UA116538C2 - Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти - Google Patents

Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти Download PDF

Info

Publication number
UA116538C2
UA116538C2 UAA201412633A UAA201412633A UA116538C2 UA 116538 C2 UA116538 C2 UA 116538C2 UA A201412633 A UAA201412633 A UA A201412633A UA A201412633 A UAA201412633 A UA A201412633A UA 116538 C2 UA116538 C2 UA 116538C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
safflower
seed
lipid
gene
oil
Prior art date
Application number
UAA201412633A
Other languages
English (en)
Inventor
Крейг Крістофер Вуд
Цин ЛЮ
Сюе-Жун Чжоу
Аллан Грін
Суріндер Пал Сінгх
Шицзюан Као
Original Assignee
Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2012903992A external-priority patent/AU2012903992A0/en
Application filed by Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн, Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн filed Critical Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Publication of UA116538C2 publication Critical patent/UA116538C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19006—DELTA12-fatty-acid desaturase (1.14.19.6), i.e. oleoyl-CoA DELTA12 desaturase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Edible Oils And Fats (AREA)

Abstract

Винахід стосується насінини сафлору, яка містить введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який зменшує продукцію і/або активність гена ∆12-десатурази (FAD2), і введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який зменшує продукцію і/або активність гена пальмітоїл-АСР-тіоестерази (FATB). Винахід також стосується рослини сафлору, способу одержання олії, екстрагованого ліпіду, макухи, композиції ліпіду, способу виробництва промислового продукту та способу виробництва палива.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується насінини сафлору, яка містить введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який зменшує продукцію і/або активність гена л12-десатурази (ЕАО2), і введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який зменшує продукцію і/або активність гена пальмітоїл-АСР-тіоестерази (ЕАТВ). Винахід також стосується рослини сафлору, способу одержання олії, екстрагованого ліпіду, макухи, композиції ліпіду, способу виробництва промислового продукту та способу виробництва палива.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Даний винахід стосується екстрагованого ліпіду з високими рівнями, наприклад, 90-95 95 у ваговому відношенні, олеїнової кислоти. Даним винаходом також забезпечуються генетично модифіковані рослини, зокрема, насіння олійних рослин, таких, як сафлор, які можуть використовуватися для продукції ліпіду. Крім того, забезпечуються способи генотипування і відбору рослин, які можуть використовуватися для продукції ліпіду.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Рослинні олії є важливим джерелом жиру, що входить у раціон людей, представляючи приблизно 25 95 калорійності споживаної їжі в країнах, що розвиваються (Вгошип еї аї., 1999).
Світове виробництво рослинних олій складає принаймні приблизно 110 мільйонів тонн на рік, з яких 86 96 використовуються для споживання людьми. Майже всі ці олії одержують з олійних культур, таких, як соя, канола, сафлор, соняшник, бавовник і арахіс підземний, або вирощуваних на плантаціях дерев, таких, як пальма, маслина європейська і кокосова пальма (Сппеіопе, 2001; ОЇ УмМопа Аппиаі, 2004). Зростаюче наукове розуміння й усвідомлення суспільством впливу окремих, жирнокислотних компонентів харчових жирів на різні аспекти здоров'я людей служить причиною розробки модифікованих рослинних олій, які мають збільшену харчову цінність при збереженні необхідної функціональної можливості для використань у різних продуктах харчування. Для цих модифікацій необхідне знання метаболічних шляхів для синтезу жирних кислот рослин і генів, що кодують ферменти для цих шляхів (Гм еїа!., 2002а; Тпеїєп апа ОПігодде, 2002).
Чимала увага приділяється впливу різних жирів і олій у їжі, зокрема, впливу складових частин жирів і олій на серцевосудинне захворювання, рак і різні запальні стани. Вважають, що високі рівні холестерину і насичених жирних кислот у раціоні збільшують ризик розвитку хвороби серця, і це привело до рекомендації відносно харчування зменшити споживання багатих на холестерин, насичених тваринних жирів на користь ненасичених рослинних олій, які не містять холестерин ("ім еї аї!., 2002а).
Хоча споживання з їжею холестерину, що присутній у тваринних жирах, може значно збільшувати рівні загального холестерину в крові, також було встановлено, що жирні кислоти, що складають жири й олії, можуть самі робити значні ефекти на рівні холестерину в сироватці
Зо крові. Особливий інтерес становить ефект жирних кислот у їжі на форми холестерину в крові: небажаний ліпопротеїн низької густини (ОЇ) і бажаний ліпопротеїн високої густини (НО).
Узагалі, насичені жирні кислоти, зокрема, міристинова кислота (14:0) і пальмітинова кислота (16:0), основні насичені вуглеводні, що присутні у рослинних оліях, мають небажану здатність підвищувати рівні ГОІЇ-холестерину в сироватці і, отже, збільшувати ризик розвитку серцевосудинного захворювання (27оск еї аї., 1994; Ни еї аї!., 1997). Однак точно встановлено, що стеаринова кислота (18:0), інший основний ненасичений вуглеводень, що є присутнім у рослинних оліях, не підвищує І ОЇ -холестерин і дійсно може знизити загальний холестерин (Вопапоте апа Стипау, 1988; бошднегіу еї аї., 1995). З цієї причини, як правило, вважають, що стеаринова кислота є принаймні нейтральною, що стосується ризику розвитку серцевосудинного захворювання (ТПоівігир, еї аїЇ.,, 1994). З іншого боку, ненасичені жирні кислоти, такі, як мононенасичена олеїнова кислота (18:21), має цілющу здатність знижувати І 01 - холестерин (МепзіпК апа Каїап, 1989; Коспе апа сірпеу, 2000), тим самим зменшуючи ризик розвитку серцевосудинного захворювання.
Багата на олеїнову кислоту олія також має множину промислових застосувань, таких, як, але без обмеження, мастильні матеріали, часто у формі складних ефірів жирних кислот, біопаливо, вихідні матеріали для спиртів жирного ряду, пластифікатори, віск, стеарати металів, емульгатори, товари для особистої гігієни, мило і детергенти, поверхнево-активні речовини, фармацевтичні засоби, добавки для обробки металів, вихідні матеріали для пом'якшувачів тканин, чорнило, прозоре мило, стабілізатор ПВХ, алкідні смоли і проміжні продукти для багатьох інших типів наступних олеохімічних похідних.
Олієпереробні підприємства і харчові підприємства-виробники традиційно спиралися на гідрогенізацію для зменшення рівня ненасичених жирних кислот в оліях, тим самим збільшуючи їхню стійкість до окислювання при смаженні, а також забезпечуючи тверді жири для застосування в маргарині і для додавань у тісто для розсипчастоті. Гідрогенізація являє собою хімічний процес, у ході якого зменшується ступінь ненасиченості олій у результаті перетворення вуглець-вуглецевих подвійних зв'язків у вуглець-вуглецеві одинарні зв'язки. Повна гідрогенізація дає повністю насичений жир. Однак процес часткової гідрогенізації приводить до збільшення рівнів і насичених жирних кислот, і мононенасичених жирних кислот. Деякі з мононенасичених вуглеводнів, утворених під час часткової гідрогенізації, знаходяться у формі трансізомеру (такій, бо як елаїдинова кислота, трансізомер олеїнової кислоти), а не в формі цис-ізомеру, що зустрічається в природі (Зебеадіо еї аї., 1994; Регпапає? Зап Учап, 1995). В даний час відомо, що на відміну від цис-ненасичених жирних кислот, трансжирні кислоти настільки ж ефективні, як і пальмітинова кислота, у підвищенні рівнів ОЇ -холестерину в сироватці (МепзіпК апа Каїап, 1990; МоакКез апа Сіїйоп, 1998) і зниженні НОЇ -холестерину в сироватці (2оскК апа Каїап, 1992) і, таким чином, роблять внесок у збільшений ризик розвитку серцевосудинного захворювання (Азспегіо апа Уміїен, 1997). У результаті збільшення інформованості про антипоживні ефекти трансжирних кислот у даний час росте тенденція відмовлення від використання гідрогенізованого жиру в харчовій промисловості на користь жирів і олій, що є як цінними в харчовому відношенні, так і можуть забезпечити необхідну функціональну можливість без гідрогенізації, особливо тих, які багаті або на олеїнову кислоту, у випадках, коли потрібні рідкі олії, або на стеаринову кислоту, у випадках, коли переважним є твердий або напівтвердий жир.
Існує потреба в додаткових ліпідах і оліях з високим вмістом олеїнової кислоти і їхніх джерелах.
КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ
Автори даного винаходу створили нові ліпідні композиції і способи їхнього одержання.
У першому аспекті даним винаходом забезпечується ліпід, екстрагований з олійного насіння, при цьому ліпід включає триацилгліцерини (ТАС), що складаються з жирних кислот, етерифікованих до гліцерину, причому ї) жирні кислоти включають пальмітинову кислоту й олеїнову кислоту, і) принаймні 95 9о у ваговому відношенні ліпіду становить ТАС, ії) приблизно 90 95 - приблизно 95 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить олеїнова кислота, їм) менше, ніж приблизно 3,1 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить пальмітинова кислота, і м) ліпід характеризується часткою десатурації олеїнової кислоти (ООР), що становить менше, ніж приблизно 0,037, і/або значенням відношення пальмітинова кислота ж лінолева кислота/олеїнову кислоту (РІ 0), що становить менше, ніж приблизно 0,063.
У варіанті здійснення ліпід має одну або більше або усі з наступних особливостей, а) приблизно 90 95 - приблизно 94 95, або приблизно 91 95 - приблизно 94 95, або приблизно
Зо 91 95 - приблизно 92 95, або приблизно 92 95, або приблизно 93 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить олеїнова кислота, р) менше, ніж приблизно З 95, або менше, ніж приблизно 2,75 95, або менше, ніж приблизно 2,5 95, або приблизно З 95, або приблизно 2,75 95, або приблизно 2,5 95, або приблизно 2,3 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить пальмітинова кислота, с) приблизно 0,1 95 - приблизно З 95, або приблизно 2 95 - приблизно З 95, або приблизно
З 95, або приблизно 2 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становлять поліненасичені жирні кислоти (РОЕА), а) менше, ніж приблизно З 95, або менше, ніж приблизно 2,5 95, або менше, ніж приблизно 2,25 95, або приблизно З 95, або приблизно 2,5 95, або приблизно 2,25 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить лінолева кислота, е) менше, ніж приблизно 1 95, або менше, ніж приблизно 0,5 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить а-ліноленова кислота (АГ А),
ТУ) приблизно 0,595 - приблизно 1 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить 181411, 9) ООРР для вмісту у вигляді жирних кислот ліпіду становить приблизно 0,033 - приблизно 0,01, або приблизно 0,033 - приблизно 0,016, або приблизно 0,033 - приблизно 0,023, або становить приблизно 0,03, або приблизно 0,02, або приблизно 0,01,
Р) значення РІО для вмісту у вигляді жирних кислот ліпіду становить приблизно 0,020 -
БО приблизно 0,063, або приблизно 0,020 - приблизно 0,055, або приблизно 0,020 - приблизно 0,050, або приблизно 0,050 - приблизно 0,055, або приблизно 0,063, або приблизно 0,055, або приблизно 0,050, або приблизно 0,040, або приблизно 0,030, або приблизно 0,020, ї) приблизно 90 95 - приблизно 96 95, або приблизно 92 95 - приблизно 96 95, або приблизно 93 95, або приблизно 94 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становлять мононенасичені жирні кислоти,
Ї) ліпід характеризується часткою олеїнової кислоти в мононенасиченості (ОМР), що становить менше, ніж приблизно 0,02, або менше, ніж приблизно 0,015, або приблизно 0,005 - приблизно 0,02,
К) ліпід знаходиться у формі очищеної олії, і 60 І) ліпід є негідрогенізованим.
У варіанті здійснення, 1) приблизно 91 95 - приблизно 94 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить олеїнова кислота, 2) менше, ніж приблизно 2,75 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить пальмітинова кислота, 3) менше, ніж приблизно З 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить лінолева кислота, 4) а-ліноленова кислота є такою, що не виявляється в жирнокислотному складі ліпіду, 5) ООР для вмісту у вигляді жирних кислот ліпіду становить приблизно 0,033 - приблизно 0,023, або приблизно 0,033 - приблизно 0,018, 6) значення РІО для вмісту у вигляді жирних кислот ліпіду становить приблизно 0,020 - приблизно 0,063, 7) приблизно 96 95, або приблизно 93 95, або приблизно 94 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становлять мононенасичені жирні кислоти, і 8) ліпід характеризується часткою олеїнової кислоти в мононенасиченості (ОМР), що становить менше, ніж приблизно 0,02, або менше, ніж приблизно 0,015, або приблизно 0,005 - приблизно 0,02.
У наступному варіанті здійснення, 1) приблизно 91 95 - приблизно 94 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить олеїнова кислота, 2) менше, ніж приблизно 2,75 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить пальмітинова кислота, 3) менше, ніж приблизно З 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становить лінолева кислота, 4) а-ліноленова кислота є такою, що не виявляється в жирнокислотному складі ліпіду, 5) приблизно 96 95, або приблизно 93 95, або приблизно 94 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становлять мононенасичені жирні кислоти, і б) ліпід характеризується часткою олеїнової кислоти в мононенасиченості (ОМР), що становить менше, ніж приблизно 0,02, або менше, ніж приблизно 0,015, або приблизно 0,005 -
Ко) приблизно 0,02.
У варіанті здійснення РИБА є лінолева кислота.
У варіанті здійснення с-ліноленова кислота є такою, що не виявляється в жирнокислотному складі ліпіду.
У наступному варіанті здійснення приблизно 55 95 - приблизно 80 95, або приблизно 60 95 - приблизно 80 95, або приблизно 70 95 - приблизно 80 95, або принаймні приблизно 60 95, або принаймні приблизно 70 95, або приблизно 60 95, або приблизно 70 95, або приблизно 80 95 від вмісту ТАС у ліпіді становить триолеїн.
В іншому варіанті здійснення менше, ніж приблизно 5 95, або менше, ніж приблизно 2 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно 5 95 від вмісту олеїнової кислоти в ліпіді знаходиться у формі діацилгліцеринів (САС).
У наступному варіанті здійснення ліпід знаходиться у формі олії, причому принаймні 90 95, або принаймні 95 95, принаймні приблизно 98 95, або приблизно 9595 - приблизно 9895 у ваговому відношенні олії становить ліпід.
У переважному варіанті здійснення олійним насінням є нефотосинтезуюче олійне насіння.
Приклади нефотосинтезуючого олійного насіння включають, але без обов'язкового обмеження, насіння сафлору, соняшнику, бавовнику або рицини звичайної. У переважному варіанті здійснення нефотосинтезуючим насінням олійної рослини є насіння сафлору.
У варіанті здійснення ліпід, крім того, включає один або більше стеролів.
У наступному варіанті здійснення ліпід знаходиться у формі олії, і цей ліпід включає менше, ніж приблизно 5 мг стеролів/г олії, або приблизно 1,5 мг стеролів/г олії - приблизно 5 мг стеролів/г олії.
У варіанті здійснення ліпід включає одне або більше або усі з: а) приблизно 1,595 - приблизно 4,595, або приблизно 2,395 - приблизно 4,595 від загального вмісту стеролів становить ергост-7-ен-Зр-ол,
Б) приблизно 0,5 95 - приблизно З 95, або приблизно 1,5 95 - приблизно З 95 від загального вмісту стеролів становить від загального вмісту стеролів становить тритерпеновий спирт, с) приблизно 8,995 - приблизно 2095 від загального вмісту стеролів становить А?7- стигмастерол/стигмаст-7-ен-Зр-ол, і
Я) приблизно 1,795 - приблизно 6,195 від загального вмісту стеролів становить А?7- (516) авенастерол.
У наступному варіанті здійснення ліпід має об'єм, що становить принаймні 1 літр, і/або вагу, що становить принаймні 1 кг, і/або цей ліпід екстрагований з олійного насіння, отриманого від вирощених у полі рослин.
У варіанті здійснення ліпід екстрагований з олійного насіння за допомогою роздавлювання і включає менше, ніж приблизно 7 95 води у ваговому відношенні. В іншому варіанті здійснення ліпід є очищеним ліпідом (екстрагованим розчинником і рафінованим) і включає менше, ніж приблизно 0,1 95, або менше, ніж приблизно 0,05 95 води, у ваговому відношенні.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується композиція, що включає перший компонент, який є ліпідом даного винаходу, і другий компонент, переважно у випадках, коли композиція отримана за допомогою змішування ліпіду з другим компонентом.
Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, другий компонент можна вибрати із широкого ряду різних сполук/композицій. В одному прикладі другим компонентом є речовина, яка не є ліпідом, така, як фермент, небілковий (неферментний) каталізатор або хімічна речовина (наприклад, гідроксид натрію, метанол або метал), або один або більше інгредієнтів їжі.
Даним винаходом також забезпечується спосіб одержання олії, що включає: її одержання олійного насіння, яке включає, і/або яке здатне породжувати рослину, що утворює олійне насіння, яке включає олію, причому вмістом у вигляді олії олійного насіння є визначений тут ліпід, і ії) екстрагування олії з олійного насіння для того, щоб одержати олію.
У переважному варіанті здійснення олійне насіння включає перший екзогенний полінуклеотид, що кодує першу РНК, яка викликає генний сайленсинг, яка здатна зменшити експресію гена Ат12-десатурази (БАО2) в олійному насінні, що розвивається, порівняно з відповідним олійним насінням, у якому відсутній екзогенний полінуклеотид, і причому полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в олійному насінні, що розвивається.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб одержання олії, що включає: ї одержання насіння сафлору, вміст у вигляді олії якого включає і/або яке здатне породжувати рослину, що утворює олійне насіння, вміст у вигляді олії якого включає триацилгліцерини (ТАС), що складаються з жирних кислот, етерифікованих до гліцерину, і
Зо причому а) жирні кислоти включають пальмітинову кислоту й олеїнову кислоту,
Юр) принаймні 95 95 у ваговому відношенні від олійності насіння становить ТАС, с) приблизно 75 95 - приблизно 95 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить олеїнова кислота, а) менше, ніж приблизно 5,1 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить пальмітинова кислота, і е) вміст у вигляді олії насіння характеризується часткою десатурації олеїнової кислоти (ООР), що становить менше, ніж приблизно 0,17, або значенням відношення пальмітинова кислота т лінолева кислота/олеїнову кислоту (РІ 0), що становить менше, ніж приблизно 0,26, і ії) екстрагування олії з насіння сафлору для того, щоб одержати олію, причому насіння сафлору включає перший екзогенний полінуклеотид, що кодує РНК, яка викликає генний сайленсинг, яка здатна зменшити експресію гена Д12-десатурази (БАЗ) у насінні сафлору, що розвивається, порівняно з відповідним насінням сафлору, у якому відсутній екзогенний полінуклеотид, і причому полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в насінні сафлору, що розвивається.
В іншому варіанті здійснення олійне насіння або насіння сафлору включає другий екзогенний полінуклеотид, що кодує другу РНК, яка викликає генний сайленсинг, яка здатна зменшити експресію гена пальмітоїл-АСР-тіоестерази (БАТВ) в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору порівняно з відповідним олійним насінням або насінням сафлору, у якому відсутній другий екзогенний полінуклеотид, і причому другий екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору.
В іншому варіанті здійснення олійне насіння або насіння сафлору включає третій екзогенний полінуклеотид, що кодує третю РНК, яка викликає генний сайленсинг, яка здатна зменшити експресію гена пластидної десатурази б жирних кислот (БАЮОб) в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору порівняно з відповідним олійним насінням або насінням сафлору, у якому відсутній третій екзогенний полінуклеотид, і причому третій екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору. 60 У варіанті здійснення
1) ген ЕАБ2 являє собою один або більше або кожний з гена СІЕЕАЮ2-1, гена СЕЕЄАОЮ2-2 і гена
СТІЕАО2-10, переважно гена СІРАЮ2-1 і/або гена СІЕЄАОЮ2-2, і/або 2) ген ЕАТВ являє собою ген СІРАТВ-3, і/або 3) ген ЕАЮб являє собою ген СІЕАЮб.
У варіанті здійснення вміст у вигляді олії насіння сафлору має одну або більше або усі з наступних особливостей, а) приблизно 80 95 - приблизно 94 95, або приблизно 85 95 - приблизно 94 95, або приблизно 90 95 - приблизно 94 95, або приблизно 91 95 - приблизно 94 95, або приблизно 91 95 - приблизно 92 95, або приблизно 92 95, або приблизно 93 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить олеїнова кислота, р) менше, ніж приблизно 5 95, або менше, ніж приблизно 4 95, або менше, ніж приблизно
З 9Уо, або менше, ніж приблизно 2,75 95, або менше, ніж приблизно 2,5 95, або приблизно З 95, або приблизно 2,75 95, або приблизно 2,5 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить пальмітинова кислота, с) приблизно 0,1 95 - приблизно 15 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно 10 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно 7,5 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно 5 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно
З 95, або приблизно 2 95 - приблизно З 95, або приблизно З 95, або приблизно 2 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становлять поліненасичені жирні кислоти (РОЕА), а) менше, ніж приблизно 15 95, або менше, ніж приблизно 10 95, або менше, ніж приблизно
БУ, або менше, ніж приблизно З 95, або менше, ніж приблизно 2,595, або менше, ніж приблизно 2,25 95, або приблизно 3 95, або приблизно 2,5 95, або приблизно 2,25 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить лінолева кислота (І А), е) приблизно 80 95 - приблизно 96 95, або приблизно 90 95 - приблизно 96 95, або приблизно 92 95 - приблизно 96 95, або приблизно 93 95, або приблизно 94 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становлять мононенасичені жирні кислоти,
І) ліпід характеризується часткою олеїнової кислоти в мононенасиченості (ОМР), що становить менше, ніж приблизно 0,05, або менше, ніж приблизно 0,02, або менше, ніж
Ко) приблизно 0,015, або приблизно 0,005 - приблизно 0,05, або приблизно 0,005 - приблизно 0,02, 9) ООР для вмісту у вигляді олії насіння становить приблизно 0,17 - приблизно 0,01, або приблизно 0,15 - приблизно 0,01, або приблизно 0,1 - приблизно 0,01, або приблизно 0,075 - приблизно 0,01, або приблизно 0,050 - приблизно 0,01, або приблизно 0,033 - приблизно 0,01, або приблизно 0,033 - приблизно 0,016, або приблизно 0,033 -приблизно 0,023, або становить приблизно 0,03, або приблизно 0,02, або приблизно 0,01, і
Р) значення РІО для вмісту у вигляді олії насіння становить приблизно 0,20 - приблизно 0,026, або приблизно 0,020 - приблизно 0,2, або приблизно 0,020 - приблизно 0,15, або приблизно 0,020 - приблизно 0,1, або приблизно 0,020 і приблизно 0,075, або приблизно 0,050 і приблизно 0,055, або становить приблизно 0,05, або приблизно 0,040, або приблизно 0,030, або приблизно 0,020.
У варіанті здійснення стадія екстракції олії включає роздавлювання олійного насіння або насіння сафлору.
Проте, в іншому варіанті здійснення спосіб, крім того, включає стадію очищення олії, екстрагованої з олійного насіння або насіння сафлору, причому стадія очищення включає одне або більше або усі з групи, що складається з: рафінування гідратацією, дезодорації, знебарвлення, сушіння і/або фракціонування екстрагованої олії, /або видалення принаймні деяких, переважно по суті всіх, восків і/або воскових ефірів з екстрагованої олії.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується олійне насіння, вміст у вигляді олії якого включає, і/або яке здатне породжувати рослину, що утворює олійне насіння, вміст у вигляді олії якого включає триацилгліцерини (ТАС), що складаються з жирних кислот, етерифікованих до гліцерину, і причому ї) жирні кислоти включають пальмітинову кислоту й олеїнову кислоту, і) принаймні 95 95 у ваговому відношенні від олійності олійного насіння становить ТАС, ії) приблизно 90 95 - приблизно 95 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії олійного насіння становить олеїнова кислота, їм) менше, ніж приблизно 3,1 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії олійного насіння становить пальмітинова кислота, і м) вміст у вигляді олії олійного насіння характеризується часткою десатурації олеїнової кислоти (ООР), що становить менше, ніж приблизно 0,037, і/або значенням відношення пальмітинова кислота ї- лінолева кислота/олеїнову кислоту (РІО), що становить менше, ніж приблизно 0,063.
У варіанті здійснення олійним насінням є нефотосинтезуюче олійне насіння, переважно насіння сафлору, соняшнику, бавовнику або рицини звичайної.
В іншому варіанті здійснення олійне насіння включає перший екзогенний полінуклеотид, що кодує першу РНК, яка викликає генний сайленсинг, яка здатна зменшити експресію гена А12- десатурази (БАЮ2) в олійному насінні, що розвивається, порівняно з відповідним олійним насінням, у якому відсутній екзогенний полінуклеотид, і причому перший екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в олійному насінні, що розвивається.
Проте, в іншому аспекті даним винаходом забезпечується насіння сафлору, вміст у вигляді олії якого включає, і/або яке здатне породжувати рослину, що утворює насіння, вміст у вигляді олії якого включає триацилгліцерини (ТАС), що складаються з жирних кислот, етерифікованих до гліцерину, і причому ї) жирні кислоти включають пальмітинову кислоту й олеїнову кислоту, і) принаймні 95 95 у ваговому відношенні від олійності насіння становить ТАС, ії) приблизно 75 95 - приблизно 95 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить олеїнова кислота, їм) менше, ніж приблизно 5,1 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить пальмітинова кислота, і м) вміст у вигляді олії насіння характеризується часткою десатурації олеїнової кислоти (ООР), що становить менше, ніж приблизно 0,17, і/або значенням відношення пальмітинова кислота т лінолева кислота/олеїнову кислоту (РІ 0), що становить менше, ніж приблизно 0,26, і причому насіння сафлору включає перший екзогенний полінуклеотид, що кодує першу РНК, яка викликає генний сайленсинг, яка здатна зменшити експресію гена Д12-десатурази (ЕАО2) у насінні сафлору, що розвивається, порівняно з відповідним насінням сафлору, у якому відсутній екзогенний полінуклеотид, і причому перший екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в насінні сафлору, що розвивається.
Зо У варіанті здійснення вміст у вигляді олії насіння сафлору має одну або більше з наступних особливостей, а) приблизно 80 95 - приблизно 94 95, або приблизно 85 95 - приблизно 94 95, або приблизно 90 95 - приблизно 94 95, або приблизно 91 95 - приблизно 94 95, або приблизно 91 95 - приблизно 92 95, або приблизно 92 95, або приблизно 93 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить олеїнова кислота, р) менше, ніж приблизно 5 95, або менше, ніж приблизно 4 95, або менше, ніж приблизно
З 9Уо, або менше, ніж приблизно 2,75 95, або менше, ніж приблизно 2,5 95, або приблизно З 95, або приблизно 2,75 95, або приблизно 2,5 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить пальмітинова кислота, с) приблизно 0,1 95 - приблизно 15 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно 10 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно 7,5 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно 5 95, або приблизно 0,1 95 - приблизно
З 95, або приблизно 2 95 - приблизно З 95, або приблизно З 95, або приблизно 2 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становлять поліненасичені жирні кислоти (РОЕА), а) менше, ніж приблизно 15 95, або менше, ніж приблизно 10 95, або менше, ніж приблизно 595, або менше, ніж приблизно З 95, або менше, ніж приблизно 2,595, або менше, ніж приблизно 2,25 95, або приблизно 3 95, або приблизно 2,5 95, або приблизно 2,25 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у вмісті у вигляді олії насіння становить лінолева кислота (І А), е) приблизно 80 95 - приблизно 96 95, або приблизно 90 95 - приблизно 96 95, або приблизно 92 95 - приблизно 96 95, або приблизно 93 95, або приблизно 94 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот у ліпіді становлять мононенасичені жирні кислоти,
І) ліпід характеризується часткою олеїнової кислоти в мононенасиченості (ОМР), що становить менше, ніж приблизно 0,05, або менше, ніж приблизно 0,02, або менше, ніж приблизно 0,015, або приблизно 0,005 - приблизно 0,05, або приблизно 0,005 - приблизно 0,02, 9) ООР для вмісту у вигляді олії насіння становить приблизно 0,17 - приблизно 0,01, або приблизно 0,15 - приблизно 0,01, або приблизно 0,1 - приблизно 0,01, або приблизно 0,075 - приблизно 0,01, або приблизно 0,050 - приблизно 0,01, або приблизно 0,033 - приблизно 0,01, або приблизно 0,033 - приблизно 0,016, або приблизно 0,033 - приблизно 0,023, або становить 60 приблизно 0,03, або приблизно 0,02, або приблизно 0,01, і
Р) значення РІО для вмісту у вигляді олії насіння становить приблизно 0,20 - приблизно 0,026, або приблизно 0,020 - приблизно 0,2, або приблизно 0,020 - приблизно 0,15, або приблизно 0,020 - приблизно 0,1, або приблизно 0,020 і приблизно 0,075, або приблизно 0,050 і приблизно 0,055, або становить приблизно 0,05, або приблизно 0,040, або приблизно 0,030, або приблизно 0,020.
У наступному варіанті здійснення вмістом у вигляді олії олійного насіння або насіння сафлору є ліпід, що, крім того, характеризується однією або більше вищезгаданими особливостями.
В іншому варіанті здійснення олійне насіння або насіння сафлору включає другий екзогенний полінуклеотид, що кодує другу РНК, яка викликає генний сайленсинг, яка здатна зменшити експресію гена пальмітоїл-АСР-тіоестерази (БАТВ) в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору порівняно з відповідним олійним насінням або насінням сафлору, у якому відсутній другий екзогенний полінуклеотид, і причому другий екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору.
У наступному варіанті здійснення олійне насіння або насіння сафлору включає третій екзогенний полінуклеотид, що здатний зменшити експресію гена пластидної десатурази 06 жирних кислот (РГАЮОб) в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору порівняно з відповідним олійним насінням або насінням сафлору, у якому відсутній третій екзогенний полінуклеотид, і причому третій екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором, який керує експресією полінуклеотиду в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору.
В іншому варіанті здійснення перша РНК, яка викликає сайленсинг, зменшує експресію більш ніж одного ендогенного гена, що кодує ЕАб2, в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору, і/або причому друга РНК, яка викликає сайленсинг, зменшує експресію більш ніж одного ендогенного гена, що кодує ЕАТВ, в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору.
Проте, у наступному варіанті здійснення перший екзогенний полінуклеотид і один із двох або обоє з другого екзогенного полінуклеотиду і третього екзогенного полінуклеотиду ковалентно з'єднані в одній молекулі ДНК, необов'язково за допомогою зв'язувальних послідовностей ДНК між першим, другим і/або третім екзогенними полінуклеотидами.
В іншому варіанті здійснення перший екзогенний полінуклеотид і один із двох або обоє з другого екзогенного полінуклеотиду і третього екзогенного полінуклеотиду знаходяться під контролем одного промотору, так що, коли перший екзогенний полінуклеотид і другий екзогенний полінуклеотид і/або третій екзогенний полінуклеотид транскрибуються в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору, перша РНК, яка викликає сайленсинг, і друга
РНК, яка викликає сайленсинг, і/або третя РНК, яка викликає сайленсинг, ковалентно зв'язані у вигляді частин одного РНК-транскрипту.
В іншому варіанті здійснення олійне насіння або насіння сафлору включає одну транспортну (перенесену) ДНК, інтегровану в геном олійного насіння або насіння сафлору, і причому одна транспортна ДНК включає перший екзогенний полінуклеотид і один із двох або обоє з другого екзогенного полінуклеотиду і третього екзогенного полінуклеотиду.
Переважно олійне насіння або насіння сафлору є гомозиготним по транспортній ДНК.
У варіанті здійснення кожну з першої РНК, яка викликає генний сайленсинг, другої РНК, яка викликає генний сайленсинг, і третьої РНК, яка викликає генний сайленсинг, незалежно вибирають із групи, що складається з антисмислового полінуклеотиду, смислового полінуклеотиду, каталітичного полінуклеотиду, мікроРНК і дволанцюжкової РНК.
У наступному варіанті здійснення будь-який один або більше, переважно всі, із промоторів є специфічними для насіння і переважно здебільшого експресуються в зародку олійного насіння, що розвивається, або насінні сафлору.
В іншому варіанті здійснення олійне насіння або насіння сафлору включає одну або більше мутацій в одному або більше генів ЕАО2, причому мутація(ї) зменшує активність одного або більше генів ЕАЮ2 в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору порівняно з відповідним олійним насінням або насінням сафлору, у якому відсутня мутація).
В іншому варіанті здійснення олійне насіння або насіння сафлору включає, порівняно з геном ЕАБ2 дикі типи у відповідному олійному насінні або насінні сафлору, мутацію в гені ЕАО2, яка являє собою делецію, вставку, інверсію, зсув рамки зчитування, стоп-кодон передчасної трансляції або одну або більше неконсервативних амінокислотних замін.
У наступному варіанті здійснення мутацією є нуль-мутація в гені ЕАО2.
В іншому варіанті здійснення принаймні одна з мутацій знаходиться в гені ЕАО2, який кодує великий ступінь активності ЕАБ2 в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору, у якому відсутня мутація(ї), ніж будь-який інший ген ГАб2 в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору.
В іншому варіанті здійснення насінням є насіння сафлору, і геном ЕАб2 є ген СІЕЕАО2-1. У цьому варіанті здійснення також переважно, коли перша РНК, яка викликає сайленсинг, принаймні здатна зменшити експресію гена СТЕАО2-2.
В іншому варіанті здійснення насінням є насіння сафлору, яке включає алель ої гена
СІРАО2-1 або алель о11 гена СІЕАО2-1, або обидва алелі. У варіанті здійснення алель ої або алель 011 гена СІРАОБ2-1 є присутнім у гомозиготному стані.
В іншому варіанті здійснення білок ЕАОБ2 є таким, що не виявляється в олійному насінні або насінні сафлору.
В іншому варіанті здійснення насінням є насіння сафлору, і перша РНК, яка викликає сайленсинг, зменшує експресію обох генів СІЕЄАЮ2-1 і СТЕЕАЮ2-2.
В іншому варіанті здійснення насінням є насіння сафлору, у якому 1) геном БГАЮ2 є один або більше з гена СІБАЮ2-1, гена СІРАЮ2-2 і гена СІБАЮ2-10, переважно гена СІРАЮ2-1 і/або гена СІЕЕАЮ2-2, і/або 2) геном ЕГАТВ є ген СІРАТВ-3, і/або 3) геном ЕАЮб є ген СТЕЕАОб.
Також забезпечується олійна рослина або рослина сафлор, здатна утворювати насіння даного винаходу.
У варіанті здійснення рослина є трансгенною і гомозиготною по кожному екзогенному полінуклеотиду і/або включає перший екзогенний полінуклеотид і один із двох або обоє з другого екзогенного полінуклеотиду або третього екзогенного полінуклеотиду.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується в значній мірі очищений і/або рекомбінатний поліпептид, що включає амінокислоти з послідовністю, представленою в будь- якій з ЗЕО ІЮО МО: 27-37, 44, 45 або 48, його біологічно активний фрагмент або амінокислотна послідовність, ідентична на принаймні 40 95 будь-якій одній або більше з 5БЕО ІЮ МО: 27-37, 44, 45 або 48.
Зо У варіанті здійснення поліпептидом є фермент, що модифікує жирні кислоти, переважно олеат-ДІ12-десатураза, Д12-ацетиленаза, пальмітолеат-Д12-десатураза або пальмітоїл--АСР- тіоестераза (ЄАТВ).
У подальшому аспекті даним винаходом забезпечується виділений і/або екзогенний полінуклеотид, що включає одне або більше з ї) нуклеотидів, що мають послідовність, представлену в будь-якій з «ЕО ІЮ МО: 1-25, 40-43, 46 або 47, і) нуклеотидів, які мають послідовність, що кодує поліпептид даного винаходу, ії) нуклеотидів, що гібридизуються з послідовністю, представленою в будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 1-25, 40-43, 46 або 47, і їм) нуклеотидів, які мають таку послідовність, що після експресії в насінні олійної рослини зменшується експресія гена, який кодує принаймні один поліпептид даного винаходу.
В особливо переважному варіанті здійснення полінуклеотид включає нуклеотиди, які мають таку послідовність, що після експресії в насінні олійної рослини зменшується експресія гена, що кодує принаймні один поліпептид даного винаходу.
У варіанті здійснення полінуклеотид елемента ім) включає послідовність нуклеотидів, представлену в будь-якій з БЕО ІЮ МО: 49-51 (у випадках, коли тимін (Т) заміняється урацилом (0)).
У варіанті здійснення полінуклеотид елемента ім) вибирають з антисмислового полінуклеотиду, смислового полінуклеотиду, каталітичного полінуклеотиду, мікроРНК, молекули дволанцюжкової РНК (длРНК) і її підданого процесингу РНК-продукту.
У наступному варіанті здійснення полінуклеотидом є молекула длРНК або її підданий процесингу РНК-продукт, що включає принаймні 19 нуклеотидів, які слідують один за одним, що ідентичні на принаймні 95 95 комплементу будь-якої однієї або більше з ЗЕО ІЮ МО: 1-25, 40-43, 46, 47 або 49-51 (у випадках, коли тимін (Т) заміняється урацилом ())).
В іншому варіанті здійснення молекула длРНК є попередником мікроРНК, і/або причому її підданим процесингу РНК-продуктом є мікроР НК.
Проте, у наступному варіанті здійснення полінуклеотид транскрибується в олійному насінні, що розвивається, або насінні сафлору під контролем одного промотору, причому молекула
ДЛРНК включає комплементарні смислову й антисмислову послідовності, які здатні 60 гібридизуватися одна з одною, зв'язані за допомогою одноланцюжкової ділянки РНК.
Проте, у наступному варіанті здійснення полінуклеотид, у випадку присутності в насінні сафлору, що розвивається, ї) зменшує експресію ендогенного гена, що кодує олеат-Д12-десатуразу (ЕАО2), у насінні, що розвивається, при цьому ЕАБ2 має амінокислотну послідовність, представлену в будь-якій одній або більше з ЗЕО ІЮО МО: 27, 28 або 36, переважно принаймні одній або обох з ЗЕО ІЮ МО: 27128; ї) зменшує експресію ендогенного гена, що кодує пальмітоїл-АСР-тіоестеразу (РАТВ), у насінні, що розвивається, при цьому ЕАТВ має амінокислотну послідовність, представлену в
ЗЕО ІЮ МО: 45; і/або ії) зменшує експресію гена, що кодує десатуразу Фб жирних кислот (РАОб), у насінні, що розвивається, при цьому ЕАЮбЄ має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 48.
Також забезпечується химерний вектор, який включає полінуклеотид даного винаходу, функціонально зв'язаний із промотором.
У варіанті здійснення промотор є таким, що функціонує в олійному насінні або є специфічним для насіння промотором, переважно є переважно експресованим у зародку олійного насіння, що розвивається.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується рекомбінантна клітина, яка включає екзогенний полінуклеотид даного винаходу і/або вектор даного винаходу.
Клітиною може бути клітина будь-якого типу, наприклад, але без обмеження, бактеріальна клітина, дріжджова клітина або клітина рослини.
Переважно, клітиною є клітина рослини, переважно клітина насіння рослини. Більш переважно клітиною рослини є клітина олійної рослини. Навіть більш переважно клітиною рослини є клітина нефотосинтезуючого насіння, переважно клітина насіння сафлору, соняшнику, бавовнику або рицини звичайної.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується трансгенний організм, який не є людиною, що включає один або більше полінуклеотидів даного винаходу, вектор даного винаходу і клітину даного винаходу.
Переважно трансгенним, таким, що не є людиною, організмом є рослина, більш переважно
Зо - олійна рослина.
Проте, в іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб створення клітини даного винаходу, що включає стадію введення полінуклеотиду даного винаходу і/або вектора даного винаходу в клітину.
Також забезпечується застосування полінуклеотиду даного винаходу і/або вектора даного винаходу для створення рекомбінантної клітини.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб створення трансгенної олійної рослини, що утворює насіння даного винаходу, або її насіння, при цьому спосіб включає її уведення принаймні одного полінуклеотиду даного винаходу і/або принаймні одного вектора даного винаходу в клітину олійної рослини, і) регенерацію трансгенної рослини з клітини, і ії) необов'язково, одержання однієї або більше рослин-потомків трансгенної рослини або їхнього насіння, тим самим створюючи трансгенну олійну рослину або її насіння.
У варіанті здійснення насінням є насіння сафлору даного винаходу.
У наступному варіанті здійснення одна або більше рослин-потомків або її насіння включає ї) перший екзогенний полінуклеотид, і/або ії) другий екзогенний полінуклеотид, і/або ії) третій екзогенний полінуклеотид, переважно всі три екзогенні полінуклеотиди.
У наступному варіанті здійснення одна або більше рослин-потомків або її насіння включає одну або більше мутацій, визначених вище.
Проте, у додатковому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб створення олійної рослини, що включає її схрещування першої батьківської олійної рослини, яка включає перший полінуклеотид даного винаходу або перший вектор даного винаходу, із другою батьківською олійною рослиною, яка включає другий полінуклеотид даного винаходу або другий вектор даного винаходу, ії) скринінг рослин-потомків, що утворюються в результаті схрещування, на присутність обох полінуклеотидів або обох векторів; і ії) відбір рослини-потомка, яка включає як (а) перший полінуклеотид або перший вектор, так і (Б) другий полінуклеотид або другий вектор, і, крім того, яка характеризується збільшеною часткою олеїновою кислотою і зменшеною часткою пальмітинової кислоти в складі олії з насіння рослини.
У подальшому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб генотипування рослини сафлору, який включає детектування молекули нуклеїнової кислоти рослини, причому молекула нуклеїнової кислоти зчеплена з, і/або включає щонайменше частину, одним (одного) або більше генів СТЕАЮ2-1, СІЕЕАО2-2 або СІРАЮБ2-10, переважно принаймні з одним або обома з генів
СІРАО2-1 і СІЕЕАОЮ2-2, або принаймні з геном СІРАЮ2-1, рослини сафлору.
У варіанті здійснення спосіб включає визначення рівня експресії і/або послідовності одного або більше з генів СІЄАЮО2-1, СІЕЕА02-2 або СІРА02-10 рослини.
У варіанті здійснення спосіб включає: ї) гібридизацію другої молекули нуклеїнової кислоти із зазначеною молекулою нуклеїнової кислоти рослини, ії) необов'язково, гібридизацію принаймні однієї іншої молекули нуклеїнової кислоти із зазначеною молекулою нуклеїнової кислоти рослини; і ії) детектування продукту зазначеної стадії(й) гібридизації або відсутність продукту в результаті зазначеної стадій) гібридизації.
Проте, у наступному варіанті здійснення друга молекула нуклеїнової кислоти використовується як праймер для зворотної транскрипції або реплікації принаймні частини молекули нуклеїнової кислоти рослини.
Нуклеїнову кислоту можна детектувати, використовуючи ряд добре відомих методів, таких, як, але без обмеження, аналіз поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів, аналіз поліморфізму довжин ампліфікованих фрагментів, ампліфікація мікросателітних локусів, секвенування нуклеїнової кислоти і/або ампліфікація нуклеїнової кислоти.
У варіанті здійснення спосіб детектує відсутність або присутність алеля гена СІБАЮ2-1, переважно алеля о).
У подальшому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб відбору рослини сафлору з популяції рослин, що включає:
Зо її генотипування зазначеної популяції рослин, використовуючи спосіб даного винаходу, причому зазначена популяція рослин була отримана в результаті схрещування між двома рослинами, принаймні одна з яких включає алель гена СІРАЮ2-1, СІЕАО2-2 або СІБАЮ2-10, переважно принаймні одного або обох з генів СТЕАЮ2-1 і СЕЕА0Ю2-2, або принаймні гена СІЕАО2- 1, що наділяє насіння, яке розвивається, зазначеної рослини зменшеним рівнем активності А12- десатурази, порівняно з відповідним насінням рослини сафлору, у якому відсутній зазначений алель, і ії) відбір рослини сафлору на основі присутності або відсутності зазначеного алеля.
У подальшому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб введення алеля гена
СІРАО2-1, СТЕА02-2 або СІРАЮ2-10 у рослину сафлор, у якій відсутній цей алель, при цьому спосіб включає; її схрещування першої батьківської рослини сафлору з другою батьківською рослиною сафлором, причому друга рослина включає зазначений алель гена СІЕЕАЮ2-1, СІЕАЮ2-2 або
СІРАО2-10, і і) поворотне схрещування потомка, отриманого в результаті схрещування стадії ії), з рослинами з тим же генотипом, що і перша батьківська рослина, достатню кількість разів для одержання рослини з перевагою генотипу першої рослини, але яка включає зазначений алель, причому алель наділяє насіння, що розвивається, зазначеної рослини зменшеним рівнем активності Д12-десатурази, порівняно з відповідним насінням рослини сафлору, у якому відсутній зазначений алель, і причому рослин-потомків генотипують на присутність або відсутність зазначеного алеля, використовуючи спосіб даного винаходу.
Також забезпечується трансгенна рослина, або рослини - її потомки, або її насіння, створене, використовуючи спосіб даного винаходу.
У подальшому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб виробництва насіння, що включає а) вирощування рослини даного винаходу, переважно в полі у вигляді частини популяції принаймні 1000 таких рослин і р) збір врожаю насіння.
Проте, у подальшому аспекті даним винаходом забезпечується олія, отримана або одержувана за допомогою одного або більше способів даного винаходу, з олійного насіння або 60 насіння сафлору даного винаходу, з рослини або її частини даного винаходу, із клітини даного винаходу і/або з такого, що не є людиною, трансгенного організму або його частини даного винаходу.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується композиція, яка включає одне або більше з ліпіду даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, поліпептиду даного винаходу, полінуклеотиду даного винаходу, вектора даного винаходу, клітини-хазяїна даного винаходу або олії даного винаходу й один або більше прийнятних носіїв.
Також забезпечується застосування одного або більше з ліпіду даного винаходу, композиції даного винаходу, способу даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, рослини або її частини даного винаходу, клітини-хазяїна даного винаходу, трансгенного організму, що не є людиною, або його частини даного винаходу, або олії даного винаходу для виробництва промислового продукту.
В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб виробництва промислового продукту, що включає стадії: її одержання одного або більше з ліпіду даного винаходу, композиції даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, рослини або її частини даного винаходу, клітини-хазяїна даного винаходу, трансгенного організму, що не є людиною, або його частини даного винаходу, або олії даного винаходу, ії) необов'язково, фізичної обробки одного або більше з ліпіду даного винаходу, композиції даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, рослини або її частини даного винаходу, клітини-хазяїна даного винаходу, трансгенного організму, що не є людиною, або його частини даного винаходу, або олії даного винаходу, стадії ї), і) перетворення принаймні деякої частини ліпіду даного винаходу, або ліпіду в одній або більше з композиції даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, рослини або частини рослини даного винаходу, клітини-хазяїна даного винаходу, трансгенного організму, що не є людиною, або його частини даного винаходу, або олії даного винаходу, або підданого фізичній обробці продукту стадії ії, у промисловий продукт за допомогою використання нагрівання, хімічного або ферментативного способу, або будь-якої їхньої комбінації, відносно ліпіду, і ії) одержання промислового продукту,
Ко) тим самим здійснюючи виробництво промислового продукту.
Проте, у подальшому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб виробництва палива, що включає ї) здійснення реакції одного або більше з ліпіду даного винаходу, або ліпіду в одній або більше з композиції даного винаходу, олійному насінні або насінні сафлору даного винаходу, рослині або частині рослини даного винаходу, клітині-хазяїні даного винаходу, трансгенному організмі, що не є людиною, або його частині даного винаходу, або олії даного винаходу, зі спиртом, необов'язково в присутності каталізатора, для утворення алкілових ефірів, і ії) необов'язково, змішування алкілових ефірів із паливом на нафтовій основі.
У варіанті здійснення алкіловими ефірами є метилові ефіри.
У подальшому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб виробництва продукту харчування, що включає змішування одного або більше з ліпіду даного винаходу, композиції даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, рослини або її частини даного винаходу, клітини-хазяїна відповідно до даного винаходу, трансгенного організму, що не є людиною, або його частини даного винаходу, або олії даного винаходу, із принаймні одним іншим харчовим інгредієнтом.
Також забезпечуються продукти харчування, косметичні засоби або хімічні продукти, що включають одне або більше з ліпіду даного винаходу, композиції даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, рослини або її частини даного винаходу, клітини- хазяїна відповідно до даного винаходу, трансгенного організму, що не є людиною, або його частини даного винаходу, або олії даного винаходу.
Проте, у подальшому аспекті забезпечується продукт, отриманий з одного або більше, або використовуючи одне або більше, з ліпіду даного винаходу, ліпіду в одній або більше з композиції даного винаходу, способу даного винаходу, олійного насіння або насіння сафлору даного винаходу, рослини або її частини даного винаходу, клітини-хазяїна даного винаходу, трансгенного організму, що не є людиною, або його частини даного винаходу, або олії даного винаходу.
Передбачається, що будь-який варіант здійснення тут застосований з необхідними змінами до будь-якого іншого варіанта здійснення, крім особливо обговорених випадків.
