加工的RNA产物。
56.根据权利要求55所述的多核苷酸，其为dsRNA分子或其经加工的RNA产物，包含与SEQ ID NO:1至25、40至43、46、47或49至51中的任一者或多者的互补序列至少95％相同的至少19个连续核苷酸(其中胸腺嘧啶(T)为尿嘧啶(U))。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的多核苷酸，其中所述dsRNA分子为微RNA(miRNA)前体和/或其中所述其经加工的RNA产物为miRNA。
58.根据权利要求55至57任一项所述的多核苷酸，其在单个启动子控制下在发育油料种子或红花种子中转录，其中所述dsRNA分子包含能够彼此杂交的通过单链RNA区域连接的互补有义和反义序列。
59.根据权利要求55至58任一项所述的多核苷酸，当存在于发育油料种子中时，
i)降低所述发育种子中编码油酸Δ12去饱和酶(FAD2)的内源性基因的表达，所述FAD2具有如SEQ ID NO:27、28或36中任一者或多者提供的氨基酸序列；
ii)降低所述发育种子中编码棕榈酰-ACP硫酯酶(FATB)的内源性基因的表达，所述FATB具有如SEQ ID NO:45提供的氨基酸序列；和/或
iii)降低所述发育种子中编码ω6脂肪酸去饱和酶(FAD6)的基因的表达，所述FAD6具有如SEQ ID NO:48提供的氨基酸序列。
60.一种嵌合载体，包含可操作地连接到启动子的根据权利要求54至59任一项所述的多核苷酸。
61.根据权利要求60所述的载体，其中所述启动子在油料种子中为功能性的，或为种子特异性启动子，优选地优先在发育油料种子的胚胎中表达。
62.一种重组细胞，包含根据权利要求54至59任一项所述的外源性多核苷酸，和/或根据权利要求60或权利要求61所述的载体。
63.根据权利要求62所述的细胞，其为植物细胞，优选植物种子细胞。
64.根据权利要求63所述的细胞，其中所述植物细胞为油料种子植物细胞。
65.根据权利要求64所述的细胞，其中所述植物细胞为非光合作用种子细胞，优选红花、向日葵、棉花或蓖麻种子细胞。
66.一种转基因非人类生物体，包含根据权利要求54至59任一项所述的多核苷酸中的一种或多种、根据权利要求60或权利要求61所述的载体，以及根据权利要求62至65任一项所述的细胞。
67.根据权利要求66所述的转基因非人类生物体，其为植物。
68.根据权利要求67所述的转基因非人类生物体，其为油料种子植物。
69.一种产生根据权利要求62至65任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求54至59任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求60或权利要求61所述的载体引入细胞的步骤。
70.根据权利要求54至59任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求60或权利要求61所述的载体在产生重组细胞方面的用途。
71.一种长出转基因油料种子植物或其种子的方法，所述转基因油料种子植物产生根据权利要求27至49任一项所述的种子，所述方法包括：
i)将根据权利要求54(部分iv))至59任一项所述的至少一种多核苷酸和/或根据权利要求60或权利要求61所述的至少一种载体引入油料种子植物的细胞，
ii)通过所述细胞再生转基因植物，以及
iii)任选地通过所述转基因植物长出一棵或多棵子代植物或其种子，
从而产生所述转基因油料种子植物或其种子。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述种子为根据权利要求28至49任一项所述的红花种子。
73.根据权利要求71或权利要求72所述的方法，其中所述一棵或多棵子代植物或其种子包含：
i)所述第一外源性多核苷酸，和/或
ii)所述第二外源性多核苷酸，和/或
iii)所述第三外源性多核苷酸，优选所有三种外源性多核苷酸。
74.根据权利要求71至73任一项所述的方法，其中所述一棵或多棵子代植物或其种子包含如权利要求40至46任一项所定义的一个或多个突变。
75.一种获得油料种子植物的方法，所述方法包括
i)使第一亲本油料种子植物与第二亲本油料种子植物杂交，所述第一亲本油料种子植物包含根据权利要求54(部分iv)至59任一项所述的第一多核苷酸、或根据权利要求60或权利要求61所述的第一载体，所述第二亲本油料种子植物包含根据权利要求54(部分iv)至59任一项所述的第二多核苷酸、或根据权利要求60或权利要求61所述的第一载体，
ii)针对两种多核苷酸或两种载体的存在性从所述杂交株中筛选子代植物；以及
iii)选择以下子代植物：它们同时包含(a)所述第一多核苷酸或所述第一载体和(b)所述第二多核苷酸或所述第二载体，并且还在所述植物的所述种子的油含量中具有提高比例的油酸和降低比例的棕榈酸。
76.一种对红花植物进行基因分型的方法，所述方法包括检测所述植物的核酸分子，其中所述核酸分子连接到以下一者或多者和/或包含以下一者或多者的至少一部分：红花植物的CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述方法包括测定所述植物的所述CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因中的一者或多者的表达水平和/或序列。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其包括：
i)将第二核酸分子杂交到所述植物的所述核酸分子，
ii)任选地将至少一个其他核酸分子杂交到所述植物的所述核酸分子；以及
iii)检测所述杂交步骤的产物或不存在得自所述杂交步骤的产物。
79.根据权利要求78所述的方法，其中将所述第二核酸分子用作引物以逆转录或复制所述植物的所述核酸分子的至少一部分。
80.根据权利要求76至79任一项所述的方法，其中使用选自以下的技术检测所述核酸：限制性片段长度多态性分析、扩增片段长度多态性分析、微卫星扩增、核酸测序和/或核酸扩增。