Об'єм даного винаходу не обмежується конкретними варіантами здійснення, описаними тут, що призначені лише для ілюстрації. Функціонально еквівалентні продукти, композиції і способи, безсумнівно, знаходяться в об'ємі даного винаходу, описаного тут.
Протягом всього цього опису, крім особливо обговорених випадків, або, якщо контекст не має на увазі інше, посилання на одну стадію, композицію, що є об'єктом винаходу, групу стадій або групу композицій, що є об'єктами винаходу, як передбачається, охоплює одну або множину (тобто одну або більше) цих стадій, композицій, що є об'єктами винаходу, груп стадій або груп композицій, що є об'єктами винаходу.
Нижче даний винахід описується через наступні необмежуючі приклади і з посиланням на супровідні фігури.
КОРОТКИЙ ОПИС СУПРОВІДНИХ КРЕСЛЕНЬ
Фіг. 1. Філогенетичне порівняння амінокислотних послідовностей, кодованих сімейством
ЕАО2г-подібних генів сафлору, і дивергентних БАЮ2-подібних ферментів з інших рослин.
Представлене філогенетичне древо було побудовано, використовуючи Месіог МТІ (Іпмігодеп).
Включеними в процес сполучення були десатурази ЕАЮ2 (ОЕ5), гідролази (ОН), епоксигенази (ЕРОХ), ацетиленази (АСЕТ) і кон'югази (СОМ). Ідентифікаційними номерами в СепеВапк амінокислотних послідовностей, представлених на філогенетичному древі, є: соСОМУ,
ААК2г6632.1; саА4СЕТ, АВСО0769.1; срЕРОХ, САА7б156.1; на4г4сСЕТ, АВС59684.1; азАСЕТ,
ААОЗ8036.1; асАСЕТ, ААОЗ8033.1; пПИАСЕТ, ААОЗ8031.1; пареЕб-2, ААЇІ 689821; НнареЕв-3,
ААЇ 68983.1; ІШОЕ5, АСЕ49507; нареЕз-1, ААЇ 68982.1; пІОЕ5, ААТ72296.2; оерЕ5, ААМУбЗ3040; 5іРЕ5, ААЕ80560.1; ЯйОЕ5-1, СААб5744.1; гсОН, ААС49010.1; абЕ5, ААМб61113.1; РІОН'ОЕ5,
ААСЗ2755.1; рІОН, АВО01458.1; Чп0Е5-4, ААО16653.1; ЧА Е5-2, САА71199.1. (со, Саієпашіа ойісіпаїїв; са, Стеріз аІріпе; ср, Стерів раіаезііпа; па, Неїапіпив аппит; ав, ОітогрпоїнНеса віпиа!е; дс, ЮОайсив сагоїа; НИ, Недега Неїїх; ш, Гіпит ив5іаййввітит; пі, Місойапа іабасит; оє, Оієа ешоравєа; ві, хХезатит іпаісит; гс, Вісіпи5 соттипів; аї, Агарідорвів ІНаїіапа; рі, Ррузаїа ТГепаїегі; рі, Рпузаїйа Іпанеїтеті.
Фіг. 2. Аналіз за допомогою блот-гібридизації по Саузерну СІРАО2-подібної геномної структури в генотипі БО сафлору. Геномну ДНК розщеплювали вісьмома різними рестриктазами до розділення в агарозному гелі. Цими ферментами були Ассі (доріжка 1), Во! (2), Ватні (3),
Зо ЕсокіІ (4), ЕсокМ (5), Ніпапі (6), хХраї (7) і Хпої (8). Блот зондували з використанням міченої радіоактивним ізотопом повної кодуючої області СЕЕАЮ2-6 і промивали в умовах зниженої жорсткості.
Фіг. 3. 50-М5 аналіз жирнокислотного складу дріжджів, які експресують СІБАЮ2-1 (В),
СІРАО2-2 (С), СТЕАЮ2-9 (0), ОБАО2-10 (Е) ії СЕЕАЮ2-11 (Р). Порожній вектор (А) і С крива для суміші С18:2 ізомерів (05).
Фіг. 4. 50-М5 аналіз жирнокислотного складу після транзиторної експресії СТЕАО02-11 у листках М. бепіпатіапа.
Фіг. 5. Аналіз за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу експресії генів СТЕЕАО2 сафлору.
Фіг. 6. Порівняння нуклеотидних послідовностей ділянки алелей СІРАЮ2-1 з генотипу дикого типу 5Ш і трьох генотипів, що визначають високий вміст олеїнової кислоти, а саме -- 5-317,
СМУ/99-ОЇ їі І езаї496, -- що демонструє делецію нуклеотиду в середині кодуючої СІРАЮ2-1 області в мутантів.
Фіг. 7. Порівняння ДНК-послідовностей інтронів у ТК у СІЕАВ2-1 у сорті дикого типу ЗШ і генотипі, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, 5-317. Вміщені в рамку послідовності
ДНК використовувалися для конструювання ідеальних ПЛР-маркерів для продуктів ПЛР, специфічних для генотипу, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, і специфічних для дикого типу.
Фіг. 8. Аналіз за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу рівнів МРНК для СЕА02- 1 ї СгА02-2 у зародках, що розвиваються, трьох стадій розвитку -- ранньої (7 ОРА), середньої (15 ОРА) ї пізньої (20 ЮРА). Сорти сафлору включають сорт дикого типу ЗИ і три сорти з високим вмістом олеїнової кислоти: 5-317, СМ/99-ОЇ і Ї езаї496.
Фіг. 9. Аналіз за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу генів СіРаї у листі, корені і зародках сафлору, що розвиваються, сорту БО. Ет-1 (рання стадія), Ет-2 (середня стадія) і
Ет-3 (пізня стадія).
Фіг. 10. Дендрограма, яка демонструє філогенетичний зв'язок між послідовностями ЕАОб сафлору і типовою пластидною Д12 десатуразою ЕАЮОб, ідентифікованою у вищих рослин
Уаїйорна сигсаз (БО106889); ОІеа епгораєа (АМ733075); Роршив Шіспосагра (ЕБЕ147523);
Агабідорвів Інаійапа (АМ079039); Оезсипапа 5орпіа (ЕР524189); Сіусіпе тах (АК243928); Вгаззіса пари (129214); Ропцаса оієгасеєа (ЕОЗ76530); Агаспіз Нуродаєа (БУ768730); Сіпкао Біоба (НОбО4563).
Фіг. 11. Склад діацилгліцеринів (БАС) (мольбоо) у 5317 порівняно з 5317-603.9, визначений з використанням аналізу за допомогою І С-М5 одного насіння.
Фіг. 12. Склад триацилгліцеринів (САС) (мольоо) у 5317 порівняно з 5317 -603.9, визначений з використанням аналізу за допомогою І С-М5 одного насіння.
Фіг. 13. Вміст олеїнової кислоти в сортах сафлору, вирощених у польових умовах у Маїтабгі австралійського літа 2011/2012.
Фіг. 14. (А) Базова структура фітостеролу з нумерацією циклів і бічних ланцюгів. (В) Хімічні структури деяких з фітостеролів.
РОЗ'ЯСНЕННЯ СПИСКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО І МО: 1 - КДНК, що кодує ЕА0Б2-1 сафлору.
ЗЕО ОО МО: 2 - КкКДНК, що кодує ЕАЮО2-2.
ЗЕО І МО: З - КДНК, що кодує ЕАЮБ2-3 сафлору.
ЗЕО І МО: 4 - КДНК, що кодує ЕА0Б2-4 сафлору.
ЗЕО І МО: 5 - КДНК, що кодує ЕАЮ2-5 сафлору.
ЗЕО І МО: 6 - КДНК, що кодує ЕАЮ2-6 сафлору.
ЗЕО І МО: 7 - КДНК, що кодує ЕАБ2-7 сафлору.
ЗЕО І МО: 8 - КДНК, що кодує ЕАЮ2-8 сафлору.
ЗЕО І МО: 9 - КДНК, що кодує ЕАЮ2-9 сафлору.
ЗЕО І МО: 10 - КДНК, що кодує ЕАО2-10 сафлору
ЗЕО І МО: 11 - КДНК, що кодує ЕАО2-11 сафлору.
ЗЕО І МО: 12 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-1 сафлору.
ЗЕО І МО: 13 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-2 сафлору.
ЗЕО І МО: 14 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-3 сафлору.
ЗЕО І МО: 15 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-4 сафлору.
ЗЕО І МО: 16 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-5 сафлору.
ЗЕО І МО: 17 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-6 сафлору.
ЗЕО І МО: 18 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-7 сафлору.
Коо) ЗЕО І МО: 19 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-8 сафлору.
ЗЕО І МО: 20 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-9 сафлору.
ЗЕО І МО: 21 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-10 сафлору.
ЗЕО І МО: 22 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮ2-11 сафлору.
ЗЕО І МО: 23 - Послідовність інтрона в гені ЕАЮ2-1 сафлору.
ЗЕО І МО: 24 - Послідовність інтрона в гені ЕАЮ2-2 сафлору.
ЗЕО І МО: 25 - Послідовність інтрона в гені ЕАЮ2-10 сафлору.
ЗЕО І МО: 26 - КкКДНК, що кодує усічений ЕАО2-1 сафлору (мутант НО).
ЗЕО ІЮ МО: 27-ЕАО2-1 сафлору.
ЗЕО ІЮ МО: 28-ЕАО2-2 сафлору.
ЗЕО ІЮ МО: 29-ЕАО2-3 сафлору.
ЗЕО ІО МО: 30-ЕАО2-4 сафлору.
ЗЕО ІО МО: 31-ЕАО2-5 сафлору.
ЗЕО ІО МО: 32-ЕАО2-6 сафлору.
ЗЕО ІЮ МО: 33-ЕАО2-7 сафлору.
ЗЕО ІО МО: 34-ЕАО2-8 сафлору.
ЗЕО ІЮ МО: 35-ЕА02-9 сафлору.
ЗЕО ІО МО: 36-ЕАЮ2-10 сафлору.
ЗЕО ІО МО: 37-ЕАО2-11 сафлору.
ЗЕО І МО: 38 - Усічений ЕАО2-1 сафлору (мутант НО).
ЗЕО І МО: 39 - КДНК, що кодує РАТВ-1 сафлору.
ЗЕО І МО: 40 - КДНК, що кодує РАТВ-2 сафлору.
ЗЕО І МО: 41 - КДНК, що кодує ЕАТВ-3 сафлору.
ЗЕО І МО: 42 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАТВ-2 сафлору.
ЗЕО І МО: 43 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАТВ-3 сафлору.
ЗЕО ІО МО: 44-ЕАТВ-2 сафлору.
ЗЕО ІЮ МО: 45-ЕАТВ-3 сафлору.
ЗЕО І МО: 46 - КДНК, що кодує ЕАОб сафлору.
ЗЕО І МО: 47 - Відкрита рамка зчитування, що кодує ЕАЮб сафлору.
ЗЕО ІЮ МО: 48-ЕАОб сафлору.
ЗЕО ІЮ МО: 49 - Послідовність СІЕЕАЮ2-2, використовувана в конструкції, що викликає генний сайленсинг, опосередкований РНК.
ЗЕО ІЮ МО: 50 - Послідовність СІЕЕАТВ-3, використовувана в конструкції, що викликає генний сайленсинг, опосередкований РНК.
ЗЕО ІО МО: 51 - Послідовність СІЕЕЄАЮб, використовувана в конструкції, що викликає генний сайленсинг, опосередкований РНК.
ЗЕО І МО: 52 - Промотор олеозину Агарідорб5ів ІПаїіапа.
ЗЕО І МО: 53 - Промотор лініну льону.
ЗЕО ІЮ МО: 54 - Сигнал поліаденілювання Мо5.
ЗЕО ІЮ МО: 55 - Сигнал поліаденілювання Осв5.
ЗЕО ІО МО: 56 - Послідовність СТЕЕАЮ2-1 дикого типу, що відповідає ділянці алеля о).
ЗБЕО ІЮ МО: 57 - Послідовність СІБАЮ2-2, що стосується алеля ої, зі зсувом рамки зчитування (те ж для 5-317, СМ/99-ОЇ і езЗаї496).
ЗЕО ІЮ МО: 58-158 - Олігонуклеотидні праймери.
ЗЕО ІЮ МО: 159-169 - Мотиви ферментів СЕЕАЮ2.
ЗЕО ІО МО: 170 - Інтрон у ТК у СІЕАЮ2-1 сорту БО сафлору дикого типу.
ЗЕО ІО МО: 171 - Інтрон у 2ОТК у СІБАЮ2-1 сорту 5-317 сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ДАНОГО ВИНАХОДУ
Загальні методи і визначення
Крім особливо обговорених випадків, передбачається, що всі технічні і наукові терміни, використовувані тут, мають те ж значення, що і значення, у якому їхні звичайно розуміє фахівець із середнім рівнем компетентності в даній галузі техніки (наприклад, культивування клітин, молекулярної генетики, імунології, імуногістохімії, хімії білків і біохімії).
Якщо не зазначено інше, методи рекомбінантних білків, культивування клітин і імунологічні методи, використовувані в даному винаході, є стандартними процедурами, добре відомими кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Такі методи описані і пояснені повністю у літературі в таких джерелах, як .). Реграї, А Ргасіїса! Сціде то Моїесшіаг Сіопіпд, Уопп УМіІєу апа
Зоп5 (1984), ). Затрбгоок еї аї., МоІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїюгу Мапиаї, Соїд ріпу Нагбоиг
Зо І арогаїогу Ргевз5 (1989), Т.А. Вгом/п (еайог), Евзепіїа! Моїесшіаг Віоіоду: А Ргасіїса! Арргоаси,
МоЇштез 1 апа 2, ІВІ Ргезз (1991), О.М. Сіомег апа В.О. Натез (еаіюгв), ОМА Сіопіпд: А Ргасіїіса)
Арргоасі, Моїштез 1-4, ІК. Ргезз (1995 і 1996), і Г.М. А!йзибеї еї а). (едйог5), Сиггепі Ргоїосо!5 іп
Моїесшіаг Віоіоду, Ссгеепе Рибр. Авз5осіаїез апа УМ/Пеу-Іпіег5сіепсе (1988, включаючи усі виправлені і доповнені видання дотепер), Еа Нагіоу/ апа Ваміа І апе (еййог5) Апіїбодіє5: А Гарогаїюгу Мапиаї,
Соій Зргіпуд Нагроиг Гарогаїогу, (1988), і У.Е. Соїїдап еї аї. (єайогє) Сштепі Ргоїосої5 іп
Ітітипоіоду, допп Уміеу 5 5оп5 (включаючи усі виправлені і доповнені видання дотепер).
Термін "і/або", наприклад, "Х і/або У", як мається на увазі, означає або "Х і У", або "Х або У", і, як передбачається, підтверджує в явній формі обидва значення або те або інше значення.
Використовуваний тут термін "приблизно", якщо тільки не зазначене інше, стосується ж/- 1095, більш переважно /-5 95, більш переважно -/-4 95, більш переважно /-3 95, більш переважно --7-2 95, більш переважно --/-1,5 95, більш переважно ч/-1 95, навіть більш переважно -/-0,5 95, від присвоєного значення.
Протягом усього цього опису слово "включати" або такі варіанти, як "включає" або "який включає", як буде матися на увазі, означає включення визначеного елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але без винятку будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.
Використовуваний тут термін "екстрагований ліпід" стосується ліпідної композиції, яка включає принаймні 60 95 (у ваговому відношенні) ліпіду і яка була екстрагована, наприклад, за допомогою роздавлювання, із трансгенного організму або його частини. Крім того, використовуваний тут термін "екстрагована олія" стосується олійної композиції, яка включає принаймні 60 95 (у ваговому відношенні) олії і яка була екстрагована з трансгенного організму або його частини.
Використовуваний тут термін "очищений" при використанні в зв'язку з ліпідом або олією даного винаходу типово означає, що екстрагований ліпід або олія був підданий одній або більше стадіям обробки для збільшення ступеня чистоти компонента у вигляді ліпіду/олії.
Наприклад, стадія очищення може включати одне або більше або усі з групи, що складається з: рафінування гідратацією, дезодорації знебарвлення, сушіння і/або фракціонування екстрагованої олії. Однак використовуваний тут термін "очищений" не включає процес переетерифікації або інший процес, що змінює жирнокислотний склад ліпіду або олії даного 60 винаходу для збільшення вмісту олеїнової кислоти у вигляді відсотка від загального вмісту жирних кислот. Іншими словами, жирнокислотний склад очищеного ліпіду або олії є по суті таким же, як і такий неочищеного ліпіду або олії. Жирнокислотний склад екстрагованого ліпіду або олії, такий, як, наприклад, частки олеїнової, лінолевої і пальмітинової кислот, є по суті таким же, як і жирнокислотний склад ліпіду або олії в насінні рослини, з якої його одержують. У цьому контексті "по суті такий же" означає 7-1 95, або, переважно, -/-0,5 б.
Використовуваний тут термін "частка десатурації олеїнової кислоти" або "ООР" стосується розрахунку, що включає ділення відносної кількості лінолевої кислоти і а-ліноленової кислоти, представленої у вигляді відсотка від суміші жирних кислот ліпіду, на суму відносних кількостей олеїнової кислоти, лінолевої і а-ліноленової кислоти, кожна з яких представлена у вигляді відсотка. Формула є наступною:
ООР-(Фо лінолевої кислоти «ж 95 а-ліноленової кислоти)/(9о олеїнової кислоти «ж 9о лінолевої кислоти ж 95 а-ліноленової кислоти). Наприклад, То603.12(5) прикладу 15 має загальний вміст лінолевої кислоти і с-ліноленової кислоти, що становить 2,15 95, і вміст лінолевої кислоти, а- ліноленової кислоти й олеїнової кислоти, що становить 93,88 95, що складає ОЮОР-О,0229.
Використовуваний тут термін "значення відношення пальмітинова кислота ї- лінолева кислота/олеїнову кислоту" або "РІО" стосується розрахунку, що включає ділення відносної кількості лінолевої кислоти і пальмітинової кислоти, представленої у вигляді відсотка від суміші жирних кислот ліпіду, на відносну кількість олеїнової кислоти, представлену у вигляді відсотка.
Формула є наступною:
РГО:-(95 пальмітинової кислоти «- до лінолевої кислоти)/9о олеїнової кислоти.
Наприклад, ТО603.12(5) прикладу 15 має загальний вміст лінолевої кислоти і пальмітинової кислоти, що становить 4,71 95, і вміст олеїнової кислоти, що становить 91,73 956, що складає
РІГ О-0,0513.
Використовуваний тут термін "частка олеїнової кислоти в мононенасиченості" або "ОМР" стосується розрахунку, який включає ділення відносної кількості таких, що не є олеїновою, кислоти мононенасичених жирних кислот, представленої у вигляді відсотка від суміші жирних кислот ліпіду, на відносну кількість олеїнової кислоти, представлену у вигляді відсотка. Формула є наступною:
ОМР-(9о мононенасичених жирних кислот - 95 олеїнової кислоти)/9о олеїнової кислоти.
Зо Наприклад, ТОо603.12(5) прикладу 15 має загальний вміст мононенасичених жирних кислот за винятком олеїнової кислоти (0,84 96 С18:1А11-0,29 95 С20:1), що становить 1,13 95, і вміст олеїнової кислоти, що становить 91,73 95, що складає ОМР-0,0123.
Термін "відповідна" стосується клітини, або рослини або її частини (такої, як насіння), якас(е) має такий же або схожий генетичний фон, що і клітина, або рослина або її частина (насіння) даного винаходу, але яка(е) не було модифіковано, як тут описується (наприклад, клітина, або рослина або її частина, у якій(ому) відсутній екзогенний полінуклеотид даного винаходу).
Відповідна клітина або рослина або її частина (насіння) може використовуватися як контроль для порівняння, наприклад, однієї або більше кількостей продукованої олеїнової кислоти, активності ЕАЮ2, активності ЕАТВ або активності ЕАЮб із клітиною, або рослиною або її частиною (насінням), модифікованою(им), як тут описується. Кваліфікований у даній галузі техніки фахівець може легко визначити придатну "відповідну" клітину, рослину або її частину (насіння) для такого порівняння.
Використовуваний тут термін "олія з насіння" стосується композиції, отриманої з насіння рослини, яка включає принаймні 60 95 (у ваговому відношенні) ліпіду, або одержуваного з насіння, якщо олія з насіння усе ще є присутньою у насінні. Тобто олія з насіння даного винаходу, або отримана, використовуючи, даного винаходу включає олію з насіння, що є присутньою у насінні або його частині, такій, як сім'ядолі або зародок, якщо тільки вона не стосується "екстрагованої олії з насіння" або схожих термінів, у випадку яких вона являє собою олію, що була екстрагована з насіння. Олією з насіння переважно є екстрагована олія з насіння.
Олія з насіння типово є рідиною при кімнатній температурі. Переважно загальною жирнокислотною сполукою (ТЕА) олії з насіння є »70 96 С18 жирних кислот, переважно 290 Фо олеїнової кислоти (С18:149). Жирні кислоти типово знаходяться в етерифікованій формі, такій, як, наприклад, ТАС, ДБАС, ацил-КоА або фосфоліпід. Крім особливо обговорених випадків, жирні кислоти можуть бути вільними жирними кислотами і/або знаходитися в етерифікованій формі. У варіанті здійснення принаймні 5095, більш переважно принаймні 70 95, більш переважно принаймні 80 95, більш переважно принаймні 90 95, більш переважно принаймні 91 95, більш переважно принаймні 92 95, більш переважно принаймні 93 95, більш переважно принаймні 94 95, більш переважно принаймні 95 95, більш переважно принаймні 96 95, більш переважно принаймні 97 95, більш переважно принаймні 98 95, більш переважно принаймні 99 95 жирних 60 кислот в олії з насіння даного винаходу можна знайти у вигляді ТАб. У варіанті здійснення олія з насіння даного винаходу є "у значній мірі очищеною" або "очищеною" олією, що була відділена від одного або більше інших ліпідів, нуклеїнових кислот, поліпептидів або інших забруднюючих молекул, з якими вона зв'язана в насінні або в неочищеному екстракті. Переважно, коли в значній мірі очищена олія з насіння звільнена на принаймні 60 95, більш переважно звільнена на принаймні 75 95 і більш переважно звільнена на принаймні 90 95 від інших компонентів, з якими вона зв'язана в насінні або екстракті. Олія з насіння даного винаходу може, крім того, включати молекули, які не є жирними кислотами, такі як, але без обмеження, стероли (див. приклад 17). У варіанті здійснення олією з насіння є сафлорова олія (Сапйвпатиз (іпсіогіи5), соняшникова олія (Неїапійих аппизх), бавовняна олія (зо55урішт Ппігешщит), касторова олія (Кісіпиє соттипів), олія каноли (Вгаззіса парив, Вгазвіса гара 55р.), гірчична олія (Вгазвіса |ппсеа), олія з інших Вгаззіса (наприклад, Вгаззіса паробргаззіса, Вгаззіса сатеїїпа), лляна олія (Гіпит изйнайбвзітит), соєва олія (СіІусіпе тах), кукурудзяна олія (7еа таув5), тютюнова олія (Місойапа гарасит), арахісова олія (Агаспі5 пуродаєа), пальмова олія (ЕІаеї5 диіпеепві5), кокосова олія (Сосо5 писігега), олія авокадо (Регзеа атегісапа), маслинова олія (ОІеа епигораєа), олія з анакардії західної (Апасагадішт оссідепіа!є), олія австралійського горіха (Масадатіа іпіегугіюїйа), мигдальна олія (Ргипих5 атудаа!пн5), олія з насіння вівса (Амепа 5аїїма), рисова олія (Огула займа або Огуа дЧіабегтіта), рижієва олія (Сатеїймпа заїїма), олія крамбе (Статбре абуззіпіса) або олія з насіння
Агарідорзів (Агарідорзі5 (паіапа). Олію з насіння можна екстрагувати з насіння за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі техніки. Це типово включає екстракцію з використанням неполярних розчинників, таких, як гексан, діетиловий ефір, петролейний ефір, суміші хлороформ/метанол або бутанол, звичайно пов'язану з першим роздавлюванням або обертанням насіння. Ліпіди, зв'язані з крохмалем у зерні, можна екстрагувати з використанням насиченого водою бутанолу. Олію з насіння можна піддати рафінації гідратацією за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки, для видалення полісахаридів і/або фосфоліпідів або піддати обробці іншими способами для видалення забруднень або збільшення ступеня чистоти, стабільності або кольору. ТАС і інші складні ефіри в олії з насіння можна гідролізувати для вивільнення вільних жирних кислот, наприклад, з використанням обробки кислотами або лугами або під дією ліпаз, або олію з насіння гідрогенізують, піддають хімічній або ферментативній обробці, як відомо в даній галузі техніки. Однак після обробки олії з насіння, так що вона більше не включає ТАС, її більше не вважають олією з насіння, що згадується тут.
Концентрації вільних і етерифікованих стеролів (наприклад, ситостеролу, кампестерину, стигмастерину, брасикастерину, Д5-авенастеролу, ситостанолу, кампестанолу і холестерину) в очищеному і/або екстрагованому ліпіді або олії можуть бути концентраціями, описаними в
РпПйїрз еї аї. (2002) і/або представленими в прикладі 17. Стероли в рослинних оліях присутні у вигляді вільних спиртів, ефірів жирних кислот (етерифіковані стероли), глікозидів і адильованих глікозидів стеролів. Концентрації стеролів у рослинних оліях, що зустрічаються в природі (оліях з насіння), знаходяться в межах аж до максимального значення, що становить приблизно 1100 мг/100 г. Гідрогенізована пальмова олія має одну з найнижчих концентрацій з рослинних олій, що зустрічаються в природі, що становить приблизно 60 мг/100 г. Витягнуті або екстраговані олії з насіння даного винаходу переважно містять між приблизно 100 і приблизно 1000 мг усіх стеролів/100 г олії. У випадку застосування як їжі або корму переважно, коли стероли присутні в основному у вигляді вільних або етерифікованих форм, а не глікозильованих форм. В оліях з насіння даного винаходу переважно принаймні 5095 стеролів в оліях присутні у вигляді етерифікованих форм, за винятком олії з насіння сої, що містить приблизно 2595 етерифікованих стеролів. Олія з насіння сафлору даного винаходу переважно містить між приблизно 150 і приблизно 400 мг усіх стеролів/100 г, типово приблизно 300 мг усіх стеролів/100 г олії з насіння, при цьому ситостерол є основним стеролом. Олія з насіння каноли і рапсова олія даного винаходу переважно містить між приблизно 500 і приблизно 800 мг усіх стеролів/100 г, при цьому ситостерол є основним стеролом, а кампестерин - наступним з наявних у найбільшій відносній кількості. Кукурудзяна олія даного винаходу переважно містить між приблизно 600 і приблизно 800 мг усіх стеролів/100 г, при цьому ситостерол є основним стеролом. Соєва олія даного винаходу переважно містить між приблизно 150 і приблизно 350 усіх стеролів/100 г, при цьому ситостерол є основним стеролом, а стигмастерин - наступним з наявних у найбільшій відносній кількості, і вона містить більше вільних стеролів, ніж етерифікованих стеролів. Бавовняна олія даного винаходу переважно містить між приблизно 200 і приблизно 350 усіх стеролів/100 г, при цьому ситостерол є основним стеролом. Кокосова олія і пальмова олія даного винаходу переважно містить між приблизно 50 і приблизно 100 мг усіх стеролів/100 г, при цьому ситостерол є основним стеролом. Арахісова олія даного винаходу переважно містить між приблизно 100 і приблизно 200 мг усіх стеролів/100 г, при цьому бо ситостерол є основним стеролом. Олія з насіння кунжуту даного винаходу переважно містить між приблизно 400 і приблизно 600 мг усіх стеролів/100 г, при цьому ситостерол є основним стеролом. Олія з насіння сафлору даного винаходу переважно містить між приблизно 200 і 400 мг усіх стеролів/100 г, при цьому ситостерол є основним стеролом.
Використовуваний тут термін "жирна кислота" стосується карбонової кислоти з довгим аліфатичним хвостом довжиною принаймні 8 атомів вуглецю, або насиченої або ненасиченої.
Типово жирні кислоти мають вуглецевий ланцюг довжиною принаймні 12 атомів вуглецю.
Більшість жирних кислот, що зустрічаються в природі, містять парне число атомів вуглецю, оскільки в їхньому біосинтезі бере участь ацетат, що містить два атоми вуглецю. Жирні кислоти можуть знаходитися у вільному стані (неетерифікованому) або в етерифікованій формі, такій, як зв'язана частина ТАС, САС, МАС, ацил-КоА (тіоефіру), або іншій ковалентно зв'язаній формі.
Коли жирна кислота є ковалентно зв'язаною в етерифікованій формі, її називають тут "ацильною" групою. Жирна кислота може бути етерифікована у вигляді фосфоліпіду, такого, як фосфатидилхолін (РС), фосфатидилетаноламін, фосфатидилсерин, фосфатидилгліцерин, фосфатидилінозит або дифосфатидилгліцерин. Насичені жирні кислоти не містять які-небудь подвійні зв'язки або інші функціональні групи уздовж ланцюга. Термін "насичені" стосується водню, у тому плані, що усі вуглеці (крім карбоксильної групи І-СООНІ) містять максимально можливе число атомів водню. Іншими словами, омега (0)) кінець містить З водні (СНЗ-), і кожен вуглець у ланцюгу містить 2 водні (-СН2-). Ненасичені жирні кислоти мають схожу з насиченими жирними кислотами форму, за винятком того, що одна або більше алкенових функціональних груп існує уздовж ланцюга, при цьому кожен алкен заміщає зв'язану одинарним зв'язком частину «-СН2-СН2-» ланцюга зв'язаною подвійним зв'язком частиною «-СН-СІН-» (тобто вуглецем, зв'язаним за допомогою подвійного зв'язку з іншим вуглецем). Два сусідні атоми вуглецю в ланцюгу, що зв'язані з однією з двох сторін подвійного зв'язку, можуть зустрічатися в цис- або транс-конфігурації.
Використовувані тут терміни "поліненасичена жирна кислота" або "РОБА" стосуються жирної кислоти, яка включає принаймні 12 атомів вуглецю у своєму вуглецевому ланцюзі і принаймні дві алкенові групи (вуглець-вуглецеві подвійні зв'язки).
Використовуваний тут термін "мононенасичена жирна кислота" стосується жирної кислоти, що має один подвійний зв'язок у своєму ацильному ланцюзі, такий, як олеїнова кислота
Зо (С18:149), С18:1011 і 201. "Триацилгліцерид" або "ТАС" є гліцеридом, у якому гліцерин перетворений у складний ефір з використанням трьох жирних кислот. У шляху Кеннеді синтезу ТАС, утворюється БАС, як описано вище, а потім третя ацильна група утворює складноефірний зв'язок з кістяком гліцерину під дією активності ОСБАТ. Альтернативні шляхи утворення ТАС включають шлях, каталізований ферментом РОАТ, і шлях за участю МОАТ (РСТ/АО2011/000794). "Діацилгліцерид" або "САС" є гліцеридом, у якому гліцерин перетворений у складний ефір з використанням двох жирних кислот. Як тут використовується, ОАС включає гідроксильну групу в 5п-1,3 або 5п-1,2/2,3 положенні, і, отже, ВАС не включає фосфориловану молекулу, таку, як РА або РС. Таким чином, ОАЄ є компонентом нейтральних ліпідів у клітині. У шляху Кеннеді синтезу САС, попередник 5п-гліцерин-3-фосфат (0-3-Р) утворює складноефірні зв'язки з двома ацильними групами, кожна з яких походить з ефіру, утвореного з жирної кислоти і коензиму А, у першій реакції, каталізованій гліцерин-3-фосфат-ацилтрансферазою (ОРАТ), у положенні 5п-1 з утворенням ГузоРА, з наступним другим ацилюванням у положенні 5п-2, каталізованим (лізофосфатидна кислота)-ацилтрансферазою (ГРААТ), з утворенням фосфатидної кислоти (РА). Цей проміжний продукт потім дефосфорилується з утворенням БАС. В альтернативному анаболічному шляху ПАС може утворюватися в результаті адилювання або 5п-1 МАС, або переважно 5п-2 МАС, каталізованого МОАТ. СДО може також утворюватися з ТАС у результаті видалення ацильної групи ліпазою, або з РС по суті в результаті видалення кінцевої групи холіну будь-яким з ферментів СРТ, РОСТ або РІ С.
Використовуваний тут термін "десатураза" стосується ферменту, що здатний уводити вуглець-вуглецевий подвійний зв'язок в ацильну групу субстрату, що включає залишки жирних кислот, який типово знаходиться в етерифікованій формі, такій, як, наприклад, ефіри, утворені з
КоА і жирної кислоти. Ацильна група може етерифікуватися до фосфоліпіду, такого, як фосфатидилхолін (РС), або до ацилпереносного білка (АСР), до КоА, або в переважному варіанті здійснення -- до РС. Десатурази, як правило, можна розподілити по трьох групах, відповідно. В одному варіанті здійснення десатуразою є десатураза "переднього кінця".
Використовувані тут терміни «Д12-десатураза" і "єАО2" стосуються зв'язаної з мембраною десатурази жирних кислот, що виконує видалення атома водню в А12 положенні, що виконує реакцію десатурації, перетворюючи олеїнову кислоту (18:1293 у лінолеву кислоту (С18:289и12), бо Таким чином, термін «А12-десатуразна активність" стосується перетворення олеїнової кислоти в лінолеву кислоту. Ці жирні кислоти можуть знаходитися в етерифікованій формі, наприклад, у вигляді частини фосфоліпіду, переважно у формі РС. У варіанті здійснення фермент ЕАО2, визначений тут, включає три багаті на гістидин мотиви (Нібз-бокси) (див. таблицю 5 заради прикладів Ніб-боксів ферментів даного винаходу). Такі багаті Ніх мотиви є у високому ступені консервативними у ферментах ЕБАБ2 і, як встановлено, залучені в утворення дизалізного комплексу з молекулярним киснем, використовуваним при біохімічному каталізі (Зпапкіїп еї аї., 1998).
Використовувані тут терміни "єАО2-1" ї "СЯТЕА02-1" і їхні варіанти стосуються поліпептиду
ЕАб2 сафлору, амінокислотна послідовність якого представлена як 5ЕО ІЮ МО: 27, такого, як поліпептид, кодований нуклеотидами, що мають послідовність, представлену як ЗЕО ІЮО МО: 12.
Як тут використовується, ген ЕАБ2-1 є геном, який кодує такий поліпептид, або його мутантним алелем. Ці терміни також включають такі, що зустрічають в природі, або штучно індуковані або отримані варіанти представлених послідовностей. У варіанті здійснення ЕБА0Б2-1 даного винаходу включає амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 95 95, більш переважно ідентична на принаймні 99 95 послідовності, представленої як зЕО ІО МО: 27. Гени
СІРА0Б2-1 включають алелі, що є мутантами, тобто які кодують поліпептиди зі зміненою десатуразною активністю, наприклад, зменшеною активністю, або не кодують функціональні поліпептиди (мовчазні алелі). Такі алелі можуть бути такими, що зустрічаються в природі, або індукованими штучним мутагенезом. Прикладом такого алеля є алель о! ЕАБ2-1, описуваний тут.
Використовувані тут терміни "єАО2-2" ї "СТЕАЮ2-2" і їхні варіанти стосуються поліпептиду
ЕАб2 сафлору, амінокислотна послідовність якого представлена як 5ЕО ІЮО МО: 28, такого, як поліпептид, кодований нуклеотидами, що мають послідовність, представлену як ЗЕО ІЮО МО: 13.
Як тут використовується, ген ЕАЮ2-2 є геном, що кодує такий поліпептид, або його мутантним алелем. Ці терміни також включають такі, що зустрічають в природі, або штучно індуковані або отримані варіанти представлених послідовностей. У варіанті здійснення БАЮБ2-2 даного винаходу включає амінокислотну послідовність, яка ідентична на принаймні 95 95, більш переважно ідентична на принаймні 99 95 послідовності, представленої як зЕО ІО МО: 28. Гени
СІРА0Б2-2 включають алелі, що є мутантами, тобто які кодують поліпептиди зі зміненою
Зо десатуразною активністю, наприклад, зменшеною активністю, або не кодують функціональні поліпептиди (мовчазні алелі). Такі алелі можуть бути такими, що зустрічаються в природі, або індукованими штучним мутагенезом.
Використовувані тут терміни "РАОБ2-10" ї "СТПЕА02-10" і їхні варіанти стосуються поліпептиду
ЕАб2 сафлору, амінокислотна послідовність якого представлена як 5ЕО ІЮО МО: 36, такого, як поліпептид, кодований нуклеотидами, що мають послідовність, представлену як ЗЕО ІЮО МО: 21.
Як тут використовується, ген ЕАБ2-10 є геном, що кодує такий поліпептид, або його мутантним алелем. Ці терміни також включають такі, що зустрічають в природі, або штучно індуковані або отримані варіанти представленої послідовності. У варіанті здійснення ЕАЮ2-10 даного винаходу включає амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 95 95, білош переважно ідентична на принаймні 99 95 послідовності, представленої як БЕО ІЮ МО: 36. Гени СТЕЕАЮ2-10 включають алелі, що є мутантами, тобто які кодують поліпептиди зі зміненою десатуразною активністю, наприклад, зменшеною активністю, або не кодують функціональні поліпептиди (мовчазні алелі). Такі алелі можуть бути такими, що зустрічаються в природі, або індукованими штучним мутагенезом.
Використовуваний тут термін "пальмітоїл-АСР-тіоестераза" або "ГАТВ" стосується білка, що гідролізує пальмітоїл-АСР з утворенням вільної пальмітинової кислоти. Таким чином, термін "пальмітоїл-АСР-тіоестеразна активність" стосується гідролізу пальмітоїл-АСР з утворенням вільної пальмітинової кислоти.
Використовувані тут терміни "єАТВ-3" ії "СТЕАТВ-3" і їхні варіанти стосуються поліпептиду
ЕАТВ сафлору, амінокислотна послідовність якого представлена як 5ЕО ІО МО: 45, такого, як поліпептид, кодований нуклеотидами, що мають послідовність, представлену як ЗЕО ІЮО МО: 43.
Як тут використовується, ген ЕАТВ-3 є геном, що кодує такий поліпептид, або його мутантним алелем. Ці терміни також включають такі, що зустрічають в природі, або штучно індуковані або отримані варіанти представлених послідовностей. У варіанті здійснення ЕБАТВ-3 даного винаходу включає амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 95 95, більш переважно ідентична на принаймні 99 95 послідовності, представленої як зЕО ІО МО: 45. Гени
СІРАТВ-3 включають алелі, що є мутантами, тобто які кодують поліпептиди зі зміненою пальмітоїл-АСР-тіоестеразною активністю, наприклад, зменшеною активністю, або не кодують функціональні поліпептиди (мовчазні алелі). Такі алелі можуть бути такими, що зустрічаються в бо природі, або індукованими штучним мутагенезом.
Як тут використовуються, "пластидна десатураза б жирних кислот", його варіанти, і "ГєАОб" стосується ферменту хлоропластів, що десатурує 16:1 і 18:1 жирні кислоти до 16:22 і 18:22, відповідно, у всіх 16:1- або 18:І-вмісних ліпідах мембран хлоропластів, включаючи фосфатидилгліцерин, моногалактозилдіацилгліцерин, дигалактозилдіацилгліцерин і сульфогвіновозилдіацилгліцерин.
Використовувані тут терміни "БАОб" і "СЧТЕАЮОб" і їхні варіанти стосуються поліпептиду ЕАЮОб сафлору, амінокислотна послідовність якого представлена як 5ЕО ІЮ МО: 48, такого, як поліпептид, кодований нуклеотидами, що мають послідовність, представлену як ЗЕО ІЮО МО: 47.
Як тут використовується, ген ЕАЮб є геном, що кодує такий поліпептид, або його мутантним алелем. Ці терміни також включають такі, що зустрічають в природі, або штучно індуковані або отримані варіанти представлених послідовностей. У варіанті здійснення ЕАЮб даного винаходу включає амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 95 95, білош переважно ідентична на принаймні 99 95 послідовності, представленої як 5ЕО ІЮ МО: 48. Гени СТЕАЮОб включають алелі, що є мутантами, тобто які кодують поліпептиди зі зміненою десатуразною активністю, наприклад, зменшеною активністю, або не кодують функціональні поліпептиди (мовчазні алелі). Такі алелі можуть бути такими, що зустрічаються в природі, або індукованими штучним мутагенезом.
Використовуваний тут термін "ацетиленаза" або "ацетиленаза жирних кислот" стосується ферменту, що вводить потрійний зв'язок у жирну кислоту, приводячи до утворення жирної кислоти ацетиленового ряду.
Термін "С" використовується тут перед такими термінами, як ЕАО2, ЕАТВ і ЕАОб, для вказівки на те, що фермент/ген походить із сафлору.
Використовуваний тут термін "РНК, яка викликає сайленсинг, яка здатна зменшити експресію" і його варіанти стосується полінуклеотиду, що кодує молекулу РНК, яка зменшує (знижує) продукцію і/або активність (наприклад, кодуючу кіРНК, шпилькову і-РНК), або сам знижує продукцію і/або активність (наприклад, є кіРНК, яку можна доставити безпосередньо, наприклад, у клітину), ендогенного ферменту, наприклад, АЛІ12 десатурази, пальмітоїл-АСР- тіоестерази, пластидної десатурази 0б жирних кислот або комбінації двох або більше або усіх трьох ферментів. У варіанті здійснення РНК, яка викликає генний сайленсинг, є екзогенна РНК,
Зо яка утворюється з трансгена в клітині і яка транскрипційно і/або посттранскрипційно зменшує кількість ендогенного ферменту, що продукується в клітині, наприклад, у результаті зменшення кількості МРНК, що кодує ендогенний фермент, або зменшення його трансляції. РНК, що викликає огенний сайленсинг, типово є РНК довжиною 21-24 нуклеотидів, яка є комплементарною ендогенній мРНК і яка може зв'язуватися з комплексом сайленсингу, відомим як КІЗС, у клітині.
Використовуваний тут термін "мутація(ї), що зменшує активність" стосується таких, що зустрічаються в природі, або штучних мутантів (наприклад, створених за допомогою хімічного мутагенезу або сайт-специфічного мутагенезу), що мають більш низькі рівні визначеної ферментативної активності (наприклад, ЕАОС2 ферментативної активності в насінні) порівняно з фенотипічно нормальним насіннями (наприклад, насінням, у якому утворюються ферменти
ЕА02, що включають амінокислотні послідовності, представлені як 5ЕО ІЮО МО: 27, 28 і 36).
Приклади фенотипічно нормальних сортів сафлору включають, але без обмеження, Сепіеппіаї,
ЕРіпсп, Миїгазай і Сагаіїпаї Перша ідентифікована ознака високого вмісту олеїнової кислоти, виявлена при впровадженні сафлору з Індії, контролювалася частково рецесивним алелем, позначеним ої, в одному локусі ОЇ. (Кпоулез апа НіїЇ, 1964). Як тут описано, локус ОЇ. відповідає гену СТЕАЮ2-1. Вміст олеїнової кислоти в олії з насіння в генотипах оо! звичайно становив 71- 75 95 у випадку вирощуваних у теплиці рослин (Кпом/ез, 1989). Кпом/ез (1968) включив алель о) у програму селекції сафлору і вивів перший сорт сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти (НО) "00-17" у 1966 у США, з наступним виведенням поліпшених сортів "ОІеїс І еей" і серії
Запоіа, зокрема бЗайоіїа 317 (5-317), 5-517 і 5-518. Генотипи оо! (високий вміст олеїнової кислоти) були відносно стійкими на рівні олеїнової кислоти при вирощуванні при різних температурах у полі (ВапйпоЇотем, 1971). Крім того, Кпоуле5 (1972) також описав відмінний алель ої: у тому ж локусі, що породжував у гомозиготному стані між 35 і 50 95 олеїнової кислоти.
На відміну від генотипу оЇ0їЇ, генотип о0І10ії: продемонстрував сильну реакцію на температуру (Кпом/ез, 1972). Як тут визначено, мутацією алеля ої, яка наділяє зменшеною активністю ЕАО2- 1 (і загальною ГАОБ2 активністю) у насінні сафлору, є мутантний ген БА02-1, що включає мутацію зі зсувом рамки зчитування (унаслідок делеції одного нуклеотиду), зображений на фіг. 6 (див. також приклад 7 і ЗЕО ІЮ МО: 26 і 38).
Використовуваний тут вираз "яке здатне породжувати рослину, що утворює насіння, вміст у бо вигляді олії якого включає" або "яке здатне породжувати рослину, що утворює олійне насіння,
вміст у вигляді олії якого включає" або його варіанти означає, що рослина, яка розвинулася з насіння, переважно олійна рослина і більш переважно рослина сафлор, має здатність продукувати олію з визначеними компонентами при вирощуванні в оптимальних умовах, наприклад, в умовах теплиці, таких, як ті, які згадуються в розділі "Приклади". Маючи насінням від рослини, звичайно вирощують рослину-потомка з принаймні одного з насіння у придатних умовах теплиці і перевіряють олійність і жирнокислотний склад олії насіння від рослини- потомка, використовуючи стандартні процедури, такі, як ті, які тут описуються. Відповідно, як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, хоча насіння, вирощене в полі, може не задовольняти усім вимогам, визначеним тут, унаслідок несприятливих умов у конкретний рік, таких, як спека, холод, посуха, заводнення, мороз, вплив шкідників і т. д., таке насіння, проте, охоплюється даним винаходом, оскільки насіння здатне породити рослину-потомка, що дає визначену олійність або жирнокислотний склад при вирощуванні в більш сприятливих умовах.
Використовуваний тут термін "у ваговому відношенні" стосується ваги речовини (наприклад, олеїнової кислоти, пальмітинової кислоти або РИГА, такої, як лінолева кислота або ліноленова кислота) у вигляді відсотка від ваги композиції, що включає речовину, або компонента в композиції. Наприклад, вага конкретної жирної кислоти, такої, як олеїнова кислота, може визначатися як відсоток від ваги загального вмісту жирних кислот у ліпіді або олії з насіння, або в насінні.
Використовуваний тут термін "біопаливо" стосується будь-якого типу палива, типово використовуваного для приведення в дію машин, таких, як автомобілі, вантажні автомобілі або мотори, що приводяться в дію з використанням нафти, енергія для який виникає в результаті біологічної фіксації вуглецю, а не походить від викопного палива. Біопаливо включає паливо, що виникає в результаті перетворення біомаси, а також походить із твердої біомаси, рідкого палива і біогазів. Приклади біопалива включають біоспирти, біодизель, синтетичне дизельне паливо, рослинну олію, біологічні прості ефіри, біогаз, сингаз, тверде біопаливо, паливо водорослевого походження, біоводень, біометанол, 2,5-диметилфуран (ОМЕ), біодиметиловий ефір (бі00ОМЕ), дизельне паливо, отримане методом Фішера-Тропша, біоводневий дизель, змішані спирти і дизельне паливо з деревних відходів.
Використовуваний тут термін "промисловий продукт" стосується вуглеводневого продукту,
Зо який в основному виготовлений з вуглецю і водню, такого, як метилові і/або етилові ефіри жирних кислот або алкани, такі, як метан, суміші більш довголанцюжкових алканів, що типово є рідинами при температурах навколишнього середовища, біопаливо, окис вуглецю і/або водень, або біоспирт, такий, як етанол, пропанол, або бутанол, або біовугілля. Термін "промисловий продукт", як передбачається, включає проміжні продукти, які можна перетворити в інші промислові продукти, наприклад, сам сингаз вважається промисловим продуктом, що може використовуватися для синтезу вуглеводневого продукту, що також вважається промисловим продуктом. Термін "промисловий продукт", як тут використовується, включає або чисті форми вищевідзначених сполук, або частіше суміші різних сполук і компонентів, наприклад, вуглеводневий продукт може містити діапазон довжин вуглеводних ланцюгів, як це добре вивчено в даній галузі техніки.
Полінуклеотиди
Терміни "полінуклеотид" і "нуклеїнова кислота" використовуються взаємозамінно. Вони стосуються полімерної форми нуклеотидів будь-якої довжини, або дезоксирибонуклеотидів, або рибонуклеотидів. Полінуклеотид даного винаходу може бути геномного, кДНК, напівсинтетичного або синтетичного походження, дволанцюжковим або одноланцюжковим, і через своє походження або внаслідок його обробки він: (1) не зв'язаний із усім полінуклеотидом або його частиною, з яким він зв'язаний у природі, (2) зв'язаний з полінуклеотидом, відмінним від такого, з яким він зв'язаний у природі, або (3) не зустрічається в природі. Необмежуючими прикладами полінуклеотидів є наступні полінуклеотиди: кодуючі або некодуючі області гена або фрагмента гена, локуси (локус), визначений у результаті аналізу груп зчеплення, екзони, інтрони, інформаційна РНК (мРНК), транспортна РНК (тРНК), рибосомна РНК (рРНК), рибозими,
КДНК, рекомбінантні полінуклеотиди, плазміди, вектори, виділена ДНК із будь-якою послідовністю, виділена РНК із будь-якою послідовністю, химерна ДНК із будь-якою послідовністю, зонди і праймери у вигляді нуклеїнових кислот. Переважні полінуклеотиди даного винаходу включають молекули дволанцюжкових ДНК, що можуть бути транскрибовані в клітинах рослин і молекули РНК, які викликають генний сайленсинг.
Використовуваний тут термін "ген" варто розуміти в його найбільш широкому контексті і включає дезоксирибонуклеотидні послідовності, що включають транскрибований районі, у випадку його трансляції, кодуючу білок область, структурного гена і включаючі послідовності, бо що розташовані поруч з кодуючою областю і на 5", і на 3' кінцях на відстані, що становить принаймні приблизно 2 т. п. о., на тому або іншому кінці і які залучені в експресію гена. У зв'язку з цим ген включає контролюючі сигнали, такі, як промотори, енхансери, сигнали термінації і/або поліаденілювання, що зв'язані в природі з конкретним геном, або гетерологічні контрольні сигнали, у цьому випадку ген називають "химерним геном". Послідовності, що розташовані 5' від кодуючої білок області і які присутні в мРНК, називають 5' нетрансльованими послідовностями.
Послідовності, що розташовані 3' або нижче кодуючої білок області і які присутні в мРНК, називають 3' нетрансльованими послідовностями. Термін "ген" охоплює і кДНК, і геномні форми гена. Геномна форма або клон гена містить кодуючу область, яку можуть переривати некодуючі послідовності, які називаються "інтронами", "проміжними районами" або "проміжними послідовностями". Інтрони є сегментами гена, які транскрибуються в ядерну РНК (яЯРНК).
Інтрони можуть містити регуляторні елементи, такі, як енхансери. Інтрони віддаляються або "вирізують" з ядерного або первинного транскрипту; з цієї причини інтрони відсутні в мРНК- транскрипті. МРНК функціонує під час трансляції зі встановленням послідовності або порядку амінокислот у поліпептиді, що утворюється. Термін "ген" включає синтетичну або злиту молекулу, яка кодує весь білок або його частину даного винаходу, описуваний тут, і нуклеотидну послідовність, комплементарну до кожної з вищенаведених послідовностей. "Алель" стосується однієї конкретної форми генетичної послідовності (такої, як ген) у клітині, в окремій рослині або в популяції, при цьому конкретна форма відрізняється від інших форм того ж гена по послідовності принаймні одного, а часто -- більше, ніж одного, варіантного сайту в послідовності гена. Послідовності в цих варіантних сайтах, що відрізняються між різними алелями, називають "варіансами", "поліморфізмами" або "мутаціями".
Як тут використовується, "химерна ДНК" стосується будь-якої молекули ДНК, що не зустрічається в природі; яка також називається "ДНК-конструкцією". Типово химерна ДНК включає регуляторні і транскрибовані або кодуючі білок послідовності, що не зустрічаються в природі разом. Відповідно, химерна ДНК може включати регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з різних джерел, або регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з того самого джерела, але розташовуються в порядку, який відрізняється від такого, що зустрічається в природі. Відкрита рамка зчитування може або може не бути зв'язана зі своїми природними 5'і 3 регуляторними елементами. Відкрита рамка
Зо зчитування може бути включена, наприклад, у геном рослини, у неприродному положенні, або в реплікон або вектор, у якому вона не зустрічається в природі, такий, як бактеріальна плазміда або вірусний вектор. Термін "химерна ДНК" не обмежується молекулами ДНК, що можуть реплікуватися в хазяїні, але включає ДНК, яку можна піддати лігуванню в реплікон з використанням, наприклад, специфічних адаптерних послідовностей. "Трансген" є геном, який був введений у геном за допомогою процедури трансформації.
Трансген може бути присутнім у вихідній трансформованій рослині, отриманій за допомогою регенерації з трансформованої клітини рослини, або в рослинах-потомках, отриманих у результаті самозапилення або схрещування, виходячи з вихідного трансформанта, або в частинах рослини, таких, як насіння. Термін "генетично модифікований" і його варіанти включає введення гена в клітину за допомогою трансформації або трансдукції, мутування гена в клітині або генетичної зміни або модуляції регуляції гена в клітині, або потомстві будь-якої клітини, модифікованої, як описано вище. "Геномна ділянка", як тут використовується, стосується місця, у яке трансген або група трансгенів (яка також називається тут кластером) були введені в клітину, або її попередник, так що вони є спільно успадкованими в клітинах-потомках після мейозу. "Рекомбінантний полінуклеотид" або "екзогенний полінуклеотид" даного винаходу стосується молекули нуклеїнової кислоти, що була сконструйована або модифікована з використанням методів штучних рекомбінантних молекул. Рекомбінантний полінуклеотид може бути присутнім у клітині в зміненій кількості або експресуватися в зміненому ступені (наприклад, у випадку мРНК) порівняно з його природним станом. Екзогенним полінуклеотидом є полінуклеотид, що був введений у клітину, яка звичайно не включає цей полінуклеотид. Типово екзогенна ДНК використовується як матриця для транскрипції мРНК, яка потім транслюється в безперервну послідовність амінокислотних залишків, яка кодує поліпептид даного винаходу в трансформованій клітині. В іншому варіанті здійснення частина екзогенного полінуклеотиду є ендогенною відносно клітини, і її експресія змінена рекомбінатним способом, наприклад, екзогенну контролюючу послідовність вводять 5' від ендогенного полінуклеотиду, щоб уможливити експресію трансформованими клітинами поліпептиду, кодованого полінуклеотидом.
Наприклад, екзогенний полінуклеотид може експресувати антисмислову РНК відносно ендогенного полінуклеотиду.
Рекомбінантний полінуклеотид даного винаходу включає полінуклеотиди, що були відділені від інших компонентів клітинної або безклітинної експресійної системи, у якій вони присутні, і полінуклеотиди, продуковані в зазначеній клітинній або безклітинній експресійній системі, які згодом очищають від принаймні деяких інших компонентів. Полінуклеотид може являти собою безперервну ділянку нуклеотидів, що існує в природі, або включати дві або більше безперервні ділянки нуклеотидів з різних джерел (такі, що зустрічаються в природі, і/або синтетичні), з'єднані з утворенням одного полінуклеотиду. Типово такі химерні полінуклеотиди включають принаймні відкриту рамку зчитування, яка кодує поліпептид даного винаходу, функціонально зв'язану з промотором, що підходить для активації транскрипції відкритої рамки зчитування в клітині, яка становить інтерес.
Що стосується визначених полінуклеотидів, буде зрозуміло, що процентні значення ідентичності, які перевищують значення, надані вище, будуть охоплювати переважні варіанти здійснення. Таким чином, де застосовно, через мінімальні процентні значення ідентичності, переважно, коли полінуклеотид включає полінуклеотидну послідовність, що ідентична на принаймні 50 95, більш переважно на принаймні 60 95, більш переважно на принаймні 65 95, більш переважно на принаймні 70 95, більш переважно на принаймні 75 95, більш переважно на принаймні 80 95, більш переважно на принаймні 85 95, більш переважно на принаймні 90 95, більш переважно на принаймні 91 95, більш переважно на принаймні 92 95, більш переважно на принаймні 93 95, більш переважно на принаймні 94 95, більш переважно на принаймні 95 95, більш переважно на принаймні 96 95, більш переважно на принаймні 97 95, більш переважно на по крайньої мері 98 95, більш переважно на принаймні 99 95, більш переважно на принаймні 99,1 95, більш переважно на принаймні 99,2 95, більш переважно на принаймні 99,3 95, більш переважно на принаймні 99,4 95, більш переважно на принаймні 99,5 95, більш переважно на принаймні 99,6 95, більш переважно на принаймні 99,7 95, більш переважно на принаймні 99,8 95 і навіть більш переважно на принаймні 99,9 95 відповідній зазначеній 5ЕО ІЮ МО.
Полінуклеотид, або застосовний для, даного винаходу може селективно гібридизуватися, у жорстких умовах, з визначеним тут полінуклеотидом. Як тут використовуються, жорсткі умови являють собою умови, у яких: (1) використовується під час гібридизації денатуруючий агент, такий, як формамід, наприклад, 5095 (в об'ємному відношенні) формаміду разом з 0,1 95
Ко) (відносно ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну, 0,195 Ффікола, 0,195 полівінілпіролідону, 50 мМ натрій-фосфатним буфером при рнН 6,5 разом з 750 мМ Масі, 75 мМ цитратом натрію при 422С; або (2) використовується 50 95 формаміду, 5 х 550 (0,75М Масі, 0,075М цитрат натрію), 50 мМ фосфат натрію (рН 6,8), 0,1 95 пірофосфату натрію, 5 х розчин
Денхардта, озвучена ультразвуком ДНК із молочка лососевих (50 г/мл), 0,195 5ОБ5 і 10 95 декстрану сульфату при 422С у 0,2 х 55С і 0,1 95 5О5, і/або (3) використовується низька іонна сила і висока температура для промивання, наприклад, 0,015М Масі/0,0015М цитрат натрію/0,1 95 505 при 50260.
Полінуклеотиди даного винаходу можуть мати, порівняно з молекулами, що зустрічаються в природі, одну або більше мутацій, які являють собою делеції, вставки або заміни нуклеотидних залишків. Полінуклеотиди, які мають мутації порівняно з посилальною послідовністю, можуть бути або такими, що зустрічаються в природі (іншими словами, виділеними з природного джерела), або синтетичними (наприклад, у результаті виконання сайт-направленого мутагенезу або перетасування ділянок ДНК на нуклеїновій кислоті, описаній вище).
Полінуклеотиди для зменшення рівнів експресії ендогенних білків
В одному варіанті здійснення клітина/насіння/рослина/організм даного винаходу включає введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, яка(ий) знижує продукцію і/або активність ендогенного ферменту, типово яка(ий) приводить до збільшеної продукції олеїнової кислоти і переважно зменшеної продукції пальмітинової кислоти і РОБА, такої, як лінолева кислота, порівняно з відповідною клітиною, у якій відсутня уведена мутація або екзогенний полінуклеотид. Приклади таких полінуклеотидів включають антисмисловий полінуклеотид, смисловий полінуклеотид, каталітичний полінуклеотид, мікроРНК, полінуклеотид, який кодує поліпептид, що зв'язується з ендогенним ферментом і дволанцюжковою РНК.
РНК-інтерференція
РНК-інтерференція, зокрема, застосовна для специфічного інгібування продукції конкретного білка. Ця технологія грунтується на присутності молекул длРНК, що містять послідовність, яка по суті ідентична мРНК з гена, що становить інтерес, або його частини, і комплементарну їй послідовність. Легсо длРНК можна продукувати з одного промотору в рекомбінантному векторі або клітині-хазяїні, причому смислова й антисмислова послідовності ковалентно з'єднані за допомогою послідовності, переважно неспорідненої послідовності, яка бо уможливлює гібридизацію смислової й антисмислової послідовностей у відповідному транскрипті з утворенням молекули длРНК із з'єднуючою послідовністю, що утворює петлеву структуру, хоча послідовність з ідентичністю РНК-мішені або її комплементу може утворювати петлеву структуру. Типово длРНК кодується дволанцюжковою ДНК-конструкцією, яка містить смислову й антисмислову послідовності в структурі інвертованого повтору, організовані у вигляді перерваного паліндрома, причому послідовності, які повторюються, транскрибуються з утворенням послідовностей, що гібридизуються, у молекулі длРНК, а послідовність переривання транскрибується з утворенням петлевої ділянки в молекулі длРНК. Розробка і продукція придатних молекул длРНК є порожниною в компетентності кваліфікованого в даній галузі техніки фахівця, особливо беручи до уваги Умаїетпоизе еї аї. (1998), тій еї аї. (2000),
УМО 99/32619, УМО 99/53050, УМО 99/49029 і УМО 01/34815.
В одному прикладі вводять ДНК, яка направляє синтез принаймні продукту(ів) у вигляді частково дволанцюжкової РНК із гомологією, переважно принаймні 19 нуклеотидами, які слідують один за одним, комплементарними до ділянки, РНК-мішені, що повинна бути інактивована. Отже, ДНК включає і смислову, і антисмислову послідовності, які, після транскрибування в РНК, можуть гібридизуватися з утворенням району дволанцюжкової РНК. В одному варіанті здійснення даного винаходу смислова й антисмислова послідовності розділені районом-спейсером, що включає інтрон, який, після транскрибування в РНК, вирізається. Ця організація, як було встановлено, приводить до більшої ефективності сайленсингу гена. Район дволанцюжкової РНК може включати одну або дві молекули РНК, транскрибовані або з одного району РНК, або з двох. Вважають, що присутність дволанцюжкової молекули ініціює відповідну реакцію ендогенної системи, яка руйнує як дволанцюжкову РНК, так і гомологічний РНК- транскрипт із гена-мішені, ефективно зменшуючи або усуваючи активність гена-мішені.
Довжина кожної зі смислової й антисмислової послідовностей, що піддаються гібридизації, повинна становити принаймні 19 нуклеотидів, які слідують один за одним, які відповідають частині мРНК-мішені. Може використовуватися повнорозмірна послідовність, що відповідає транскрипту з усього гена. Ступінь ідентичності смислової й антисмислової послідовностей із заданим транскриптом повинна становити принаймні 85 95, принаймні 90 95 або принаймні 95- 10095. Молекула РНК може, звичайно, включати неспоріднені послідовності, які можуть функціонувати для стабілізації молекули. Молекула РНК може експресуватися під контролем
Зо промотору для РНК-полімерази ІЇ або РНК-полімерази ПП. Приклади останнього включають промотори для тРНК або невеликий ядерний РНК.
Переважні молекули коротких інтерферуючих РНК ("кіРНК") включають нуклеотидну послідовність, що ідентична приблизно 19-21 нуклеотидам мРНК-мішені, які слідують один за одним. Переважно послідовність кіРНК починається з динуклеотиду АА, характеризується С- вмістом, що становить приблизно 30-70 95 (переважно, 30-60 95, більш переважно 40-60 95 і більш переважно приблизно 45-55 95), і не має високий відсоток ідентичності з будь-якою нуклеотидною послідовністю, відмінною від мішені в геномі організму, у який її вводять, наприклад, як визначено за допомогою стандартного пошуку ВІ А5Т.
Як приклад, длРНК даного винаходу включає нуклеотидну послідовність, представлену як будь-яка з 5БЕО ІЮО МО: 49-51 (у випадках, коли Т замінюється У). мікроРНК
МікроРНК (скорочено міРНК), як правило, являють собою молекули (19-25)-нуклеотидних (звичайно приблизно (20-24)-нуклеотидних у рослинах) некодуючих РНК, що походять з більш великих попередників, що утворюють недосконалі структури "петля на стеблі".
МікроРнНК зв'язуються з комплементарними послідовностями в транскриптах - інформаційних РНК (мРНК), звичайно приводячи до пригнічення трансляції або деградації мішені і сайленсингу гена.
У клітинах рослин молекули-попередники мікроРНК, як вважають, спочатку піддаються процесингу в ядрі. Вихідна мікроРНК (яка містить один або більше локальних дволанцюжкових або "шпилькових" районів, а також звичайний 5' "кеп" і поліаденільований хвіст мРНК) піддаються процесингу до більш короткої молекули-попередника мікроРНК, яка також включає структуру "петля на стеблі" або структуру, яка самогібридизується, і називається "пре- мікроРНК". У рослинах пре-мікроРНК розщеплюється особливими РІСЕК-подібними (ОСІ) ферментами, зокрема, ОСІ-1, продукуючи дуплекси мікроРНК:мікроРНК". До перенесення з ядра, ці дуплекси метилуються. Навпаки, молекули шпилькових РНК, що мають більш довгі райони длРНК, піддаються процесингу, зокрема, під дією ОСІ -3 і ОСІ -4.
У цитоплазмі ланцюг мікроРНК із дуплекса мікроРНК:мікроРНК селективно включається в активний РНиНК-індукований комплекс сайленсингу (КІЗС) для розпізнання мішені. КІЗС- комплекси містять особливу підгрупу білків Агдопашіе, які викликають специфічну відносно послідовності репресію гена посттранскрипційно (див., наприклад, МіПаг апа Умаїегпоизе, 2005;
Раздиіпеїії еї а!., 2005; АІтеїда апа АїІвпіге, 2005).
Косупресія
Гени можуть пригнічувати експресію споріднених ендогенних генів і/або трансгенів, які вже є присутніми у геномі, феномен, названий залежним від гомології сайленсингом генів. Велика частина випадків залежного від гомології сайленсингу генів розділяються на два класи -- ті, які функціонують на рівні транскрипції трансгена, і ті, які функціонують посттранскрипційно.
Посттранскрипційний залежний від гомології сайленсинг генів (тобто косупресія) характеризується зменшенням експресії трансгена і споріднених ендогенних або вірусних генів у трансгенних рослинах. Косупресія часто, але не завжди, має місце, коли транскрипти з трансгена присутні у великій кількості, і вона, як звичайно вважають, ініціюється на рівні процесингу РНК, її локалізації і/або деградації. Існує кілька моделей, які пояснюють, яким чином косупресія працює (див. у Тауїог, 1997).
Косупресія включає введення додаткової копії гена або його фрагмента в рослину в смисловій орієнтації відносно промотору для її експресії. Кваліфікованому фахівцю буде зрозуміло, що розмір смислового фрагмента, його відповідність районам генам-мішеням і ступінь ідентичності його послідовності гену-мішені може варіювати. У деяких випадках додаткова копія послідовності гена заважає експресії гена-мішені в рослині. Наводиться посилання на УМО 97/20936 і ЕР 0465572 для способів здійснення методів косупресії.
Експресійний вектор
Як тут використовується, "експресійний вектор" являє собою ДНК або РНК-вектор, який здатний трансформувати клітину-хазяїна і здійснювати експресію одного або більше визначених полінуклеотидів. Переважно, коли експресійний вектор також здатний реплікуватися в хазяїні або інтегруватися в геном клітини-хазяїна. Експресійні вектори типово є вірусами або плазмідами. Експресійні вектори даного винаходу включають будь-які вектори, що функціонують (тобто керують експресією генів) у клітинах-хазяїнах даного винаходу, включаючи клітини грибів, водоростей і рослин. "Функціонально зв'язані", як тут використовується, стосується функціонального зв'язку між двома або більше сегментами нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК). Типово він стосується
Зо функціонального зв'язку регулюючого транскрипцію елемента (промотору) із транскрибованою послідовністю. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю полінуклеотиду, визначеного тут, якщо він стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у придатній клітині. Як правило, регулюючі транскрипцію елементи промотору, що функціонально зв'язані з транскрибованою послідовністю, Є фізично дотичними з транскрибованою послідовністю, тобто вони є діючими в цис-положенні. Однак, деякі регулюючі транскрипцію елементи, такі, як енхансери, не обов'язково повинні бути фізично дотичними з кодуючими послідовностями, чию транскрипцію вони підсилюють, або розташованими в безпосередній близькості від них.
Експресійні вектори даного винаходу містять регуляторні послідовності, такі, як контролюючі транскрипцію послідовності, контролюючі трансляцію послідовності, початку реплікації й інших регуляторних послідовностей, які сумісні з клітиною-хазяїном і які контролюють експресію полінуклеотидів даного винаходу. Зокрема, експресійні вектори даного винаходу включають контролюючі транскрипцію послідовності. Контролюючі транскрипцію послідовності являють собою послідовності, які контролюють ініціацію, елонгацію і термінацію транскрипції. Особливо важливими контролюючими транскрипцію послідовностями є ті, які контролюють ініціацію транскрипції, такі, як послідовності промотору, енхансера, оператора і репресора. Придатні контролюючі транскрипції послідовності включають будь-яку контролюючу транскрипцію послідовність, яка може функціонувати в принаймні одній з рекомбінантних клітин даного винаходу. Вибір використовуваних регуляторних послідовностей залежить від організму-мішені, такого, як рослина, і/або органа, що є мішенню, або тканини, що становить інтерес. Такі регуляторні послідовності можна одержати з будь-якого еукаріотичного організму, такого, як рослини або віруси рослин, або можна хімічно синтезувати. Ряд таких контролюючих транскрипцію послідовностей відомий кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям.
Особливо переважними контролюючими транскрипцію послідовностями є промотори, ефективні в керуванні транскрипцією в рослинах, або конститутивній, або специфічній відносно стадії і/або тканини, залежно від використання рослини або її частини(частин).
Ряд векторів, що підходять для стійкої трансфекції клітин або рослин для створення трансгенних рослин, був описаний, наприклад, у Роцу/еЇ5 єї аї., Сіопіпд Месіоге: А І арогайогу
Мапиаї, 1985, 5зирр. 1987, М/візвраси апа МУвіззрбаси, Меїпод5 їТог Ріапі МоїіІесшіаг Віоіоду, 60 Асадетіс Ргез5, 1989, і Сеїміп еї аїЇ, Ріапі МоїІесшіаг Віоїоду Мапиаї, Кішуег Асадетіс Рибіїзпегв,
1990. Типово вектори для експресії в рослинах включають, наприклад, один або більше клонованих генів рослин під транскрипційним контролем 5' і 3' регуляторних послідовностей і домінантний селектований маркер. Такі вектори для експресії в рослинах також можуть містити промоторний регуляторний район (наприклад, регуляторний район, що контролює індуковану або конститутивну, регульовану умовами навколишнього середовища або стадіями розвитку, або клітино- або тканиноспецифічну експресію), сайт початку транскрипції, ділянку зв'язування рибосоми, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції і/або сигнал поліаденілювання.
Був описаний ряд конститутивних промоторів, що є активними в клітинах рослин. Придатні промотори для конститутивної експресії в рослинах включають, але без обмеження, промотор 355 вірусу мозаїки кольорової капусти (Самм), 355 вірусу мозаїки ранника (ЕМУМ), промотор бактеріального вірусу цукрової тростини, промотор вірусу жовтої мозаїки Сотіпеїїпа, світлоїндукований промотор з гена малої субодиниці рибулозо-1,5-біс-фосфат-карбоксилази, промотор гена цитозольної триозофосфатізомерази рису, опромотор гена аденін- фосфорибозилтрансферази Агарідорзіх, промотор гена актину 1 рису, промотори генів монопінсинтази й октопінсинтази, промотор Ай, промотор гена сахарозосинтази, комплексний промотор гена К і промотор гена хлорофільного са/В зв'язувального білка. Ці промотори використовувалися для створення ДНК-векторів, що були експресовані в рослинах, див., наприклад, УМО 84/02913. Усі з цих промоторів використовувалися для створення різних типів експресованих у рослинах рекомбінантних ДНК-векторів.
З метою експресії у вихідних тканинах рослини, таких, як листок, насіння, корінь або стебло, переважно, коли промотори, використовувані в даному винаході, характеризуються відносно високою експресією в цих конкретних тканинах. Для цього ланцюга може бути вибраний промотор з ряду промоторів для генів із тканино- або клітиноспецифічною, або збільшеною в тканині(ах) або клітині(ах) експресією. Приклади таких промоторів, про які повідомлялося в літературі, включають промотор гена хлоропластної глютамінсинтази 552 гороху, промотор гена хлоропластної фруктозо-1,6-біфросфатази пшениці, промотор ядерного фотосинтетичного гена 51-І 51 картоплі, промотор гена серин/греонін-кінази і промотор гена глюкоамілази (СНЗ5Б) з
Агарідорвзізв ІНаїіапа.
Для експресії генів РЕК-зв'язувальних білків у клітинах рослин може також
Зо використовуватися ряд промоторів генів рослин, які регулюються у відповідь на сигнали навколишнього середовища, гормональні, хімічні і/або сигнали, що стосуються розвитку, зокрема промотори, регульовані за допомогою (1) нагрівання, (2) освітлення (наприклад, промотор КБс5-3А гороху, промотор РМбе5 кукурудзи), (3) гормонів, таких, як абсцизова кислота, (4) скарифікації (наприклад, УМипі) або (5) хімічних речовин, таких, як метилжасмонат, саліцилова кислота, стероїдні гормони, спирти, Сафенери (МО 97/06269), і вигідним може також бути використання (6) органоспецифічних промоторів.
Використовуваний тут термін "специфічний для органа запасання рослини промотор" стосується промотору, що переважно, порівняно з іншими тканинами, керує транскрипцією гена в органі запасання рослини. Переважно органом запасання є насіння. Переважно промотор тільки керує експресією гена, який становить інтерес, в органі запасання, і/або експресія гена, що становить інтерес, в інших частинах рослини, таких, як листки, є такою, що не виявляється з допомогою аналізу з використанням Нозерн-блоту і/або ПЛР у режимі реального часу. Типово промотор керує експресією генів під час росту і розвитку органа запасання, зокрема, під час фази синтезу і нагромадження сполук, які запасаються, в органі запасання. Такі промотори можуть керувати експресією генів у всьому органі запасання рослини або тільки в його частині, такій, як оболонка насінин, зародок або сім'ядоля(і) у насінні дводольних рослин або ендосперм або алейроновий шар насіння однодольних рослин.
Інші промотори можуть також використовуватися для експресії білка в конкретних тканинах, таких, як насіння або плоди. Може використовуватися промотор для Д-конгліцинину або інші специфічні для насіння промотори, такі, як промотори генів напіну, зеїну, лініну і фазеоліну. В одному варіанті здійснення промотор керує експресією в тканинах і органах, у яких відбувається біосинтез ліпідів. Такі промотори функціонують у ході розвитку насіння у придатний момент часу для модифікації складу ліпідів у насінні. В одному варіанті здійснення промотором, специфічним для органа запасання рослини, є специфічний для насіння промотор. У більш переважному варіанті здійснення промотор переважно керує експресією в зародку і/або сім'ядолях дводольної рослини або в ендоспермі однодольної рослини, порівняно з експресією в інших органах у рослині, таких, як листки. Переважні промотори для специфічної відносно насіння експресії включають: 1) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь у біосинтезі ліпідів і їхньому нагромадженні в насінні, такі, як десатурази і елонгази, 2) промотори з генів, що бо кодують білки, які запасаються в насінні, і 3) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь у біосинтезі вуглеводів і їхньому нагромадженні в насінні. Специфічними для насіння промоторами, які є придатними, є промотор гена лініну льону (наприклад, промотори
Сп або Спіг), промотор гена напіну олійного рапсу (патент США з Мо 5608152), промотор О5Р
Місіа табаг (Ваштівїп еї аї., 1991), промотор гена олеозину Агарідорзі5 (УМО 98/45461), промотор гена фазеоліну Рпазеоїй5 миЇдагіз (патент США з Мо 5504200), промотор Все4 Вгазвзіса (МО 91/13980) або промотор гена легуміну В4 (Ваитіевїп еї аї., 1992), і промотори, що приводять до специфічної відносно насіння експресії в однодольних рослинах, таких, як кукурудза, ячмінь, пшениця, жито, рис і т. п. Відомими промоторами, які є придатними, є промотор гена Ірі2 або Ірі! ячменю (МО 95/15389 і УМО 95/23230) або промотори, описані в МО 99/16890 (промотори з гена гордеїну ячменю, гена глютеліну рису, гена оризину рису, гена проламіну рису, гена гліадину пшениці, гена глютеліну пшениці, гена зеїну кукурудзи, гена глютеліну вівса, гена касирину сорго, гена секаліну жита). Інші промотори включають промотори, описані Вгошип еї аї. (1998),
Роїепла еєї а. (2004), у 5 20070192902 ї 05 20030159173. У варіанті здійснення специфічний для насіння промотор переважно експресується у визначених частинах насіння, таких, як зародок, сім'ядоля() або ендосперм. Приклади специфічних для сім'ядолі промоторів включають, але без обмеження, промотор ЕР (ЕїІегеігот еї аї!., 1996), промотор гена легуміну гороху (Регїтіп еї аї., 2000) ії промотор гена фітогемаглютиніну квасолі (Рег!тіп еї аї., 2000). У наступному варіанті здійснення специфічний для насіння промотор не експресується або експресується лише на низькому рівні в зародку і/або після проростання насіння.
У випадку присутності множини промоторів, кожен промотор може бути незалежним однаковим або відмінним. 5 нетрасльована лідерна послідовність може походити з промотору, вибраного для експресії гетерологічної генної послідовності полінуклеотиду, або може бути гетерологічною відносно області, що кодує продукований фермент, і може бути специфічно модифікованою, при бажанні, для збільшення трансляції мРНК.
Термінація транскрипція здійснюється за допомогою 3' нетрансльованої послідовності ДНК, функціонально зв'язаної в експресійному векторі з полінуклеотидом, що становить інтерес. 3" нетрансльований район рекомбінантної молекули ДНК містить сигнал поліаденілювання, який функціонує в рослинах з викликом додавання нуклеотидів аденілатів до З3' кінця РНК. 3'
Зо нетрансльований район може бути отриманий з різних генів, які експресуються, наприклад, у клітинах рослин. 3' нетрансльований район гена нопалінсинтази, 3' нетрансльований район з гена малої субодиниці Кибізсо гороху, 3' нетрансльований район з гена білка, що запасається в насінні, 75 сої звичайно використовуються в цьому об'ємі. 3' транскрибовані, нетрансльовані райони, що містять сигнал поліаденілювання з генів індукуючої пухлину (Ті) плазміди
Адгобасіегішт (Ті) також є придатними.
Технології рекомбінантних ДНК можуть використовуватися для збільшення експресії з трансформованого полінуклеотиду за допомогою маніпуляції, наприклад, числом копій полінуклеотиду в клітині-хазяїні, ефективністю, з якою цей полінуклеотид транскрибується, ефективністю, з якою транскрипти, що отримуються в результаті, транслюються, і ефективністю посттрансляційних модифікацій.
Для полегшення ідентифікації трансформантів рекомбінантний вектор бажано включає селектований або скринабельний ген-маркер у вигляді, або крім, нуклеотидної послідовності полінуклеотиду, визначеного тут. Під "геном-маркером" мається на увазі ген, що надає особливий фенотип клітинам, які експресують ген-маркер, і, таким чином, дозволяє відрізнити трансформовані клітини від клітин, які не містять маркер. Селектований ген-маркер надає особливість, по якій може здійснюватися відбір на основі стійкості до агента для відбору (наприклад, гербіциду, антибіотика, випромінювання, нагрівання або іншої обробки, що завдає шкоду нетрансформованим клітинам). Скринабельний ген-маркер (або ген-репортер) надає особливість, яку можна ідентифікувати завдяки спостереженню або перевірці, тобто за допомогою скринінгу (наприклад, ДВ-глюкуронідазну, люциферазну, ЕР або іншу ферментативну активність, що не є присутньою у нетрансформованих клітинах). Ген-маркер і нуклеотидна послідовність, що становить інтерес, не повинні бути зчепленими, оскільки котрансформація незчеплених генів, описана, наприклад, у патенті США з Мо 4399216, також є ефективним процесом у випадку, наприклад, трансформації рослин. Фактичний вибір маркера не є критичним за умови, що він є функціональним (тобто селективним) у комбінації з переважними клітинами, такими, як клітина рослини.
Селектовані маркери, що наводяться як прикладу, для відбору рослин-трансформантів включають, але без обмеження, ген пуд, що кодує стійкість до гігроміцину В; ген неоміцин- фосфотрансферази (прі), що надає стійкість до канаміцину, паромоміцину, 5418; ген бо глютатіон-5-трансферази з печінки щура, що надає стійкість до гербіцидів, які є похідними глутатіону, що, наприклад, описаний у ЕР 256223; ген глютамінсинтетази, що надає, при надекспресії, стійкість до інгібіторів глютамінсинтетази, таких, як фосфінотрицин, що, наприклад, описаний у МО 87/05327; ген ацетилтрансферази зі 5ігеріотусез мігідоспготодепев, що надає стійкість до агента для відбору - фосфінотрицину, що, наприклад, описаний у ЕР 275957; ген, що кодує 5-енолшикімат-3-фосфат-синтазу (ЕРБР5), що надає стійкість до М- фосфонометилгліцину, що, наприклад, описаний Ніпспее еї аї. (1988); ген Баг, що надає стійкість до бідалофосу, що, наприклад, описаний у М/091/02071; ген нітрилази, такий, як Бхп з
КіІерзіейа оо7аєпає, що надає стійкість до бромоксиліну (ЗіаіКег еї аї., 1988); ген дигідрофолатредуктази (ОНЕК), що надає стійкість до метотрексату (ТиШеї еї аї., 1988); мутантний ген ацетолактатсинтази (А! 5), що надає стійкість до імідазолінону, сульфонілсечовини або інших АГ зЗ-інгібуючих хімічних речовин (ЕР 154204); мутований ген антранілатсинтази, що надає стійкість до 5-метилтриптофану; або ген далапондегалогенази, що надає стійкість до гербіциду.
Переважні скринабельні маркери включають, але без обмеження, ген цідА, що кодує фермент В-глюкуронідазу (505), для якого відомі різні хромогенні субстрати; ген Д- галактозидази, що кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати; ген екворину (Ргазпег еї аї., 1985), що може використовуватися для чутливого до кальцію біолюмінесцентного детектування; ген зеленого флуоресцентного білка (Міеєа? еї аї., 1995) або його похідні; або ген люциферази (Іс) (Ом/ еї аї., 1986), що створює можливість для біолюмінесцентного детектування. Під "репортерною молекулою" мається на увазі молекула, що, по своїй хімічній природі, забезпечує аналітично ідентифікований сигнал, який допомагає визначенню активності промотору відповідно до білкового продукту.
Переважно, коли рекомбінантний вектор стійко включається в геном клітини, такої, як клітина рослини. Відповідно, рекомбінантний вектор може включати відповідні елементи, які дозволяють вектору включитися в геном, або в хромосому клітини.
Транспортні нуклеїнові кислоти
Транспортні нуклеїнові кислоти можуть використовуватися для доставки екзогенного полінуклеотиду в клітину і включають одну, переважно дві, прикордонні послідовності й полінуклеотид, що представляє інтерес. Транспортна нуклеїнова кислота може кодувати або
Зо може не кодувати селектований маркер. Переважно, коли транспортна нуклеїнова кислота утворює частину бінарного вектора в бактерії, причому бінарний вектор, крім того, включає елементи, що уможливлюють реплікацію вектора в бактерії, відбір або збереження бактеріальних клітин, що містять бінарний вектор. Після перенесення в еукаріотичну клітину, компонент бінарного вектора, що є транспортною нуклеїновою кислотою, здатний до інтеграції в геном еукаріотичної клітини.
Використовуваний тут термін "екстрахромосомна транспортна нуклеїнова кислота" стосується молекули нуклеїнової кислоти, що може бути перенесена з бактерії, такої, як
Адгорасіегішт 5р., в еукаріотичну клітину, таку, як клітина рослини. Екстрахромосомна транспортна нуклеїнова кислота є генетичним елементом, що широко відомий як елемент, який може бути перенесений, з наступною інтеграцією нуклеотидної послідовності, що міститься усередині її границь, у геном реципієнтній клітині. У зв'язку з цим транспортна нуклеїнова кислота фланкована, типово, двома "прикордонними" послідовностями, хоча в деяких випадках одна прикордонна послідовність на одному кінці може використовуватися, а другий кінець перенесеної нуклеїнової кислоти створюється довільно в процесі перенесення. Полінуклеотид, що становить інтерес, типово знаходиться між послідовністю начебто лівої прикордонної послідовності і послідовністю начебто правої прикордонної послідовності транспортної нуклеїнової кислоти. Полінуклеотид, що міститься в транспортній нуклеїновій кислоті, може бути функціонально зв'язаний із рядом різних промоторних і регулюючих термінації елементів, що допомагають його експресії, тобто транскрипції і/або трансляції полінуклеотиду. Транспортні
ДНК (Т-ДНК) з Аодгобасіегішт 5р., наприклад, Адгорасієегішт їшптегтасіеп5 або Адгорасіегічт гпідодепеб5, і їхні штучні варіанти/мутанти, імовірно, є найбільш охарактеризованими прикладами транспортних нуклеїнових кислот. Іншим прикладом є Р-ДНК ("рослинна ДНК"), що включає послідовності начебто прикордонних послідовностей Т-ДНК із рослин.
Як тут використовується, "Т-ДНК" стосується, наприклад, Т-ДНК Ті плазміди Адгобасіегічт їштегїтасіеп5 або з Кі плазміди Адгобасіегішт гпілодепе5, або їхніх штучних варіантів, що функціонують як Т-ДНК. Т-ДНК може включати всю Т-ДНК, включаючи і праву і ліву прикордонні послідовності, але повинна лише включати мінімальні послідовності, необхідні в цис для перенесення, тобто праву і прикордонну послідовність, що стосується Т-ДНК. Т-ДНК даного винаходу містять вставлений у них, де-небудь між правою і лівою прикордонними бо послідовностями (у випадку їхньої присутності), полінуклеотид, що становить інтерес.
Послідовності, кодуючі фактори, необхідні в транс для перенесення Т-ДНК у клітину рослини, такі, як гени міг, можуть бути вставлені в Т-ДНК, або можуть бути присутніми у тому ж репліконі, що і Т-ДНК, або переважно знаходяться в транс-положенні в сумісному репліконі в хазяїні
Адгобасіегіцшт. Такі "бінарні векторні системи" добре відомі в даній галузі техніки.
Як тут використовується, "Р-ДНК" стосується транспортної нуклеїнової кислоти, виділеної з геному рослини, або її штучних варіантів/мутантів і включає на кожному кінці, або тільки на одному кінці, послідовність начебто прикордонної послідовності Т-ДНК. Послідовність начебто прикордонної послідовності переважно ідентична на принаймні 5095, принаймні 60 95, принаймні 70 96, принаймні 75 95, принаймні 80 95, принаймні 90 95 або принаймні 95 95, але менше, ніж 10095 прикордонній послідовності Т-ДНК із Адгобрасіегішт 5р., наприклад,
Адгорасіегіцт їштеїасіеєпе або Адгобасіегішт гпігодепе5. Таким чином, Р-ДНК можуть використовуватися замість Т-ДНК для перенесення нуклеотидної послідовності, що міститься в
Р-ДНК, з, наприклад, Адгобасіегішт, в іншу клітину. Р-ДНК, перед вставкою екзогенного полінуклеотиду, що повинний бути перенесений, можна модифікувати для полегшення клонування, і вона переважно не повинна кодувати який-небудь білок. Р-ДНК характеризується тим, що вона містить принаймні праву прикордонну послідовність і переважно також ліву прикордонну послідовність.
Як тут використовується, "прикордонна" послідовність транспортної нуклеїнової кислоти можна бути виділеною з вибраного організму, такого, як рослина або бактерія, або бути її штучним варіантом/мутантом. Прикордонна послідовність активізує і полегшує перенесення полінуклеотиду, з яким вона зв'язана, і може сприяти його інтеграції в геном реципієнтної клітини. У варіанті здійснення довжина прикордонної послідовності становить 5-100 пар основ (п. о.), 10-80 п. о., 15-75 п. о., 15-60 п. о., 15-50 п. о., 15-40 п. о., 15-30 п. о., 16-30 п. о., 20-30 п. о., 21-30 п. о., 22-30 п. 0., 23-30 п. о., 24-30 п. о., 25-30 п. о. або 26-30 п. о. Прикордонні послідовності з Т-ДНК із Адгобасієегішт 5р. добре відомі в даній галузі техніки і включають ті, які описані в І асгоїх еї аї. (2008), Т2йга апа Спйом5Ку (2006) і СІеміп (2003).
Хоча традиційно тільки Адгобрасіегішт 5р. використовувалися для перенесення генів у клітини рослин, у даний час існує велика кількість систем, що були ідентифіковані/розроблені, які працюють аналогічно Адгобасіегішт 5р. Деякі види, які не належать до Адгобасіегішт, були
Зо нещодавно генетично модифіковані, щоб бути компетентними для перенесення генів (Спипд еї а!., 2006; Вгооїпаєгів еї а!., 2005). Вони включають Кпі2орішт 5р. МОК234, 5іпогпігобішт теїШоїй! і
Мегогпі2орішт Ісїї. Бактерії зроблені компетентними відносно перенесення генів за допомогою забезпечення бактерії апаратом, необхідним для процесу трансформації, тобто рядом генів вірулентності, кодованих Ті-плазмідою Адгобасіегішт, і сегментом Т-ДНК, що знаходиться на окремій, невеликій бінарній плазміді. Бактерії, створені таким чином, здатні трансформувати різні тканини рослин (листкові диски, калуси і яйцеклітини), однодольних або дводольних рослин, і різні інші види рослин (наприклад, тютюн, рис).
Як тут використовуються, терміни "трансфекція", "трансформація" і їх варіації, як правило, використовуються взаємозамінно. "Трансфіковані" або ""трансформовані" клітини можуть бути піддані обробці для введення полінуклеотиду(ів), що становить(лять) інтерес, або можуть бути клітинами-потомками, що походять від них.
Рекомбінантні клітини
Даним винаходом також забезпечується рекомбінантна клітина, наприклад, рекомбінантна клітина рослини, яка є клітиною-хазяїном, трансформованою одним або більше полінуклеотидом або вектором, визначених тут, або їхньою комбінацією. Термін "рекомбінатна клітина" використовується взаємозамінно з терміном "трансгенна клітина" тут. Придатні клітини даного винаходу включають будь-яку клітину, яку можна трансформувати полінуклеотидом або рекомбінантним вектором даного винаходу, що кодує, наприклад, поліпептид або фермент, описуваний тут. Переважно клітиною є клітина, яка у зв'язку з цим може використовуватися для продукції ліпіду. Рекомбінантна клітина може являти собою клітину в культурі, клітину іп міго, або в організмі, такому, як, наприклад, рослина, або в органі, такому, як, наприклад, насіння або листок. Переважно клітина знаходиться в рослині, більш переважно в насінні рослини, більш переважно в насінні олійної рослини, такої, як сафлор. У варіанті здійснення клітина рослини включає ліпід або олію, що має жирнокислотний склад, описуваний тут.
Клітини-хазяїни, у які вводять полінуклеотид(и), можуть бути або нетрансформованими клітинами, або клітинами, що вже трансформовані принаймні однією нуклеїновою кислотою.
Такі нуклеїнові кислоти можуть бути пов'язані із синтезом ліпідів, або не пов'язані з ним.
Клітини-хазяїни даного винаходу або можуть бути ендогенно (тобто по своїй природі) здатними до продукції поліпептиду(ів), визначених тут, у цьому випадку рекомбінантна клітина, що 60 походить від них, має збільшену здатність продукувати поліпептид(и), або можуть бути здатні продукувати зазначений поліпептид(и) тільки після трансформації принаймні одним полінуклеотидом даного винаходу. У варіанті здійснення рекомбінантна клітина даного винаходу має збільшену здатність продукувати неполярний ліпід. Клітини можуть бути прокаріотичними або еукаріотичними. Переважними клітинами-хазяїнами є дріжджові клітини, клітини водоростей і рослин. У переважному варіанті здійснення клітиною рослини є клітина насіння, зокрема, клітина в сім'ядолі або ендоспермі насіння. Приклади клітин водоростей, застосовних як клітини-хазяїнів даного винаходу, включають, наприклад, Спіатудотопах 5р. (наприклад, СпПіатудотопах геїіппагайії), ЮОипаїїена 5р., Наетайососси5 5р., СпПіІогеМйа 5р.,
Тигаивіоспуїгішт 5р., Зспі2оспуйнічт 5р. і МоїЇмох 5р.
Клітини-хазяїни можуть бути клітинами організму, що підходить для процесу зброджування, такого, як, наприклад, Магтом/а Ігроїуїса або інші дріжджі.
Трансгенні рослини
Даним винаходом також забезпечується рослина, що включає екзогенний полінуклеотид або поліпептид даного винаходу, клітину даного винаходу, вектор даного винаходу або їхню комбінацію. Термін "рослина" стосується цілих рослин, у той час як термін "її частина" стосується органів рослини (наприклад, листя, стебел, коренів, квіток, плодів), окремих клітин (наприклад, пилку), насіння, частин насіння, таких, як зародок, ендосперм, скутелум або оболонка насіння, тканини рослини, такої, як судинна тканина, клітин рослини і їх потомків. Як тут використовуються, частини рослини включають клітини рослини.
Як тут використовується, термін "рослина" використовується в найбільш широкому значенні.
Він включає, але без обмеження, будь-який вид трави, декоративної рослини, культури або хлібного злаку (наприклад, олійних рослин, кукурудзи, сої), кормової рослини, плодової або овочевої рослини, лікарської трави, деревної рослини, квітучої рослини або дерева. Не мається на увазі обмеження рослини якою-небудь конкретною структурою. Він також стосується одноклітинної рослини (наприклад, мікроводоростей). Термін "її частина" відносно рослини стосується клітини рослини і її потомства, множини клітин рослин, що значною мірою диференційовані усередині колонії, (наприклад, вольвоксу), структури, що є присутньою на будь-якій стадії розвитку рослини, або тканини рослини. Такі структури включають, але без обмеження, листки, стебла, квітки, плоди, горіхи, корені, насіння, оболонку насіння, зародки.
Зо Термін "тканина рослини" включає диференційовані і недиференційовані тканини рослин, зокрема ті, які присутні в листках, стеблах, квітках, плодах, горіхах, коренях, насінні, наприклад, зародкову тканину, ендосперм, тканину шкірного покриву (наприклад, епідерміс, перидерму), судинну тканину (наприклад, ксилему, флоему) або покривну тканину (яка включає паренхіму, коленхіму і/або клітини склеренхіми), а також клітини в культурі (наприклад, окремі клітини, протопласти, калус, зародки і т. д.). Тканина рослини може знаходитися в рослині, в органній культурі, культурі тканин або культурі клітин. "Трансгенна рослина", "генетично модифікована рослина" або його варіанти стосується рослини, що містить трансген, який не зустрічається в рослині дикого типу того ж виду, сорту або культивару. Трансгенні рослини, які визначаються в зв'язку з даним винаходом, включають рослини і їх потомків, що були генетично модифіковані, використовуючи рекомбінантні методи, для виклику продукції принаймні одного поліпептиду, визначеного тут, у бажаній рослині або її частині. "Частини трансгенної рослини" мають відповідне значення.
Терміни "насіння" і "зерно" є спорідненими термінами, використовуваними тут, і мають значення, що частково співпадають. "Зерно" стосується зрілого зерна, наприклад, зібраного зерна, або зерна, що усе ще знаходиться на рослині, але готове для збору, але може також стосуватися зерна після насичення вологою або проростання, відповідно до контексту. Зріле зерно звичайне має вміст вологи, що становить менше, ніж приблизно 18-20 95. "Насіння" включає "насіння, що розвивається", а також "зерно", що є зрілим зерном, але не зерном після насичення вологою або проростання. "Насіння, що розвивається", як тут використовується, стосується насіння до дозрівання, що типово зустрічається в репродуктивних структурах рослини після запилення або цвітіння, але може також стосуватися такого насіння до дозрівання, яке виділяють з рослини. Розвиток насіння в рослині типово поділяється на ранню, середню і пізню фази розвитку.
Використовуваний тут термін "орган запасання рослини" стосується частини рослини, пристосованої для нагромадження енергії у формі, наприклад, білків, вуглеводів, ліпідів.
Прикладами органів запасання рослини є насіння, плід, бульбоподібні корені і бульбоплоди.
Переважним органом запасання рослини даного винаходу є насіння.
Як тут використовується, термін "тканина вегетативного органа/частини" або "вегетативна частина рослини" або його варіанти являє собою будь-яку тканину, орган або частину рослини, 60 що не включає органи статевого розмноження рослин або насіннєносні органи або близько зв'язані тканини або органи, такі, як квітки, плоди і насіння. Тканини вегетативних органів/частин і вегетативні частини включають принаймні листки, стебла (зокрема стрілки і пагони, але крім колосся), бульби і корені рослин, але виключають квітки, пилок, насіння, зокрема оболонку насіння, зародок і ендосперм, плід, зокрема тканину міжоплодня, насіннєносні стручки і насіннєносне колосся. В одному варіанті здійснення вегетативна частина рослини є надземною частиною рослини. В іншому або подальшому варіанті здійснення вегетативна частина рослини є зеленою частиною, такою, як листок або стебло. Вегетативні частини включають ті частини, що в основному залучені в забезпечення або підтримку здатності до фотосинтезу рослини або пов'язаної функції, або закріплення рослини.
Використовуваний тут термін "фенотипічно нормальне" стосується генетично модифікованої рослини або її частини, зокрема, органа запасання, такого, як насіння даного винаходу, що не має значно зменшену здатність рости і репродукуватися порівняно з немодифікованою рослиною або її частиною. У варіанті здійснення генетично модифікована рослина або її частина, що є фенотипічно нормальною, включає принаймні один екзогенний полінуклеотид, визначений тут, і має здатність рости і репродукуватися, по суті однакову з такою відповідної рослини або її частини, що не включає зазначений полінуклеотид(и). Переважно, коли біомаса, швидкість росту, швидкість проростання, розмір органів запасання, розмір насіння і/або кількість утвореного життєздатного насіння становить не менше 90 95 від такої рослини, у якій відсутній зазначений екзогенний полінуклеотид, при вирощуванні в ідентичних умовах. Цей термін не охоплює особливості рослини, що можуть бути відмінними від таких рослини дикого типу, але які не впливають на застосовність рослини для комерційних цілей.