81.根据权利要求76至80任一项所述的方法，其中所述方法包括检测CtFAD2-1基因的等位基因、优选ol等位基因的存在与否。
82.一种从红花植物种群中选择红花植物的方法，所述方法包括：
i)使用根据权利要求76至81任一项所述的方法对所述植物种群进行基因分型，其中所述植物种群得自两种植物之间的杂交株，其中至少一种植物包含CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因的等位基因，所述等位基因相对于不含所述等位基因的红花植物的相应种子在所述植物的种子发育时赋予降低水平的Δ12去饱和酶活性，以及
ii)基于所述等位基因的存在与否选择所述红花植物。
83.一种将CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因的等位基因引入不含所述等位基因的红花植物中的方法，所述方法包括：
i)使第一亲本红花植物与第二亲本红花植物杂交，其中所述第二亲本植物包含CtFAD2-1、CtFAD2-2或CtFAD2-10基因的所述等位基因，以及
ii)将步骤i)的杂交株的子代与作为所述第一亲本植物的相同基因型的植物回交足够多的次数，以产生具有所述第一亲本的大部分基因型但包含所述等位基因的植物，
其中所述等位基因相对于不含所述等位基因的红花植物的相应种子在所述植物的种子发育时赋予降低水平的Δ12去饱和酶活性，并且其中使用根据权利要求76至81任一项所述的方法针对所述等位基因的存在与否对子代植物进行基因分型。
84.一种转基因植物或其子代植物或其种子，使用根据权利要求71至83任一项所述的方法产生。
85.一种产生种子的方法，所述方法包括：
a)使根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物生长，优选地作为至少1000棵此类植物的种群的部分在田间生长，以及
b)收获所述种子。
86.一种油，从以下来源通过根据权利要求15至24任一项所述的工艺中的一种或多种获得，或可通过根据权利要求15至24任一项所述的工艺中的一种或多种获得：根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的细胞，和/或根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分。
87.一种组合物，包含根据权利要求1至12任一项所述的脂质，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求52或权利要求53所述的多肽，根据权利要求54至59任一项所述的多核苷酸，根据权利要求60或权利要求61所述的载体，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞或根据权利要求86所述的油中的一种或多种，以及一种或多种可接受的载剂。
88.根据权利要求1至12任一项所述的脂质，根据权利要求13、14或87所述的组合物，根据权利要求15至24任一项所述的工艺，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油中的一种或多种在制造工业产品方面的用途。
89.一种生产工业产品的工艺，所述工艺包括以下步骤：
i)获得根据权利要求1至12任一项所述的脂质，根据权利要求13、14或87所述的组合物，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油中的一种或多种，
ii)任选地对步骤i)的根据权利要求1至12任一项所述的脂质，根据权利要求13、14或87所述的组合物，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油中的一种或多种进行物理加工，
ii)通过向所述工业产品应用热、化学、或酶手段或其任意组合将根据权利要求1至12任一项所述的脂质，或根据权利要求13、14或87所述的组合物中的一种或多种中的脂质，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油，或步骤ii)的物理加工产物中的至少一些转化成液体，以及
iii)回收所述工业产品，从而产生所述工业产品。
90.一种产生燃料的方法，所述方法包括：
i)使根据权利要求1至12任一项所述的脂质，或根据权利要求13、14或87所述的组合物中的一种或多种中的脂质，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油中的一种或多种与醇任选地在存在催化剂的情况下反应，以产生烷基酯，以及
ii)任选地将所述烷基酯与基于石油的燃料共混。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述烷基酯为甲基酯。
92.一种生产饲料的方法，所述方法包括将根据权利要求1至12任一项所述的脂质，根据权利要求13、14或87所述的组合物，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油中的一种或多种与至少一种其他食品成分配混。
93.饲料、化妆品或化学品，包括使根据权利要求1至12任一项所述的脂质，根据权利要求13、14或87所述的组合物，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油中的一种或多种反应。
94.一种通过或使用以下一者或多者生产的产品：根据权利要求1至12任一项所述的脂质，根据权利要求13、14或87所述的组合物中的一种或多种中的脂质，根据权利要求15至24任一项所述的工艺，根据权利要求25至49任一项所述的油料种子或红花种子，根据权利要求50、51、67、68或84任一项所述的植物或其部分，根据权利要求62至65任一项所述的宿主细胞，根据权利要求66所述的非人类转基因生物体或其部分，或根据权利要求86所述的油。
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