Рослини, забезпечувані даним винаходом або передбачувані для використання при здійсненні на практиці даного винаходу, включають і однодольні, і дводольні рослини. У переважних варіантах здійснення рослинами даного винаходу є культурні рослини (наприклад, злаки і зернобобові, кукурудза, пшениця, картопля, маніок, рис, сорго, просо, маніока, ячмінь або горох) або інші бобові рослини. Рослини можуть вирощуватися для одержання їстівних коренів, бульб, листя, стебел, квіток або плодів. Рослини можуть бути овочевими або декоративними рослинами. Рослинами даного винаходу можуть бути: сафлор (Саппатив
Ііпсіогіиз), кукурудза (7еа таув), канола (Вгаззіса пари, Вгазвіса гара 55р.), інші Вгаззісав, такі
Зо як, наприклад, бруква (Вгаззіса паробгаввіса), гірчиця (Вгаззіса |псеа), ефіопська гірчиця (Вгазвзіса сагіпаїа), крамбе (Статбре абуззіпіса), рижій (Сатеїйпа заїїма), цукровий буряк (Веїа миЇдагіз), конюшина (Тпоїїйшт 5р.), льон (Сіпит и5йаїїзбзітит), люцерна (Меадісадо заїїма), рис (Огула займа), жито (ЗесаІе сегаіє), сорго (Зогупит бБісоїог, Зогупит миЇдаге), соняшник (Неїїапіпи5 аппи5), пшениця (Тгйшт аевзіїмит), соя (Сіусіпе тах), тютюн (Місоцапа їарасит), картопля (Зоіапит Іибегозит), арахіс (Агаспіз пуродаєа), бавовник (Со55зурішт Пігшшт), солодка картопля (І ортоеа бБаїацш5), маніока (Мапійої езсшіепіа), кавове дерево (Соїєа 5рр.), кокосова пальма (Сосо5 писіїега), ананас (Апапа сотозив), цитрусове дерево (Сйги5 5рр.), дерево какао (Пеобгота сасаоб), чай (Сатеїїа зепепві5), бананове дерево (Миза 5рр.), авокадо (Регзеа атегісапа), фігове дерево (Рісиб5 савіса), гуава (Рзідішт диа|ама), мангове дерево (Мапоїтег іпаіса), маслина європейська (СОїєа епигораєа), динне дерево (Сагіса рарауа), анакард (Апасагаійшт оссідепіаІіє), макадамія (Масадатіа іпіегодгітоїйа), мигдаль (Ргипи5 атудаа|нв), ятрофа (даїгорна сигсав), люпіни, евкаліпти, пальма, горіх, шавлія, погамія, овес або ячмінь.
Інші переважні рослини включають С4-трави, такі, як Апагородоп дегагаії, Вошеїоца сипірепашіа, В. дгасії5, Виспіое дасіуіоіде5, Рапісит мігдаїйшт, Зспігаспугічт 5сорагійт, види
Мізсапіпи5, наприклад, Мізсапіпиз5 х дідапівєи5 і Мізсапіпи5 б5іпеп5зі5, Зогупазігит пшапв, зрогороїйз сгуріапаги5, просо прутовидне (Рапісит мігдаїшт), цукрова тростина (Засспагит оНісіпагит), ВгасНуагіа; СЗ-трави, такі, як ЕІутив5 сападепві5, бобові рослини І езредела сарійайа і
РеїаІюзієтит міозит, напівчагарник Авіег алигеи5; і деревні рослини, такі, як Опцегси5 еПрзоідаїз і 0). ппасгосагра.
У переважному варіанті здійснення рослиною є покритонасінна рослина.
У переважному варіанті здійснення рослиною є олійна рослина, переважно олійна культура.
Як тут використовується, "олійна рослина" являє собою вид рослини, використовуваний для комерційного одержання ліпіду з насіння рослини. "Комерційне одержання" тут означає одержання ліпіду, переважно олії, для продажу в обмін на прибуток. Олійною рослиною може бути олійний рапс (такий, як канола), кукурудза, соняшник, сафлор, соя, сорго, льон (лляне насіння) або цукровий буряк. Крім того, олійною рослиною можуть бути інші Вгабзіса5, бавовник, арахіс, мак, бруква, гірчиця, рицина звичайна, кунжут, сафлор або рослини, які утворюють горіхи. Рослина, така, як маслина європейська, олійна пальма або кокосова пальма, може продукувати високі рівні ліпіду у своєму плоді. Плодоовочевими рослинами, на які може 60 поширюватися даний винахід, є салат-латук, цикорний салат або овочеві Вгабт5іса5, що
Зо включають капусту, броколі або кольорову капусту. Даний винахід може поширюватися на тютюн, гарбуз, моркву, полуницю, помідор або перець. Більш переважними рослинами є олійні рослини, насіння яких, що розвивається, є нефотосинтезуючим, які також називаються рослинами з "білим насінням", такі, як сафлор, соняшник, бавовник і рицина.
У переважному варіанті здійснення трансгенна рослина є гомозиготною по кожному і всякому гену, що був уведений, (трансгену), так що її потомки не розщеплюються по бажаному фенотипу. Трансгенна рослина може також бути гетерозиготною по введеному трансгену(ам), переважно рівномірно гетерозиготною по трансгену, наприклад, у Е1 потомстві, що було вирощене з гібридного насіння. Такі рослини можуть дати переваги, такі, як гібридна сила, добре відомі в даній галузі техніки.
Трансформація рослин
Трансгенні рослини можна створити, використовуючи відомі в даній галузі техніки методи, такі, як ті, які в цілому описані в 5іагег еї аї., Ріапі Віоїесппоіоду- Те Сепеїїс Мапіршіайноп ої
Ріапі5, Охіога Опімегейу Ргез5 (2003), і Спгізіои апа КіІее, Напабоок ої Ріапі ВіоїесппоЇІоду, доп
УМіеу апа 5опв (2004).
Використовувані тут терміни "стійке трансформування", "стійко трансформований" і їхні варіанти стосуються інтеграції полінуклеотиду в геном клітини, так що він передається клітинам- потомкам під час розподілу клітини без необхідності в позитивній селекції відносно його присутності. Стійкі трансформанти, або їхніх потомків, можна відібрати і/або ідентифікувати за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі техніки, такого, як блотинг по Саузерну на хромосомній ДНК або іп 5йш гібридизація геномної ДНК.
Адгорасіегйт-опосередковане перенесення є широко застосовною системою для введення генів у клітини рослин, оскільки ДНК можна ввести в клітини в тканинах цілої рослини, органах рослини, або експланти в культурі тканин, або для транзиторної експресії, або для стійкої інтеграції ДНК у геном клітини рослини. Для введення ДНК у клітини рослини добре відоме використання векторів для АдгоБбасіегійт-опосередкованої інтеграції в геном клітини рослини (див., наприклад, патенти США з Мо 5177010, 5104310, 5004863 і 5159135). Район ДНК, що повинний бути перенесений, визначається прикордонними послідовностями, і проміжна ДНК (Т-
ДНК) звичайно вбудовується в геном рослини. Крім того, інтеграція Т-ДНК є відносно точним
Зо процесом, що приводить до невеликого числа перестановок. У випадку тих сортів рослин, для яких Адгобасіегіцт-опосередкована трансформація є ефективною, вона є переважним методом через легкий і визначений характер перенесення генів. Переважні вектори для Адгобасіегійт - опосередкованої трансформації здатні реплікуватися в ЕЕ. соїї, а також Адгобасіегічт, створюючи можливість для придатних маніпуляцій, як описано (КіІее еї аї., Іп: Ріапї ОМА
Іптесіїои5 Адепів, Нонп апа зенеї, едв5., Зргіпдег-Мепіад, Мем Моїк, рр. 179-203 (1985)).
Способи прискорення, які можуть використовуватися, включають, наприклад, бомбардування мікрочастинками і т. п. Одним прикладом способу доставки молекул, що трансформують нуклеїнові кислоти у клітини рослини, є бомбардування мікрочастинками. Цей спосіб був розглянутий у Уапо еї аї., Рагпісіє Вотрагатепі ТесппоЇоду ог Сепе Тгапвїег, Охтога
Рге55, Охтога, Епдіапа (1994). Небіологічні частинки (мікрочастинки) можуть бути покриті нуклеїновими кислотами і доставлені в клітини за допомогою рушійної сили. Такі методи добре відомі в даній галузі техніки. В іншому варіанті здійснення можна стійко трансформувати пластиди. Способи, описані для трансформації пластид вищих рослин, включають доставку за допомогою генної гармати ДНК, що містить селектований маркер, і спрямовану доставку ДНК у геном пластид завдяки гомологічній рекомбінації (патент США з Мо 5451513, патент США з 5545818, патент США з 5877402, патент США з 5932479 і УМО 99/05265).
Трансформації протопластів клітин рослин можна досягти, використовуючи методи на основі преципітації фосфатом кальцію, обробки полієтиленгліколем, електропорації і комбінації цих обробок. Використання цих систем для різних сортів рослин залежить від можливості регенерувати цю конкретну лінію рослин із протопластів. Ілюстративні способи регенерації зернових із протопластів описані (Еційтига еї аї., 1985; Тогіуата еї аї., 1986; Абашіапй еї аї., 1986).
Інші способи трансформації клітин можуть також використовуватися і включають, але без обмеження, уведення ДНК у рослини за допомогою прямого перенесення ДНК у пилок, за допомогою прямої ін'єкції ДНК у репродуктивні органи рослини або за допомогою прямої ін'єкції
ДНК у клітини недорозвинених зародків з наступною регідратацією сухих зародків.
Регенерація, розвиток і вирощування рослин з окремих трансформантів протопластів клітин рослин або з різних трансформованих експлантів добре відома в даній галузі техніки (М/евівврасі еї аї., й: Меїнподв їог Ріапі МоїІесціаг Віоіоду, Асадетіс Рге55, Зап Оієдо, Саїїї., бо (1988)). Цей процес регенерації і вирощування типово включає стадії відбору трансформованих клітин, вирощування цих індивідуалізованих клітин протягом звичайних стадій розвитку зародків аж до стадії укорінених паростків. Трансгенні зародки і насіння регенерують подібно. Отримані в результаті трансгенні укорінені паростки згодом висаджують у придатне середовище для вирощування рослин, таке, як грунт.
Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний, екзогенний ген, добре відомо в даній галузі техніки. Переважно регенеровані рослини є самозапильними для забезпечення гомозиготних трансгенних рослин. У протилежному випадку, пилок, отриманий з регенерованих рослин, використовують для запилення вирощених з насіння рослин агрономічно важливих ліній. У протилежному випадку, пилок від рослин цих важливих ліній використовують для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину даного винаходу, що містить бажаний полінуклеотид, вирощують, використовуючи способи, добре відомі кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцю.
Способи трансформації дводольних рослин, в основному з використанням Аадгобасіегійт
Ішптегасієеп5, і одержання трансгенних рослин були опубліковані для бавовнику (патент США з Мо 5004863, патент США з Мо 5159135, патент США з Мо 5518908), сої (патент США з Мо 5569834, патент США з Мо 5416011), Вгаззіса (патент США з Мо 5463174), арахісу (Спепо еї аї., 1996) і гороху (огапі еї аї., 1995).
Способи трансформації хлібних злаків, таких, як пшениця і ячмінь, для внесення генетичної варіації в рослини в результаті введення екзогенної нуклеїнової кислоти і регенерації рослин з протопластів або недорозвинених зародків рослин добре відомі в даній галузі техніки, див., наприклад, СА 2092588, А 61781/94, АО 667939, патент США з Мо 6100447, РСТ/І597/10621, патент США з Мо 5589617, патент США з Мо 6541257. Регенеровані клітини пшениці переважно походять зі скутелума недорозвинених зародків, зрілих зародків, калуса, що походить з них, або тканини меристеми.
Для підтвердження присутності трансгенів у трансгенних клітинах і рослинах можна виконати ампліфікацію з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або аналіз із використанням блотингу по Саузерну, використовуючи методи, відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям. Після одержання трансгенних рослин їх можна вирощувати для одержання тканин рослин або їхніх частин, що мають бажаний фенотип. Можна зібрати тканину
Зо рослини або частини рослини, і/або можна зібрати насіння. Насіння може служити як джерело для вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, що мають бажані характеристики.
Трансгенна рослина, створювана, використовуючи методи трансформації з використанням
Адгобасієгішт або інші методи трансформації, типово містить один трансгенний локус в одній хромосомі. Такі трансгенні рослини називають гемізиготними по доданому гену(ам). Більш переважною є трансгенна рослина, що є гомозиготною по доданому гену(ам), тобто трансгенна рослина, що містить два додані гени, один ген у тому самому локусі в кожній хромосомі пари хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути отримана за допомогою самозапилення гемізиготної трансгенної рослини, пророщення деяких з отриманих насінин і аналізу отриманих у результаті рослин на предмет гена, що становить інтерес.
Також повинно бути зрозуміло, що дві різні трансгенні рослини, що містять два екзогенні гени або локуси, що незалежно розщеплюються, можуть бути також схрещені з одержання потомків, що містять обидва набори генів або локусів. Самозапилення відповідного Е1 потомка може привести до одержання рослин, що є гомозиготними по обох екзогенних генах або локусах. Також передбачається поворотне схрещування з батьківською рослиною й ауткросинг із нетрансгенною рослиною, як і вегетативне розмноження. Описи інших методів схрещування, що звичайно використовуються для різних особливостей і культур, можна знайти в Репйг, Іп:
Вгеєдіпуд Меїнодз тог Сийімаг ОемеІортепі, УМ/іЇсох у. єд., Атегісап б5осівїу ої Адгопоту, Мадізоп
Мі. (1987).
Для трансформації сафлору особливо застосовні способи, описані Веїїде і ін. (2011).
ТІШІМа
В одному варіанті здійснення ТІССІМО (індуковані в результаті спрямованого впливу локальні ушкодження в геномах) можуть використовуватися для створення рослин, у яких відбувся нокаут ендогенних генів, наприклад, генів, що кодують Д12 десатуразу, пальмітоїл-
АСР-тіоестеразу, активність десатурази Фб жирних кислот або Аб десатурази, або комбінацію двох або більше з них.
На першому етапі індукують мутації, що вводяться, такі, як нові зміни однієї пари основ, у популяції рослин за допомогою обробки насіння (або пилку) хімічним мутагеном і потім розвитку рослин до покоління, у якому мутації будуть стійко успадковуватися. ДНК екстрагують, і зберігають насіння від усіх членів популяції для створення запасів, до яких можна звернутися повторно з часом.
Для аналізу ТІ. ІМО конструюють праймери для ПЛР для специфічної ампліфікації одного гена-мішені, що становить інтерес. Специфічність особливо важлива, якщо мішень є членом сімейства генів або частиною поліплоїдного геному. Потім мічені барвником праймери можуть використовуватися для ампліфікації продуктів ПЛР, виходячи з об'єднаної ДНК множини індивідуумів. Ці продукти ПЛР денатурують і знову піддають відпалу для допуску утворення помилково спарених пар основ. Помилкові спарювання, або гетеродуплекси, відображають і однонуклеотидні поліморфізми (ЗМР), що зустрічаються в природі (тобто кілька рослин з популяції, імовірно, будуть мати той самий поліморфізм), і індуковані 5МР (тобто лише рідкісні окремі рослини, імовірно, будуть демонструвати мутацію). Після утворення гетеродуплексів використання ендонуклеази, такої, як СеїЇ, яка розпізнає і розщеплює помилково спарену ДНК, є ключем для виявлення нових ЗМР у популяції з ТІ ІМ.
Використовуючи цей підхід, можна скринувати багато тисяч рослин для ідентифікації якого- небудь індивідуума із заміною однієї основи, а також невеликими вставками або делеціями (1- 30 п. о.) у будь-якому гені або конкретній ділянці геному. Розмір досліджуваних геномних фрагментів може коливатися десь від 0,3 до 1,6 т. п. о. У випадку 8-кратного об'єднання фрагментів розміром 1,4 т. п. о. (не враховуючи кінці фрагментів, у яких виявлення ЗМР є проблематичним через шум) і 96 доріжок на кожен аналіз, ця комбінація дозволяє скринувати аж до мільйона пар основ геномної ДНК в одному аналізі, що робить аналіз ТІ ІМО методом з високою пропускною здатністю. Аналіз ТІ ІМ, крім того, описаний у 5біаде апа Кпашцї (2005), і
Непікоїї єї а). (2004).
Крім того, що технологія ТІ.ГІМО з високою пропускною здатністю дозволяє ефективно детектувати мутації, вона є ідеальною для детектування природних поліморфізмів. Отже, дослідження невідомої гомологічної ДНК за допомогою утворення гетеродуплекса з відомою послідовністю дозволяє встановити кількість і положення поліморфних сайтів. Ідентифікують як заміни нуклеотидів, так і невеликі вставки і делеції, включаючи принаймні деякі поліморфізми кількості повторів. Це було названо Есоїйіпо (Сопаї еї а!., 2004).
Кожен ЗМР реєструється відповідно до його приблизного положення в межах декількох
Зо нуклеотидів. Таким чином, кожен гаплотип може бути заархівований на основі його мінливості.
Дані про послідовності можна одержати з відносно невеликим інкрементним об'ємом роботи, використовуючи аліквоти тієї ж ампліфікованої ДНК, що використовується для аналізу розщеплення помилкових спарювань. Лівий або правий праймер для секвенування для однієї реакції вибирають відповідно до його близькості до поліморфізму. Програмне забезпечення зедиепспег виконує множину сполучень і виявляє зміну основи, що у кожному випадку підтверджено смугою в гелі.
Есоїйіпуд можна виконати дешевше, ніж повне секвенування, спосіб, використовуваний у даний час для виявлення більшої частини ЗМР. Можна скринувати пластини, що містять екотипічну ДНК у ранжированих рядах, а не пули ДНК із підданих мутагенезу рослин. Оскільки детектування здійснюється в гелях з розрізнювальною здатністю майже пара основ, і фонові малюнки є однаковими по доріжках, можна зіставити смуги з однаковим розміром, у такий спосіб виявляючи і генотипуючи ЗМР в один прийом. Таким чином, завершувальне секвенування ЗМР є простим і ефективним, зробленим навіть у більшому ступені таким у силу того, що аліквоти тих же продуктів ПЛР, використовуваних для скринінгу, можуть піддаватися секвенуванню ДНК.
Процедури мутагенезу
Методи створення мутантних ліній рослин відомі в даній галузі техніки. Приклади мутагенів, що можуть використовуватися для створення мутантних рослин, включають опромінення і хімічний мутагенез. Мутанти можна також створити за допомогою таких методів, як вставка Т-
ДНК і транспозон-індукований мутагенез. Мутації в будь-який бажаний ген у рослині можна ввести сайт-специфічним способом з використанням штучних нуклеаз з доменами "цинкові пальці" (2ЕМ), ефектора ТАЇ (ТАГЕМ) або технологій СКІЗРЕ. (використовуючи нуклеазу типу
Са59), як відомо в даній галузі техніки. Процедури мутагенезу можна виконати на будь-якій родовій клітині рослини, наприклад, насіння або батьківської клітини в культурі тканин.
Хімічні мутагени піддаються класифікації відповідно до хімічних властивостей, наприклад, алкілуючі агенти, зшиваючі агенти і т. д. Застосовні хімічні мутагени включають, але без обмеження, М-етил-М-нітрозосечовину (ЕМО); М-метил-М-нітрозосечовину (ММ); прокарбазину гідрохлорид; хлорамбуцил; циклофосфамід; метилметансульфонат (ММ5); етилметансульфонат (ЕМ5); діетилсульфат; мономер акріамід; триетиленмеламін (ТЕМ); мелфалан; азотистий іприт; вінкристин; диметилнітрозамін; М-метил-М'-нітро-нітрозогуанідин 60 (ММС); 7,12-диметилбензантрацен (ОМВА); етиленоксид; гексаметилфосфорамід і бісульфан.
Прикладом придатного опромінення для індукції мутацій є опромінення гамма-променями, таке, як опромінення, забезпечуване джерелом Севзішт 137. Опромінення гамма-променями клітин рослин переважно забезпечується в дозі, що становить приблизно 60-200 крад, і найбільш переважно в дозі, що становить приблизно 60-90 крад.
Рослини типово піддають впливу мутагену протягом відрізка часу, достатнього для здійснення бажаної генетичної модифікації але недостатнього для повного знищення життєздатності клітин і їхньої здатності до регенерації в рослину.
Процедури мутагенезу, описані вище, типово приводять до створення мутантів у гені, що становить інтерес, з частотою, що складає принаймні 1 на 1000 рослин, що означає, що скринінг підданих мутагенезу популяцій рослин є здійсненним способом для ідентифікації мутацій у будь-якому гені, що становить інтерес. Ідентифікації мутантів можна також досягти за допомогою технології нуклеотидного секвенування з масовим паралелізмом.
Відбір за допомогою маркера
Відбір за допомогою маркера є широко відомим способом відбору гетерозиготних рослин, необхідним при поворотному схрещуванні з поворотним батьком у класичній програмі схрещування. Популяція рослин у кожному поколінні одержуваному при поворотному схрещуванні, буде гетерозиготною по гену, що становить інтерес, що звичайно є присутнім у співвідношенні 1:1 у популяції, отриманій в результаті поворотного схрещування, ( молекулярний маркер може використовуватися для розрізнення двох алелей гена. Екстрагуючи
ДНК, наприклад, з молодих паростків і перевіряючи з використанням специфічного маркера для бажаної ознаки, що є результатом інтрогресії, здійснюють ранній відбір рослин для подальшого поворотного схрещуванні при зосередженні енергії і ресурсів на меншій кількості рослин. Для подальшого прискорення програми поворотного схрещування зародок із недорозвиненого насіння (25 днів після цвітіння) можна висікти і вирощувати на поживних середовищах у стерильних умовах, а не допускати повне дозрівання насіння. Цей процес, названий "порятунок зародка", використовуваний у комбінації з екстракцією ДНК на стадії трьох листків і аналізом відносно бажаного генотипу, дозволяє швидко відібрати рослини, які мають бажану ознаку, які можна вирощувати до дозрівання в теплиці або на полі для наступного поворотного схрещування з поворотним батьком.
Будь-який молекулярний біологічний метод, відомий у даній галузі техніки, за допомогою якого можна детектувати ген ЕАО2, ЕАТВ або ГАОб, може використовуватися в способах даного винаходу. Такі методи включають, але без обмеження, використання ампліфікації нуклеїнових кислот, секвенування нуклеїнових кислот, гібридизацію нуклеїнових кислот з відповідно міченими зондами, аналіз одноланцюжкового конформаційного поліморфізму (55СА), електрофорез у градієнтному гелі в денатуруючих умовах (ОССЕ), аналіз гетеродуплексів (НЕТ), аналіз хімічного розщеплення (ССМ), каталітичне розщеплення нуклеїнових кислот або їх комбінацію (див., наприклад, І етіеєих, 2000; І апогідде еї аї., 2001). Даний винахід також включає використання методів з використанням молекулярних маркерів для детектування поліморфізмів, зв'язаних з алелями (наприклад) гена ГАЮ2, ЕАТВ або ЕБАЮОб, що надають бажаний фенотип. Такі методи включають виявлення або аналіз поліморфізмів довжин рестрикційних фрагментів (КЕРГР), КАРОЮ, поліморфізмів довжин ампліфікованих фрагментів (АРІ Р) і поліморфізмів мікросателітних локусів (повтору простої послідовності, 55К). Зчеплені маркери можна одержати легко за допомогою методів, добре відомих у даній галузі техніки, таких, як аналіз об'єднаних сегрегантів, що розглянуті І аподгідде і ін. (2001). "Полімеразна ланцюгова реакція" ("ПЛР") являє собою реакцію, у ході якої створюються копії-репліки з полінуклеотиду-мішені, використовуючи "пари праймерів" або "набір праймерів", що складається з "верхнього" (5) і "нижнього" (3) праймера, і каталізатор полімеризації, такий, як ДНК-полімераза і типово термостабільний фермент полімераза. Способи для ПЛР відомі в даній галузі техніки і повідомляються, наприклад, у ""СЕ" (Ед. М.У. МеРпегзоп апа 5.65 Моїег (2000) ВІО5 Зсієпіййс Рибіїзпег5 ЦЯ, Охіога). ПЛР може виконуватися на кДНК, отриманій в результаті зворотної транскрипції мРНК, виділеної з клітин рослини. Однак буде, як правило, зручніше, якщо ПЛР буде виконуватися на геномній ДНК, виділеній з рослини.
Праймер являє собою олігонуклеотидну послідовність, що здатна до гібридизації специфічним відносно послідовності способом з послідовністю-мішенню і до подовження під час
ПЛР. Амплікони або продукти ПЛР, або фрагменти ПЛР, або продукти ампліфікації являють собою продукти подовження, що включають праймер і знову синтезовані копії послідовності- мішені. Мультиплексні системи для ПЛР містять множину наборів праймерів, що приводять до одночасної продукції більш ніж одного амплікона. Праймери можуть бути повністю відповідними послідовності-мішені, або вони можуть містити внутрішні невідповідні основи, які можуть бо приводити до введення сайтів розпізнавання/розщеплення рестрикційними ферментами або каталітичними нуклеїновими кислотами в конкретних послідовностях-мішенях. Праймери можуть також містити додаткові послідовності і/або містити модифіковані або мічені нуклеотиди для полегшення захоплення або детектування ампліконів. Повторювані цикли термічної денатурації ДНК, відпалу праймерів з комплементарними до них послідовностями і подовження підданих відпалу праймерів за допомогою полімерази приводять до експонентної ампліфікації послідовності-мішені. Терміни "мішень" або "послідовність-мішень" або "матриця" стосуються послідовностей нуклеїнових кислот, що ампліфікують.
Способи прямого секвенування нуклеотидних послідовностей добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям, і їх можна знайти, наприклад, у А!Мзибеї еї аї. (вище) і Затогоок еї аі. (вище). Секвенування може виконуватися будь-яким придатним способом, наприклад, із використанням дидезокси-секвенування, хімічного секвенування або їхніх варіантів. Пряме секвенування дає перевагу визначення варіації в будь-якій парі основ конкретної послідовності.
Системи детектування на основі гібридизації включають, але без обмеження, аналіз ТадМап і аналіз із використанням молекулярних маяків (патент США з Мо 5925517). В аналізі ТадмМап (патент США з Мо 5962233) використовуються специфічні відносно алелей (АБО) зонди з флуорофором-донором на одному кінці і флуорофором-акцептором на іншому кінці, так що пара флуорофорів взаємодіє за допомогою резонансного перенесення енергії флуоресценції (ЕВЕТ).
В одному варіанті здійснення спосіб, описаний у прикладі 7, використовується в програмі селекції і схрещування для ідентифікації і відбору рослин сафлору з мутацією ої. Наприклад, спосіб включає виконання реакції ампліфікації на геномній ДНК, отриманій з рослини, використовуючи один або більше з наступних наборів праймерів; ї) 5-АТАДАССсСТИаТаТттоАСа,ацаттт-3" (ЗЕО ІО МО: 140) и 5- астоАдсаттасасАТАСААсСаАТ-З (ЗЕО І МО: 141), та ії) 5Б-АСТТАТОИТТоСАТаАТСИ,АСаИ-3" (ЗЕО ІО МО: 142) и 5- тТТастАТАСАТАТТаААСаИсАСТ-З (5ЕО ІО МО: 143).
Поліпептиди
Терміни "поліпептид" і "білок", як правило, використовуються взаємозамінно.
Поліпептид або клас поліпептидів може характеризуватися ступенем ідентичності (90 ідентичності) його амінокислотної послідовності з посилальною амінокислотною послідовністю, або наявністю більшого 95 ідентичності з однією посилальною амінокислотною послідовністю, ніж з іншою. 95 ідентичності поліпептиду з посилальною амінокислотною послідовністю типово визначають за допомогою аналізу ЗАР (Мееаієтап апа УуУсп5сй, 1970; програма Со) з використанням параметрів: штрафу за створення пропуску в послідовності-5 і штрафу за розширення пропуску в послідовності-:0,3. Довжина запитуваної послідовності становить принаймні 100 амінокислот, і при аналізі ЗАР сполучаються дві послідовності протягом ділянки з принаймні 100 амінокислот. Навіть більш переважно, коли довжина запитуваної послідовності становить принаймні 250 амінокислот, і при аналізі (АР сполучаються дві послідовності протягом ділянки з принаймні 250 амінокислот. Навіть більш переважно, коли при аналізі ОСАР сполучаються дві послідовності протягом усієї їхньої повної довжини. Поліпептид або клас поліпептидів може мати ту ж ферментативну активність, що і посилальний поліпептид, або активність, відмінну від такого посилального поліпептиду, або не мати активність посилального поліпептиду. Переважно, коли поліпептид має ферментативну активність, що становить принаймні 10 95 від активності посилального поліпептиду.
Як тут використовується, "біологічно активний фрагмент" являє собою частину поліпептиду даного винаходу, у якій зберігається визначена активність повнорозмірного посилального поліпептиду, наприклад, Д12 десатуразна, пальмітоїл-АСР-тідоестеразна або Дб десатуразна активність. Біологічно активні фрагменти, як тут використовуються, виключають повнорозмірний поліпептид. Біологічно активні фрагменти можуть бути частиною будь-якого розміру за умови, що в них зберігається визначена активність. Переважно, коли в біологічно активному фрагменті зберігається принаймні 10 95 від активності повнорозмірного поліпептиду.
Що стосується визначеного поліпептиду або ферменту, буде зрозуміло, що процентні значення ідентичності, які перевищують значення, надані тут, будуть охоплювати переважні варіанти здійснення. Таким чином, де застосовно, через мінімальні процентні значення ідентичності, переважно, коли поліпептид/фермент включає амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 50 95, більш переважно на принаймні 60 95, більш переважно на принаймні 65 95, більш переважно на принаймні 70 95, більш переважно на принаймні 75 95, більш переважно на принаймні 80 95, більш переважно на по щонайменше 85 95, більш переважно на принаймні 90 95, більш переважно на принаймні 91 95, більш переважно на бо принаймні 92 95, більш переважно на принаймні 93 95, більш переважно на принаймні 94 95,
більш переважно на принаймні 95 95, більш переважно на принаймні 96 95, більш переважно на принаймні 97 95, більш переважно на принаймні 98 95, більш переважно на принаймні 99 95, більш переважно на принаймні 99,1 95, більш переважно на принаймні 99,2 95, більш переважно на принаймні 99,3 95, більш переважно на принаймні 99,4 95, більш переважно на принаймні 99,5 95, більш переважно на принаймні 99,6 95, більш переважно на принаймні 99,7 95, більш переважно на принаймні 99,8 95 і навіть більш переважно на принаймні 99,9 95 відповідній зазначеній 5ЕО ІЮ МО.
Мутантні амінокислотні послідовності поліпептидів, визначених тут, можна приготувати за допомогою уведення відповідних замін нуклеотидів у нуклеїнову кислоту, визначену тут, або за допомогою іп міго синтезу визначеного поліпептиду. Такі мутанти включають, наприклад, делеції, вставки або заміни залишків в амінокислотній послідовності. Можна здійснити комбінацію з делецій, вставок і замін, щоб прийти до кінцевої конструкції, з умовою, що кінцевий поліпептидний продукт має бажані характеристики.
Мутантні (змінені) поліпептиди можна приготувати, використовуючи будь-який метод, відомий у даній галузі техніки, наприклад, використовуючи стратегії спрямованого розвитку або розробки на основі логічного обгрунтування (див. нижче). Продукти, що походять з мутованої/зміненої ДНК, можна легко скринувати, використовуючи методи, описані тут, для визначення того, чи мають вони, чи не мають, активність ДІ12 десатурази, пальмітоїл-АСР- тіоестерази або десатурази б жирних кислот.
При розробці мутантних амінокислотних послідовностей положення місця для мутації і природа мутації будуть залежати від характеристик(и), що піддаються модифікації. Місця для мутацій можна модифікувати окремо або партіями, наприклад, за допомогою (1) заміни спочатку консервативними варіантами амінокислот, а потім більш радикальними варіантами залежно від результатів, що досягаються, (2) делеції залишку-мішені, або (3) вставки інших залишків поруч з локалізованим сайтом. Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, використання неконсервативних замін може використовуватися при продукуванні мутанта зі зменшеною ферментативною активністю.
Делеції в амінокислотній послідовності, як правило, знаходяться в межах від приблизно 1 до 15 залишків, більш переважно від приблизно 1 до 10 залишків і типово від приблизно 1 до 5
Зо залишків, що слідують один за одним, але можуть бути набагато довше, особливо, коли мутант призначений для зменшення ферментативної активності.
Мутанти із заміноює(ами) мають принаймні один амінокислотний залишок у поліпептиді, вилучений з послідовності, і відмінний залишок, вставлений на його місце. Місця, що становлять найбільший інтерес для мутагенезу із заміною(ами) для інактивації ферменту, включають місця, ідентифіковані як активний центр(и). Іншими місцями, що становлять інтерес, є місця, у яких конкретні залишки, отримані з різних ліній (штамів) або видів, є ідентичними. Ці місця можуть бути важливі для біологічної активності. Консервативні заміни представлені в таблиці 1, у той час як неконсервативними замінами є заміни, що не є консервативними замінами.
В одному варіанті здійснення поліпептидом даного винаходу є А12 десатураза, яка включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в будь-якій з зЗЕО ІЮО МО: 27-34, 36 або 37, її біологічно активний фрагмент, або амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 40 95 будь-якій одній або більше з БЕО ІЮ МО: МО: 27-34, 36 або 37.
В іншому варіанті здійснення поліпептидом даного винаходу є олеат-А12-десатураза, що є присутньою у насінні (олійному насінні) олійної рослини, що включає амінокислоти, які мають послідовність, представлену в будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 27, 28 або 36, її біологічно активний фрагмент, або амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 40 95 будь-якій одній або більше з 5ЕО ІЮ МО: 27, 28 або 36.
В іншому варіанті здійснення поліпептидом даного винаходу є Д12-ацетиленаза, яка включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 37, її біологічно активний фрагмент, або амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 40 95 5ЕО ІЮ
МО: 37.
В іншому варіанті здійснення поліпептидом даного винаходу є пальмітолеат-А12- десатураза, яка включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 35, її біологічно активний фрагмент, або амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 40 6 ЗЕО І МО: 35.
В іншому варіанті здійснення поліпептидом даного винаходу є пальмітоїл-АСР-тіоестераза (ЕАТВ), яка включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в будь-якій з 5ЕО ІЮ
МО: 44 або 45, її біологічно активний фрагмент, або амінокислотну послідовність, яка ідентична на принаймні 40 95 будь-якій одній або більше з 5БЕО ІО МО: 44 або 45. (510)
Таблиця
Конегрвативні заміни
Ав (А) ма!; ем; Пе; ву
Авп (М)
АБр(Б) су сів (0) св) сус) ніз(В) це Ф
Гец 01) Це; ха; пес ага; рпе
Гу
Мем)
Ріє ФГ) ро (Р) бег (5)
Тиг (В)
Туг СО
Уа! (У) Пе; Іец; тес опе. азй
В іншому варіанті здійснення поліпептидом даного винаходу є пальмітоїл-АСР-тіоестераза (ЕАТВ), що є присутньою у насінні олійної рослини, яка включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 45, її біологічно активний фрагмент, або амінокислотну послідовність, яка ідентична на принаймні 40 95 5ЕО ІО МО: 45.
В іншому варіанті здійснення поліпептидом даного винаходу є Дб-десатураза, яка включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 48, її біологічно активний фрагмент, або амінокислотну послідовність, що ідентична на принаймні 40 95 5ЕО ІО МО: 48.
Переважні властивості ферментів даного винаходу представлені в розділі "Приклади", зокрема, у прикладі 2, що стосується ЕАО2 сафлору.
Поліпептиди, описувані тут, можна експресувати у вигляді злиття з принаймні одним іншим поліпептидом. У переважному варіанті здійснення принаймні один інший поліпептид вибирають із групи, яка складається з поліпептиду, що збільшує стабільність злитого білка, і поліпептиду, що сприяє очищенню злитого білка.
Продукція ліпідів і/або олій, багатих на олеїнову кислоту
Методи, що звичайно здійснюються она практиці в даній галузі техніки, можуть використовуватися для екстракції, обробки, очищення й аналізу ліпідів, продукованих рослинами, особливо насінням, даного винаходу. Такі методи описані і пояснені повністю у літературі в таких джерелах, як Регеідооп Зпапйіді, Сиггепі Ргоїосоїв іп Росд Апаїуїїса! Спетівігу,
УоНп У/їву 5 Бопв, Іпс. (2001) О01.1.1-011.1.11, ії Реге?-Місн евї а. (1998).
Одержання олії з насіння
Типово насіння рослин піддають тепловій обробці, віджиманню і/або екстракції для одержання неочищеної олії з насіння, яку потім піддають рафінуванню гідратацією, рафінуванню, знебарвленню і дезодорації. У цілому методи для роздавлювання насіння відомі в даній галузі техніки. Наприклад, олійне насіння можна довести до потрібного стану за допомогою оббризкування їх водою для збільшення вмісту вологи, наприклад, до 8,595, і відвальцювати, використовуючи гладкий валець з величиною зазору, що становить 0,23-0,27 мм. Залежно від типу насіння воду можна не додавати до роздавлювання. Застосування нагрівання дезактивує ферменти, сприяє подальшому руйнуванню клітин, приводить до з'єднання ліпідних крапельок і агломерації білкових частинок, усе це сприяє процесу екстракції.
У варіанті здійснення велика частина олії з насіння вивільняється при проходженні через гвинтовий прес. Макухи, витиснуті з гвинтового преса, потім піддають екстракції розчинником, наприклад, гексаном, використовуючи колонку з підігрівом. Альтернативно, неочищену олію з насіння, отриману за допомогою операції віджимання, можна пропустити через відстійник з оснащеним щілинами, дротовим верхом для стоку для видалення твердих частинок, що вичавлюються разом з олією з насіння під час операції віджимання. Твердий залишок від віджимання й екстракції, після видалення сгексану, являє собою макуху, що типово використовується як корм для тварин. Очищену олію з насіння можна пропустити через листовий фільтр у вигляді рами для видалення будь-яких дрібних твердих частинок, що залишаються. Якщо бажано, олію з насіння, виділену в результаті процесу екстракції, можна об'єднати з очищеною олією з насіння для одержання змішаної неочищеної олії з насіння.
Після звільнення неочищеної олії з насіння від розчинника, отримані в результаті віджимання й екстракції частини поєднують і піддають звичайним процедурам обробки ліпідів, таким, як, наприклад, рафінування гідратацією, лужна рафінація, знебарвлення і дезодорація.
Деякі або всі стадії можуть бути пропущені, залежно від характеру спрямованості продукту, наприклад, у випадку кормової олії може знадобитися обмежена обробка, тоді як у випадку олеохімічних застосувань потрібно більше стадій очищення.
Рафінування гідратацією
Рафінування гідратацією є ранньою стадією при очищенні олій, і його основною метою є видалення більшої частини фосфоліпідів з олії, що можуть бути присутніми у вигляді приблизно
Зо 1-2 95 від всього екстрагованого ліпіду. Додавання -2 95 води, що типово містить фосфорну кислоту, при 70-802С до неочищеної олії приводить до відділення більшої частини фосфоліпідів, супроводжуваних слідами металу і барвниками. Нерозчинний матеріал, що видаляють, являє собою в основному суміш фосфоліпідів і триацилгліцеринів і також відомий як лецитин.
Рафінування гідратацією можна виконувати за допомогою додавання концентрованої фосфорної кислоти до неочищеної олії з насіння для перетворення нездатних до гідратації фосфатидів у здатну до гідратації форму або для хелатування слідів металу, що присутні.
Рослинний клей відокремлюють від олії з насіння за допомогою центрифугування.
Лужна рафінація
Лужна рафінація є одним із процесів очищення для обробки неочищеної олії, який іноді також називається нейтралізацією. Вона звичайно слідує за рафінуванням гідратацією і передує знебарвленню. Після рафінування гідратацією олію з насіння можна піддати обробці за допомогою додавання достатньої кількості розчину лугу для нейтралізації усіх з жирних кислот і фосфорних кислот, і видалення мил, утворених у такий спосіб. Придатні матеріали у вигляді лугів включають гідроксид натрію, гідроксид калію, карбонат натрію, гідроксид літію, гідроксид кальцію, карбонат кальцію і гідроксид амонію. Цей процес типово виконують при кімнатній температурі, і з його допомогою видаляється фракція вільних жирних кислот. Мило видаляють за допомогою центрифугування або за допомогою екстракції в розчинник для мила, і нейтралізовану олію промивають водою. Якщо потрібно, будь-яку надлишкову кількість лугу в олії можна нейтралізувати з використанням придатної кислоти, такої, як соляна кислота або сірчана кислота.
Знебарвлення
Знебарвлення являє собою процес очищення, у якому олії нагрівають при 90-12026 протягом 10-30 хвилин у присутності відбілюючої глини (0,2-2,0 95) і під час відсутності кисню, оперуючи азотом або парою або у вакуумі. Ця стадія при обробці олії призначена для видалення небажаних барвників (каротиноїдів, хлорофілу, госиполу і т. д.), і за допомогою цього процесу також видаляються продукти окислювання, сліди металу, сірчисті сполуки і сліди мила.
Дезодорація
Дезодорація являє собою обробку олій і жирів при високій температурі (200-2602С0) і низькому тиску (0,1-1 мм. рт ст). Вона типово досягається при введенні пари в олію з насіння зі бо швидкістю, що становить приблизно 0,1 мл/хвилину/100 мл олії з насіння. Після барботажу протягом приблизно 30 хвилин допускають охолодження олії з насіння під вакуумом. Олію з насіння типово переносять у скляний контейнер і очищують струменем аргону перед збереженням при охолодженні. Ця обробка поліпшує колір олії з насіння і видаляє велику частину летких речовин або пахучих сполук, зокрема будь-яких вільних жирних кислот, моноацилгліцеринів і продуктів окислювання, що залишаються.
Фракціонування охолодженням
Фракціонування охолодженням є процесом, іноді використовуваним при комерційному виробництві олій, для поділу олій і жирів на тверду (стеаринову) і рідку (олеїнову) фракції за допомогою кристалізації при низьких температурах. Воно спочатку використовувалося для бавовняної олії для виробництва продукту без твердих речовин. Воно типово використовується для зменшення вмісту насичених жирних кислот в оліях.
Переетерифікація
Переетерифікація є процесом обмінів жирних кислот у або між ТАС, на початку за допомогою вивільнення жирних кислот з ТАС або у вигляді вільних жирних кислот, або у вигляді ефірів жирних кислот, звичайно етилових ефірів жирних кислот. У сполученні з процесом фракціонування переєтерифікація може використовуватися для модифікації жирнокислотного складу ліпідів (Магапдопі еї аї.,, 1995). Для переєтерифікації можуть використовуватися або хімічні, або ферментативні способи, при цьому в останньому випадку використовуються ліпази, які можуть бути специфічними відносно положення (51п-1/3- або 5п-2-специфічними) жирної кислоти в ТАС, або віддавати перевагу деяким жирним кислотам перед іншими (5регапла еї аї, 2012). Фракціонування жирних кислот для збільшення концентрації І! С-РОБА в олії можна досягти за допомогою будь-якого зі способів, відомих у даній галузі техніки, таких, як, наприклад, кристалізація при заморожуванні, комплексоутворення, використовуючи сечовину, молекулярна дистиляція, надкритична флюїдна екстракція і комплексоутворення з іоном срібла.
Комплексоутворення, використовуючи сечовину, є переважним способом через його простоту й ефективність у зменшенні рівня насичених і мононенасичених жирних кислот в олії (зате еї а!.,, 2003). На початку, ТАС олії розщеплюються на жирні кислоти, які є їхніми складовими частинами, часто у формі ефірів жирних кислот, за допомогою гідролізу або ліпаз, і ці вільні жирні кислоти або ефіри жирних кислот потім змішуються зі спиртовим розчином сечовини для
Зо комплексоутворення. Насичені і мононенасичені жирні кислоти безперешкодно утворюють комплекси із сечовиною і викристалізовуються при охолодженні, і можуть бути згодом вилучені за допомогою фільтрації. Фракція, яка не утворила комплекс із сечовиною, таким чином, є збагаченою І С-РОБА.
Гідрогенізація
Гідрогенізація жирних кислот включає обробку воднем, типово в присутності каталізатора.
Некаталітична гідрогенізація відбувається тільки при дуже високих температурах.
Гідрогенізація звичайно використовується при обробці рослинних олій. Гідрогенізація перетворює ненасичені жирні кислоти в насичені жирні кислоти, і в деяких випадках, трансжири.
Гідрогенізація приводить до перетворення рідких рослинних олій у тверді або напівтверді жири, такі, як ті, які присутні в маргарині. Зміна ступеня насичення жиру приводить до зміни деяких важливих фізичних властивостей, таких, як діапазон температури плавлення, ось чому рідкі олії стають напівтвердими. Тверді або напівтверді жири є переважними для випікання, оскільки те, яким способом жир змішується з борошном, створює більш бажану текстуру в хлібобулочному виробі. Оскільки частково гідрогенізовані рослинні олії дешевші жирів із тваринних джерел, є в наявності в широкому діапазоні консистенцій, і мають інші бажані характеристики (наприклад, збільшену стійкість до окислювання/більш тривалий термін зберігання), вони є переважними жирами, використовуваними як розпушувач у більшості комерційних хлібобулочних виробів.
У варіанті здійснення ліпід/олія даного винаходу не був(була) підданий(а) гідрогенізації.
Ознакою того, що ліпід або олія не був(була) підданий(а) гідрогенізації, є відсутність яких- небудь транс-жирних кислот у його(її) ТАС.
Застосування ліпідів
Ліпіди, такі, як олія з насіння, переважно олія з насіння сафлору, отримана описаними тут способами, мають ряд застосувань. У деяких варіантах здійснення ліпіди використовуються як харчові олії. В інших варіантах здійснення ліпіди є очищеними і використовуються як мастильні матеріали або для інших застосувань, таких, як синтез пластмас. Він може використовуватися при виробництві косметичних засобів, мил, пом'якшувачів тканин, електроізоляційних матеріалів або детергентів. Він може використовуватися для виробництва хімічних речовин для сільського господарства, таких, як поверхнево-активні речовини або емульгатори. У деяких варіантах здійснення ліпіди піддають очищенню для виробництва біодизеля. Олія даного винаходу може переважно використовуватися в фарбах або лаках, оскільки відсутність ліноленової кислоти означає, що вона не знебарвлюється легко.
Промисловим продуктом, одержуваним, використовуючи спосіб даного винаходу, може бути вуглеводневий продукт, такий, як ефіри жирних кислот, переважно метилові ефіри жирних кислот і/або етилові ефіри жирних кислот, алкан, такий, як метан, етан або більш довголанцюжковий алкан, суміш більш довголанцюжкових алканів, алкен, біопаливо, окис вуглецю і/або газоподібний водень, біоспирт, такий, як етанол, пропанол або бутанол, біовугілля, або комбінація окису вуглецю, водню і біовугілля. Промисловий продукт може являти собою суміш будь-яких з цих компонентів, таку, як суміш алканів, або алканів і алкенів, переважно суміш, що являє собою в основному (250 95) С4-С8 алкани, або в основному Сб6-С10 алкани, або в основному С6-С8 алкани. Промисловим продуктом не є вуглекислий газ і вода, хоча ці молекули можуть утворюватися при об'єднанні з промисловим продуктом. Промисловий продукт може являти собою газ при атмосферному тиску/кімнатній температурі, або переважно рідину або тверду речовину, таку, як біовугілля, і в технологічному процесі може утворюватися комбінація з газового компонента, рідкого компонента і твердого компонента, така, як окис вуглецю, газоподібний водень, алкани і біовугілля, які можна згодом розділити. У варіанті здійснення вуглеводневий продукт являє собою в основному метилові ефіри жирних кислот. В альтернативному варіанті здійснення вуглеводневим продуктом є продукт, відмінний від метилових ефірів жирних кислот.
Нагрівання може використовуватися в ході процесу, такого, як піроліз, згоряння, газоутворення, або разом з ферментативним розщепленням (зокрема анаеробним розщепленням, компостуванням, зброджуванням). Газоутворення при більш низьких температурах має місце, наприклад, при температурах від приблизно 70020 до приблизно 100020. Газоутворення при більш високих температурах має місце, наприклад, при температурах від приблизно 120020 до приблизно 160020. Піроліз при більш низьких температурах (більш повільний піроліз) має місце при приблизно 4002С, тоді як піроліз при більш високих температурах має місце при приблизно 50020. Розщеплення з використанням мезофільних бактерій має місце при температурах між приблизно 2020 і приблизно 4020.
Розщеплення з використанням термофільних бактерій має місце при температурах від
Зо приблизно 5022 до приблизно 6520.
Хімічні способи включають, але без обмеження, каталітичне розтріскування, анаеробне розщеплення, зброджування, компостування і переетерифікацію. У варіанті здійснення в хімічному способі використовується каталізатор або суміш каталізаторів, що може використовуватися разом з нагріванням. У способі може використовуватися гомогенний каталізатор, гетерогенний каталізатор і/або ферментативний каталізатор. У варіанті здійснення каталізатором є каталізатор на основі перехідних металів, каталізатор типу цеоліту, каталізатор на основі активованого оксиду алюмінію або карбонат натрію як каталізатора. Каталізатори включають кислотні каталізатори, такі, як сірчана кислота, або лужні каталізатори, такі, як гідроксид калію або натрію або інші гідроксиди. Хімічний спосіб може включати переетерифікацію жирних кислот у ліпіді, при якій може використовуватися гомогенний каталізатор, гетерогенний каталізатор і/або ферментативний каталізатор. Перетворення може включати піроліз, при якому використовується нагрівання і може використовуватися хімічний спосіб, і може використовуватися каталізатор на основі перехідних металів, каталізатор типу цеоліту, каталізатор на основі активованого оксиду алюмінію і/або карбонат натрію як каталізатор.
Ферментативні способи включають, але без обмеження, розщеплення мікроорганізмами, наприклад, при анаеробному розщепленні, зброджуванні або компостуванні, або з використанням рекомбінатних ферментативних білків.
Біопаливо
Використовуваний тут термін "біопаливо" включає біодизель і біоспирт. Біодизель можна створити з олій, що походять з рослин, водоростей і грибів. Біоспирт утворюється при зброджуванні цукру. Цей цукор можна екстрагувати безпосередньо з рослин (наприклад, цукрової тростини), одержати з крохмалю рослин (наприклад, кукурудзи або пшениці) або утворити з целюлози (наприклад, деревини, листків або стебел).
В даний час витрати на виробництво біопалива вище таких на виробництво нафтового палива. Крім витрат на переробку, культури, що служать джерелом біопалива, вимагають посадки, внесення добрив, внесення пестицидів і гербіцидів, збору врожаю і транспортування.
Рослини, водорості і гриби даного винаходу можуть зменшити витрати на виробництво біопалива.
Загальні методи для виробництва біопалива можна знайти, наприклад, у Мапег апа Вгев5іІег (2006), Манег апа Вгезвзівг (2007), Стеепмеї! єї аї. (2011), Каптакаг єї аї. (2010), АІопзо еї аї. (2010), Геє апа Мопатеа (2010), Си еї аї. (2010), Сопд апа діапд (2011), ЕпдаІему еї аї. (2011) і зетумаї! єї аї. (2011).
Біодизель
Виробництво біодизеля, або алкілових ефірів, добре відомо. Існують три основні шляхи утворення складних ефірів з ліпідів: 1) каталізована основою переетерифікація ліпіду з використанням спирту; 2) безпосередня, каталізована кислотою переетерифікація ліпіду з використанням метанолу і 3) перетворення ліпіду в жирні кислоти, а потім в алкілові ефіри за допомогою кислотного каталізу.
Може використовуватися будь-який спосіб приготування алкілових ефірів жирних кислот і гліцерилових ефірів (у яких етерифіковані одна, дві або три гідроксигрупи в гліцерині).
Наприклад, жирні кислоти можна приготувати, наприклад, за допомогою гідролізу або омилення тригліцеридів з використанням кислотних або лужних каталізаторів, відповідно, або використовуючи фермент, такий, як ліпаза або естераза. Алкілові ефіри жирних кислот можна приготувати за допомогою здійснення реакції жирної кислоти зі спиртом у присутності кислотного каталізатора. Алкілові ефіри жирних кислот можна також приготувати за допомогою здійснення реакції тригліцериду зі спиртом у присутності кислотного або лужного каталізатора.
Гліцерилові ефіри можна приготувати, наприклад, за допомогою здійснення реакції гліцерину з алкілгталідом у присутності основи, або з олефіном або спиртом у присутності кислотного каталізатора.
У деяких переважних варіантах здійснення ліпіди піддають переетерифікації для утворення метилових ефірів і гліцерину. У деяких переважних варіантах здійснення здійснюють реакцію ліпідів зі спиртом (таким, як метанол або етанол) у присутності каталізатора (наприклад, гідроксиду калію або натрію) для утворення алкілових ефірів. Алкілові ефіри можуть використовуватися для біодизеля і змішуватися з нафтовим паливом.
Алкілові ефіри можуть бути безпосередньо змішані з дизельним паливом або промиті водою або іншими розчинами на водній основі для видалення різних домішок, зокрема каталізаторів, до змішування. Можна нейтралізувати кислотні каталізатори за допомогою основи. Однак цей
Зо процес приводить до утворення солі. Щоб уникнути корозії мотора переважно звести до мінімуму концентрацію солі в паливній композиції з добавкою. Солі можна по суті видалити з композиції, наприклад, за допомогою промивання композиції водою.
В іншому варіанті здійснення композицію сушать після її промивання, наприклад, за допомогою пропущення композиції через осушувач, такий, як сульфат кальцію.
Проте, в іншому варіанті здійснення нейтральну добавку до палива одержують без утворення солей або використання стадії промивання, використовуючи полімерну кислоту, таку, як Оомжех 50"М, що являє собою полімер, що містить сульфокислотні групи. Каталізатор легко видалити за допомогою фільтрації після завершення реакцій утворення складного ефіру й утворення простого ефіру.
Триацилгліцерини рослин як джерело біопалива
Використання триацилгліцеринів рослин для виробництва біопалива розглядається в Оштей еї а. (2008). Коротко, рослинні олії в основному складаються з різних триацилгліцеринів (ТАС), молекул, що складаються з трьох жирнокислотних ланцюгів (довжиною звичайно 18 або 16 вуглеців), етерифікованих до гліцерину. Ацильні (жирнокислотні) ланцюги хімічно схожі з аліфатичними вуглеводнями, що складають основну частину молекул, які зустрічаються в бензині і дизелі. Вуглеводні в бензині містять 5-12 атомів вуглецю на молекулу, і це летке паливо змішується з повітрям і займається від іскри в звичайному моторі. На відміну від них, компоненти дизельного палива типово містять 10-15 атомів вуглецю на молекулу і займаються в результаті дуже сильного стиску, що досягається в дизельному моторі. Однак більшість ТАС рослин мають діапазон в'язкості, що набагато вище такого звичайно дизеля: 17,3-32,9 мм? сек." порівняно з 1,9-4,1 мм? сек.7, відповідно (АТМ 0975; Кпоїпе апа 5іеїадІєу, 2005). Ця велика в'язкість приводить до поганого розпилення палива в сучасних дизельних двигунах, що приводить до проблем, які є результатом неповного згоряння, таких, як нагароутворення і закоксовування (Куап еї аї., 1984). Для подолання цієї проблеми ТАС перетворюють у менш в'язкі ефіри жирних кислот за допомогою етерифікації з використанням первинного спирту, найчастіше метанолу. Одержуване в результаті паливо звичайне називають біодизелем і має динамічний діапазон в'язкості від 1,9 до 6,0 мм сек (АБТМ 06751). Метилові ефіри жирних кислот (ЕАМЕ), що зустрічаються в біодизелі, характеризуються високою густиною енергії, відображенням чого є велика енергія, виділювана у вигляді тепла при їхньому згорянні, що є бо схожою, якщо не вище, (с) такої звичайного дизеля (Кпоїпе, 2005). Так само цетанове число
(показник займистості дизеля) ЕАМЕ, які зустрічаються в біодизелі, перевищує таке звичайного дизеля (Кпоїпе, 2005).
Рослинні олії, головним чином, складаються з п'яти розповсюджених жирних кислот, а саме - пальмітату (16:0), стеарату (18:00), олеату (18:1), лінолеату (18:2) і ліноленату (18:3), хоча, залежно від конкретного виду, більш довгі або більш короткі жирні кислоти можуть також бути основними компонентами. Ці жирні кислоти відрізняються одна від одної за показником довжини ацильного ланцюга і числом подвійних зв'язків, що приводить до різних фізичних властивостей.
Отже, властивості біодизеля, який походить із суміші жирних кислот, залежать від цієї сполуки.
Тому зміна жирнокислотного профілю може привести до поліпшення властивостей палива - біодизеля, таких, як характеристики текучості при низьких температурах, стійкість до окислювання і МОх виділення. Зміна жирнокислотного складу ТАС може привести до зменшення в'язкості рослинних олій, виключенню необхідності в хімічній модифікації, у такий спосіб збільшуючи ефективність за вартістю біопалива.
Продукти харчування
Ліпід/олія даного винаходу має перевагу в застосуваннях у продуктах харчування через дуже високий вміст олеїнової кислоти в ньому(ній) і низьких рівнях лінолевої кислоти («3,2 90) і насичених жирних кислот, таких, як пальмітинова кислота, і по суті нульового рівня ліноленової кислоти. Це надає олії високу стійкість до окислювання, забезпечуючи меншу прогірклість і роблячи її ідеальною для застосувань у продуктах харчування, коли потрібне нагрівання, таких, як смаження, наприклад, для картопляної стружки. Олія має високий О5І (коефіцієнт стійкості до окислювання), що визначається як інтервал часу, протягом якого олію можна тримати при 110920, такий, як більше 20 або 25 годин, переважно більше 30 годин або більше 50 годин.
Низькі рівні насичених жирних кислот порівняно з іншими рослинними оліями приносять користь для здоров'я, оскільки насичені жирні кислоти були пов'язані зі шкідливими ефектами на здоров'я. Олії також мають по суті нульовий вміст транс-жирних кислот, що є бажаним на деяких ранках, оскільки транс-жирні кислоти були пов'язані з негативними ефектами на здоров'я серця або підвищенням І ОіІ-холестерину. Більше того: унаслідок дуже низького рівня поліненасичених жирних кислот для олії не потрібна гідрогенізація для зниження рівнів РОРА - у результаті такої гідрогенізації утворюються трансо-жирні кислоти. Олії також є переважними для
Зо зниження захворюваності або важкості ожиріння і діабету. Вони також є бажаними для застосувань у продуктах харчування, оскільки вони містять тільки жирні кислоти, які зустрічаються в природі (Зсагій апа Тапо, 2006).
Відносно цілей даного винаходу, "продукти харчування" включають будь-який харчовий продукт або продукт для споживання людьми або тваринами (зокрема для ентерального і/або парентерального харчування), що після надходження в організм: (1) служить для харчування або нарощування тканин або постачання енергії, і/або (2) зберігає, відновлює або підтримує відповідний аліментарний статус або метаболічну функцію. Продукти харчування даного винаходу включають склади для немовлят і/або новонароджених.
Продукти харчування даного винаходу включають, наприклад, клітину даного винаходу, рослину даного винаходу, частину рослини даного винаходу, насіння даного винаходу, екстракт даного винаходу, продукт способу даного винаходу або суміш із придатним носієм(ями). Термін "носій" використовується в його найбільш широкому значенні з охопленням будь-якого компонента, що може мати або може не мати харчову цінність. Як буде зрозуміло кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцю, носій повинний бути придатним для застосування (або використовуватися в достатньо низькій концентрації) у продукті харчування, так, щоб він не здійснював шкідливий ефект на організм, який споживає продукт харчування.
Продукт харчування даного винаходу включає ліпід, продукований безпосередньо або опосередковано, використовуючи методи, клітини або організми, описувані тут. Суміш може знаходитися або у твердій, або в рідкій формі. Крім того, суміш може включати придатні для їжі поживні макроелементи, вітаміни і/або мінеральні речовини в кількостях, бажаних для конкретного застосування. Кількості цих або інших інгредієнтів будуть варіювати залежно від того, чи призначена суміш для вживання нормальними індивідуумами або для вживання індивідуумами зі спеціалізованими потребами, такими, як індивідууми, що страждають на метаболічні порушення і т. п.
Харчові продукти можна приготувати за допомогою змішування олії з одним або більше іншим інгредієнтом, так що харчовий продукт включає олію, або змішаний з одним або більше іншим інгредієнтом для приготування добавки до харчового продукту, такої, як приправа до салату або майонез. Харчовий продукт або добавка до харчового продукту може включати 1- 10 95 або більше олії у ваговому відношенні. Олія може бути змішана з іншими рослинними 60 оліями для забезпечення оптимального складу або з твердими жирами, або з пальмовою олією для забезпечення напівтвердого розпушувача. Харчові продукти або добавки до харчових продуктів, приготовлені з олії, включають приправу до салату, майонез, маргарин, хліб, торти, печиво, рогалики, хлібобулочні вироби, млинчики або млинцеві суміші, солодкі соуси, заморожені десерти, немолочні продукти.
Приклади придатних носіїв з харчової цінності включають, але без обмеження, поживні макроелементи, такі, як їстівні жири, вуглеводи і білки. Приклади таких їстівних жирів включають, але без обмеження, кокосову олію, олію огірочника, олію з грибів, олію чорної смородини, соєву олію і моно- і дигліцериди. Приклади таких вуглеводів включають, але без обмеження, глюкозу, придатну для їжі лактозу і гідролізований крохмаль. Крім того, приклади білків, що можуть використовуватися в харчовій суміші даного винаходу, включають, але без обмеження, соєві білки, піддану електродіалізу сироватку, піддане електродіалізу зняте молоко, молочну сироватку або гідролізи цих білків.
Що стосується вітамінів і мінеральних речовин, у харчові суміші даного винаходу можуть бути додані наступні речовини: кальцій, фосфор, калій, натрій, хлорид, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селен, йод і вітаміни А, Е, 0, С і комплекс вітамінів групи В. Можуть бути також додані інші такі вітаміни.
Компоненти, використовувані в харчових сумішах даного винаходу, можуть бути з напівочищеного або очищеного джерела. Під напівочищеним або очищеним мається на увазі матеріал, що був приготовлений за допомогою очищення з природного матеріалу.
Харчова суміш даного винаходу може бути додана в харчовий продукт, навіть коли поповнення раціону не потрібно. Наприклад, суміш може бути додана в харчовий продукт будь- якого типу, зокрема, але без обмеження, маргарин, модифіковану олію, сири, молоко, йогурт, шоколад, цукерки, закуску, олії для салатів, олії для кулінарії, кулінарні жири, м'ясо, рибу і напої.
Крім того, ліпід, продукований відповідно до даного винаходу, або клітини-хазяїни, трансформовані, щоб вони містили і експресували розглянуті гени, можуть також використовуватися як добавки до корму для тварин для зміни жирнокислотного складу тканини або молока тварини або жирнокислотного складу яєць, до складу, більш бажаного для споживання людьми або тваринами, або для здоров'я і благополуччя тварин. Приклади таких тварин включають вівцю, велику рогату худобу, коней, домашніх птахів, домашніх тварин, таких,
Зо як собаки і кішки і т. п.
Крім того, продукти харчування даного винаходу можуть використовуватися при риборозведенні для збільшення рівнів жирних кислот у риб для споживання людьми або тваринами.
Переважними продуктами харчування даного винаходу є рослини, насіння й інші частини рослини, такі, як листки, плоди і стебла, що можуть використовуватися безпосередньо як харчовий продукт або корм для людей або інших тварин. Наприклад, тварини можуть пастися безпосередньо в полі з такими рослинами, або ними можуть подаватися більш визначені кількості при контрольованій подачі корму.
Композиції
Даний винахід також охоплює композиції, зокрема, фармацевтичні композиції, які включають один або більше ліпідів або олій, продукованих, використовуючи способи даного винаходу.
Фармацевтична композиція може включати один або більше ліпідів, у комбінації зі стандартним, добре відомим, нетоксичним фармацевтично прийнятним носієм, допоміжним засобом або наповнювачем, таким, як забуферений фосфатом сольовий розчин, вода, етанол, поліоли, рослинні олії, змочувальний реагент або емульсія, така, як емульсія вода/олія.
Композиція може знаходитися або в рідкій, або твердій формі. Наприклад, композиція може знаходитися у формі таблетки, капсули, прийнятої усередину рідини, порошку, мазі для місцевого застосування або крему. Придатну текучість можна підтримувати, наприклад, зберігаючи необхідний розмір частинок у випадку дисперсій і використовуючи поверхнево- активні речовини. Може бути також бажаним включення агентів для надання ізотонічності, наприклад, цукрів, хлориду натрію і т. п. Крім таких інертних розчинників, композиція може також включати допоміжні засоби, такі, як змочувальні реагенти, емульгатори і суспендуючі засоби, підсолоджувачі, коригенти й ароматизатори.
Суспензії, крім активних сполук, можуть включати суспендуючі агенти, такі, як етоксиловані ізостеарилові спирти, поліоксіетиленові ефіри сорбіту і сорбітану, мікрокристалічна целюлоза, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант, або суміші цих речовин.
Тверді лікарські форми, такі, як таблетки і капсули, можна приготувати, використовуючи методи, добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, ліпід, продукований відповідно до даного винаходу, можна таблетувати зі звичайними основами для таблеток, такими, як лактоза, бо сахароза і кукурудзяний крохмаль, у комбінації зі зв'язувальними речовинами, такими, як аравійська камедь, кукурудзяний крохмаль або желатин, дезінтегруючими агентами, такими, як картопляний крохмаль або алгінова кислота, і змащувальним матеріалом, таким, як стеаринова кислота або стеарат магнію. Капсули можна приготувати за допомогою включення цих наповнювачів у желатинову капсулу разом з антиоксидантами і відповідним ліпідом(ами).
Для внутрішньовенного введення, ліпіди, продуковані відповідно до даного винаходу, або їхні похідні можна включити в комерційні препарати.
Типова доза конкретної жирної кислоти становить від 0,1 мг до 20 г, прийнятих від одного до п'яти разів на день (аж до 100 г щодня), і переважно знаходиться в діапазоні від приблизно 10 мг до приблизно 1, 2, 5 або 10 г щодня (прийнятих в одній або множині доз). Як відомо в даній галузі техніки, мінімальна кількість, що становить приблизно 300 мг/день жирної кислоти, є бажаною. Однак буде зрозуміло, що будь-яка кількість жирної кислоти принесе користь суб'єкту.
Можливі способи введення фармацевтичних композицій даного винаходу включають, наприклад, ентеральний і парентеральний. Наприклад, рідкий препарат може вводитися перорально. Крім того, гомогенна суміш може бути повністю диспергована у воді, змішана в стерильних умовах з фізіологічно прийнятними розріджувачами, консервантами, буферами або газами-витіснювачами для утворення аерозолю або лікарської форми для інгаляції.
Дозу, що вводиться суб'єкту, композиції може визначити фахівець із середнім рівнем компетентності в даній галузі техніки, і вона залежить від різних факторів, таких, як вага, вік, загальний стан здоров'я, анамнез, імунний статус і т. д. суб'єкта.
Крім того, композиції даного винаходу можуть використовуватися з косметичною метою.
Композиції можуть бути додані в попередні косметичні препарати, так що утвориться суміш, або жирна кислота, отримана відповідно до даного винаходу, може використовуватися як єдиний "активний" інгредієнт в косметичному препараті.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Загальні матеріали і методи
Рослинні матеріали й умови вирощування
Рослини сафлору (Саппативх ііпсіогіиє) генотипи З), 5-317, 5-517, І ебзаї496, СМ/99-ОЇ і
Сіапо-СОЇ вирощували з насіння в теплиці в перлітній і супіщаній грунтовій суміші з використанням циклу дня і ночі 16 годин (252С3/8 годин (2222). Сорт ЗО дикого типу, що є
Зо сортом з високим вмістом лінолевої кислоти, був отриманий з НепПегпап Зеєеаз у МЗМУ. Насіння
РІ 603208 (Іебаїг496, АТС 120562) і СМУ 99-0Ї (АТС 120561) було отримано з Аийвігаїйап
Тетрегаїє Рієїд Стор СоПесійоп.
Тканини рослин для екстракції ДНК і РНК, що включають листки, корені, сім'ядолі і гіпокотилі, збирали з проростків сафлору через 10 днів після проростання. Квіткові голівки одержували в перший день відкриття квітки, а зародки, що розвиваються, збирали на трьох стадіях розвитку через 7 (ранньої), 15 (середньої) і 20 (пізньої) днів після пилення (ОРА). Зразки відразу ж заморожували в рідкому азоті і зберігали при -802С до виконання екстракції ДНК і
РНК.
Квітки сафлору є трубчастими й у значній мірі самозапильними з ауткросингом, що складає, як правило, менше 10 95 (Кпоу/ез 1969). Комахи, але не вітер, можуть збільшити ступінь ауткросингу в полі. Не піддане запиленню рильце може залишатися рецептивним протягом декількох днів. Кожна голівка (голівка сафлору) містить приблизно 15-30 сім'янок. Маса насіння, що розвивається, у рослині швидко збільшується під час перших 15 днів після цвітіння. Вміст олії збільшується в 5-10 разів під час періоду 10-15 днів після БАР і досягає максимального рівня в приблизно 28 день після ОРА (НІЇЇ апа Кпоул/Ле5 1968). Сафлорове насіння і рослини є фізіологічно зрілими через приблизно 5 тижнів після цвітіння, і насіння готове до збору, коли більшість листків стає коричневими, і відтінок зеленого кольору залишається лише на приквітках найбільш пізніх квіткових голівок. Насіння легко збирали, розтираючи голівки рукою.
Ліпідний аналіз
Виділення зразків ліпідів з окремих насінин для швидкого аналізу жирнокислотного складу
Після збору по досягненні зрілості рослини насіння сафлору сушили, зберігаючи насіння протягом З днів при 372С і згодом при кімнатній температурі, якщо не аналізували відразу ж.
Окремі насінини або об'єднані насінини роздавлювали між фільтрувальними паперами невеликого розміру, і зразки виділеної олії з насіння, які ввібралися в папери, аналізували відносно жирнокислотного складу за допомогою способів С, описаних нижче.
Виділення всіх ліпідів з половин сім'ядоль після проростання
З метою скринінгу, наприклад, насіння потомків трансгенних рослин насіння сафлору пророщували на вологому фільтрувальному папері в чашці Петрі протягом 1 дня. З кожної пророщеної насінини обережно витягали сім'ядолю для ліпідного аналізу. Частину кожного проростка, що залишилася, переносили в грунт, і рослини, що виходять у результаті, вирощували до досягнення зрілості з наступним збором насіння для підтримки трансгенної лінії.
Екстракція олії з насіння, використовуючи пристрій ЗохПеї.
Для кількісної екстракції олії з насіння зібране насіння сафлору сушили в духовці при 10520 протягом ночі і потім подрібнювали в Риск МіїїЇ протягом 1 хв. Подрібнений матеріал насіння (-250 грамів) збирали в попередньо зважену склянку і зважували до екстракції олії. Після додавання шару бавовняної вати наверх борошна, олію екстрагували в пристрої для екстракції
БохПпіеї з використанням розчинника (Уайт-спіріту 40-60 С), на початку при 70-8020. Потім суміш нагрівали протягом ночі в посудині зі зворотним холодильником з розчинником, що переливається через сифон в колбу для екстракції кожні 15-20 хв. Розчинену, екстраговану олію витягали випарюванням розчинника, використовуючи роторний випарник, під вакуумом. Вагу екстрагованої олії вимірювали, і визначали олійність. Для визначення жирнокислотного складу екстрагованої олії невеликі аліквоти розводили в хлороформі й аналізували за допомогою газової хроматографії.
Виділення всіх ліпідів з матеріалу листків
Зразки тканин листків ліофілізували, зважували, і всі ліпіди екстрагували із зразків із сухою вагою, що становить приблизно 10 мг, як описано Віїднй і Оуег (1959).
Фракціонування ліпідів
Коли це було необхідно, фракції ТАС відокремлювали від інших ліпідних компонентів, використовуючи систему для тонкошарової хроматографії (ТС) на двофазних, попередньо покритих пластинах силікатного гелю (Зпйїса деІ 60, МегсК). Хроматографію зразка екстрагованого ліпіду, еквівалентний 10 мг сухої ваги тканини листків, здійснювали в першій фазі з використанням гексану/діетилового ефіру (98/2 в об'ємному відношенні) для видалення неполярних восків і потім у другій фазі, використовуючи гексан/діетиловий ефір/оцтову кислоту (70/30/1 в об'ємному відношенні). Коли це було необхідно, полярні ліпіди відокремлювали від неполярних ліпідів у зразках ліпідів, екстрагованих з еквівалента 5 мг сухої ваги листків, використовуючи двовимірну тс (5іїїса деї 60, МегскК), використовуючи хлороформ/метанол/воду (65/25/4 в об'ємному відношенні) для першого напрямку і хлороформ/метанол/мМНаОН/етилпропіламін (130/70/10/1 в об'ємному відношенні) для другого напрямку. Ліпідні споти, і відповідні стандарти, аналізовані на тих же пластинах для ТІС, візуалізували за допомогою короткочасного піддавання впливу парів йоду, збирали в пробірки і піддавали переетерифікації для одержання ЕАМЕ для аналізу за допомогою ОС, як зазначено нижче.
Приготування метилових ефірів жирних кислот (ЕАМЕ) і аналіз з використанням газової хроматографії (С)
Для аналізу жирнокислотного складу за допомогою С зразки екстрагованих ліпідів, приготовлені як описано вище, переносили в скляну пробірку і піддавали переметилуванню в 2 мл 1М НСЇ у метанолі (ЗиреїЇсо) при 8020 протягом З годин. Після охолодження при кімнатній температурі у кожну пробірку додавали 1,3 мл 0,995 МасСі і 800 мкл гексану, і ЕАМЕ екстрагували в гексанову фазу. Для визначення жирнокислотного складу ЕАМЕ розділяли за допомогою газової хроматографії ((8С), використовуючи газовий хроматограф Аодйепі
Тесппоодіез5 7890А (Раїо Айо, Саїйогпіа, США), оснащений 30-м колонкою ВРХ?70О, по суті як описано 2пПпои і ін. (2011), за винятком того, що програма виведення на температурний режим була замінена на первісну температуру при 15020, збереження протягом 1 хв., лінійна зміна
Зеб/хв. до 2102, потім 502С/хв. до 2402С протягом кінцевого збереження протягом 2 хв. Піки кількісно аналізували, використовуючи програмне забезпечення Адіепі Тесппоіодіе5
Спетбіацйоп (Кем В.03.01 (317), Раїо АГо, Саїїйогпіа, США). Відгуки піків були схожими у випадку жирних кислот автентичного стандарту-411 Ми-Снеск СІ С (Ми-Спеск Ргер Іпс, ММ, США), що містив рівні частки 31 метилових ефірів різних жирних кислот, включаючи 18:1, 18:0, 20:0 ії 22:0, використовуваного для калібрування. Частку кожної жирної кислоти в зразках розраховували на основі окремих і загальних площ піків для жирних кислот.
Аналіз ЕАМЕ за допомогою газової хроматографії - мас-спектрометрії
Підтвердження положень подвійних зв'язків у БАМЕ за допомогою модифікації з використанням 2,4-диметилоксалозоліну (ОМОХ) і аналізи за допомогою (зС-М5 виконували, як описувалося раніше (2пои еї аї!., 2011), за винятком використання Зпітадли 5С-М5 ОР2О10
Рін5, оснащеного 30-м колонкою ВРХ70. Температура в колонку була запрограмована на первісну температуру при 150202 протягом 1 хв., лінійна зміна зі швидкістю 52б/хв. до 20020, а потім 102б/хв. до 24020 зі збереженням протягом 5 хв. Мас-спектри одержували й обробляли за допомогою програмного забезпечення ЗСМ550ЇІшіоп (Зпітаайи, Мегвіоп 2.61). Вільні жирні бо кислоти і стандарти РАМЕ купували в 5ідта-Аїагісп (5. Гоці5, МО, США).
Аналіз видів ліпідів за допомогою І С-МО
Зрілі окремі насінини піддавали ліпідомному аналізу, використовуючи ЇС-М5, у Зспоої ої
Воїапу, Опімегейу ої Меїроцигпе. Усі ліпіди екстрагували, як описано Відн ї Оуег (1959), і розчиняли в СНСЇїз. Аліквоти, кожна складає один мг ліпіду, сушили з використанням Мг, розчиняли в 1 мл 10 мМ бутильованого гідрокситолуолу в суміші бутанол:метанол (1:11 в об'ємному відношенні) і аналізували, використовуючи І1С-М5 з використанням трьох квадруполів і іонізації методом електророзпилення Адіепі 1200 серій С і 64108. Ліпіди хроматографічно розділяли, використовуючи колонку Азсепіїз Ехрге55 КР-Атіае (5 см х 2,1 мм, зиреїсо) і градієнт із двома змінними зі швидкістю потоку, що становить 0,2 мл/хв. Рухомими фазами були: А, 10 мМ формат амонію в суміші НгО:метанол:тетрагідрофуран (50:20:30, в об'ємному відношенні); В. 10 мМ формат амонію в суміші НгО:метанол:тетрагідрофуран (5:20:75, в об'ємному відношенні). Вибрані нейтральні ліпіди (ТАС і БАС) і фосфохолін (РС) з жирними кислотами 16:0, 16:11 18:0, 18:11, 18:2, 18:33 аналізували за допомогою моніторингу множинних реакцій (МЕМ), використовуючи енергію зіткнення-25 В і фрагментор 135 В. Окремі
ТАС і АС при МКМ ідентифікували на основі іона-попередника, що містить амоній, й іона - продукту втрати нейтральної частинки жирної кислоти. ТАС і РАС кількісно аналізували, використовуючи зовнішній стандарт, - 10 мкМ тристеарин.
Аналіз вмісту стеролів у зразках олії
Зразки, кожен з яких складає приблизно 10 мг олії, разом з доданою аліквотою С24:0 монолу як внутрішнім стандартом піддавали сапоніфекації, використовуючи 4 мл 5 95 КОН у 8095 Меон і нагріваючи протягом 2 год. при 8020 у скляній пробірці з кришкою, що загвинчується, з тефлоновим покриттям. Після охолодження реакційної суміші додавали 2 мл води Міїййй-б, і стероли екстрагували в 2 мл суміші гексан:ідихлорметан (4:11 в об'ємному відношенні), струшуючи і перемішуючи на вортексі. Суміш центрифугували, і екстракт стеролів витягали і промивали 2 мл води Мій-0. Екстракт стеролів потім витягали після струшування і центрифугування. Екстракт випарювали, використовуючи струмінь газоподібного азоту, і стероли силілували, використовуючи 200 мл ВЗТРА і нагріваючи протягом 2 год. при 8020.
Для аналізу за допомогою 5С/ЗС-М5 стеролів похідні стерол- ОТМ5і сушили під струменем газоподібного азоту в термоблоці при 402С і потім знову розчиняли в хлороформі або гексані безпосередньо перед аналізом за допомогою С/зС-М5. Похідні стерол-ОТМ5 аналізували за допомогою газової хроматографії (5С), використовуючи Адіїепі Тесппоіодієє 6890А СС (Раїо
Айо, Саійотіа, США), оснащену кварцовою капілярною колонкою Зиреїсо Едийу"м-1 (15 м х 0,1 мм -- внутрішній діаметр, 0,1 мкм -- товщина фази), РІО, інжектором для введення проб з розподілом/без розподілу потоку й автоматичним дозатором і інжектором Адіїепі Тесппоіодіеб 76838 серії. Газом-носієм був гелій. Зразки вводили без розподілу потоку при температурному режимі термостата-12020. Після введення температурний режим термостату підвищували до 27020 зі швидкістю 102С/хв. і нарешті, до 30020 зі швидкістю 52С/хв. Піки кількісно аналізували, використовуючи програмне забезпечення Адіїепі ТесппоЇодіе5 Спетеацйоп (Раїо А, Саїйогпіа,
США). Результати СС допускають наявність похибки, що становить 5 95 від площ окремих компонентів.
Сіб-мас-спектрометричні (5С-М5) аналізи виконували на ТПегптодиебїі СО С-М5 і
Еіппідап ТНепто ЕЇІесштоп Согрогайоп (2С-М5; обидві системи були оснащені інжектором для введення проби безпосередньо в колонку і програмним забезпеченням Тпептодиевзі Хсаїїриг (Аизііп, Теха5х, США). Кожна ОС була оснащена капілярним колонкою з полярністю, схожою з такою, описаною вище. Окремі компоненти ідентифікували, використовуючи мас-спектральні дані, і за допомогою порівняння даних, що стосуються часу утримання, з такими, отриманими для автентичних і лабораторних стандартів. Холостий аналіз, що стосується повної процедури, виконували одночасно із серією зразків.
Кількісний аналіз ТАС за допомогою Іайго5сап (ятроскану)
Один мкл кожного екстракту з рослин наносять на одну пластину Спготагоа-5іІ для ТІ.С-РІЮ
Іатозсап'"мМ (Міїзирізні Спетіса! Медіепсе Согрогаїйоп - Японія). Потім тримач для Спготагоа переносять в урівноважену проявну камеру, що містить 70 мл системи розчинників гексан/СНСІз/2-пропанол/мурашина кислота (85/10,716/0,567/0,0567 в об'ємному відношенні).
Після інкубації протягом 30 хв. тримач для Спготагой потім сушать протягом З хв. при 10020 і відразу ж сканують в аналізаторі Іайгоб5сап МК-6б5 ТІ С-РІЮ (Міївибізні Спетіса! Меаієпсе
Согрогайоп - Японія). Площі піків внутрішнього стандарту ОАСЕ і ТАС поєднують, використовуючи програмне забезпечення для об'єднання 5ІС-4801! (Мегвіоп:7.0-Е 5ІС бБувієт іпвігитепів Со., І ТО - Японія).
Кількісний аналіз ТАС виконують у два етапи. Спочатку сканують внутрішній стандарт ОАСЕ бо у всіх зразках для внесення поправок у виходи екстракції, після чого сконцентровані зразки ТАО вибирають і розводять. Потім кількість ТАС визначають у розведених зразках за допомогою другого сканування відповідно до калібрування з використанням гліцерилтрилінолеату як зовнішнього стандарту (5ідта-Аагісн).
Експресія генів ЕАО02 - кандидатів у Засспаготусез сегемізіає
Фрагменти ДНК, які містять повні відкриті рамки зчитування кКДНК для ЕБАО2-кандидатів, вирізували з вектора РОЕМТ-еазу у вигляді ЕсоКІ-фрагментів і вбудовували у відповідний сайт вектора рЕМТК11 (Іпмігодеп, Сагізраа, СА, США). Потім вставки клонували в цільовий експресійний вектор РУЕЗ2-ОЕ5Т52, із вміщенням відкритих рамок зчитування під контроль промотору ЗАЇ1 для індукованої експресії генів у дріжджових клітинах, використовуючи рекомбінаційну технологію клонування СагежауФф (Зігагадепе, Іа доПа, СА, США). Послідовності генів у результуючих плазмідах підтверджували за допомогою секвенування ДНК. Результуючі плазміди і вектор РУЕ5З2-ОЕ5ЗТ52, у якому відсутня яка-небудь вставка кКДНК, як контроль вводили в клітини штам МУРН4ОЗ дріжджів зЗасспаготусеб5 сегемізіае за допомогою трансформації з використанням ацетату літію. Експресія цих генів ЕАО2-кандидатів у дріжджових клітинах з подачею екзогенного субстрату - жирних кислот або без неї була по суті такою, яка була описана раніше 2пои і ін. (2006). Кожен експеримент проводили в трьох повторах.
Експресія генів у клітинах рослин у системі для транзиторної експресії
Гени експресували в клітинах листків Місойапа репіпатіапа, використовуючи систему для транзиторної експресії, по суті як описано Моїіппеї і ін. (2003) ї Умоса і ін. (2009). Вектор для конститутивної експресії вірусного білка-супресора сайленсингу, Р19, під контролем промотору
Самм 355, був отриманий з лабораторії Реїег УМаїетоизе, С5ІКО Ріапі Іпдивігу, Сапбе!та,
Австралія. Химерний бінарний вектор 355:Р19 вводили в штам АС 1 Адгобасіегічт ішптегасіепв.
Всі інші бінарні вектори, що містять кодуючу область, яка повинна бути експресована в клітинах рослин із промотору, часто промотору 355, також вводили в штам АСІі1 А. фштптегасієеп5.
Рекомбінантні клітини вирощували до стаціонарної фази при 282С у 5 мл бульйону ІВ, доповненого 50 мг/л рифампіцину й або 50 мг/л канаміцину, або 80 мг/л спектиноміцину відповідно до геном-селектованого маркера в бінарному векторі. Бактерії з кожної культури осаджували за допомогою центрифугування при З3000хд протягом 5 хв. при кімнатній
Зо температурі до ресуспендування в 1,0 мл буфера для інфільтрації, що містить 5 мМ МЕ5, рн 5,7, 5 ММ Мо95О» і 100 мкМ ацетосирингон. Культури ресуспендованих клітин потім інкубували при 282С зі струшуванням протягом ще З годин. 10-кратне розведення кожної культури в буфері для інфільтрації потім змішували з однаковим об'ємом культури 355:Р19, розведеної так само, і суміші використовували для інфільтрації в нижню сторону повністю розвинених листків М.
Бепіпатіапа. Змішані культури, що включають гени, які повинні бути експресовані, включали конструкцію 355:Р19 у Адгорасієгішт, крім особливо обговорених випадків. Контрольні інфільтрації включали тільки конструкцію 355:Р19 у Адгобасіегіт.
Інфільтрацію листків здійснювали з використанням сумішей клітин Адгобасіегічт, і рослини типово вирощували протягом ще п'яти днів після інфільтрації, до одержання листкових дисків для виділення всіх ліпідів і аналізу жирних кислот. Рослини М. Ббепіпатіапа вирощували в камерах для вирощування при постійній температурі 249С з використанням циклу світлоллемрява - 14/10 з інтенсивністю освітлення, що становить приблизно 200 люкс, використовуючи освітлення - флуоресцентні лампи м'якого білого світіння О5гат, розміщені безпосередньо над рослинами. Типово рослини віком б тижнів використовували для експериментів, і здійснювали інфільтрацію належних листків, що були майже повністю розвиненими. Усі не піддані інфільтрації листки видаляли після інфільтрації, щоб уникнути затемнення.
Кількісна ПЛР у режимі реального часу
Аналіз експресії генів виконували за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу, використовуючи систему для детектування продуктів ПЛР у режимі реального часу ВІОКАЮ
СЕХ9б"М ії їОТМ 5УВЕФ Огееп Зирегтіх (ВіоРайд, Негсшев, СА, США). Праймери довжиною 19- 23 нуклеотидів і з температурою плавлення (Тт), що становить приблизно 6520, були розроблені для ген-специфічних ампліфікацій, що будуть приводити до продуктів ампліфікації розміром приблизно 100-200 п. о. Реакції ПЛР виконували в 96-ямкових планшетах. Усі реакції кількісні ПЛР у режимі реального часу виконували в трьох повторах. Реакційна суміш містила 1хіОТМ 5УВАяФ Стеєп Зирегтіх (ВіоКайд, Негсшіез, СА, США), 5 мкм прямого і зворотного праймерів і 400 нг кДНК, і її використовували в об'ємі 10 мкл на ямку. Умовами циклічної зміни температури були 952С протягом З хв., з наступними 40 циклами 952С протягом 10 сек., 6026 протягом 30 сек. і 682С протягом 30 сек. Контроль специфічності ампліфікації за допомогою 60 ПЛР здійснювали за допомогою аналізу кривої плавлення, після кінцевої стадії ПЛР зі збільшенням температури від 602С до 952С включно зі швидкістю 0,12С/сек. Крім того, ступінь чистоти продуктів ПЛР також перевіряли за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, і продукти ПЛР підтверджували за допомогою секвенування. Конститутивно експресований ген
КАБІЇ використовували як ендогенний контроль для нормалізації рівнів експресії. Дані також калібрували відносно рівня експресії відповідного гена, слідуючи 278 способу для визначення відносних кількостей (Зсптійдеп, 2008). Дані були представлені у вигляді середнього значення - 50 (середньоквадратичне відхилення) трьох реакцій, виконаних у незалежних 96-ямкових планшетах.
Виділення ДНК і аналіз за допомогою блотингу по Саузерну
Геномну ДНК проростків сафлору, генотип "5", виділяли з повністю розвинених листків, використовуючи буфер СТАВ і слідуючи способу, описаному Раїегхоп і ін. (1993). Подальше очищення виконували, використовуючи градієнти С5СІ, як раніше описувалося (ім еї аї., 1999).
Аліквоти, кожна 10 мкг геномної ДНК сафлору, розщеплювали окремо з використанням восьми різних рестриктаз, а саме Ассі, Ва, Ватні, ЕсоКіІ, ЕсомКУ, Ніпап, хваї і Хпої. Геномну ДНК, розщеплену кожною рестриктазою, піддавали електрофорезу через 1 9о агарозний гель. Гель занурювали в 0,5М Маон, 1,5М Масі на 30 хв., і ДНК блотували на нейлонову мембрану
Нубопа-м- (Атегепат, Об'єднане Королівство). Фільтри зондували з використанням а-РЗ2г астр- міченого фрагмента ДНК, що відповідає всій кодуючій області гена СІРАО2-6 сафлору як типового представника сімейства генів СІЕЕАЮ2, в умовах гібридизації зниженої жорсткості.
Гібридизацію виконували протягом ночі при 652С у розчині, що містить бх ЗОРЕ, 10 95 розчин
Денхардта, 0,595 5ЮОБ5 і 100 мкг/мл денатурованої ДНК молочка лосося. Після гібридизації і після короткочасного промивання в 2х 55С/0,1 96 5ЮО5 при 502С фільтри тричі промивали, щоразу протягом 20 хв., у 0,2 х 55С/0,1 95 505 при 502С до авторадіографії.
Трансформація сафлору і Агарідорзів Іпаіапа
Химерні вектори, що включають гени, використовувані для трансформації АгаБрідорзвів, вводили в А. їштеїасіеєп5 штам АсСі1, і клітини культур трансформованих Адгорасіегійт використовували для обробки рослин А. ІПаійапа (екотипу СоІштбіа), використовуючи спосіб занурення квіток для трансформації (Сіоцоп апа Вепі, 1998). Трансформовані рослини сафлору одержували, як описано Веїїйде і ін. (2011), використовуючи трансформовані культури
Зо Адгорасіветит.
Приклад 2. Виділення кДНК сафлору, які є кандидатами на кодування ЕАО2
Екстракція тотальної РНК і синтез КкКДНК
Для продукування кДНК із сафлору тотальну РНК виділяли з 100 мг зразків заморожених тканин сафлору, включаючи зародки, що розвиваються, листки, корені і гіпокотилі. Це було зроблено для кожної тканини окремо, використовуючи набір для виділення тотальної РНК рослин КМеазуФ (Оіадеп, Ніїдеп, Німеччина), відповідно до протоколу постачальника.
Концентрацію РНК у препаратах визначали за допомогою спектрофотометра МО1000
МапоОгор"мМ (Тпегто Різпег Зсієпійіс, Місюгіа, Австралія), і концентрації РНК робили однаковими до аналізу. Якість і відносні кількості РНК у кожному препараті візуалізували за допомогою гель- електрофорезу зразків через 195 (відносно ваги до об'єму) агарозні гелі, що містять формальдегід. Препарати РНК обробляли ДНКазою, що не містить РНКазу КО (Оіадеп, Ніїдеп,
Німеччина), для видалення забруднюючої геномної ДНК. Перший ланцюг кДНК синтезували з 400 нг кожного препарату РНК, що не містить ДНК, використовуючи систему Зирегзогірі ПІ Рігеї- зігапа Зупіпезіз Зузтет (Оіадеп, Ніїдеп, Німеччина) разом із праймером оліго(аТ)го, слідуючи інструкціям виробника.
Виділення експресованої у насінні КДНК для БАЮОБ2 з бібліотеки кКДНК насіння, що розвивається
На початку експресована в насінні КДНК для ЕАБ2 сафлору була отримана за допомогою скринінгу бібліотеки КДНК, що походять із зародків сафлору, що розвиваються, генотипу "ЗИ" (дикого типу, з високими рівнями лінолевої кислоти). Конструювання бібліотеки починали з екстракції РНК із суміші недорозвинених зародків різних стадій розвитку, які збирали і подрібнювали в порошок у рідкому азоті, і екстракцію РНК здійснювали, використовуючи ТКІ?2оЇ, слідуючи інструкціям виробника (Іпмігодеп, Сагізрад, СА, США). Полі(А)-вмісну РНК виділяли, використовуючи набір для очищення мРНК Оіадеп (Оіадеп, Ніїдеп, Німеччина).
Перший ланцюг кКДНК, праймером для синтезу якого служив оліго(ат), синтезували і перетворювали в дволанцюжкову ДНК, використовуючи набір для синтезу кКДНК 5ігагадепе, відповідно до інструкцій виробника (Зігаїадеп, а доМПа, СА, США). кКДНК із тупими кінцями лігували з ЕсоКІ-адаптерами, фосфорилували і фракціонували по розмірах за допомогою гель- фільтрації на колонку Спгота 5ріп-ТЕ-400 (Сіопіесп, СА, США). Кількість рекомбінантних КкДНК збільшували в Е. соїї штамі ХІ-1 Віпе МЕР", використовуючи набір для клонування 5бігаїадепе
Ргедідевієд І атраа 2АР П/ЕсоВІ/СІАР.
Для ідентифікації клонів ЕАЮ2 бібліотеку піддавали скринінгу, використовуючи фрагмент
ДНК, що відповідає кодуючій області ЕАО2 Агабідорзі5 (ідентифікаційний Мо у СепВапк-І 26296), слідуючи раніше описаному протоколу (іш еї аїЇ.,, 1999). Позитивні бляшки очищували з використанням двох циклів скринінгу, що слідують один за іншим, і очищені фагеміди, що містять КДНК для передбачуваних ЕАб2, виділяли, як описано в керівництві для набору для синтезу КДНК А2АРІЇ 5ігаїадепе. Аналіз послідовностей БАЮ2 здійснювали за допомогою програми МСВІ Віабі (м/мли.пебі.піт.пій-.дом/ВГАБТ/. Відкрита рамка зчитування була передбачена, використовуючи МесіогТІ. Дві різні повнорозмірні кКДНК були виділені з бібліотеки
КДНК насіння, що розвивається, і названі СТЕЕАЮО2-1 і СЕЄАЮ2-2, відповідно.
Ідентифікація Е5Т (експресованих маркерних послідовностей) для генів ЕАЮ2-кандидатів
Для ідентифікації додаткових КДНК для ГАОБ2-кандидатів була детально досліджена база даних, що стосуються експресованих маркерних послідовностей (Е5Т), сафлору Сотрозйає
Сепоте Ргої|есі (СОР) (сдораб.исдамі5.еди/сдравр2.), використовуючи програму ВГА5Тр для Е5Т, які кодували поліпептиди, що мають подібність з ГАЮ2 А. ІШаїїапа (ідентифікаційний Ме у
СепВапк-1І 26296). Принаймні одинадцять різних контингів послідовностей КДНК для ЕАб2 було ідентифіковано, серед яких два континги продемонстрували ідентичні послідовності з СТЕАЮ2-1 і СІЕАЮ2-2, виділеними з бібліотеки кКДНК насіння сафлору. Крім того, дев'ять різних кДНК були ідентифіковані і позначені як СІЄАЮО2-3-СТЕАО2-11, відповідно. 3- і 5-КАСЕ (швидка ампліфікація кінців КкКДНК).
Клон найдвошої ЕЗТ з кожного з 9 контингів (з СЕЕАЮ2-3 по СІБАЮ2-11 включно) був вибраний як вихідна точка для виділення відповідних повнорозмірних послідовностей кКДНК. У цьому процесі використовувалася 3- і 5-швидка ампліфікація кінців кКДНК (КАСЕ), використовуючи кКДНК, продуковану з РНК, отриманої з різних тканин сафлору, включаючи зародки, що розвиваються, листки, корені, гіпокотилі і квітки. Специфічні для гена праймери (С5Р) були сконструйовані, виходячи з клону найдовшої ЕЗБТ з кожного континга. 3'-ВАСЕ виконували, використовуючи набір для ПЛР у режимі реального часу в один прийом, слідуючи інструкціям виробника (Віоїїпе, Гопаоп, Об'єднане Королівство). Специфічний для гена праймер
Зо (С5Р) використовували в першому циклі ампліфікації за допомогою ПЛР для кожної з вибраних
Е5Т у комбінації з праймером полі(атТ) із сайтом для Мої! на його 3'-кінці. Другий цикл ПЛР виконували на продукті першого циклу, використовуючи "вкладений" З5Р у комбінації з праймером полі(ат). О5Р для 3' КАСЕ перераховані в таблиці 2.
Клонування 5'-кінця КДНК для СІРАЮ2-6 виконували за допомогою набору 5' КАСЕ Зувзіет
КИ (Іпмігодеп, Сагізрад, СА, США). Тільки мРНК для СІРАЮ2-6б була піддана зворотній транскрипції в кКДНК, використовуючи специфічний для гена праймер О5Р1, 5-
АССТААСО,АСАСТСАТОаААСААС-З (ЗЕБО 10 МО: 76). "Вкладений" специфічний для гена праймер С5Р2, 5-2чтОсАдаспАдАдаСаспАатасАСААС-З (ЗЕБО ІЮ МО: 77), використовувався в першій ампліфікації за допомогою ПЛР. В умовах реакції використовувався гарячий старт при 95205 протягом 4 хв. до додавання полімерази, 33 циклів денатурації при 9420 протягом 45 сек., відпалу при 5522 протягом 1 хв. і подовження ланцюга при 7220 протягом 2 хв.
Ампліфіковані 3'ї 5" фрагменти субклонували у вектор РОЕМ-Теавзу і секвенували в обох напрямках. Порівняння послідовностей 3'- і 5'-кінців клонованих Фрагментів з відповідними Е5Т указало на райони, що перекриваються, які збігалися один з одним, що забезпечило тим самим
З її 5 послідовності для кожного гена і дозволило зібрати передбачувану повнорозмірну послідовність для кожної з 11 кКДНК.
Виділення повнорозмірних послідовностей кКДНК для генів СТІЕАЮ2-кандидатів
Для виділення повнорозмірних кодуючих білки областей для дев'яти генів СІЕБЕАЮО2 ОКЕ (відкриті рамки зчитування) ампліфікували, використовуючи набір для ПЛР у режимі реального часу в один прийом, використовуючи тотальну РНК, що походить з декількох тканин сафлору, включаючи зародки, що розвиваються, листки, корені, гіпокотилі і квітки (5ігаїадепе, Га доПа,
СА, США). Праймери (таблиця 3), використовувані для ампліфікації ОМЕ, були основані на послідовностях ДНК, що знаходяться в 5'ї 3' ТК кожної кКДНК. Ампліфіковані продукти ПЛР клонували у вектор РОЕМ-ТеазуФф),, і їх нуклеотидні послідовності одержували за допомогою секвенування ДНК.
Характеристики послідовностей ЕАБ2-кандидатів із сафлору
Характеристики 11 кКДНК підсумовані в таблиці 4, а поліпептидів -- у таблиці 5.
Передбачені амінокислотні послідовності кодованих поліпептидів ОБРАЮ2-1-ОБАВ2-11 продемонстрували великий ступінь ідентичності послідовностей, що становить від приблизно 60 44 95 до 86 95 ідентичності один з одним. Вони продемонстрували ідентичність послідовностей з
ЕАра2 Агарідорзі5х, що становить 53-62 95. Розміри передбачених поліпептидів знаходилися в діапазоні від 372 до 388 амінокислот, тобто усі вони були довжиною, що становить приблизно 380 амінокислотних залишків. КДНК мали унікальні послідовності 5' і З3' нетрансльованих районів (ОТК), з цієї причини ендогенні гени можна було легко пізнати по їхніх послідовностях ТЕ.
Ампліфікація кодуючих білки областей з геномної ДНК сафлору привела до послідовностей
ДНК, ідентичних з відповідною кДНК, для кожного з 11 генів, що означає, що не було інтронів, які переривають їх кодуючі білки області.
Таблиця 2
Олігонуклеодтидні праймерин, використовувані ух 9" КАСЕ множнни генів ГАЮ)І сафлору
Тен, для ампліднкації якого Смислова Антнемислова використовувалися прамери послідовність посліловніс ть
СтТАЮІ-3 5- 5-
СТТСАССОАСТАССААТОО 0 сот ТСАТСОТОСАСТОСТТ
СТОССАС-У(5БО ОО МО: 58) СА -У(5ЕО ЛО МО: 59)
СЖтАЮрІ-А4 п- У-
СТТСАССОСАСТАССААТООС ООТТТсСАТСОТОССАСТОСТТ
СТОСАС-ВУ (5БЕО10МО:60) бА А Ч5ЕО НІ МО: 61)
СІБАЮ2-5 У- 5-
АТОАСАССАТТСОСОСТІТСАТ Ст СТОСТСАСТОСАТАСТ
СТОССА - (580 МО: 62) ТС -У3 (560 І МО: 63)
СТАЮ -6 У- У-
АСССААТАТСАСТОСОСТТО АСТОССОСТІТТССТСАСТОССО
АССАТО -У(5БЕО1ІЮ МО: 64) 0 ТАС -У (5ЕБО 1 МО: 65)
СЖБАЮІ-7 5- 5-
САТОААТСТОСОСТСАТСАТО / СсСтТІСТТСАТССАТТССОСТІТТ
ССТІТАС-Г (ЗО МО: 66) ОС -3У (5БЕОТО МО: 67)
СІЕАЮ2-5 У- У-
СОТОСТТОААТОАСАССАТ 0 АССТТІСТАСАСАССОСТАТ
ТОСОСТТАС-У (БО МО:68) сССтТ -У (5БОІЮ МО: 69)
СТАЮ2-9 У- У-
САТОСААСАТААСССАССО АдАСАСОССТТСОСТТОдОС
ТСОАСАТС -3 (5БЕО І МО: АСОА -3 (560 ІБ МО: 71) 79)
СЛЕАЮ2-19 У- У-
ТОСАТАСССОСЛАССАЛАА сССАТСТСТСЧаАСАОТТОСтТ
ССО -У (БО МО: 72) ТАС -У (5БО ІО МО: 73)
СТЕАГ2-1 У- У-
АТОТОСТСАССАТОССТТІ 0 ТОбААТОСТССТССАТТСС
АОсТОАОо-3 (52010 МО:74) ОСТ -У (БО ПО МО: 75)
Таблиця 3
Олігонуклеодтидні праймери, використовувані для ампліфікації всієї кодуючої області генів ЕАТЮЮ сафлору
Ген, для амипліфіканії якого Смислова АнІНОМКЗИСЛОВА використовувалися прамерн послідовніс їЬ посліловність
СІКА 2-1 У- У-
ТОАААОССААСАТОССАОС 0 ТСАСААСТІТАСТТАТТСТТО
АСО -3 (ЗБОЮ МО: 78) Т-3 (5БО І МО: 79,
СТАЮ щ- У-
АТТСААСААТОСОССТОСАС 0 САТСАТСТТСАААТСТТАТТС
ОС -У (5БО ІЮ МО: 80) -3'5ЕО Ю МО: 51)
СЕАЮ2-3 У- У
ААТСАССАССАССАСААО 0 СААДАСАТАССАССАААТОСТ
С-У (ЗБОЇ МО: 82) АСТ-3 (5БО ОО МО: 83)
СТАЮ -4 У- 3-
СТСАСТААССАОССТСААА ОСОСАТТОАТСАААТАСТТО
АСТТО -У (5ЕО ІЮ МО: 84) ТО -У (ЗБОЮ МО: 85)
СІРА У У- У-
АТСАСАССААССТСАААС ОТАСОТТАТОТААСААТСОТ
САТСТ-3 (5БЕ0Ю МО: 86) О-3 (ЗБОЮ МО: 87)
СІЕА 02-66 У- У-
ТОААСАССТТААСАТООСЮ / СТАСЄСТТАТСОТААСААТССТ
АсСТО-У (5БО Р МО: 85) о -У(5ЗЕО ІВ МО: 89)
СІТАрІ-7 У- У-
САСАТССААСАСТІСАССА АСАТСТАААСААТТТССАТО
ССАС-З3 (5БО Ю МО: 90) СТО -У (5БО1ІЮ МО: 91)
СТАО2-5 5- У-
СТОСТСТСТАСОСАСАСТАА / ТОСТАТСТААТОСАСТАТСААС
АТІСАС-У (5БО МО:92) бААС -У (560 1 МО: 93)
СІЕАЮ29 У- У-
СТОАДАТТІСАСАСССАСАСА АСАТСССТІСТТАОСТІТАА
ТАССтТАС -У (5БО Ю МО: СТА-У (560 ІЮ МО: 95) 94)
СТАІ2-1О У- У-
АСТТСОСССТСТОСТТАТСТ 0 СсССАТАСАСАТАСАТОСТАСА
СИ -У (ЗБОЮ МО: 96) СОАТ -3 (56О І МО: 97)
СІЕА 2-11 У- У-
АСТСАСААТААСТІСАТСТ СТАСТАСССАТАСААТОТСТ
СТСТО -У (ЗБОЇ МО: 58) ТСО -3 (БО 1Ю МО: 99)
Таблиня 4
Характеристики КДНК для КАЮ2-канлидлатів із сафлору
Назва ДовжинакюдДНЕ Кодующа Розмір Розмір Положення 0 Розмір ОКР нуклеотидна тенз (нуклеотидів! білокобласть ТВ З'ЮТВ 00 інтрона інтрена 5БО р МО
СТАБО-І 1423 1241266 123 156 -ІЗ 1144 13
СІКАБПО-2 1486 8І-1233 80 253 -І12 3090 ІЗ
СЕТАБО-3 1333 5І-1197 50 І36 - 114 І4
СІБАБО-4А 1403 32-1227 І! 175 - 124 І5
СТАБО-5 1350 о6-1194 65 185 -33 122 16
СТЕАБО-б 1263 151146 14 117 ж Ж 17
СФБАБО-7 1375 66-1185 65 150 -29 233 18
СЕАБО- 1345 38-1207 У; 138 ж Ж 19
СТЕАБО-9 1326 108-1172 107 154 Шй Ж 20
СТАВО2- ІЗ58 26-1199 55 159 -38 2247 21 10
СТАрО- 1229 58-1092, 57 137 -22 104 22
ЩІ
Таблипя 5
І Характеристики неоліпептидів СЕКА 2 кандилатів
Назва Довжина полі- Положення Положення Положення Аузнокислотна тена петтилу (Жопослідовність) (Жопослілювність) (22 посліловність) ЗО Мо (к-сть амінакнслот) від пернюго Ніз-баксу від другато Ніз-боксу відлретьоко Нів-боксу
СЕАБО-Р 380 105 ІАІНККННО ЗІЗНУМНИ 27
НЕСОСНУ
СЖТАБЮ-2 384 І06НЕСОН о 142 НКЕКНАЯ ЗІбНМТННо 25
СПРА2-3 ЗІ І04НЕСОСН ОО 140 НКкТНН ЗА НАУННО 29
СжАБ2-4А 350 ІЗ НЕСОН 139 НКТНН о 313НАУННО 3
СФТАЮБО-5 375 102 НОСОН ОО ІЗ8НКТННО МІНМУМУННО 31
СЖАЮ2-б 376 ІЕНБІСН 137 НЕ5ННО МОНнУУНН о 32
СЖТАБО-7 372 99 НЕСОН ІЗЗ5НКТНН о 305 НАУНН о 33
СЖАРБО-В 382 ІЗ НЕССН 139НЕТНН ЗІЗ НАУННоО 34
СФжТАПО-9 387 1І07НЕССН 1433 НКТНН о ЗІВНАУННО 35
СТЕАР2- Зо 1І44НЕССН 10 НЕКННоО 3ЗІ4НУУННо 36 10
СТЕАО- 377 ІООНЕССН 13 НЕМННО ЗО НУІННо 37
Ід "НЕСОН (ЗЕО ІЮ МО: 159), НОССН (ЗЕ О МО: 1603, НОЇ СН (520 МО: 161), НЕЯНН (5ЕО 6 МО; 162), НАТНН (ЗЕО ІО МО: 153), НЕЗНН (ЗЕОИЮ МО: 164), НАМНН (ЗЕ Ю МО: 165), НУУНН (5ЕО І МО: 166), НМТНН (ЗЕО Ю МО: 167), НАУНН (ЗЕСИІО МО: 168) и НУСНН (ЗЕОІЮ МО: 169),
Для дослідження споріднення поліпептидів ЕБАЮ2-кандидатів сафлору з відомими ферментами БАЮБ2, 11 виведених поліпептидних послідовностей були сполучені з послідовностями ЕАБ2 рослин, і дерево, побудоване методом приєднання сусіда, було побудовано, використовуючи Месіог МТІ (фіг. 1). Як показано на фіг. 1, амінокислотні послідовності СІЕЄАЮ2-1 і СТЕАО2-10 знаходилися в найближчому спорідненні, насамперед одна з одною, а потім з експресованим у насінні РАб2 з інших видів. СІЕЕАЮ2-2 знаходиться в більш близькому спорідненні з конститутивно експресованими генами з інших видів, ніж з іншими
ЕАр2-кандидатами в сафлорі. СІБАЮ2-3, -4, -5, -6 і -7 утворювали нову гілку у дереві, побудованому методом приєднання сусіда, повністю ймовірно, у результаті еволюції, що полягає в тому, що нещодавно дивергентний ген став збільшеним у числі в сафлорі. Примітно, при співвіднесенні з іншими видами, що вони знаходилися в найближчому спорідненні з функціонально дивергентною кон'югазою БАО2 з СаїІепаціа ойісіпаїй5. ЕАО2-11 знаходився в більш близькому спорідненні з ацетиленазами з декількох видів рослин, зокрема мгАр2 сафлору, який був індукований грибними еліситорами (Сапооп еї аї., 2003). Очевидно, СЕЕАЮ2-8 і -9 були більш дивергентними, ніж інші ЕАО2-кандидати із сафлору. Однак цей аналіз також показав, що порівняння послідовностей, хоча вони до деякої міри натякнули про можливу функцію, самі не могли дати надійні висновки про функцію різних ЕАО2-кандидатів. З цієї причини потрібен був функціональний аналіз, щоб зробити висновки про функцію кожного гена/поліпептиду.
Порівняння послідовностей показали, що поліпептиди БАЮО2-кандидати сафлору демонструють ідентичність послідовностей, що становить приблизно 50-60 95, і схожість з відомими ферментами ЕАбАаІ з інших видів, що становить 52-65 95. Ступінь невідповідності між нуклеотидними послідовностями генів СІБАЮ2 сафлору відображував їхнє філогенетичне споріднення, оскільки усі з СТЕЕАЮ2-3, -4 і -5 є більш схожими одна з одною, ніж з СІЄАЮ2-1 або
СІРАОР2-10, і навпаки. Ці значення були близько відповідними в матриці тотожності амінокислот (таблиця 6).
Таблиця
Ідентичність послідовностей ДНК в колуючих областях і виведених амінокислотних посліловностях у генах ГАЮ? сафлеру
Ідентичність вивелених змінокислотних посліловностей (25)
СА СІРА СІБА СІРА СА СТА СА СТА СА СТВА СФА рії ро ро-3 ро-4 2-5 2-6 0Б2-7 2-8 2-9 02-10 02-11
СІБА рі - 70.3 53.2 52,5 53.5 50,9. 54.1 59,7 59,5 80,1 564
СТА р2-2 700 - 54.5 55,00 54.2 51,7 576 0006 02,5 695 58,6
СТА
2-3 620 620 - 97,1 62.0 61,8 631 52,7 509 51.2 5658
СЕА
Пр2-4 62,7 633 951 - 614 614 633 531 509 509 56,9
СА б2-5 61.9 603 697 706 - 63.2 62.0 51.4 51.3 51,7. 53.9
СІРА
02-6 606 59,9 68.8 696 720 - 63,1 49.35 50,8 5001 562
СТА
2-7 62,5 65,6 694 693 666 6852 - 51,7 492 514 607
СТА
02-98 65,2 062 631 62,8 608 617 612 - 38.8 538.1 56.40
СТА
2-9 649 66.2 59.5 59.5 58.3 59,2 59,5 635 - 59.3 55.9
СТА
0Б2-1078.9 72.0 60.7 62.0 59.8 61.0 60.7 643 641 - 57.2
СТА
0Б2-1160,0 62.9 64,1 644 624 64.1 62.7 639 606059 617 -
Характеристики поліпептидів СІЕЄАО2-кандидатів
Кожний з передбачених поліпептидів з 11 СТЕЕАО2-кандидатів містив багатий ароматичними амінокислотами мотив у самому кінці С-кінця. Такі мотиви були ідентифіковані в поліпептидах
ЕАбЗ2 інших рослин і, як думають, необхідні для збереження локалізації в ЕК (МсСагіпеу еї аї., 2004). Згідно зі зв'язаними з мембраною ферментами десатуразами жирних кислот інших рослин кожен передбачений поліпептид СІРАЮ2 містив три багаті на гістидини мотиви (Нівб- бокси). Такі багаті Ні5 мотиви є у високому ступені консервативними у ферментах ЕАБбЗ і, як установлено, залучені в утворення дизалізного комплексу з молекулярним киснем, використовуваним при біохімічному каталізі (З5папкіїйп еї а!., 1998). У більшості послідовностей поліпептидів СІЕЄАЮ2-кандидатів першим багатим на гістидин мотивом був НЕСОНН, при цьому винятками були СІРАЮБ2-5 і -6, що мали НОСОНН і НОІГОНН, відповідно. Останньою амінокислотою першого Ніз-боксу в СІБЄАЮ2-8 (НЕСОНО) був О, а не Н. Автори даного винаходу шукали цей мотив у 55 відомих ферментах ЕАба2 рослин, і заміна Н на О також є присутньою у гомологу, що відхилився, ЕАО2 з І ездиегеїа Іпапеїйтегі в основному з активністю гідролази жирних кислот (ідентифікаційний Мо у Сепрапк-ЕР432246; Баик еї аї., 2007). Другий багатий на гістидин мотив був дуже консервативним, у вигляді амінокислотної послідовності НЕКНН, у декількох ЕАОЮ2 сафлорах-кандидатах, включаючи СІРАЮ2-1, -2, -8, -9 і -10. Було відзначено, що в СТЕАЮ2-11 у положенні 43 мотиви знаходиться амінокислота М, що також відзначалася в ряді функціонально дивергентних ферментів РАЮ2-типу, включаючи СКЕРІ Сгері5 аїріпа, Сраі2
Стгеріб5 раїаезііпа і мЕАЮ2 соняшнику (АМ166773.1), ЕАС2 Саїепашіа опйісіпаїй5 (АЕ343064.1),
ацетиленазу Кидрескіа піпа (АУ1667 76.1). Амінокислотою в цьому положенні в СТБАО2 -3, -4, -5, -6 або -7 або була 5, або Т.
У кожному з поліпептидів СТЕБАЮ2-1, -2, -9 і -40 амінокислотою, що безпосередньо передує першому Нів-боксу, був аланін, так само як і у випадку ферментів Д12-десатураз жирних кислот інших рослин. Амінокислота валін (М), а не аланін, була присутня в цьому положенні в СТЕЕАЮ2- 5, у той час як інші шість поліпептидів СІЄАЮ2 мали гліцин у цьому положенні. Сапооп і ін. (2003) припустили, що заміна аланіну на гліцин у цьому положенні зустрічається у функціонально дивергентних ферментах ЕАб2, крім А1Т2-гідролази жирних кислот. Як описано в наступних прикладах, наступні експерименти, пов'язані з гетерологічною експресією, у яких перевірялася функція кандидатів, показали, що кожний з поліпептидів СТЕЕАЮ2-1, -2 і -10 був олеат-Д1і2-десатуразою, у той час як СІЕАЮ2-9 продемонстрував субстратну специфічність десатурази до пальмітолеату (С16:1), а не олеату.
Було відзначено, що з 11 СТЕАБ2-кандидатів тільки поліпептид СТБАЮ2-11 мав послідовність
РМТН у положеннях з -5 по -2 третього Ніз-боксу, що відповідала мотиву (О/М)МХ(Н/М), що, як думають, зустрічається в ацетиленазах усіх рослин (Віаскіоск еї аЇ, 2010). П'ятьма амінокислотами відразу ж після третього Ніз-боксу поліпептидів СТЕАЮ2-1, -2 і -40 були ГЕ5ТМ, як і у випадку інших відомих олеатдесатураз ЕАО2 рослин. Навпаки, СІЕАЮ2-9, специфічна відносно пальмітолеату десатураза жирних кислот, мала мотив ГЕБЗМУ! у цьому положенні з двома амінокислотними замінами в положенні 4 і 45. У поліпептидах СІБАЮ2-3, -4 і -5 5 у положенні «3 був замінений на Р, який також був присутній тільки в інших кон'югазах жирних кислот ЕАБбБ2, включаючи такі з СаІепаціа ойісіпаїій5 (ЕАС2, ідентифікаційний Мо - ААК26632) і
Тгіспозапіпез Кіпіом/ії (ідентифікаційний Мо - ААОЗ37751).
Було встановлено, що Серин-185 ферменту ЕАО2-1 сої піддається фосфорилуванню під час розвитку насіння як регуляторний механізм для його ферментативної активності (Тапо еї аї., 2005). Серед 11 поліпептидів СЕЕАО2-кандидатів тільки СТЄАЮ2-1 мав серин у відповідному положенні (серин-181) відносно БАЮ2-1 сої. Був зроблений висновок, що той же посттрансляційний механізм через фосфорилування серину-185 може працювати під час розвитку насіння сафлору і нагромадження олії, для модуляції А12-десатурації олеїнової кислоти в мікросомах у насінні, що розвивається.
Приклад 3. Виділення геномних послідовностей для ЕАБ2-кандидатів
Виділення інтронів у 5'ТК генів СТЕЕАЮВ2-кандидатів
Інтрон-екзонні структури генів ЕАЮ2 є консервативними в багатьох квітучих рослинах. Усі гени ЕАВ2, досліджені дотепер, містять тільки один інтрон, що знаходиться в ТК, з одним винятком, що є ЕАЮ2-1 сої, у випадку якого інтрон знаходиться в кодуючій області відразу ж після першого АТО, що ініціює трансляцію кодона (Гіи еї аї., 2001; Кіт еї а!., 2006; МгосгкКа еї аї., 2010). Дивергенція послідовностей інтронів могла б використовуватися як розмір еволюційної відстані між таксономічно близькоспорідненими видами (ГІ ім еї а!., 2001).
Для виділення послідовностей ДНК можливих інтронів, розташованих у 5'-/ТЕ генів СТЕЕАЮ2- кандидатів, були передбачені типові сайти сплайсингу інтронів (АС:ЗТ) у 5 ТК кожної послідовності КДНК для СІРАЮО2, і праймери для ПЛР були розроблені на основі фланкуючих послідовностей передбачених сайтів сплайсингу. Праймери перераховані в таблиці 7. Геномну
ДНК, виділену із сафлору генотипу ЗО, використовували як матрицю в реакціях ПЛР для ампліфікації геномних ділянок, що відповідають 5ШТК. Ампліфікації виконували в реакціях об'ємом 50 мкл із використанням 100 нг геномної ДНК, 20 пмоль кожного праймера і Ноїєїаг (Оіадеп, Ніідеп, Німеччина), поставленого виробником. Циклічні зміни температури для ПЛР виконували, як зазначено нижче: 9420; протягом 15 хв. протягом одного циклу, 9420; протягом 30 сек.,, 552Об протягом 1 хв., 7220 протягом 2 хв. протягом 35 циклів; 7220 протягом 10 хв., використовуючи Кугаїес зирегсусієг 50200 (Кугагес, Оцеепзіапа, Австралія). Продукти ПЛР клонували в РОЕМ-Т Еавзу, а потім секвенували.
Автори даного винаходу змогли одержати передбачений 5' інтрон з 8 з 11 генів СЕЕАЮ2- кандидатів, а саме -- СІРАЮ2-Ї, -2, -3, -4, -5, -7, -10 ії -11. Основні особливості цих інтронів представлені в таблиці 8. Ампліфікація інтрона була неуспішною з СІЕАЮ2-6, -8 і -9, ймовірно внаслідок недостатньої довжини 5' ТЕ, у яких були присутні інтрони. Очевидно, про ЕАВ2 без інтрона не повідомлялося, хоча втрата інтронів з ядерних генів часто відзначалася у вищих рослин (І одиегсіо еї а!., 1998; Зтаї! еї аІ., 2000а;Б).
Таблипя 7
Олігонуклеотидні нраймери, використовувані для ампліфікації СТЕК районів генів КАП2-кандилатів у сафлору.
Ген. для ампліфіканії якого Смислова Антисмислова послідовність використовували праймери послідовність
СТЕАБІ-1 5- У-
САСАТІТТСАСАСАССАА 0 СТТТООТСтТООСАСОСАСАС
ОССОСТТ -3 (5БО ШО МО: АТА -У (5БЕ0О1ІР МО: 101) 100)
СЕАБ2-7 У- 3
САЛААООАСТТТСАСАЛА 0 АСТОССОТТООСАТОССТТІССАСО
СССТОС -У (5БО 10 МО: ТТС- У (5БО ІБ МО: 103) 102)
СТАДА 3- У-
ААТСАССАССАССАСААСО ААСССОСТОСАСААТТАТОСА
СУ (5БО 1 МО: 104) ТАТС-У(5ЕО Ю МО: 105)
СЕАрІ-4 У- 5-
СТСАСТААССАСССТСАА 0 ААСОСОСАСАССАТТАТОА
ААСТТО -3 (50 ІЮ МО: ТАТС -У (5БО ДЮ МО: 107) 106)
СТАРІ У У- У-
АТСАСАССААССТСАААО 0 АТСАТСТСТТСОСТАССТТА
САТСТ-У БО МО: 108) 0 ТО -У (БОР МО: 109)
СІЕАБ2-А7 У- 8-
САСАТССААСАСТТСАССА СТАААСААТТТССАТОСТОТ
ССАСІ-3 (5БО Ю МО: 110) ТАС-У (ЗБОЮ МО: 11)
СТЕАБ2-10 8- 3-
АСТТСОСССТІСТОТТАТСТ сАбАСАСОСТОСААСТАСС со -У (5БОЮО МО: 112) ТО -3 (БО Р МО: 113)
СТАБ2І-11 У- У-
СТСАСААТААСТІСАТСТС АлААСАСАТАСОССААСААСО
ТСТС-Нг (5БО ТО МО: 114) АСАТС -У (5БЕО1О МО: 115)
Таблиня В їхобливість інтронів у генах АТ кавлилатах.
ОРМН сІКАЮЬІ. САЛІ С ЄЖАВИЗ США СТАВ СТАВІ сСфАЮТЮ СРО
Почложеннх М з -и НІ! -33 -ха -38 -22 довживя ля 3090 Та 124 22 253 2247 104
Вяист АТ 64595 65 тзлев т5дрва 57296 ві вк ту й се 35.55 зада 2623 25.075 32-83 зтяне зм 2595 шк АСОТОСАТ АСХТОАСА АСТАТОА АОЮТААОТ АОХТОЛАС АбОТАТАЄ ОпСТТОбТ о АботттсТ
ЛО 0 теослоют ттосаєют АТОСАФТ осослоют ттЄМст послоют ТАТАЧЄТ ПОСАФЄТ
Послідовність інтрона в кожному з восьми генів розташовувалася в 5-0ТК кожного гена, у положеннях, що знаходяться в межах від 11 до 38 п. о. 5" від передбачуваного кодона початку трансляції, першого АТО у кожній відкритій рамці зчитування. Довжина інтрона знаходилася в межах від 104 п. о. (СТЕАЮ2-11) до 3090 п. о. (СІТЕАЮ2-2) (таблиця 8). У випадку СІТЕАЮ2-1 розмір інтрона становив 1144 п. 0о., що схоже з розмірами інтронів, ідентифікованих у генах ЕАбБ2 з
Агарідорвзів (Тне Агабідорвів Іпіоптайоп Везошгсе, пир/Лимли.агарідорзів.ог9у), бавовнику (І ім еї а!., 2001) і кунжуту (Хезатит іпаісит) («Кіт еї аї., 2006). Динуклеотиди в передбачуваних сайтах сплайсингу, АС і СТ, були консервативними у всіх восьми досліджених генів СІЕЕАО02, але у всьому іншому всі послідовності інтронів були дивергентними по послідовності без якої-небудь значної гомології між ними. Усі послідовності інтронів були АЛІ -багатими зі вмістом А/І між 61 95 і 75 956, що відповідало багатьом іншим інтронним послідовностям із дводольних рослин. У випадку генів інших дводольних рослин ген ЕАО2 Агабрідорзі5 містив інтрон розміром 1134 п. о. 5 на відстані лише 5 п. о. від свого ініціюючого трансляцію кодона АТО. Розмір інтрона в 5-О0ТА гена ЕАЮ2-1 Соззурішт, що знаходиться 5' на відстані 9 п. о. від ініціюючого трансляцію кодона, становив 1133 п. о. Навпаки, гени ЕАЮ2-4 і РЕАО2-3 бавовнику містили більш великі інтрони розміром 2780 п. о. і 2967 п. о., відповідно, що знаходяться 5' на відстані 12 п. о. від ініціюючого трансляцію кодона. Кожен ген СЕЕАЮ2-кандидат можна було відрізнити за розходженнями в положенні і розмірі інтрона в 5-0ОТК у кожному гені. Розходження могли бути також важливі в забезпеченні диференціальної експресії генів. Як повідомлялося, такі інтрони роблять позитивний ефект на експресію генів-репортерів у кунжуті (Кіт еї а!., 2006). Відповідний інтрон, як було встановлено, є ефективною мішенню для посттрансляційного сайленсингу гена ЕАбВ2 у сої (МгосгКа еї а1., 2010).
Було відомо, що інтрони можуть робити істотні впливи на профілі експресії генів. Аналіз послідовностей інтронів за допомогою програми РІ АСЕ (млум.апа.айтс.до.Ір/РІ АСЕ/) дозволив ідентифікувати кілька передбачуваних цис-регуляторних елементів. Наприклад, кілька мотивів, таких, як АВКЕ і 5ЕК4, що звичайно є присутніми у специфічних для насіння промоторах, були визначені в специфічному для насіння СІБАЮ2-1. АСі-мотив, що звичайно зустрічається в промоторі зв'язаних із захисною реакцією генів, індукованих різними стресами, такими, як скарифікація або обробка еліситорами, був визначений у СІБАЮБ2-3, що специфічно експресуються в гіпокотилях і сім'ядолях молодих проростків сафлору.
Приклад 4. Аналіз за допомогою блот-гібридизації по Саузерну генів ЕАЮ2 сафлору - кандидатів
Складність сімейства ЕАО2-подібних генів у сафлорі була досліджена за допомогою аналізу
Зо за допомогою блот-гібридизації по Саузерну. Аналіз гібридизації в умовах зниженої жорсткості показав, що в сафлорі, РЕАЮБ2 кодується складним мультигенним сімейством (фіг. 2). За допомогою підрахунку фрагментів, що гібридизуються, отриманих, використовуючи різні рестриктази для розщеплення геномної ДНК, було встановлено, що існує більше 10 ЕАО2 або
ЕАОр2-подібних генів у сафлорі. Відмічувані розходження в силі гібридизації у випадку різних фрагментів, очевидно, корелювали з відносними ступенями ідентичності послідовностей із ДНК зонда, що використовувався. Сафлор є дводольним видом і, як думають, має один дикий вид- прабатько, С. раїаезіїпи5 (Спартап апа ВигКе, 2007). Автори даного винаходу думають, що незвичайно велике сімейство генів ЕАЮ2 у сафлорі, імовірно, є результатом декількох дуплікацій давнього гена, що приводять до спеціалізації і диференціальної активності різних членів сімейства генів.
Приклад 5. Функціональний аналіз генів-кандидатів у клітинах рослин
Експресія генів СТЕЕАЮ2-кандидатів при аналізі функції в дріжджових клітинах
Як зручна клітина-хазяїн, дріжджі 5. сегемізіае використовувалися для дослідження функціональної експресії декількох ЕАБ2 А12 специфічних відносно олеату десатураз жирних кислот рослин (Сомеїо апа Кееа 1996; Буег еї аї!., 2002; Нетапаве? еї аї., 2005). 5. сегемізіае має відносно простий профіль жирних кислот, і він містить олеїнову кислоту з надлишком у своєму фосфоліпіді, що може використовуватися як субстрат для ферментів ЕАЮ2. У ньому також відсутня ендогенна активність ЕАО2. З цієї причини 11 генів СІЕЄАЮ2-кандидатів були перевірені в дріжджовому штамі УРН499, використовуючи конструкції що походять з руУЕ52, кожна відкрита рамка зчитування в яких знаходиться під контролем промотору САГ1, як описано в прикладі 1.
Як продемонстровано на фіг. 3, коли аналізували жирнокислотний склад у дріжджових клітинах, що містять "порожній вектор" руУЕеЕ52, лінолева кислота (18:2) або гексадекадієнова кислота (16:2) не виявлялася, як і очікувалося, оскільки в дріжджів немає ендогенного ЕАО2.
Навпаки, на газовій хроматограмі для жирних кислот, отриманих із дріжджових клітин, які еспресують кожну з відкритих рамок зчитування для СІРАЮ2-1, СІРАЮ2-2 і СІБАЮ2-10, виявлявся пік жирної кислоти з часом утримання, що становить 11,293 хв., що відповідає лінолевій кислоті (С18:2), і на газових хроматограмах для СІЕАЮ2-9 і СТЕАЮВ2-10 виявлявся пік жирної кислоти з часом утримання, що становить 8,513 хв., що відповідає С16:2. Ці дані бо вказували на те, що СІБАЮ2-1, СІЕАЮ2-2 і СТЕАЮ2-10 були здатні перетворювати олеїнову кислоту в лінолеву кислоту і, отже, були Д12 олеатдесатуразами. Однак рівень утвореної 18:2 був нижче, ніж у випадку конструкції АЕЕАО2 Агабрідорвзі5, що використовувалася як позитивний контроль. СЕЕАЮ2-10 утворював як лінолеву кислоту (С18:2), так і гексадекадієнову кислоту (С16:2), використовуючи олеїнову кислоту (С18:1) і пальмітолеїнову кислоту (С16:1) як субстрати, відповідно, у той час як СІЕЄАЮ2-9 десатурувала пальмітолеїнову кислоту і, отже, була А12 пальмітолеатдесатуразою. Два нові малі піки, що з'являлися на хроматограмах для
ЕАМЕ із дріжджових клітин, що експресують СІРАЮ2-11, були ідентифіковані як лінолева кислота (18:2 А90212(23) | її трансізомер (18:2 212) при 5С-М5 його піролідинових аддуктів, і
РМОХ (фіг. ЗН). У таблиці 9 підсумований жирнокислотний склад в дріжджових клітинах, які експресують кодуючі СТЕАЮ2 області. Нові піки не були виявлені в дріжджових клітинах, які експресують СТЕЕАЮ2-3, -4, -5, -6, -7 і -8.
Для дослідження, чи мав який-небудь з поліпептидів СІРАЮБ2-кандидатів активність гідролази жирних кислот, здійснювали реакцію ЕАМЕ, приготовлених із дріжджових клітин, які експресують кожну із відкритих рамок зчитування для СІБАЮ2, із силілуючим агентом, що перетворює гідроксильні залишки в похідні ТМ5-ефіри, виходячи з яких можна було досліджувати мас-спектри. Однак похідні гідроксильних залишків розповсюджуваних жирних кислот, таких, як олеїнова кислота, не були виявлені в якій-небудь з ліній дріжджових клітин, які експресують відкриті рамки зчитування для СІЕАЮ2-кандидатів. Це означало, що жоден з 11 генів СЕЄАВ2 не кодував поліпептиди, що мають активність гідролази жирних кислот у дріжджах.
Додаткові експерименти були проведені для виявлення активності Ді12-епоксигенази і Д12- ацетиленази, обидві з яких використовують лінолеву кислоту як жирнокислотний субстрат, за допомогою доповнення середовищ для росту тих же ліній дріжджових клітин вільною лінолевою кислотою й аналізу жирнокислотного складу згодом. Доповнення здійснювали після додавання галактози в культури для експресії конструкцій. На газових хроматограмах не виявлялися нові піки жирних кислот, зокрема ті, які являли собою похідні у вигляді епоксикислот і жирних кислот ацетиленого ряду. Гетерологічна експресія цих нових жирних кислот у дріжджах, з доповненням екзогенною вільною жирною кислотою, зіткнулася з деякими труднощами в демонстрації активності (І ее еї аї., 1998; Сапооп еї аї., 2003). З цієї причини функціональні аналізи в клітинах рослин були проведені, як зазначено нижче.
Коо)
Таблиня З
Жирнекнєлетний склад у дріжджових клітинах, які експресують вирбані генн СКАТ ! обща сму боб о: бЖя 00 бІвЮ ОВ бів 00 біяя о сосіромеюю, "Вектор хО1л0аИБ МИ хОов оавеа ія ВЖК 00000: Тож зо во може з по
ШОЕА0ОЯ зт жОбо Од оої Зоб Ооє ЗРАБОЯЕ ОВ ОЮЮ: тд Ода вва ЗЕИЕОДИ ВЕНОМЕ 0
СМЕАО2О с 1ЛЕОД6 ВОЗ ЖОЮІ ОАооОЯЕ ЗЕЕОЖОЄМ 0000 ТОВЖЦОМ ОВК ОЕ МЕКФО ОМВО:
ФФЕАОМЯ ІВ ЖООЮ ОВО 2330 ЗДО ІБТЕОЮЮ ВВОНОЛУ ЗВЕ Ж БВМЕ 0
ОЖМЛО АдеЖОО 0оукОо? зам коли ЗТОВОСІ. ОМЕООМ аббжоое оБезЕад? ЕФ ВВЖОЛО 0.
МТРАВОМІ: ФеВЖОТ З О0У ІВАТЕО ЗОРЕО 0:000 ТАМОФТ ЗВЕЛІВ ЗДБОО лоно; ЗБОКО0В
Транзиторна експресія генів СІЕЕЄАО2-кандидатів у М. бепіпатіапа
Для конститутивної експресії генів у клітинах рослин, зокрема в листках рослин, кожну з ОКЕ для СІЕАЮ2 вбудовували в смисловій орієнтації в модифікований бінарний вектор РОКЕО4 між промотором Саму-355 зі збільшеною активністю і термінатором по53", що містить послідовність сигналу поліаденілювання (Сошіи еї аї., 2007) (ЗЕБЕО ІЮ МО: 54). Попереднє дослідження показало, що експресію трансгенів можна значно збільшити за допомогою коекспресії вірусного білка-супресора сайленсингу, Р19, для зменшення сайленсингу трансгена в хазяїні в аналізі транзиторної експресії на основі листків М. репіпатіапа (Моіппеї єї аї., 2003; Мооса еї аї., 2009;
Реїгіє еї аї., 2010). Ці експерименти проводилися, як описано в прикладі 1.
Як описано вище, функцію СТЕАЮБ2-11 на початку досліджували за допомогою експресії в 5. сегемізіає, і дві нові жирні кислоти були ідентифіковані за допомогою С-М5 як 18:2 892120 18:2 29012), відповідно. Відповідно до результатів, отриманими на дріжджах, експресія СІЕЕАЮ2- 11 у листках М. репіпатіапа дала новий 18:2 трансізомер. Метиловий ефір цього ізомеру продемонстрував час утримання при СС, що був однаковим з таким для метилового ефіру 18:2 деле (фіг. 48). Новий 18:2 892122 обумовлював 0,35 95 жирних кислот у листках після транзиторної експресії СЕЄАЮ2-11 (таблиця 10). Крім того, був виявлений інший новий пік, що не був виявлений у дріжджових культурах. Хроматограма всіх іонів і мас-спектр цієї нової жирної кислоти відповідали крепеніновій кислоті (18:2 А5(0212(су) (фіг. 4В і С), що означає, що поліпептид
СІРАр2-11 мав А12-ацетиленазну активність. Як показано в таблиці 10, крепенінова кислота обумовлювала 0,51 95 від усіх жирних кислот.
Було відзначено, що транзиторна експресія СТЕА02-11 у клітинах М. Ббепіпатіапа приводила до зменшення вмісту 18:2 892122) порівняно з нетрансформованим контролем (таблиця 10).
Імовірно, це було обумовлено конкуренцією СІБАЮБ2-11 з ендогенною /цис-А12 олеатдесатуразою у клітинах М. Бепіпатіапа за наявний у розпорядженні пул олеїнової кислоти, субстрату для обох ферментів. У цілому, результати експериментів з експресії в дріжджах і М. репіпатіапа показали, що СТЕАЮ2-11 функціонував в основному як специфічна відносно олеату ДІ12-десатураза без специфічності відносно стереоізомерів, утворюючи як лінолеву кислоту, так і її транс-Л12 ізомери. Крім того, він міг також десатурувати А12 подвійний зв'язок лінолевою кислотою з утворенням ацетиленового зв'язку крепенінової кислоти.
Інші десять поліпептидів СІЕЄАЮ2-кандидатів були також транзиторно експресовані в листках
М. рРепіпатіапа у такий же спосіб, але автори даного винаходу не виявили які-небудь нові жирні кислоти, що не були присутні ендогенно в листках М. рбепіпатіапа, що вже мали високі рівні
ЕАО2.
Тайблиня 10 жирнокислотний склад у листках М. Вевійатіапа, які транзиторно екснресують СІКАВО-1І1 : со же обо Же біб ос се своею срве оба сб ою сво
Уснелюль КОН АВ ПОБУ Од? ДЕН ДИР Толя ЗЕ ВОВКА ОЮТ 000 б ов дек ЕКО
СЕК ЗАЛ Зоя? (ВЕБ ОВТ, ВК БО ВВ 55 ВЛ ЗМ: 03 ІК ОІВ ОККО? МАХ ОВ ДКЛЬЕ МИ ОБ КОЛО Од» ОО ДІ з ОД
ГОДИНИ ПИ ПОСОЛ ПОХО О ОТНННО ОН НО ПОЛЕ ИН
Обговорення 11 генів СЕЕАЮ2-кандидатів, описаних вище, що були ідентифіковані в сафлорі, являють собою найбільше сімейство генів ЕАЮ2, виявлене в якому-небудь виді рослині, що був досліджений дотепер. Хоча тільки один ген ЕАО2 був ідентифікований у Агабідорвзі5 (ОКиїеу єї аі!., 1994), БЕАЮБ2, очевидно, кодується множиною генів у геномах більшості інших рослин, досліджених дотепер. Два відмінні гени ЕАО2 були описані в сої (Неррага еї аї., 1996), льону (Еогапа єї аї., 2004; Кнадаке еї аї., 2009) і маслині європейській (Негпап?е еї аї., 2005); три гени
Зо в соняшнику (Магпіпе2-Кімав5 еї аї., 2001) і Сатеїїпа займа (Капу еї аї., 2011); ії п'ять генів у бавовнику (Гіи еї аїІ., 1998). В амфітетраплоїдному виді Вгазвіса пари5 4-6 різних генів ЕАО2 були ідентифіковані в кожному диплоїдному субгеномі (5спетег еї аї., 1997). Усі гени СЕЕАЮ2- кандидати були експресовані в рослинах сафлору, оскільки послідовності були виділені з кДНК.
Це надалі перевіряли, як описано в прикладі 6.
Хоча порівнянні дослідження відсутні, очевидно, що сафлор є незвичайним, що стосується еволюції сімейства генів ЕАЮ2. Сафлор є самозапильним диплоїдним видом рослин, який знаходиться в найближчому спорідненні з диким диплоїдним видом Сагіпатизх раїаезіїпив, і він, як відомо, не характеризується дуплікацією або реаранжировкою геному у великому ступені (Спартап апа ВигКе, 2007). КДНК для множини ЕАО2, що були ідентифіковані, не могли бути зв'язані з альтернативним сплайсингом, оскільки гени ЕАБ2-кандидати не містили інтрони в послідовностях кодуючих областей. Швидше, дуплікація гена, з більшим ступенем імовірності, була відповідальна за створення складності в сімействі РАО2 у сафлорі. Топологія філогенетичного дерева показала, що дуплікації гена могли відбутися на декількох ієрархічних рівнях. Наприклад, поліпептиди СІРАЮ2-3, -4 і -5 знаходилися в більш близькому спорідненні з іншими послідовностями в цьому кладі, ніж з іншими послідовностями БАО2 сафлору, що означає, що більш недавні дуплікації гена могли бути відповідальні за появу цього кладу.
Приклад 6. Рівень експресії генів ЕАр2-кандидатів у сафлорі
Профіль експресії генів ЕАО2 у різних тканинах
Для визначення картин експресії в тканинах різних генів СІЕЄАЮ2-кандидатів були виконані аналізи з використанням кількісної ПЛР у режимі реального часу, як описано в прикладі 1.
Тотальну РНК екстрагували із сім'ядоль, гіпокотилей, тканин коренів і листків, отриманих із проростків сафлору 10 БАС генотипу з високим вмістом ліноленової кислоти З, і з тканин квіток ії зародків, що розвиваються, із квітучих рослин, і використовували в аналізах.
Олігонуклеотидні праймери, використовувані для аналізу, перераховані в таблиці 11.
Таблиця 1ї
Олігонуклеотидні праймери, використовувані для кількісної ПЛР у режимі ревльного часу в лослізженні профілів ексиресії генів КАР: сафлору
Тен, для ампліфіконоії Свклово посліловність Анкцемислова послідовність кого ЕпКОориУІову- валися пипнМери
СТАТІ 5У- ВТОТАТОТСТОССТСОСАСА З (БЕО МО: 116) 5 ПСААОПТАСТАПАОСАССАЛО У (БОЮ МО І
СКАТ 5У-аССТОСАВАСАТТСАТТСАСОТС- З (5ЕО10 МО:115) 0 У- СААСАТОПСАТОССАТОСТААОС - (550 10 МО: 119)
СТАЮ 5У- АСОТОССОПТСТСАСОТТ-У(5БО 1 МО: 120) 5У- АООСОТОАСААТТАТОАТАТС -3 (БОЮ МО: 121)
СІЕАРОІ-А КЕ- ААСОСАСОССОСТОАТОСООА У (БО ОО МО: 122) 5У- АОТАТТТСАТСААТОСОСТОС -У(5БО 1 МО: 123)
СШЕАЮЮ-5 0/8 СААТАСООТАБАОСССАСАСАЄ (ЗВО МО:І124) 0 8'- АТСАТСТСТТООСТАООТТАТО -И(85БО НО МО: 125)
СТКАПІ-6 У пАСАТСТИСТСАСОТООТОасСАТ -У (ЗБОЮ МОХ 126) У-СТТОСТААТАТОСАСАСССТА -Г(5БО НУ Мк 127)
СІЕАГО-7 0 5- ССААТСАСАСССАССОСАТС -3' (850 Ю МО: 128) е-СТАААСААТТТССАТООТОТТАЄ -3 (559 13 МО: 1293
СІАБОІ-8 У- ЧАОССААСОСАСАСААСТААСС -У (5БЕО ПО МО: 130) К-САСОБАТСАТАСААЛАСАССОТСОС -У (БОЮ МО: 131)
СТАЮ -З 5 САТОТОТООСТОКпАССАТТСОСА - (БО М МО: 132) Г-ССАССОЛОаТТТАСССТ ТРОС АКБ МО: 133)
СФАРІ-Ю 0/5 ССААСААЛАСАААССАТСТСТСО-Г(ЗБО ПЗ МОМ; 0 У- ОАСАСАСОСТОСААОТАСОТО -7 (ЗБОЮ МО: 135)
СЕАБМІ ОО У-ССАТТОСАТССАСССТТСАССТТА -Т(БО В МО:136) 00 К- АЛАСАСАТАСОСААСААССТАСАТС З ЧРОЇЮ МО: 137 «КАБ 000 5УСТОААСТОСААТТАТСТАСО (БОЮ МО ІЗ 000 5 ОСТАТТООТАТТОСАТОООСО З (ЗВО НІВ)
Часова і просторова картина експресії 11 генів СІЕЄАОЮ2 представлена на фіг. 5. Аналіз з використанням кількісної ПЛР у режимі реального часу показав, що СІБА02-1 експресувався тільки в насінні, що розвивається. Навпаки, СІЄАЮ2-2 експресувався на низьких рівнях у насінні, а також інших досліджених тканинах. Крім того, експресія СІБАЮО2-4, -5, -6, -7, -8, -9 не виявлялася в зародках, що розвиваються. Низькі, проте такі, що виявляються, рівні експресії
СІЕАО2-10 ї -11 відзначалися в насінні, що розвивається, особливо на пізній стадії розвитку, коли насіння сафлору досягає зрілості. Усі з СІЕЕАЮ2-4, -6, -7, -9 і -11 продемонстрували високі рівні експресії в тканинах молодих проростків, зокрема в сім'ядолях і гіпокотилях. СТЕАЮ2 -5 і -8, очевидно, були специфічними відносно коренів, а СІРАЮ2-10 переважно експресувався в тканинах квіток, при цьому відносно низькі рівні виявлялися в різних інших досліджених тканинах, включаючи насіння, що розвивається, і тканинах проростків віком десять днів.
Продукти ампліфікації не детектувалися після 40 циклів ампліфікації в контрольних реакціях з використанням матриці у вигляді тотальної РНК, але без зворотної транскриптази, що означає відсутність домішкової геномної ДНК у препаратах РНК.
Приклад 7. Демонстрація генетичної мутації в лінії 5317 сафлору
Перша ідентифікована ознака високого вмісту олеїнової кислоти в сафлорі, виявлена при впровадженні сафлору з Індії, контролювався частково рецесивним алелем, позначеним ої, в одному локусі ОЇ. (Кпоулез апа Нії!Ї, 1964). Вміст олеїнової кислоти в генотипах оо! звичайно становив 71-75 95 у випадку вирощуваних у теплиці рослин (КпоулЛез, 1989). Кпоулез (1968) включив алель ої у програму селекції сафлору і вивів перший сорт сафлору з високим вмістом
Зо олеїнової кислоти (НО) "0ОС-1" у 1966 у США, з наступним виведенням поліпшених сортів "ОіІвїс
Ї еейд" ії серії Запйоіа, зокрема Зайоіа 317 (5-317), 5-517 і 5-518. Генотипи оо! (високий вміст олеїнової кислоти) були відносно стійкими при різних температурах (Вагпоіотем, 1971). Крім того, Кпом/Лез (1972) також описав відмінний алель оЇї у тому ж локусі, що породжував у гомозиготному стані між 35 і 50 95 олеїнової кислоти. На відміну від генотипу ої, генотип 01101: продемонстрував сильну реакцію на температуру (Кпоул/ез, 1972).
Повідомлялося про додаткову зародкову плазму з більш високим вмістом олеїнової кислоти (585 бос) (Гегпапає2-Мапіпе? еї аї., 1993; Вегдатап еї аї., 2006). Регпапде2-Мапіпе? і ін. (1993) повідомили про вміст олеїнової кислоти аж до 89 95 у сафлорі в надходженні зародкової плазми
РІ401472, спочатку доставленої з Бангладеш. Серія Мопісоїа, виведена Вегодтап і ін. (2006), містить більше 80 956 олеїнової кислоти, очевидно нижче найбільш верхнього рівня олеїнової кислоти в сорті "ОС-1", що містить алель оїої, як описано Кпоулез і НІЇЇ (1964). Генетичний аналіз протягом схрещувань і аналіз розщеплень ліній з високим і дуже високим вмістом олеїнової кислоти свідчив про те, що дві лінії мають однакові алелі в локусі ОЇ. Дуже високий вміст бо олеїнової кислоти (85 95) був породжений в результаті об'єднання алелей ої і модифікації генів з невеликим позитивним ефектом на олеїнову кислоту (Натаанп еї аї., 2009).
Іп міго біохімічна характеристика мутантної лінії 5-317 з високим вмістом олеїнової кислоти
Мікросоми сафлору були свіжоприготовлені з насіння, що розвивається, генотипу 5-317, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, на стадії середини дозрівання, через приблизно 15 днів після пилення (ОРА), як описано 5іутпе і АрреїЇдмізї (1978). Стандартна реакційна суміш об'ємом 90 мкл містила 40 мкг мікросомального білка, 2 нмоль Г"СІ|олеоїл-КоА в 0,1 ммоль калі- фосфатному буфері рН 7,2. Потім додавали 10 мкл 50 мМ МАбБН, їі інкубацію продовжували протягом ще 5, 10 або 20 хв. Реакції зупиняли, додаючи 90 мкл 0,15М оцтової кислоти, і ліпід екстрагували з використанням 500 мкл СНСіІз:МеОнН (1:1). Нижню СНСІз фазу одержували, і полярні ліпіди з неї розділяли за допомогою тонкошарової хроматографії (ТІ С), використовуючи систему розчинників СНСІЗ/МеОН/НАс/НгО (90:15:10:3 в об'ємному відношенні). Споти, що відповідають РС, вискребали з пластини, і зв'язані ацильні (жирнокислотні) групи піддавали переметилуванню в 2 мл 2 95 сірчаної кислоти в МеоОН при 902С протягом 30 хв. Отримані в результаті ЕАМЕ розділяли на оброблених АдМО»з пластинах для ТІ С з використанням суміші гексан"ОЕЕ:НАс (85:15:11 в об'ємному відношенні). ""С-мічені стандарти метилових ефірів олеїнової і ліноленової кислот наносили на пластину як контролі. Пластини експонували й аналізували за допомогою формувача зображення на люмінесцентному фосфорному покритті
Еціййт БЕСА-5000. Радіоактивність кожного зразка кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення Еціййт Мийі Зацде.
Після додавання МАН у реакції з мікросомами дикого типу відзначали, що доданий
Г"Сролеоїл-КоА швидко зникає, у межах 10 хв., у той час, коли з'являється | "С|лінолеат, що вказує на ефективне перетворення олеату в лінолеат у мікросомах сафлору дикого типу.
Навпаки, у випадку генотипу 5-317 з високим вмістом олеїнової кислоти, значно більше відношення Г"С|олеату до Г"С|лінолеату було виявлено у міїго реакціях протягом всього часу (таблиця 12), що означає, що біосинтез лінолевої кислоти через десатурацію олеату за допомогою мікросом був істотно зменшеним у цьому генотипі.
Таблиня 12
Процент С18:2 нрелукту, утворюваного з СІК:Ї у мікресемах єсафлеру час Дикий тип що св) Сів СІВ 00 СІВ СІВ 0 да ПА 10090000 00-00
З 796512 01.2 99.40.53 06503 10 6906-04 30404 9541.6 416 2 60,6-0,6 30406 95.151,5 451,5 й-й
Коо)
Молекулярна характеристика алеля ої, що визначає високий вміст олеїнової кислоти
Для розуміння молекулярної основи генотипу, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, (010) у сафлорі кКДНК для двох експресованих у насінні ЕАОС2, а саме СІЕАЮ2-1 і СЯЕАЮ2-2, ампліфікували за допомогою ПЛР із трьох сортів з високим вмістом олеїнової кислоти: 5-317,
Ї езаї 496 і СУМ99-ОЇ,, і секвенували. КДНК, що охоплюють повні кодуючі області генів СЕЄАЮ2-1 із трьох сортів з високим вмістом олеїнової кислоти, були ідентичними по нуклеотидній послідовності один одному і продемонстрували ідентичність послідовностей, що становить приблизно 98 95, із КДНК для СІРАЮ2-1, що походить із сорту дикого типу 5), включаючи делецію одного нуклеотиду і 22 заміни нуклеотидів у генотипі НО порівняно з диким типом.
Делеція однієї пари основ була виявлена в положенні 606 нуклеотиду, вважаючи з першого
АТО, приблизно в середині кодуючої області СІЕАЮ2-1. Ця делеція приводила до зсуву трансляційної рамки зчитування, що створював стоп-кодон незабаром після делеції, так що мутантний ген у трьох сортах оо! кодував передбачений, усічений поліпептид без третього Нів- боксу, що присутнього у білку дикого типу (фіг. 6). Було відзначено, що існував відносно високий рівень варіації послідовностей у послідовностях ДНК поблизу місця делетованого одного нуклеотиду алеля ої, що наводить на думку, що додаткові мутації нагромадилися в мутантному гені.
Райони ДНК, що включають інтрони в 5 ТК СІРАЮ2-1 і СІЕАЮ?2-2, були також виділені з мутанта оо! 5-317 і порівняні з інтронами дикого типу. Розмір інтрона в СТБАЮО2-1 з 5-317 становив 1144 п. о., на 61 п. о. більше інтрона дикого типу з 5), розмір якого становив 1083 п. о.
Порівняння нуклеотидних послідовностей інтронів у СІРАЮБ2-1 показало, що загальна ідентичність послідовність становить 76,8 95, при цьому інтрони відрізнялися по 27 вставках або делеціях і 95 однонуклеотидних замінах (фіг. 7).
Примітно, що заміни нуклеотидів у мутантному гені не були розподілені рівномірно протягом всього району довжиною 1142 п. о., відповідного кодуючій області дефектного СІБАЮ2-1, оскільки 14 з 22 (63,6 95) замін були присутні поблизу делеції нуклеотиду, більшість у межах 123 п. о. небагато 3" від делеції одного нуклеотиду. Навпаки, інтрони в СІРАЮ2-2 у дикому типі і мутантних генотипах продемонстрували ідентичність послідовностей, що становить в загальному 99,5 95, тільки з 12 замінами нуклеотидів і однією 2-нуклеотидною делецією. Це означає, що або деякий тиск відбору мав місце в дефектному гені СТІЕАВ2-1 у мутанті НО, або, можливо, з більшим ступенем імовірності, що мутація СЕЄАЮ2-1 була давнього походження і могла походити з виду-прабатька сафлору, такого, як С. раїаевііпив.
ЕМ5 мутант (5-901), отриманий з комерційного сорту з високим вмістом олеїнової кислоти 5-518, був описаний у патенті США з Мо 5912416. Хоча генетичні дослідження показали, що так званий алель 0ї2г у цьому новому генотипі відмінний від алелей о! і 0оЇї у локусі ОЇ, його молекулярна природа не була визначена УуеізКег (патент США з Мо 5912416). Генотип 5-901 характеризувався збільшенням рівня олеїнової кислоти до 89,5-91,5 95 від загального вмісту жирних кислот у зрілому насінні. Відзначалося зниження насичених жирних кислот, тобто пальмітинової кислоти, вниз до приблизно 4 95 і стеаринової кислоти вниз до приблизно 2,5 95.
Однак 5-901 не виявив фенотип нормальної рослини і страждав на деякий знижений ріст і врожайність. Морфологічно він був коротше, і квіткові голівки були менші порівняно з його батьківською лінією 5-518. Він також зацвітав пізніше і містив менше олії в насінні.
Розробка ідеальних ПЛР-маркерів для селекції ознаки "високий вміст олеїнової кислоти»
Розходження в делеції одного нуклеотиду в послідовності мутантного алеля СЕЕАЮ2-1, що, як був зроблений висновок, є каузальною мутацією, відповідальної за фенотип НО, було покладено як молекулярну основу для дуже ефективного маркера для відстеження мутантного
Зо алеля ої. Таким чином, автори даного винаходу розробили аналіз молекулярного маркера, що дозволяв ідентифікувати і відбирати мутантний алель ої із селекційною метою або з метою ідентифікації сортів, навіть коли він присутній у гетерозиготному стані. Відбір за допомогою молекулярного маркера, таким чином, усуває необхідність в одержанні додаткового покоління рослин, які необхідно піддати скринінгу відносно жирнокислотного фенотипу. Проста генетики в сполученні з дослідженням ідеального молекулярного маркера дасть можливість селекціонерам сафлору швидко включити ознаку високого вмісту олеїнової кислоти в їхню селекційну програму.
Представлялося, що існує недостатня варіація послідовностей у екзонах СТЕАЮ2-1 між генотипом дикого типу 5И і генотипом 5-317, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, щоб легко створити диференціальний маркер на основі реакцій ПЛР. Однак автори даного винаходу змогли використовувати відносно високу дивергенцію послідовностей у інтроні в 5 ТК СІЕАБ2- 1 між алелями ОЇ і ої. Існували ділянки дуже варіабельних послідовностей між цими двома алелями, що дозволили розробити унікальні праймери для ПЛР. Наступні ілюстративні праймери були розроблені для ампліфікації специфічного продукту розміром 315 п. о. 3 генотипів, що визначають високий вміст олеїнової кислоти, що містять мутантний алель оЇйоЇ, але не в генотипі дикого типу БО. НО-смисловий: У-АТАДАССсСТОТаТттСАСИасякаттт-3 (5ЕО І
МО: 140); і НО-антисмисловий: 5-БЬСтоАСсСттавасАТАСААССАТ-З' (ЗЕО ІЮ МО: 141) (фіг. 7).
Інша пара ілюстративних праймерів, специфічних відносно гена дикого типу в сорті ЗМУ, що обумовлювала продукт ПЛР розміром 603 п. о0., була наступною: Ні -смисловий: 5'-
Бо АатТТАТасСІТТСсАТОАТСОсАСО-3 (ЗБО ІО0 МО: 142); ії Нісантисмисловий: /-5-
ТТастАТАСАТАТТОаААСОасСАСТ-З3' (5ЕО ІО МО: 143) (фіг. 7). Пару праймерів, що походять з гена КАБІЇ сафлору, сіКазі-смисловий: 5-СТаААСТасСААТТАТСТАСИ-3 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 144) і сікаві-антисмисловий: 5-СИОЗТАТТааТАТТаСпйАТтТОасОаСо-3 (5ЕО ІЮ МО: 145), використовували як позитивний контроль для гарантії рівного внесення матричної ДНК і хорошого виконання
ПЛР.
Умовами реакцій ПЛР були 9420 протягом 2 хв., з наступними 40 циклами 942С протягом 30 сек., 582С протягом 30 сек. і 7270 протягом 30 сек. Продукти реакції розділяли за допомогою електрофорезу в 1 95 агарозному гелі і візуалізували під ультрафіолетовим світлом після фарбування гелю етидієм броміду. Фрагмент розміром приблизно 300 п. о. відзначався в бо реакціях ампліфікації у випадку всіх п'яти досліджених генотипів, що визначають високий вміст олеїнової кислоти, а саме -- 5-317, 5-517, СМУ/99-ОЇ, І ебаї496 і Сіапо-ОЇ, у той час як такий фрагмент був відсутній у випадку генотипу дикого типу 50. Навпаки, фрагмент розміром приблизно 600 п. о. був присутній при ампліфікаціях у випадку сафлору дикого типу 5, але не був присутній у якому-небудь з перевірених сортів з високим вмістом олеїнової кислоти. Як позитивний контроль, смуга розміром 198 п. о., що походить з гена КАФЗІЇ, була ампліфікована в реакціях у випадку всіх перевірених ліній. Справжності ампліконів підтверджували за допомогою секвенування ДНК.
Таким чином, дивергенція послідовностей у інтроні в ТК гена СІЕЕА02-1 між алелем, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, і алелем дикого типу сафлору сприяла розробці
ПЛР-маркера, що визначає присутність або відсутність мутації в СТЕЄАЮ2-1. Він був повністю зчеплений з алелем ої, незалежно від генетичного фону, тобто він був повністю зчепленим маркером. Однак цей молекулярний маркер був домінантним маркером, і тому використання тільки цього маркера не дозволило б відрізнити гомозиготні по алелю о! генотипи від гетерозиготних по ньому генотипів. Для подолання цього була розроблена інша пара праймерів для ПЛР, що приводила до ампліфікації тільки алеля ОЇ дикого типу. Отже, використання таких специфічних для дикого типу праймерів у сполученні з праймерами для ПЛР, специфічними відносно генотипів, що визначають високий вміст олеїнової кислоти, дозволило відрізнити гомозиготні від гетерозиготних генотипів у локусі СЕЕАО2-1.
Експресія СТЕАЮ2-1 істотно зменшена в генотипах, які визначають високий вміст олеїнової кислоти.
У наведених вище розділах було показано, що СІЕАЮ2-1 експресуються тільки в зародках, що розвиваються, насіння, що розвивається, і є такими, що не виявляються в різних інших досліджених тканинах, зокрема листі, корені, квітці, сім'ядолі і гіпокотилі, що походять з молодих проростків сафлору. СТЕАЮ2-1 експресувався на високому рівні в насінні, що розвивається, у якому швидкість метаболізму жирних кислот була високою, і приводив до активного нагромадження олії, що містить в основному С18:2, за відносно короткий період часу. СЕЕАО2-1 характеризувався найбільшим рівнем експресії приблизно в середині розвитку насіння, з більш помірним рівнем експресії і на ранній, і на пізній стадіях розвитку насіння.
Використовуючи метод аналізу за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу, рівень
Зо нормалізованої експресії гена СІЕЕАЮ2-1 визначали в трьох сортах з високим вмістом олеїнової кислоти, а саме -- 5-317, Іезай49б і СУУ99-ОЇ, і порівнювали з таким у насінні, що розвивається, генотипу дикого типу 5). Як видно на фіг. 8, експресія СЕЕЄАЮ2-1 детектувалась на всіх трьох стадіях розвитку зародків у генотипі сафлору дикого типу З), при цьому найбільший рівень експресії відзначався на стадії досягнення середини зрілості, відповідно до попередніх результатів і з підтвердженням часової картини транскрипції цього ключового гена
ЕАО2. Однак транскрипти СІРАЮ2-1 були такими, що ледве виявляються у трьох сортах з високим вмістом олеїнової кислоти 5-317, | езан496 і СУМ99-ОЇ (фіг. 8), що означає високий рівень нестабільності РНК-транскриптів з цього гена в мутантних зародках.
Навпаки, рівні транскриптів з СТЕАЮ2-2 були схожими у випадку генотипу дикого типу і генотипів, що визначають високий вміст олеїнової кислоти, що свідчить про те, що експресія
СІРАр2-2 була не порушена в зародках НО, також про те, що препарати РНК були відповідно чистими для цих аналізів. Тому був зроблений висновок, що експресія СЕЕАЮ2-2 може також робити внесок у Д12-десатурацію жирних кислот для ліпідів, що запасаються, у насінні сафлору, що розвивається, але в набагато меншому ступені, ніж СІЕЕАО2-1 у насінні дикого типу, а також бути залученою у АІ12-десатурацію жирних кислот для мембранних ліпідів у корені, листку і стеблі. Не було даних, що експресія СІЕАЮ2-2 була збільшеною в мутанті з високим вмістом олеїнової кислоти у відповідь на, або як компенсацію за, зменшення активності СТЕА02-1 у насінні сафлору, що розвивається, мутанта СЕЕАО2-1.
Причиною істотно зменшеного рівня транскриптів СЕЕА02-1 у лініях НО є опосередкована несмисловим полінуклеотидом деградація мРНК (ММО).
Причиною істотно зменшеного рівня транскриптів СЕЕАЮ2-1 у зародках НО могла би бути опосередкована несмисловим полінуклеотидом деградація мРНК (ММО) для СІЕАВ2-1, оскільки стоп-кодон був виявлений у середині кодуючої послідовності незабаром після делеції одного нуклеотиду. Система ММО, як думають, є механізмом, що бере участь у деградації аберантних
МРНАК, що містять передчасний стоп-кодон (РТС), що є результатом несподіваних помилок, таких, як мутації в геномі, помилки при транскрипції і неправильний сплайсинг. Вона є механізмом, який всюди є присутнім у еукаріот, і, особливо, він був ретельно вивчений у дріжджів і ссавців. Вона порівняно погано вивчена у вищих рослин, але існує кілька повідомлень, включаючи ген інгібітору трипсину Кунітца із сої (КІЗ), ген фітогемаглютиніну
(РНА) із квасолі звичайної (ЧоїиКи еї аї., 1989; МоеїКег еї а!., 1990), ген фередоксину з гороху (ЕЕОТ) (ОіскКеу еї а!., 1994) і ген Умаху з рису (ІззПіКі еї аї., 2001).
У цих експериментах було встановлено, що мутація оЇ, яка приводить до ознаки високий вміст олеїнової кислоти в сім'ядолі сафлору, знаходилася відповідно до низьких рівнів нагромадження мРНК для СІБАЮ2-1 у насінні, що розвивається. Попереднє дослідження показало, що алель сої був напіврецесивним, що не відповідало механізму посттранскрипційного сайленсингу гена, опосередкованого короткими РНК. У генний сайленсинг залучені 21-24- нуклеотидні кіРНК, утворені з дволанцюжкової РНК, що є результатом транскрипції антисмислової або шпильковий РНК і може функціонувати генетично як домінантний або полідомінатний локус (Вгодегзеп апа Моїппеї, 2006). Для підтвердження того, що механізм мутації оЇ відмінний від сайленсингу гена, зв'язаного з РНК-інтерференцією, автори даного винаходу виконали секвенування коротких РНК, як зазначено нижче.
Були створені дві бібліотеки коротких РНК, що походять з генотипу, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, 5-317 і генотипу дикого типу ЗО, використовуючи об'єднані РНК, виділені із зародків, що розвиваються, на стадії досягнення середини зрілості. Загальне секвенування бібліотек коротких РНК виконували з використанням технології 5оЇеха (Наїпег еї аі,, 2008). Секвенування цих двох бібліотек було виконано в секвенаторі ПШиміпає Зоїеха зедиепсег, і зразки аналізували одночасно. Секвенування бібліотек коротких РНК ЗИ і 5-317 породило в цілому 23160261 і 21696852 грубих зчитувань, відповідно. Аналіз трьох зчитувань привів до ідентифікації 22860098 ії 21427392 послідовностей, довжина яких знаходилася в межах від 18 до 30 нуклеотидів, відповідно. Була визначена присутність і розподіл коротких
РНК, що відповідають СІРАЮ2-1, у бібліотеках БИ і 5-317. Лише низькі, такі, що ледь виявляються, рівні коротких РНК, що відповідають СІРАЮ2-1, були виявлені, виходячи з обох бібліотек коротких РНК, і розподілялися майже рівномірно по кодуючих областях генів СЕЕАЮ2- 1. Не було очевидного розходження між бібліотеками, що роблять з генотипу дикого типу, і генотипу, що визначає високий вміст олеїнової кислоти.
Виходячи з цих даних, був зроблений висновок, що механізм опосередкованого короткими
РНК посттранскрипційного сайленсингу гена не був основним механізмом, за допомогою якого було відвернене нагромадження транскриптів з мутантного СІЕЕАЮ2-1.
Зо Дослідження транзиторної експресії в листках М. репіпатіапа
З метою додаткового вивчення феномену ММО автори даного винаходу виконали експерименти з транзиторної експресії СТЕАЮ2-1, що походить і з генотипу дикого типу, і з генотипу, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, у листках М. Ббепіпатіапа.
Кожну з ОРЕ для СІБАЮ2-1 вбудовували в смисловій орієнтації в модифікований бінарний вектор РОКЕО4 під контроль промотору Самму-355. Для інфільтрації в нижню сторону повністю розвинених листків М. бепіпатіапа використовували штам Асі 1 Адгорасіегіит їшптегасіеп5, що містить або 355:СІЕАЮ2-1, або його мутантну форму 355:СІЕАЮБ2-1А, разом з 355:Р19, як описано в прикладі 5. Після періоду вирощування протягом ще 5 днів при 2420 ділянки з інфільтратами вирізували, зі зразків одержували тотальну РНК, використовуючи набір ЕМеазу
Міпі Ки (Оіадеп). Для вимірювання рівнів РНК для СІРАЮ2-1 аналізи за допомогою кількісної
ПЛР у режимі реального часу виконували в трьох повторах, використовуючи Ріайпит 5ЗУВК
Стееп ОРСВ БиуирегМіх-О0ра (Іпмийгодеп), і проводили в АВІ 7900НТ Зедшиепсе Оеїесійоп Зубіет, як описано в прикладі 1. ПЛР виконували в наступних умовах: на початку 482С протягом 30 хв., потім 952С протягом 10 хв., з наступними 40 циклами: 952С протягом 15 сек. і 602С протягом 60 сек. Праймерами для екзогенного гена СІЕАО2-1 були: смисловий: 5- статАтатотТасстоСаАСцА-З! (ЗЕО ІО МО: 146); антисмисловий: 5-
ВСААДСИтТАаТАпАс,аАСОсАдО-3 (5БО 10 МО: 147). Контрольний ген, СІКАЗІЇ сафлору, використовували для нормалізації рівнів експресії; специфічним для нього праймерами були: смисловий: 5-СТаААСТОасСААТТАТСТАСО-3 (ЗЕБО ОО МО: 144); і антисмисловий: 5- 5о аатАттаатАТТасАТтТассас(оа-3 (5ЕО ІЮО МО: 145). Високі рівні експресії СІЕЕАЮ2-1 відзначали в листках М. бепіпатіапа з гена 355-СІЕАЮ2-1, що походить із сорту дикого типу З). Порівняно, набагато більш низькі рівні експресії відзначалися у випадку гена 355-СТЕА02-1А, що походить з генотипу, що визначає високий вміст олеїнової кислоти.
Рослини А. ІПпаійапа екотипу СоІ-0 трансформували з використанням штаму АС11 А.
Іштегїасіеп5, що містить бінарний вектор, що містить специфічний для насіння промотор Ері, який керує областю, що кодує або СІРАЮ2-1, або СІЕАЮ2-14А, відповідно до способу Сіоцой і
Вепі (1998). Тотальну РНК виділяли зі стручків, які містять зародки на стадії досягнення середини дозрівання, потомків отриманих у результаті трансформованих рослин, використовуючи набір КМеазу Міпі Кий (Оіадеп). Дослідження експресії генів проводили, бо використовуючи препарати РНК, з використанням аналізів за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу, проведених у трьох повторах, як описано вище. Високі рівні експресії СТЕЕАО2-1 відзначалися в стручках Агарідорвзі5, які експресують Ер1-СТЕАЮ2г-1, що походить з 5), однак експресія Ер1!-СТЕАЮ2-1А, що походить з генотипу, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, була істотно зменшеною порівняно.
Було продемонстровано, що специфічні відносно СТІРАЮ2-1 короткі РНК не продукувались на значно більш високих рівнях у насінні сафлору, що розвивається, з високим вмістом олеїнової кислоти, ніж короткі РНК із гена дикого типу, незважаючи на те, що кількість транскрипту з мутантного СІЕАЮ2-1 було істотно зменшеною. Тому був зроблений висновок, що зменшення
РНК для СІБАВ2-1 у генотипі, що визначає високий вміст олеїнової кислоти, обумовлене ММО, відмінною від механізму опосередкованого короткими РНК посттранскрипційного сайленсингу гена. Явище ММО також спостерігали, коли мутантну кодуючу область експресували екзогенно або в листках М. БРепіпатіапа, або в стручках Агабідорбвів.
Приклад 8. Виділення кДНК сафлору, які є кандидатами на кодування ЕАТВ
Виділення послідовностей кДНК для ЕАТВ сафлору
Олія насіння сафлору містить приблизно 7 95 пальмітинової кислоти. Ця жирна кислота синтезується в пластидах клітин насіння, що розвивається, з яких вона експортується в цитозоль клітин для включення в триацилгліцерини. Основним ферментом для експорту пальмітинової кислоти є пальмітоїл-АСР-тіоестераза, що гідролізує тіоефірний зв'язок між пальмітоїльною складовою й ацилпереносним білком (АСР), з яким ацильна група ковалентно зв'язана, коли вона синтезується в пластиді. Фермент пальмітоїл-АСР-тіоестераза належить до групи розчинних, таких, що направляються в пластиди ферментів, названих ЕАТВ. В олійних рослинах цей фермент виявляє специфічність відносно АСР, що переносить коротколанцюжкові насичені ацильні групи, як субстрата. Ген, що кодує фермент ЕАТВ, був на початку виділений з видів рослин, що накопичують середньоланцюжкові насичені жирні кислоти, такі, як лауринова кислота (С12:0), з каліфорнійського лавра (ШтрбеїІшіагіа саїІйогпіса). Наступні дослідження показали, що ортологи ЕАТВ були присутні у всіх тканинах рослини, в основному в насінні, із субстратною специфічністю, що коливається від С8:0-АСР до С18:0-АСР. У АгаБбідорбвів і більшості середньоширотних олійних культур, включаючи сафлор, пальмітинова кислота є основною насиченою жирною кислотою в олії насіння.
Для виділення КДНК сафлору, що кодують кандидати на ЕАТВ, бібліотеку КкКДНК насіння сафлору, що розвивається, піддавали скринінгу, використовуючи гетерологічний зонд, що складається з фрагмента КкДНК для БГАТВ з бавовнику ((зо55урішт Піг5шїцт), як описано в прикладі 1. Одна повнорозмірна кДНК, названа СІРАТВ-112, була виділена з бібліотеки кКДНК насіння сафлору. Ця кКДНК містила відкриту рамку зчитування довжиною приблизно 1029 нуклеотидів, що кодує поліпептид з 343 амінокислот. Довжини її 5'ї 3 ТК становили 236 нуклеотидів і 336 нуклеотидів, відповідно. Відповідно до передбачень поліпептид СІЕЕАТВ-Т12 містить передбачений, відповідальний за перенесення пептид довжиною приблизно 60 амінокислот і кістяк з 210 амінокислотних залишків, що містить два повтори додавання у вигляді спірали і багатоланцюгового листа, характерного для білків з так званим складанням "хот-дог".
Виходячи з бази даних, що стосуються експресованих маркерних послідовностей (ЕЗТ), сафлору Сотрозіїаеє Сепоте Ргої|есії (СОР) (сдраб.исдаміз.еди/сораба2.), були ідентифіковані три різні ЕТ, гомологічні СТЕЕАТВ-Т12, а саме -- ЕІ! 379517, ЕІ 389827 і ЕІ 396749. Кожна була неповної довжини. Відповідні гени були названі СІЄАТВ-А, СІРАТВ-у і СІЕЕАТВ-С, відповідно.
Повнорозмірна кКДНК СІБАТВ-1Т12, виділена з бібліотеки кКДНК насіння сафлору, була ідентична по нуклеотидній послідовності ЕТ з СІБРАТВ-С у їхній ділянці, що перекривається.
Представлялося, що СІРАТВ-А був таким, що більш відрізняється по своїй нуклеотидній послідовності, ніж інші дві послідовності СТЕЕАТВ.
Профіль експресії генів СІБАТВ, визначений з використанням аналізу за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу.
Профіль експресії трьох генів СІЄАТВ досліджували за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу, як викладено в прикладі 1. Були розроблені олігонуклеотидні праймери, що відповідають унікальному району кожного з трьох генів, включаючи СІРАТВ-А, смисловий праймер: 5-АШАСАТСАТТаСАСАСТАСАСТИ-3 (5ЕО ІЮ МО: 148); антисмисловий праймер: 5'-
СССАТСАДИаСАСААТТСТТСТТАС-3 (5ЕБО ІЮ МО: 149); СТЕАТВ-В, смисловий праймер: 5- СТАСАСААТССааАСТоТастТОасСтТ-3 (БО 10 МО: 150) антисмисловий праймер: 5- ,ССАТОСАТОАСАССТАТТСТА-3 (5ЕБО 10 МО: 151); СІБАТВ-С, смисловий праймер: 5-
ССТСАСТСТасОаАССААсСАдДАТ-3 (ЗБО ОО МО: 152) антисмисловий праймер: 5- тстасваАСАТаТаАСИаТАсСАА-З (ЗБО І МО: 153). Реакції ПЛР проводили в трьох повторах, як описано в прикладі 1.
Як продемонстровано на фіг. 9, СЕЕАТВ-А продемонстрував низькі рівні експресії в листках, коренях і на всіх трьох стадіях розвитку зародків, що були перевірені. СІЕЄАТВ-В був діючим у листках і коренях, але продемонстрував експресію на більш низькому рівні в зародках, що розвиваються, ніж у листках і коренях. Це наводило на думку про те, що цей ген, імовірно, грає лише незначну роль, якщо взагалі грає, у біосинтезі жирних кислот у насінні, що розвивається.
Навпаки, СІЕЕАТВ-С продемонстрував високі рівні експресії у всіх перевірених тканинах, зокрема, у зародках, що розвиваються. Це означало, що СІЕАТВ-С був основним геном, що кодує ЕАТВ для продукції пальмітинової кислоти в олії насіння сафлору. Це не розходиться з виділенням авторами даного винаходу тільки одного клону КДНК для ЕГАТВ з бібліотеки, що походить з зародка насіння, а саме СІЕАТВ-112, що був ідентичний по послідовності СЕЄАТВ-О.
На основі цих даних був вибраний фрагмент ДНК розміром приблизно 300 п. о., що походить з
СІРАТВ-Т 12 (СІРАТВ-С), як послідовність гена, що повинна була використовуватися для приготування конструкцій шпилькових РНК для зменшення експресії ЕАТВ у насінні сафлору, як описано в наступних прикладах.
Приклад 9: Виділення й експресія КДНК сафлору, що кодує ЕАЮб
Виділення послідовності КДНК для ЕАЮб сафлору
Особливі жирнокислотні сполуки, що виявляються в ліпідах мембран мікросом і хлоропластів і оліях насіння, що запасаються, є результатом складної метаболічної мережі, що функціонує з контролюванням цього складу, регулюючи біосинтез жирних кислот і постійний рух по так званих прокаріотичних і еукаріотичних шляхах. Очевидно, що мікросомальний фермент
ЕАб2 відіграє основну роль у перетворенні олеату в лінолеат у ЕК після експорту олеїнової кислоти з пластиди і перетворення в ефіри КоОА в цитоплазмі. Хлоропластна омега-6 десатураза (ЕАОб) є ферментом, який десатурує 16:1 і 18:11 жирні кислоти до 16:2 і 18:2, відповідно, у всіх 16:11- або 18:1-вмісних ліпідах мембран хлоропластів, включаючи фосфатидилгліцерин, моногалактозилдіацилгліцерин, дигалактозилдіацилгліцерин і сульфогвіновозилдіацилгліцерин.
Мутант Тадб Агабрідорзі5, як повідомлялося, є слабким у десатурації 16:1 ї 181 до 16:2 і 18:22, відповідно, у всіх ліпідах хлоропластів (Вгомжузе еї а!., 1989). Коли мутант Тадб вирощували при низькій температурі (522), листки ставали хлоротичними, і швидкість росту була значно зменшеною порівняно з диким типом (Нидіу апа зотегміе, 1992). Послідовність КДНК, що кодує
ЕАОб, була спочатку виділена з Агарідорвіх5 Раїсопе і ін. (1994). Відтоді КДНК, що кодує ЕАОЄб, і гени ЕАОб були виділені з декількох видів рослин, включаючи Вгазвіса парих, Рогіцаса оіІегасеа, сою і Кісіпи5 соттипів.
Для виділення клону кКДНК, що кодує хлоропластну десатуразу Фб жирних кислот, кодовану геном ЕРАЮОб із сафлору, провели пошук гомологічних послідовностей у базі даних СРО. Вісім послідовностей Е5Т, а саме -- ЕІ 378905, ЕІ 380564, ЕІ 383438, ЕІ 385474, ЕІ 389341, ЕІ 392036,
ЕГ393518, ЕІ 411275, були ідентифіковані й об'єднані в послідовність одного континга розміром 808 нуклеотидів. Ця послідовність мала інтактний 5'-кінець, але була неповною на 3'-кінці.
Повнорозмірна кДНК була згодом отримана за допомогою ампліфікації за допомогою ПЛР
З'ЄАСЕ, використовуючи, як матрицю, ДНК, екстраговану з бібліотеки в лямбда кДНК, отриманих з насіння сафлору, що розвивається (5). Умовами ПЛР були умови, описані в прикладі 2. Один олігонуклеотидний праймер, позначений СІЕЄАЮОб-52, використовували в реакції ампліфікації в сполученні з прямим праймером МТ13, оскільки послідовність для цього праймера була присутня у векторі бібліотеки кКДНК. Послідовністю праймера сіБАЮб-52 була: 5-
САТТаААдатТосаатАТТаАТАТСТИа-3 (ЗЕО ІЮО МО: 154). Була отримана кДНК розміром 1545 п. о., що мала відкриту рамку зчитування розміром 1305 п. о., що кодувала поліпептид ЕАЮОб- кандидат довжиною 435 амінокислот. Цей поліпептид мав ідентичність амінокислотної послідовності, що становить 60-74 95, з іншими клонованими поліпептидами БАЮОб рослин.
Дендрограма, яка демонструє філогенетичний зв'язок між послідовністю ЕБАЮОб сафлору і типовою пластидною 412 десатуразою ЕАЮб, ідентифікованою у вищих рослин, була створена за допомогою Месіог МТІ (фіг. 10).
Профіль експресії СТРАЮОб, визначений з використанням аналізу за допомогою кількісної
ПЛР у режимі реального часу.
Профіль експресії СІЕЕАЮбЄ був досліджений за допомогою кількісної ЗТ-ПЛР у режимі реального часу, що проводили, використовуючи Ріайпит ЗУВЕ Сгееп ЗРСК ЗирегмМіх-Пра (Іпмігодеп), і досліджували в системі АВІ 7900НТ 5едиепсе Оеїесіюп Зузіет з використанням параметрів за замовчуванням, описаних у прикладі 1. Використовуваними праймерами були:
СІРАОб-52: 5-САТТаААдатОсатАТТОАТАТСТО-3 (5ЕБО 10 МО: 155) і сіБАрб-аг: 5-
СТТоСААСААТАТСТТССАССАСТ-3 (ЗЕО ІЮ МО: 156). Реакції виконували в трьох повторах у загальних об'ємах-10 мкл, що містять 20 нг матриці у вигляді тотальної РНК, 800 мМ кожного бо праймера, 0,25 мкл зворотної транскриптази і 5 мкл реагентів мастер-мікс для ЗТ-ПЛР в один прийом. Умовами для зворотної транскрипції й ампліфікації були 4820 протягом 30 хв., потім 95205 протягом 10 хв., з наступними 40 циклами 9520 протягом 15 сек. і 602 протягом 60 сек.
Експресію з контрольного гена сафлору СіКабхі! використовували для нормалізації рівнів експресії ЕАОб. Розрахунки були зроблені, як описано в прикладі 1.
Цей аналіз показав, що СІРАЮб експресувався на відносно низьких рівнях у листках, коренях і на трьох стадіях розвитку зародків, що слідували одна за іншою. Низькі рівні експресії, відмічені в зародках, що розвиваються, не суперечили ідеї, що БАЮб може грати відносно незначну роль у десатурації олеату в насінні.
Приклад 10. Розробка і приготування генетичних конструкцій для сайленсингу генів біосинтезу жирних кислот у сафлорі
Шпилькові РНК (ШРНК) являють собою тип молекул РНК, які широко використовувалися для зменшення експресії генів у рослинах. Шпилькові РНК типово транскрибуються в клітинах рослин із ДНК-конструкції, що містить інвертований повтор послідовності, що походить з гена, який піддається сайленсингу. Таким чином, транскрипт у вигляді шпилькової РНК має повністю комплементарні смислову й антисмислову послідовності, що гібридизуються з утворенням ділянки дволанцюжкової РНК (длРНК), з'єднаної за допомогою послідовності петлі. Такі структури длРНК піддаються процесингу ендогенними апаратами сайленсингу в клітинах рослин з утворенням молекул коротких РНК довжиною приблизно 21-24 нуклеотиди, що відповідають по послідовності гену, активність якого зменшується. Ці короткі РНК можуть утворювати комплекси з ендогенними білками, які специфічно пригнічують експресію гена, що становить інтерес. Такий сайленсинг може відбуватися на транскрипційному рівні, з використанням метилування ДНК частин гена-мішені, на посттранскрипційному рівні за допомогою деградації мРНК-мішені, або в результаті зв'язування мРНК із інгібуванням їх трансляції і, таким чином, зменшенням синтезу білка, кодованого геном. Коли шпилькова РНК включає послідовність, що є загальною між членами сімейства генів, шпилькова РНК може пригнічувати експресію кожного з цих генів, що мають цю послідовність.
Сафлор має велике сімейство генів БАЮБ2, при цьому принаймні 11 членів були ідентифіковані, як тут описано (приклади 2-6). Сафлор також має множину генів, які кодують поліпептиди ЕАТВ, при цьому принаймні три члени були ідентифіковані (приклад 8), і принаймні
Зо один ген ЕГАОб був ідентифікований (приклад 9). Дійсно, у результаті експериментів, описаних вище, не змогли ідентифікувати всі члени сімейств генів у сафлорі. Для визначення того, які члени сімейства генів РАО2 і ЕАТВ брали участь у біосинтезі лінолевої кислоти або насичених жирних кислот, що виявляються в олії насіння сафлору, зокрема, пальмітинової кислоти, і того, чи був ЕАЮб також таким членом, було створено кілька генетичних конструкцій для експресії молекул ШРНК у насінні сафлору, для сайленсингу різних комбінацій генів ЕАО2, РАТВ і ЕАОб.
Кожна з конструкцій для ШРНК була розроблена для специфічної експресії в насінні сафлору, що розвивається, під час періоду синтезу олії. Це було здійснено, або використовуючи чужорідні промотори, або промотори, виділені із сафлору, для експресії конструкцій, що були введені в сафлор за допомогою трансформації рослин.
Конструювання рсСуубоо
Бінарний експресійний вектор для рослин був розроблений для експресії трансгенів у насінні, використовуючи промотор гена Оїезоїп1 Агарідорзі5 (примітка на УУер-сайті ТАЇК до гена Аї4д25140) (ЗЕО ІО МО: 52). Виділений промотор був довжиною 1192 п. о., починаючи з нуклеотиду 12899298 в ідентифікаційному Мо МСО0О03075.7, за винятком того, що, усередині послідовності довжиною 1198 п. о., б п. о. були пропущені, щоб уникнути послідовностей, розщеплюваних розповсюдженими рестриктазами, для сприяння стадіям клонування пізніше.
Промотор АЮіеозіп раніше використовувався для сильної, специфічної для насіння експресії трансгенів у сафлорі і видах Вгазвзіса (МукКкіїтогик еї аї., 1995; МапгоойЦеп апа Моіопеу, 1995). Цей промотор, імовірно, був діючим у двох напрямках промотором, керуючи сильною, специфічною для насіння експресією кодуючих областей, з'єднаних з обома кінцями фрагмента промотору.
Промотор олеозину Агабрідорхіє має загальні особливості з промотором олеозину Вгазвзіса пари5, що характеризується тим, що має двонаправлений характер (Задапапдот еї аї., 1996).
Промотор був хімічно синтезований, клонований у РОЕМТ-Еаву, і ЕсоКІ-фрагмент, що містить промотор, кінці якого були затуплені за допомогою реакції заповнення за допомогою ферменту фрагмента Кленова, лігований у сайт для Ніпаї!ї рсум265 після затуплення кінців за допомогою фрагмента Кленова (Веїїае еї а!., 2011), створюючи рСУуУбОО (АюЮіеовзіп: порожньо). Цей вектор містив ген - селектований маркер, що кодував гігроміцин-фосфотрансферазу (НРТ), що дозволяє, таким чином, здійснювати відбір на предмет стійкості до гігроміцину в культурі тканин під час процесу трансформації. Вектор також включав 355:ген СЕР, що дозволяв здійснювати бо відбір трансформованих клітин і тканин відповідно до флуоресценції при ультрафіолетовому освітленні. За допомогою вбудовування промотору Аіеозіп був розроблений вектор для експресії кодуючої області, що становить інтерес, яку можна було вставити в сайт множинного клонування, розташований 3' від промотору і 5' від сигналу поліаденілювання поз (по53). Цей вектор служив як базовий вектор для конструкцій РСМУбО2 і рСМубоЗ, описаних нижче.
Конструювання рхАР410
Промотор лініну льону (патент США з Мо 7642346) (5ЕО ІЮО МО: 53) був вставлений у вигляді
Мот-ХпоІ-фрагмента в бінарний вектор рГ7-НЕГ І ЗСАТЕ12 (УМезіеу еї а!., 2001), створюючи
Саїємжау М, що приводить до сайленсингу бінарний вектор рХх2РА10. Вектор рХхАРА10 містив ген - селектований маркер, що додавав стійкість до канаміцину під час культивування тканин, і уможливлював специфічну для насіння експресію конструкцій для шпилькових РНК під контролем промотору лініну. Вектор мав два інтрони, один у смисловій орієнтації, а інший -- в антисмисловій орієнтації відносно промотору, і мав сайти для рекомбінази АШ1 і АН, фланкуючі інтрони.
Для створення конструкції, що приводить до сайленсингу, виходячи з рХхАРА410, дві копії послідовності з гена-мішені в (заїеул"ау вихідному векторі, експресія якого повинна бути пригнічена, були вставлені у вектор, одна вставлена 5", інша - 3' від двох інтронів, у зворотних орієнтаціях один відносно одного, з утворенням інвертованого повтору. Сайти для рекомбінази дозволяли швидко вставити дві копії, використовуючи систему для клонування з використанням рекомбінази Сагемжау (Іпмйгодеп, Сагізрай, США), як описувалося раніше (У/евієу еї аї., 2001).
Цей вектор рХАР410 використовувався як базовий вектор для створення рСУуб31 і рСУуб32, як описано нижче.
Конструювання рему571
Послідовність довжиною 300 п. о. (ЗЕБО ІЮ МО: 50), ідентична району гена СІРБАТВ-3 сафлору, що відповідає нуклеотидам 485-784 КкДНК для СІБРАТВ-3, була хімічно синтезована і вставлена в РЕМТЕ/О оро (Іпмігодеп) відповідно до інструкцій виробника, створюючи Сагемжмау вихідний клон, позначений рСМуУ569. Фрагмент розміром 756 п. о. (5ЕО ІЮ МО: 49) кКДНК для
СІРАО2-2, що відповідає нуклеотидам 427-1182, був синтезований і ампліфікований за допомогою ЗТ-ПЛР, виходячи з РНК, виділеної з насіння сафлору, що розвивається.
Праймерами були 028-Рваї-5 (5-ССстасСсАаатАССААтТасстоаАСаАСАСТа-3) (БО ІО МО:
Коо) 157) і 028-Ав5сІі-3 (5-сСссаСсасассТТСАССТОСТСАТСТТТАТОСО-3) (5БО 10 МО: 158), відповідно. Праймери включали 5' сайт для рестриктази РЗї| і 3' сайт для рестриктази АФвсі, у такий спосіб що дозволяють вставити ампліфікований фрагмент у відповідні сайти рСМу/569, створюючи рСМУ570. Цей вектор містив складені райони з генів СІРАТВ і СТЕАЮО2-2 у вигляді фрагмента розміром 1080 п. о., фланкованого сайтами для рекомбінази, АНІ і АНІ 2. Дві копії цього фрагмента РГАТВ-РАЮБ2-2 потім були вставлені в рХАР410, друга копія інвертована відносно першої, використовуючи клоназу І К відповідно до інструкцій постачальника (Іпмігодеп,
Сагпізрад, США). Результуюча плазміда рСмуУ571 містила промотор лініну льону для транскрипції району у вигляді інвертованого повтору специфічним для насіння способом, щоб продукувати
ШРНК для зменшення експресії генів СЕРАТВ і СЕЕАОЮ2-2 у насінні.
Конструювання рсСуубоз
Фрагмент ДНК із рСуУу571, що містить інвертований повтор фрагментів СЕЕАТВ-СІЕАО2-2 із двома проміжними інтронами, був вирізаний за допомогою 5реї, затуплений, використовуючи фрагмент Кленова | ДНК-полімерази, і лігований у сайт для ЕсокЖМ рсУубоОб, створюючи рсУубОЗ3. Ця конструкція РСМУбОЗ була здатна експресувати ШРНК під контролем промотору
АОеозіп у насінні сафлору, для зменшення експресії СІЕРАТВ і СТЕАЮ2-2.
Конструювання ремуза81
Фрагмент розміром 590 п. о. (ЗЕО ІЮ МО: 51) ДНК, що складається з фрагмента розміром 290 п. о. СІЄАЮб, що відповідає нуклеотидам 451-750 кКДНК для СІБАЮОб, і фрагмента розміром 300 п. о. СІЕРАТВ, як і у випадку РСУМ571, був хімічно синтезований і вставлений у РЕМТК/О горо, створюючи рСМУ579. Фрагмент розміром 780 п. о. СТЕЕАЮ2-2, описаний вище для рСмМу570, був клонований у сайт для Авсі рСМ/579, створюючи роСУУ580. Ця конструкція була вихідним клонованим вектором, що містить послідовності з генів СІЄАТВ, СІЕАОб і СІЕАЮ2-2, з'єднані в тому ж порядку, що і у фрагменті ДНК розміром 1370 п. о. із фланкуючими сайтами для рекомбінази, АНІ 1 і АНІ 2. Дві копії цього фрагмента ЕАТВ-РГАОб-ЕАО2-2 були потім вставлені у вигляді інвертованого повтору в рХхАР410, використовуючи клоназу ГК, створюючи рСсуу581. Ця конструкція рСУМ581 являла собою бінарний вектор, що містить промотор лініну льону, функціонально зв'язаний з інвертованим повтором, який після транскрипції в клітинах насіння сафлору, що розвивається, був здатний експресувати ШРНК для зменшення експресії генів
СІЕАТВ, СІЕАЮб і СЕЕАЮ2-2. бо Конструювання рсуУубог
Фрагмент ДНК, що містить інвертований повтор з'єднаних районів СІЕЕАТВ-СТЕАОб-СТЕАО2- 2, із двома проміжними інтронами, був ферментативно вирізаний з рСМУ571 за допомогою Мої, затуплений, використовуючи фрагмент Кленова І, і потім лігований у сайт для ЕсоМ рсуубоо, створюючи рСУУбО2. рсМуУбОо2 містив послідовності СІЕЕАТВ-СТЕАОб-СТІРА02-2 під контролем промотору АЮіеозіп, на відміну від РСМУ581, що мав ту ж конструкцію і ті ж фрагменти генів за винятком промотору лініну.
Конструювання реСмуба31 і рСМуУб32
Хоча промотор лініну був застосовний для експресії ШРНК у насінні, ії рСМуУ571, і ресмуз81 містили селектований маркер, що надавав стійкість до канаміцину. У попередніх експериментах, які стосуються трансформації сафлору, автори даного винаходу відзначили, що експланти не були в достатній мірі чутливими до канаміцину. З цієї причини генну касету стійкості до канаміцину рСУУ571 і рСУуУб581 замінили генною касетою стійкості до гігроміцину як ген селектованого маркера. Ген стійкості до гігроміцину, що складається з промотору епСсИиР'ген стійкості до гігроміцинуграйон поліаденілювання по53, вирізали з рСМ/265 за допомогою розщеплення рестриктазами ре! ії АмгіЇ і використовували для заміни касети стійкості до канаміцину в рСУМ571 і рСмузат1, у такий спосіб створюючи рСуУмМб31 і 632, відповідно.
Підсумовуючи, конструкції, використовувані в цьому першому ряді трансформацій сафлору, містили наступні основні елементи.
Фрагменти генів вінвертованому новторі
Бектор Промотов розі гена лініну СТАВО-2 Я СІТАТВ рОувзо тена дініну СТАРІ СКАН ОО СТРАТВ робо ліІСНеовій СА, СТРАПЮ 1 СІЕАТВ рема Ащкговіп СТАПІ-? її СІКАТВ
Ці конструкції вводили в штам АС 1 Адгобасіегішт і використовували для трансформації сафлору, як описано в прикладі 1, з наступними результатами.
Приклад 11. Трансформація сафлору конструкціями, які приводять до генного сайленсингу
Геномні конструкції використовували для трансформації витягнутих сім'ядоль і гіпокотилей сорту 5317 сафлору, використовуючи спосіб з використанням Адгорасіегішт, з порятунком генерованих паростків, використовуючи трансплантацію (Веїйде еї аї.,, 2011). Понад 30 незалежних трансформованих паростків, вирощуваних на нетрансформованих кореневищах (які нижче називаються рослинами То), було регенеровано у випадку вектора рсуубоз і
Зо вирощено до досягнення зрілості, як описано в прикладі 1. Інтеграцію Т-ДНК у пагони сафлору
Топеревіряли за допомогою ПЛР, використовуючи специфічні для векторної Т-ДНК праймери, як описано Веїїде і ін. (2011). Більшість рослин, у яких, як виявлено, була відсутня Т-ДНК, використана у випадку конкретної трансформації, що продовжували "вислизати" від відбору за допомогою гігроміцину під час регенерації в культурі тканин, були забраковані. Однак деякі з них були збережені як "нульові" рослини або негативні контролі для порівняння з трансформованими рослинами. Ці контрольні рослини обробляли в тих же умовах, що і трансформований матеріал в умовах культивування тканин, трансплантації і таблиці.
Приклад 12. Аналіз жирнокислотного складу олії з насіння трансгенного сафлору
Аналізи жирних кислот проводили на окремому насінні Ті, отриманому від трансформованих рослин сафлору, як зазначено нижче. 30 незалежних рослин То, трансформованих рСуУубоОозЗ на генетичному фоні 5317, вирощувалися в теплиці і самозапилювалися для утворення насіння.
До 10 зрілих насінин з однієї насінної шапки від кожної рослини То аналізували відносно складу ліпідів, використовуючи аналіз за допомогою С, як описано в прикладі 1. Результати аналізу жирнокислотного складу насіння сафлору, 5317, трансформованого рСсуУубозЗ, підсумовані в таблиці 13. Оскільки кожна трансформована рослина сафлору То, як очікувалося, є гетерозиготною по Т-ДНК ї, отже, породжує популяцію насіння Ті, що розщеплюється, передбачалося, що аналіз 5-10 насіння від кожної рослини буде включати деякі "нульові" (сегреганти) насіння. Такі насінини-нульові сегреганти були хорошими негативними контролями в цьому експерименті, оскільки вони виросли і розвивалися в тій же насінній шапці, що і трансформовані насінини від тієї ж рослини. Як можна помітити, виходячи з даних, представлених у таблиці 13, рівні олеїнової кислоти, що перевищують 87 95 (у вигляді вагою від загального вмісту жирних кислот), відзначалися в 6 незалежних лініях (лініях 9, 12, 14, 20, 34 і 36) з 30 регенерованих ліній. Багато трансформованих насінин мали вміст олеїнової кислоти в діапазоні 87-91,7 96, з рівнями лінолевої кислоти, що становлять 2,15-5,9 95, і рівнями пальмітинової кислоти, що становлять 2,32-3,45 905. Рівні інших жирних кислот у насінні не відрізнялися значно від нетрансформованих контролів. Максимальний вміст олеїнової кислоти, відзначений в насінні сафлору Ті, що трансформовано рсуУубозЗ, становив 91,7 9о, порівняно з приблизно 7795 у нетрансформованих контрольних насінин 5317 і насінин-нульових сеграгантах. Примітно, що ліпіди в насінні були також значно зменшеними по рівнях 16:0, зменшуючись з 4,595 вниз до 2,3 95. Профілі жирних кислот фракцій ТАС олій з насіння, очищених на пластинах для ТІ!С, не відрізнялися значно від таких для всіх ліпідів, екстрагованих з насіння.
Два показники розраховували на основі загального жирнокислотного складу насіння сафлору, беручи до уваги найважливіші жирні кислоти в олії з насіння. Ними були частка десатурації олеїнової кислоти (ООР) і значення відношення пальмітинова кислота ж лінолева кислота/олеїнову кислоту (РІ 0). Їх розраховували для кожного насіння, і дані представлені в таблиці 13. Насінини дикого типу (5317, нетрансформовані) і нульові сегреганти мали відношення ОЮР, що становить приблизно 0,1500, і значення РІО, що становить приблизно 0,2830. Насінини, трансформовані Т-ДНК із рСУубоЗ3, продемонстрували значні зменшення значень ООР і РІО. 13 насінин, регенерованих з 6 незалежних випадків, мали значення РІО, що становить менше 0,1, і ООР, що становить менше 0,06. Одна трансформована лінія мала
ООР, що становить 0,0229, і РІО, що становить 0,0514.
Зрілі окремі насінини однієї елітної лінії, 5317, трансформованої рсСуУубоОЗ, рядок 9, і нетрансформованої родової лінії 5317 були піддані ліпідомному аналізу, використовуючи І! сС-
М5. Ці аналізи ясно показали, що олія 3 насінин, трансформованих конструкцією
АЮІеозіпр:шпилька СІЕЕАТВ-СТЕАЮ2-2 для РНК-інтерференції, мала істотно змінений склад ТАС і САС (фіг. 11 і 12). Відзначалося очевидне збільшення рівня ТАФ(54:3) і зменшення ТАС(54:5), які являли собою в основному 18:1/18:1/18:1-ТАС (триолеїн) і 18:1/18:2/18:2-ТАС, відповідно.
Серед насінин, проаналізованих за допомогою І С-М5, вміст триолеїну (-54:3) у ТАО становив до 64,6 95 (мольбо) при найвищому рівні олеїнової кислоти (290 95, таблиця 14) для насіння з лінії із сайленсингом за допомогою РНК-інтерференції, порівняно з нетрансформованим (5-317) батьком, що мав рівні триолеїну, які знаходяться в межах 47 95-53 95. Другим ТАС, що містить олеат у найбільшій кількості, був 18:0/18:1/18:1, а потім 18:1/18:1/18:2. Найбільш очевидну
Зо різницю між цими оліями сафлору можна було також відзначити для ліпідного класу ВАС.
Рівень ОАС(36:1) був подвоєним в олії з трансформованого насіння порівняно з батьківським насінням, у той час як ОАдО(36:4) був зменшеним на аж до 10 95. ЮАС(36.1) являє собою в основному 18:0/18:1-ЮАС, а ОАС(36:4) являє собою 18:2/18:2-0АС (дилінолеат). САС у ліпідах насіння були лише мінорним компонентом, оскільки рівні всіх ТАС були в приблизно 100 разів вище таких усіх ПАС (таблиця 15).
Ріст і морфологія трансгенних рослин
Трансформанти сафлору То, які містять Т-ДНК із рСМуУбОозЗ, утворювали насіння Ті, що розщеплювалося по Т-ДНК, даючи сукупність гомозигот, гемізигот і нульових сегрегантів.
Співвідношення цих субпопуляцій залежало від числа і зчеплення подій вставки Т-ДНК у рослинах То, як і очікувалося відповідно до менделеєвської генетики. Тому насіння Ті від рослини То було проаналізовано окремо. Аналіз профілів ліпідів з окремих насінин ясно показав, що окремі насінні шапки містять і нульові, і трансгенні випадки.
Таблиця 15
Жирнекислотний склад ліпілів у окремих насінннах сифлору Ті, трансформованих 1 ДНК вСхувОоз на фені 5-317,
Тівнь кожної жирної кислоти (95) представлений у витглялі препента віз загальнота вмісту жирних кислот
Зразкова сво, сіва | сіваан | ства | сів: сю | сю моє орв
БЗГНО) -ь- Се 1 13727 20555-1 60611545 065050 005317656 15 БІЯЮ. 5317031 46147 | 79705 б 1509 1 000. ..032 ). 028 1025620) 01638 5370) 5 138 | 7620 | 068 1614 | 0 п32 |. -926 | О2Лв1 бі 8 071 Я 10157. 7641. 069. 561 006 034 | 026 026506) 61605. 5376) 435 51 07750 оба 1428 1 006 033 | 025 1024176) 01549, тет СЕЛО 7807 1085 | 1382 00 038 3 000 | 023815. Кия
Нульжийсї 516760 вок а 1355 06. 0,38 0.28 | 0.26942| 01698 фпутювтй с 4-8 ни нен 41565 000 045 000 028302 01726 еле) 1 Я6Е 165 1 7652 | 078) 1358 000 ) 035 0 028 023163) 0147 во НН НБН пе о» 96 ою 328, 56031305) 2-56 205973 0841 215 1 000 0.37 029 1003136 пла 13605098, ях (б ооо 020 1034 905911 00396 1Т8603.09 (5) ни 266 | 243 Я 00781 245000 1 027 ) 000 |0.05587| 00561 75693.09 0) аа 16 1 Я ом 302 1 000 |.023..033 00597. кт ви 2.05 915 067 3. 525 000 045 1 039 005379) бом 56036 273 177. 19053 069 1 336 000 036.) 032. | 006728| 00358 5603200 18941131 8963 0 ОЖВ 14580000 031) 034 008393 | 00486, 321255 8903 049. 295 000. 04 635 10007 6016 1560314 02) а ТЯ песттвнь 4.39 1 000035 034 008257 00468 15603.09(3) | 990 | 175 8000. 083 | 552 | 000 0.00 000 0609465 00584 15603340) | 336 | 223 8892 1 085 389 000 | 043 | 032 |008І5Р 004 15603342) | 324 1276 858.74 1102 | 451 | 000) 037 0.37 4608725 | ОВ, Т56093.14 321 Т.5і 858.65 0.85 | 505 ) 000 ! рі | 037 009310) 00539
Бетон, Мен катки в: шо ши ше в ОрСОхх ДОБРА, (15603203) 3-29. |. 1.39 8844 | 0ОК | 550 | 000 | 600 000 1010591) 00625
ІВбО3 1200) 340 163 В64 075. з свою 635. 15003200) 345 3 166 | 8836...099.3.5.4 000. ою 000 2010173 1.00590. 56032001). 330 | 146 1 8816 | 089. 553 00 | 933 о 010021 00590. ї5003.14(5) 1. 3,45 166 8743 | 087 | 588 1 000 736 і 035 010673 00630 -ІБбО3Л4() 010337 | 1841 8736 058581 1 000 10357 535 00624 15603364). Не елИ 87.33 0.67 5.50 000 | 042 030. ше 80.0603 18603.3603) | 349 233 | 86.82 5.68 | 000 05 0.32 010591 00614
Т563.14(3) | 355 | 161 | 8650 | 086 ! 674) 000 1 036 0.35 1011931 и ї5603.124) 3681139 й5дб 00525 797 000 029 0 030 013624 00853 56031123) 335 | 206 85011 074 | 802 | 0001 035.1 027. 10156091 00862 78603235) 1 493 175 | 8863 01441 875 0 000 | 0410031 016561) 00958) 15603905) 68157 8506 070 10371 0007633 031 018339) 0.3 5603170) 441 11310894 00068 | 606 658 638 61550) б
ЇВ6О323403) 1824 517 ВІЛО 00681098 000. 045 027.
Т560324(5)4481 348.1 150291 10561 0001 0411027 ФЕЯ ЛО
Іво ов 16 юЮБЕ ою лок обо о 035 блвв69о1В5 15603234) 134 | 201 | ВоЖ6 | 083 1123 00 | 040 1 0295 019313 01220.
ТБбО324 0) 239.1 00 | 065 | 10751 000 1 044. 026 б 01180 т8603417 (3) 4.60 1.75 ) 8065 | об | 11691 000 035 1 027
Т5603281) 0428 201 | 5054 | 60 1351 000 00 027 019632 01255. 15603.17 (23 405 Же о уник нн 15603060) | 438 11.60 | 85022) О88 0031 1 000 | оз |В 020803 04336.
Т5603615)..452. 147.1 80111 0841330 000 -25. 13 ТоЗ 01350
І5603150) | 465 1201 1794) 0851192 | 000 | 035 ) 026 020720 01297.
Т5603.3443). 477 | 244 воли шсни 000 045 Ї 0.28 00281 01252
Бозі 3 1 ОВ 1 068 10124 1 000 | 043 1 026 (0.202538) 0125 зе 000 Сб обівю росія | сСівнат і сСі8:22 | Сі83 1 Сни оси ГРО | Орвех ни шишшши Шш Во МИ МАК ОН ПО ПИ 15603063 000449 10189 | 7953 | 082 1261 1 000 | 038. 029 пе ЕСЯНяЕт 15603230) 447 | 174 7945) 036 1256 000 | 035 б 021ЖІ0) 01493 тво 74 135 соя 006 1 041...04юЮ. 021554 01325
ГТБ603 В 00047300, Т94А2 10045 1226 | Ю | 043 1 000 021390) 01337. 15603240) 504 | 196 7937 | 097 1206) 000 000 000 022301| 01376 15603282) 1 495 216 | 7933 | 088 1229 | 00 039000. отв взяІ -Б60І5 85073383 0006Я9 | 1280 | 00903607. 1021585. 0.359
Т5603.06(4).......460.3..173 7923 058 | 12951 000 | 033 028 05521 01403. твбозі5) 14301 7 ож 012791 0001 039026. 0215691 61355
ТЗООЗІ2И) ОО 428 1 133 179085 1076 | 13582. 0 п 035 Гола в їЇ56030602) 465 1 224 | 79051 08 11955 | 000 042 027. 021765) 01373
Ї5603.0900). 439 17 | Ю | 0731330 049) 0341 030 0224531 01462.
ІББоз ау 1456210 7863 0079) 1324 1 0009639 027 022648 | ол
ОСТІ ПР ШЕ ХО ШЕ СЯ я Толя 113951 0377 37170361 033386 1540 15631501 1199 Я 08) 38) 000) 036 | 026 023135 фі
ТБ ВО СЯ 6 ВЗ В 39 03 00053031, 025508 бат. 8603340) 10465 | 213 07775) 0831355 00351 041 | 030 02341) 01519 4 15603.23 (3) 3 70 728085 4631 031 1 036 998 024866. 01620
ІБ во 1 Я 13108 аж 0.00 0.35 027 1025302) ФІ)
УЗразки, помічені з викорвстанням пього умовного позначення: 15501515) означає рослюну, транеформовану вектором рОХИООХ, випадок 13, насіння 3, Зразки. помічені лу енудьюовіх. визначені з використавням аналізу з допомогою ПЛР як нетравеформовані «вислизуванияє при твансформанії рослин.
Показник РІО. розрахований як ПОЛІ ВІІВІЙИЇ
ЖЖ Покааник СПІР, розрахований як ІІІ РАІ ІВ Я
Таблиня 14 жирнокислоний склял всіх типів лінідів одного насіння (95 від загального вмісту жирних кнелаті 8317 Насдния | 5.21 32 7730 8 1420 ою по СЮ 5317 Насіння З 5.8 ЗОО77.20 ОО 013.55 000 ооо 00 5317 Нжаіння З 50 2055 89 Ов 1567 ою 00 0ОЮю
Т5603,9 Насіння | 3.76 307 5753 ої 434 юю 00 (мю
Т5003.9 Насиня 2 3.33 2.58 ЩО 093 р ою 00 ОО 756030 Насіння 4 3.6 2 55.20 07 305 (щю 00 щю 156039 Насіння 5 зе 313 58.45 02 3.38 ою 0.50 Гея;
ЕСЕ ИН ИН НД Но НИ
Таблиця їх
Нізносна кількість ТАСіБАЄ
Зразок Відношення ТАОЮАО 51317 беей | бо 5317 5ессй 2 547 5317 сей 3 71
Т5605.9 Насіння | 117.5
Т5ОО5.9 Насіння 2 154.7
Т5603,9 Насіння З 97.8
Т5803,9 Насіння 5 96.5 5604, Насіння 6 95.2 5 ппллалаалаааааа Ак аки и
Насінини від деяких із трансгенних ліній вирощували в контрольованих умовах (температури, грунту, оптимального поливу і внесення добрив, але при природному освітленні) у теплиці для дослідження морфології і швидкості росту рослин. Фенотипічні розходження не відзначалися між трансформованими рослинами Ті і їх сибсами - нульовими сегрегантами.
Трансформовані насінини проростали з тією ж швидкістю, що і нетрансформовані насінини, і давали проростки, що мають однакову початкову швидкість росту проростків (силу). Усі посіяні насінини укорінювалися і виростали в повністю плодоносні рослини. ДНК екстрагували з верхівкових кінців відповідних листків окремих рослин покоління Ті, і аналіз за допомогою ПЛР проводили для визначення співвідношення нульових і трансгенних рослин. Як і очікувалося, були ідентифіковані нульові сегреганти.
Цей фенотипічний аналіз показав, що рослини сафлору, які трансформовані Т-ДНК рсуУуУбоз і експресують трансгени, не страждають від яких-небудь шкідливих ефектів порівняно з нульовими сегрегантами.
Насіння сафлору покоління Тег перевіряли відносно олійності. Насінини від декількох рослин з високими рівнями олеїнової кислоти (таблиця 13) вирощували в зрілі рослини, що утворюють насінини другого покоління (насіння Т2). Ці насінини збирали при досягненні дозрівання й аналізували відносно жирнокислотного складу їхньої олії. Дані представлені в таблиці 16. Хоча насіння Ті продемонструвало аж до приблизно 92 95 олеїнової кислоти, у насінні Т» досягалося 94,6 95 олеїнової кислоти. Відзначене збільшення в поколінні Т2 порівняно з поколінням Ті могло бути обумовлене гомозиготністю трансгена, або просто великим числом проаналізованих ліній.
Аналіз за допомогою блот-гібридизації по Саузерну використовується для визначення числа вставок Т-ДНК у кожній трансформованій лінії, і лінії з однією вставкою Т-ДНК відбирають.
Олійність насіння Т» не відрізняється значно від таких контрольних, нетрансформованих насінин з тим же генетичним фоном і вирощених у тих же умовах.
Аналіз насіння сафлору, трансформованого Т-ДНК із рСуУуб31.
Насіння Ті сорту сафлору 5-317, трансформованого рсМУуУб31, аналізували так само відносно його жирнокислотного складу. У таблиці 17 представлені дані і показані ООР і РІО для цих насіння. Вміст олеїнової кислоти в ліпідах цих насінин становив аж до 94,19 95. Вміст пальмітинової кислоти в насінні 5631-01 Т1 (21) з найбільшим рівнем олеїнової кислоти становив 2,43 95, значення ООР становило 0,0203, і значення РІО становило 0,0423. Ці аналізи показали, що конструкція для шпилькової РНК у рСУуб31, як правило, породжувала більш високі рівні олеїнової кислоти, ніж конструкція в РСМУбОЗ після трансформації в сафлор з генетичним фоном 5-317. Ці дані спостережень означали, що промотор лініну, використовуваний у РСУУб31,
Зо експресував шпилькову РНК сильніше або з кращим узгодженням за часом експресії, або і те, і інше, порівняно з промотором АЮіеозіп, використовуваним в ремубоз.
Насінини Те» сорту сафлору 5-317, трансформованого Т-ДНК із рСМУб31, були проаналізовані за допомогою ОС. Відзначалися рівні олеїнової кислоти аж до 94,95 95 зі значенням ООР, що становить 0,01, і значенням РІО, що становить 0,035.
Насіння і рослини сафлору, трансформовані Т-ДНК із конструкцій рСУУб32 і росуубог, аналізують так само, як і насіння, і рослини, трансформовані рСУУбОЗ ії рСсУуб31. Аналіз за допомогою ОС насіння Ті сорту сафлору 5-317, трансформованого рсууб632, показав, що рівень олеїнової кислоти становить аж до 94,88 95, зі значенням ООР, що становить 0,0102, і значенням РІО, що становить 0,0362. Їхні насінини Т»2 продемонстрували аж до 93,14 95 олеїнової кислоти, зі значенням ООР, що становить 0,0164, і значенням РІО, що становить 0,0452.
Екстракція більш великих об'ємів олії з насіння сафлору
Насіння ТА від гомозиготної трансгенної лінії, позначеної Т5603-22.6, збирали, і всю олію з насіння екстрагували, використовуючи пристрій Бохпієї як описано в прикладі 1. Аліквоти екстрагованої олії аналізували за допомогою (С (таблиця 18). Всього 643 грамів олії було виділено. Екстракції 2, 3, 5, і 6 об'єднували, у той час як екстракції 4, 7 і 8 об'єднували у відособленій серії. Суміші надалі аналізували відносно жирнокислотного складу за допомогою
СОС. Ці дані представлені в таблиці 18.
Приклад 13. Розробка і приготування додаткових конструкцій, які викликають генний сайленсинг
На основі результатів, описаних у прикладах 10-12, інші конструкції, які викликають генний сайленсинг, були приготовлені, як зазначено нижче, для збільшення вмісту олеїнової кислоти в олії насіння сафлору і зменшення відношень ОР або РІО. Ці конструкції, які викликають генний сайленсинг, включали сполучення різних промоторів, з несафлорових джерел, а також сафлорових джерел, для досягнення максимального зменшення експресії генів ЕАЮ2-2, ЕАТВ-3 і БАЮб сафлору, і, крім того, сайленсингу більш ніж одного гена БА02, крім ЕАО2-2. Ці конструкції використовують для трансформації сортів сафлору, що мали інактивовані варіанти ендогенного гена СІЕАЮ2-1, таких, як 5-317, Сіапо-ОЇ і І езай496.
Конструювання рем/700
Цей бінарний експресійний вектор для рослин містить два чужорідні (несафлорові) промотори з різними, але такими, що перекриваються, картинами експресії у насінні сафлору, а не один промотор, для утворення шпилькової РНК для зменшення експресії ендогенного
СІЕАТВ і СТЕАЮ2-2. Двома промоторами є промотор АЮШЮіеобвіп і промотор лініну льону, і дві касети для експресії шШРНК знаходяться в одній і тій же молекулі Т-ДНК. Цей вектор конструюють за допомогою вирізання рестриктазами касети для експресії гена для шШРНК із рсууб31, що містить промотор лініну й область, що кодує ШРНК для сайленсингу СІЕЕАЮ2-2 і
СІРАТВ, і вбудовують її в Т-ДНК рСУуУбОЗ, у такий спосіб створюючи конструкцію, що кодує шпилькову РНК, спрямовану проти цих двох генів сафлору. Цю конструкцію використовують для трансформації сортів сафлору, таких, як І езай496, Сіапо-ОЇ і 5-317.
Тайлиня 16
ЖжЖирнокнелоний склад ліілу з окремих насінин сафлеру ГТ» трансформованих ТЛ НК реа на фені 5-37. Рівень кожної жирної кислоти (бо) представлений у вигляді процента від загального вмісту жирних кислот.
Зразок Си сів ОсІ8Я сво сі СОР собі об Мо
По КЗ 24 це зе ІЛ оо ча ща НИК ще
ТУШ ЗХ ІЙ вок з по по во ОМЯ олаю
ТЛ г з по щі 24 по НЕ щооплова ОО
ТЗ ві 14 Ід 3 23 по НА ЩО ОБОХ
ТАТІ 12 15 ща ІХ по НО БЕ ООщЩЮ УЮ
Не М ЕП Том І: Уа ТА по НИ Що мож щем
ТУКА 32 Ії що Зі по НЯ ЩО ОА
БА во І 519 ра Це НЯ Щаоплж ОДУ
ТОЮ ох Із 532 з по НА ЩО НОМ (е2О аа ТЯ на ЗВ І що рл, о НИЄ НВ щЩНЯ ЛюМХ
Км ВМ ро ІЗ УА їй п Нм ЩО ОО
ТІВ ТІ 13 щХ 17 по НА ЩО) ем
ТВ о 0025 до тА ря од НИ ща Оля БАК
ТАТО 35 Іх щл 19 НЯ НЯ ЩЕ НО поХ
Ва з 12 Ж 23 по НИ о ЩО Олю
Те рах І МАКИ ій по НК ЩЕ (ОУН
ТМЦ. ра Ох ща 33 де НА .щР щока
Тло То Й за ІЗ 515 ря по Уа ЩО О0О5КХ
ТУКА 35 Що 545 за по НА ФОН (5
ТВА А ТІ ЗІ З ТК) 915 ку ЦІ Шо а оплмя ООН
ТЕО З М йо 55 За по НИ ЩО 005925)
ТТН І 4 з по по вп щОМм почо
ТБ М йо АК Та пе ИН о НО Од
Зразек спе св св ско сва Ом Є ож Мо
ТВ 12 2 16 934 5 Пл НАЙ по мот БМ
ТО Т215) 15 933 24 по по що бота
ТУТ 023 ІН 93 33 Це НВ па мох БНО їм М за 12 93 28 до по ЩО ОК
ПЕТ вмеви МВ ЗА ІЗ 913 23 до 0 Па МохУ ОО
Тех З Ге. А з до НАВ пи шуб Ок
ТА ТЕ ВІ М 1 93 М по па ЩЕ щем Не
ТБ) 002 12 34 25 по Н моих
ТАТА) 24 Із щі КА до НА що ОМ а3Ю МК
ІБ ІВ 13 Ух 38 оо 0 ЩЕ ОООДМХ
ПЕК МІВ М 15 КАН МУ по па ПО ЖХ щОМОБИ ен У МИ 14 93 ЗА до 02 Я пан о по
ТЯ ХК це 939 М по В пх ОДНО ОН
Та) 003 ІН 929 М пл йо по мая Ж МХ 10 938 13 М 02 ЦО ОО МБ тая 0029 пх 92 32 до 0 ПО дме БУ 5 зл Що ща зе о НА ща ЖІ
БА (З 26 І: ща 3 пе да пп о ОДек О0бв
ГТ М НК) це 913 Кл по що ЩО ООБМеХ
ТІ ТП) ра ІН! що М 02 НА мМ щаМ щюМІ
БА 33 14 А М НЯ ША пж ол 5 ю
Пет кнане м ВИ; ми 14 ща 23 по 3 Ж ОБУ ОщУ
Те ТЯ) ЗА 65 чай 44 що НА ЩО щем щу
Т5ОАНО ТІ в М 935 34 зо 05 ОПО ОБУ
ТИХ ТЯ ГІ 19 М ща 15 по по мак щеня
-разок сю сСвю СВІ с82 с со сю ОБ Мо
ТАТА ТІВ З 2 иЖу за о ща 04 пох ОК
Та АТ 5 3 ІЗ озА 39 по ЩІ пк ЛюЮМа
ТАТИ 3 М 3 Ки по що па аю ОО та з 14 94 14 ПН ЩА по бе опбю
ТВА УТ) за В 924 19 о 4 по КОВО 13 Я 17 а 3 до пі пл аю опа
Пса ВЕН НИ їй Фі 3 до М 01 ою ож та ТО 34 2 да ю по ві ЩО оч ОКІКвІ 16 10 о ЗІ Пі; І по аа МТ
ТБ ТТ 15 ЕЙ. 934 4 до по по Оп те КТ 23 16 да М по 03 п ВІВ ЛВ
ТИ 301) 08 пз 915 19 о по па бімб опе
ТИ 30 п. 919 щі (й ЩЕ ЩО пл
ТЕ ІЗ ТА 14 1 14 Ще по Машею
ТАТ 10 ЕН! 917 ЩІ ІН ЦІ (по пі Оп
ТОЛК ТІ А 23 І чл юЮ о Б па олюз поома та АТ 33 13 1 30 по па пл ІН щеНх
ТЕ ТО 34 16 914 34 Її па 04 НЯ пдею
ТАКТ 14 13 915 19 до ЩІ 04 че ООН тела 24 14 915 М (й п3 пх о ОЛчо 15 з 16 ФА Ка по ЩЕ появ тю
ТОБ ТТІ І 13 14 43 до ТНК до ВРеХе тб 4 19 14 Я ПІН Гн о ВІ; ЦІЮ М
Т5ЩВ-1 3 ТО З 15 щ12 34 ПН НН по він ие
ТВ 3 024 13 92 г! Що щ паю ЛО
ТВА 38 ІВ КІН; 43 02 (ЩЕ РО ЩО Ні
Там ОА ТВ за І то КУ 0 3 Ва щМяВ ОО
ТЯ АЛ ВНІ ІЛ 05 44 Пд ЦЯ НЯ: ЩО НяУМ
ТаБОВ-27 5 ТІ М І що 3 Пе (З ва НМР бот там юЄТ 21 І 90 45 й (р МЕ НК ОО ша ий ОМ ІЛ 5 40 по ї- БА ЩО по
Та х 3 в 3 3 (з (8) ЩО щу 913 тав 5 ІХ 5 42 І З п3 щи МК тат 03 22 я Ко; по ща ща ЛОЮ
То 35 ІЗ 3 33 І ЩІ пу ООБОЮ
ТО мая 025 3 що 4 0 1 па НХР ТК
Те В 1) 1Х ІЗ 00 10 по З па пом
МТ А зу МЩЮ 1198 що 0 ОО 011 пох уче 477 зв ов ОО пю КО 0 ШО пр УМ
Ні 45 18 1408 що 0005 05 во
НТ 481 155 щ5ю 5 що 05 08 плям ов
Таблиця 17
Аналіз жирнокислеотнего складу лініду з екремих насінин сафлору І. трансфермованих 1 ЯНЕ ВС на фоні 5317. Рівень кожної жирної кислоти (95) представлений у вигляді пронента віл загального вмісту жирнинх кнелот.
КАМЕ Зразок Сів обібР Сів Сі Сів? Со Си: См ОР Ро 96 Т5631М (21) 243 біз 1.06 9 156 0.24 0.39 027 доз оо?
Фі2 т5630Е ТІ? 23760 КІ? 93.73 187 0.23 0.34 019 00230 Фо 913 5631-0105) 02570 0.07 93.27 2.56 022 0.38 6.9 0.0305 00550 827 5631-0116) 025000 1.04 93.24 2.35 02 0.37 018 0000247 00521 910 ТБ 10) 00024200 1.60 93.00 2.01 0.30 0.34 033 00250 Ф0476 921 т5631-04Т0) 02490 131 22.93 234 0.37 0.34 0.20 00275 00521 895 56301104) 0254 01 107 92.82 2.56 0.25 0.37 0.20 00316 00549 . 917 Т5631011(22) 266 017 116 92.75 2.68 0.28 0.42 030 00134 9.0576 918 5631-0312) 236 о 2.02 92.64 192 036 0.42 925 00242 00463 914 К5631-0171419) 268 012 1.23 92.30 2.84 02 034 021 00345 0.0598 898 8631-0210) 299 012 121 90.79 46 0.26 032 026 00483 00777 915 5631-01 Т1(020) 374 од 1.07 90.67 4.14 0.09 0.00 о38 00456 00865
Фо 5631-0310) 004235 06 1.50 81.70 01192 030 0.29 027 01494 01976 щ99 75531422) 454 0ОВ8 Ме 85047 001207 о 0.26 025 01525 02054 900 5631-0213) 447 008 2.07 8064 Ню 037 0.24 023 041506 02030 901 Т5631-027114) 450 009 1.83 80.24.1231 029 022 0.22 01586 02132 906 5631-0219) 444 009 174 80.20. 12.6 0.31 0.23 024 01619 002144 903 5631-02 Ті) 00447 010 1.60 7999 13.06 0.30 0.25 024 01664 02191 907 5631-02 11110) 439 009 1.82 7990298 0.33 0.24 024 01655 02174 909 5631-02 7142) 431 009 1.52 79-87. ЗЯК 0.27 026 Фі9 01720 02227 б05 563108) 446 009 Ех? 79,58. 1347 030 0.30 023 01730 02254 902 55310453 472 008 1.44 7985 013,87 0.32 0.27 024 041789 02351
Таблиця 18
Екетракнія олії, використовуючи пристрій зохінеї, і проефізь жирних кисла олії
Пе Срна | Вага | о Ветягене | Оліннють | Жирнекнслетний екладіватй! 0
ПВ юдіннктт | Зеров в. мето 000бе00 пат ваті перрі Ес вет Бо я ах пр срвр юр пет ОВ Й СОДІ в4.о5 | зе З8| 01) імр яя| 30) 006 03 03 б (Еклрякщяя 2007) 0023809 0002370000036551 341 б 15ря»; 25 06 03 бло
Ееиюжиют, ЗО свист ! 2940) 30 011 151 я 356 03 031 0
Еюшипраюця я 0022022 21954134 000253 291 01 131 Я 36 00303
Гедлия І з8697 яна в яр ол 159531 25 00103 ших кН вени НТ пи сх ли ши 7961 чі 2951 1 Я 951 321 001 031 0310 (Евхтрактщя є 24308 пк НС з5| 041 16 94) 341 601 631 03 і г ан ТЕ вихо в ВО ЗЕЯ ЕС Я ВК ВС ЕС ВИК НАСТЯ ВСЯ НОЯ НИ, ля 00000
ІЕхе2Л/в н Ї- 35 шк во! 29) 006) 3) ол
Конструювання реСуу701-рсСУу710
Промотори сафлорового походження, які, як вважають, мають оптимальну активність у насінні сафлору, виділяють, використовуючи технології секвенування ДНК, що дають точну інформацію про послідовності районів ДНК 5 і 3 від експресованого гена. Попередні результати, описані в прикладах 2-6, свідчили про те, що ген СІБАЮБ2-1 експресується на високому рівні під час розвитку насіння у сафлорі. Тому промоторний район цього гена є відмінним кандидатом на керування ефективної експресії трансгенів у насінні сафлору. Як продемонстровано в прикладі 6, СІЕАЮ2-2 був активним на генетичних фонах, коли СТІЕАЮ2-1 був інактивований у результаті мутації. З цієї причини промотор СІРАЮ2-2 використовується в сафлорі для керування експресією шпилькових РНК, мішенню яких є активність СТЕАЮ2-2, серед інших генів. Інші елементи промоторів, застосовні для експресії трансгенів у насінні сафлору, включають ендогенні (тобто сафлорові) елементи промоторів у 5' частинах генів для олеозину (СіОіеовіп) і білків, що запасаються в насінні, таких, як білки 25 і 115 (С125 і СИ115).
Елементи промоторів СТЕЕАЮ2-1, СІОІеовзіп, С125 і СИ15 виділяють, використовуючи стандартні методи на основі ПЛР, основані на геномних послідовностях сафлору, і включають у бінарні експресійні вектори для рослин. Ці елементи промоторів використовуються для експресії викликаючих генний сайленсинг молекул ШРНК у конструкціях роУМ701-рСУМу710 або в сполученні з іншими несафлоровими промоторами, які експресують ті ж або відмінні гени для
ШРНК, такі, як у рРСМУбО2, рсСуубозЗ, рсСууб631 або рСМуб32. Комбінації генів для ШРНК із різними промоторами також одержують за допомогою схрещування трансформованих окремими генами рослин, типово, коли гени для ШРНК є незчепленими.
Для виділення промотору СІЄАЮ2-1 фрагмент геномної ДНК розміром приблизно 3000 п. о., розташований 5' від ініціюючого трансляцію СТЕАЮ2-1 кодона АТО, виділяють, використовуючи методи на основі ПЛР, їі використовують для заміни промотору АЮіеозіп з РСУУбОЗ і рСуубо2, у такий спосіб створюючи конструкції РСМУ/7О1 і рСУМ702, відповідно.
Для виділення промотору СЕЕАЮ2-2 фрагмент геномної ДНК розміром приблизно 3000 п. о., розташований 5' від ініціюючого трансляцію СЕЕАО2-2 кодона АТО, виділяють, використовуючи методи на основі ПЛР, їі використовують для заміни промотору АЮіеозіп з РСУУбОЗ і рСуубо2, у такий спосіб створюючи конструкції РСУМ70ОЗ і рСМУ?7О4, відповідно.
Для виділення промотору СіОіІеозіп-1 фрагмент геномної ДНК розміром приблизно 1500 пар основ, розташований 5' від ініціюючого трансляцію СіОІеозіп кодона АТО, виділяють, використовуючи методи на основі ПЛР, і використовують для заміни промотору АюЮіеозіп з рсуубоз і ромубо2, у такий спосіб створюючи конструкції рСМУ?7О5 і рСМуУ7об, відповідно.
Для виділення промотору СІ25 фрагмент геномної ДНК розміром приблизно 1500 пар основ, розташований 5' від ініціюючого трансляцію С125 кодона АТО, виділяють і використовують для заміни промотору АЮїеовзіп з рСУуУбОЗ і рСМубо2, у такий спосіб створюючи вектори рСУУ?707 і рсумтов, відповідно.
Для виділення промотору СИ15 фрагмент геномної ДНК розміром приблизно 1500 пар основ, розташований 5" від ініціюючого трансляцію СМИ15 кодона АТО, виділяють з геномної
ДНК сафлору, використовуючи методи на основі ПЛР, і використовують для заміни промотору
Зо АШЮІеовзіп з рСУУбОЗ і рСУубо2, у такий спосіб створюючи вектори рСУМУ709 і рСМуУ7/10, відповідно.
Кожний з цих векторів використовують для трансформації сортів сафлору, як описано в прикладі 1.
Приклади 14. Характеристики сортів сафлору, отримані в польових умовах
Ряд нетрансформованих сортів і нових надходжень сафлору вирощували влітку 2011-2012 року на польовій дослідній станції спостереження в Маїгтабгі, Мем/ зоційп УмаїІе5. Насіння засівали на польові ділянки розміром 5 м х З м у грунт із важкої глини, що звичайно зустрічається в районі Маїтабгі. Рослини піддавалися природному освітленню й атмосферним опадам, за винятком того, що їх поливали один раз після 4 тижнів росту. Зріле насіння збирали, і зразки з приблизно 50 насінин аналізували відносно вмісту ліпіду і жирнокислотного складу олії з насіння. Вмісти олеїнової кислоти в олії з насіння різних сортів і нових надходжень представлені в таблиці 19 і на фіг. 13.
Дані польового випробування вказували на те, що існує діапазон вмістів олеїнової кислоти в насінні сафлору, несподіваний по довжині діапазону, що спостерігається. Що особливо важливо, різні нові надходження, описані як "з високим вмістом олеїнової кислоти" і, як повідомлялося раніше, що дають олію з насіння з принаймні 70 95 олеїнової кислоти, такі, як
Сіапо-ОЇ, продукували тільки приблизно 42-46 95 олеїнової кислоти. Рівні лінолевої кислоти були набагато вище, ніж очікувалося на основі попередніх повідомлень. Навпаки, інші нові надходження, такі, як РІ-5601698 і РІ-560169, що, як повідомлялося, дають високі вмісти олеїнової кислоти, дійсно продукували високі рівні олеїнової кислоти (60-76 95) в оліях з насіння у польових умовах. Вважали, що причина значно більш низьких рівнів олеїнової кислоти, ніж очікувалося, у деяких нових надходженнях пов'язана з присутністю алелей СІБА02-1, а не алеля ої, такого, як, наприклад, алель оії, що є чутливим до температури, і з умовами вирощування, що були неідеальними в сезоні 2011-12. Додаткові аналізи жирних кислот на насінні, отриманому від вирощеного в полі сафлору, будуть проведені для підтвердження варіації, відзначеної у вмісті олеїнової кислоти в деяких нових надходженнях.
Таблиня 19
Жирнокислатний склад ліпілу сортів сафлору, вирощених у полі
І сСіею С1ії сС185:55 с сі) СІВ Снка сі
РІ БІО 543 «04 5.5 941 78.Я па бе 02
РІ 537077 63 02 КД: 103 799 рі 03 02
РІ 537645 7.8 02 2.2 І.5 78.0 ра 04 02
РІ 572433 4 01 2.5 І07 787 По 04 02
РІ 573472 63 02 4 ПЛ 78.7 по 24 0
ВЕСТ, 65.8 п 27 Па тд п п по
РІ 53 6.7 0.2 вд 11.6 77Х п па 02
ССТ4855-341- 7.8 п. 22 11.6 76.9 п С. по 14141
РІ 500163 70 п 19 11.7 775 01 О.Я 02
РІ ЯБІ955 ті по 2 11.8 714 «0 па п.
РІ О0бОЮ 6.6 п 2.8 12.0 773 02 0.4 п
РІ ЗУРУО 6.6 (ЩІ 2.2 12.4 77.5 4 0.4 па
РІ 557705 ве (2 2.6 11 708.3 02 А ї2
РІ ЯІЗЯ8 Та п 29 13.4 749 02 0. п.
РІ 360161 за 02 241 144 75.0 0 0. п.
РІ ЗО ЯО 6.5 02 2 18.3 71.5 пз 04 0
РІГ 301477 5.5 0.2 2.3 36.8 332 по 0.5 0
РІ 537712 55 0 2.5 40.5 48.5 п п. по
РІ 537695 60 0.2 2 41.9 475 Пп п.5 03
СТАМО-ОЇ, 6 п 19 42.9 46.5 0 0.5 пл
РІ 535779 6.6 0.2 24 43.2 2 02 па пл
Зіпопагіа 6.0 02 24 43.5 о 02 0.4 02
РІ ЯОТ479 59 па 24 45.2 л 0 5 04
РІ ЗБ Об я, п. 2.3 55.0 35.0 01 5 0.3
РІЖНЛЯЯ ЗА оп 12 59.3 6 04 0.6 по
РІ 500177 хі по 19 07 30.3 02 с 0.3
РІ 603907 36 0.2 232 65.2 25.0 по 0.5 пла
РІ 360167 я. (2 1.6 65. 248 02 04 п.
РІЗІ 35 0 1.85 07.6 25.6 03 05 0.3
РІ 603208 34 02 23 Б. І 02 06 03
РІЗУ 5.3 0 2.3 68.5 21.5 па 04 0.3
РІ 500165 32 0 1.5 68.5 21.8 па 0.5 03
РІ 500169 за 02 1.5 71.8 15.6 02 05 03
РІ 577808 За 0.2 2.0 75.0 15.5 03 0.5 03
РІ 612067 54 о 1.8 то. 14.5 п. (же 03
Цей експеримент також показав, що рівень олеїнової кислоти в олії з насіння, отриманій від рослин, вирощених у полі, типово на приблизно 5-10 95 нижче, ніж з рослин, вирощених у теплиці, навіть у випадку нових надходжень з найкращими характеристиками в полі. Вважали, що причиною цього є те, що умови вирощування в полі були менш ідеальними, ніж у теплиці.
У подальшому експерименті рослини сафлору сорту 5317 вирощували або в полі, або в теплиці для порівняння жирнокислотного складу олії з насіння. Навіть якщо польові умови були більш сприятливими в сезон вирощування, ніж у сезон 2011-12, вага 20 насінин від рослин, вирощених у полі, становила 0,977 г порівняно з 1,202 г від рослин, вирощених у теплиці. Від вісімнадцяти до 20 насінин з кожної групи були проаналізовані відносно жирнокислотного складу з використанням аналізу за допомогою ОС. Рівень олеїнової кислоти в насінні рослин, вирощених у полі, знаходився в діапазоні від 74,83 до 80,65, при цьому середнє значення (/- середньоквадратичне відхилення) становило 78,52 -/-1,53, порівняно з діапазоном для насіння рослин, вирощених у теплиці, що становить 75,15-78,44, при цьому середнє значення становило 76,33--/-1.00. Інші жирні кислоти були присутні на рівні, зазначеному в таблиці 20.
Таблиця 20 жирнокислотний склад олії з насіння 8317, вирошеного або у полі, або в тенлиці
Гб: зе 18:61 8 1882 рія 101 Які | 220
Зразак (дог ох 0 Айх дб | й; А11х
ВИМ МИ ПО ПО я ПО ВН я СИ ННЯ ВАН ВАННЯ
Вирошенкни х полі і | ! ! !
Єтреднєзниєння ОО 000340 755 БВ Об 1 045006 ванни 0041 00403 100 017 106) 000 | 012) 0061 0.06
Приклад 15. Перехід трансгенів в інші сорти сафлору
Сорти сафлору вручну схрещують, використовуючи загальноприйняті способи, наприклад, описані в МипдеІ апа Вегдтап (2009). Відбирають найкращі з трансформованих ліній, що містять конструкції, описані вище, зокрема, трансформовані лінії, що містять тільки одну вставку
Т-ДНК, і їх схрещують з рослинами інших сортів сафлору, нетрансформованих або вже трансформованих відмінною конструкцією, які мають оптимальні агрономічні характеристики.
Використовуючи багаторазові цикли поворотного схрещування з поворотним батьком, наприклад, протягом 4 або 5 поворотних схрещувань, і потім самозапилення, одержують рослини, що є гомозиготними по бажаній конструкції(ях) на генетичному фоні для оптимальних агрономічних характеристик. Відбір за допомогою маркера, такого, як, наприклад, використання ідеального маркера для алеля ої, описаного в прикладі 7, може використовуватися в процесі схрещування.
Приклад 16. Модифікація складу олії з насіння за допомогою опосередкованого штучними мікроРНК генного сайленсингу
МікроРНК є класом регуляторних коротких РНК (кКРНК) довжиною 20-24 нуклеотиди, ендогенних відносно рослин і тварин, які регулюють активність ендогенних генів. Трансгенна експресія модифікованих РНК-попередників мікроРНК (штучних попередників мікроРНК) являє собою недавно розроблену, основану на РНК і специфічну відносно послідовності стратегію сайленсингу ендогенних генів. Було встановлено, що заміна декількох нуклеотидів у послідовності попередника мікроРНК для створення штучного попередника мікроРНК не впливає на біогенез мікроРНК за умови, якщо залишаються незачепленими положення відповідностей і невідповідностей у структурі "петля-на-ніжці" попередника.
С5БІКО пакет програм МаїспРоїпі (м/млму.рі.свіго.ашКМАї) (Нот апа Умаїегпоизе, 2010) використовували для ідентифікації специфічних 21-нуклеотидних послідовностей у генах ЕАО2,
ЕАТВ і РАЕТ Агабідорзі5, що були унікальними в геномі Агарідорзі5 і тому з меншою часткою імовірності викликають сайленсинг генів, що не є мішенями (вплив поза геном), при експресії у вигляді штучних мікроРНК. Унікальна 21-нуклеотидна послідовність була відібрана для кожного
Зо з З генів, при цьому 21-нуклеотидна послідовність у кожному випадку була повністю комплементарна (антисмислова) району транскрипту з відповідного гена. Для кожного була розроблена штучна молекула попередника мікроРНК, на основі послідовності попередника ага- ті159Б5 А. Іпаійапа. У кожному випадку послідовність попередника Іпі159р була модифікована в її ніжці для розміщення антисмислової 21-нуклеотидної послідовності. Були створені три конструкції, кожна з яких кодує одну з РНК-попередників, кожна під контролем специфічного для насіння промотору ЕР'1, і їхній клонували в бінарний експресійний вектор для створення конструкцій, названих рОР1106, руР1109 і руР1110.
Три конструкції використовували окремо для трансформації штаму АС 1 А. Шшптпегасіеп5 за допомогою електропорації, і трансформовані лінії використовували для введення генетичної конструкції в А. (паіапа (екотип Соїштрбіа) з використанням методу занурення квіток (приклад 1).
Насіння (насіння Ті) від оброблених рослин висівали на чашки із середовищем М5, доповненим 3,5 мг/л РРТ для відбору трансформованих проростків, що переносили в грунт для укорінення підтверджених трансгенних рослин Ті. Передбачалося, що більшість цих рослин Ті будуть гетерозиготними по введеній генетичній конструкції. Насіння Т» від трансгенних рослин збирали при досягненні зрілості й аналізували відносно їх жирнокислотного складу. Ці рослини Тег включали лінії що були гомозиготними по генетичній конструкції, а також лінії, що були гетерозиготними. Гомозиготні рослини Т2 самозапилювалися для одержання насіння Т»з5, і рослини-потомки Тз, отримані з цих насінин, у свою чергу використовувалися для одержання рослин-потомків Та. Тому це дозволило проаналізувати стійкість генного сайленсингу протягом трьох поколінь рослин-потомків.
Профілі жирних кислот в олії з насіння, отриманій з партій насіння Т», Тз і Та., аналізували за допомогою (С, як описано в прикладі 1. Зміни активності Д12-десатурази, викликані дією трансгена на основі ЕАО2, відзначалися у вигляді збільшення кількості олеїнової кислоти в профілях для олій з насіння. Зв'язаний метод оцінки кумулятивних ефектів активності А12- десатурази під час синтезу жирних кислот у насінні здійснювали за допомогою розрахунку показника частки десатурації олеїнової кислоти (ООР) для кожної олії з насіння, отриманої, використовуючи наступну формулу: ОбР:-9518:2--9518:3/9518:1--9518:2--9518:3. Олія з насіння
Агаврідорзіз дикого типу типово мала величину ОЮОР, що становить приблизно 0,70-0,79, що означає, що 70-79 95 18:11, утвореної під час синтезу жирних кислот в насінні, були згодом перетворені в поліненасичені С18 жирні кислоти, насамперед під дією А12-десатурази з утворенням 18:2, а потім у результаті подальшої десатурації до 18:3. Отже, показник ООР застосовувався для визначення ступеня сайленсингу гена ЕАб2 на рівні активності ендогенної д12-десатурази.
Рівні С18:189 (олеїнової кислоти) у насінні Т2, трансформованою конструкцією рОР1106 (мішенню якої є ЕАО2), знаходилися в межах від 32,9 905 до 62,7 95 у ЗО трансгенних випадках порівняно із середнім рівнем С18:І дикого типу, що становить 14,0 95--0,2. Піддана сайленсингу у високому ступені лінія (рослина І0-30), що мала одну вставку трансгена, що характеризується коефіцієнтами сегрегації (3:1) селектованого маркера рослин (РРТ), була переведена в наступне покоління (Тз). Так само в насінні Тз відзначалися високі рівні 18:129, що знаходяться в межах від 46,0 95 до 63,8 95, при цьому середнє значення становило 57,3--5,0 95. У наступному поколінні насіння Т4 також продемонструвало схоже високі рівні 18:12, що знаходяться в межах від 6195 до 65,8 95, це середнє значення становило 63,3--1,06 956. Загальний вміст РОБА (18:24-18:3) в олії з трансгенного насіння То знаходився в межах від 6,1 95 до 38 95, але в олії з насіння гомозиготної лінії ІО-30 загальний вміст РОЕБА був додатково зменшений і знаходився в межах від 4,3 до 5,7 95. Олія з насіння контрольного Агарідорзіз екотипу СоІштбіа мала значення ОЮР, що знаходиться в межах 0,75-0,79, що означає, що більше 75 95 олеїнової кислоти, утвореної в насінні, що розвивається, було згодом перетворено в 18:2 або 18:3.
Навпаки, олія з насіння мутанта їад2-1 Агарідорзі5 мала значення ООР, що становить 0,17, що означає зменшення на приблизно 75 95 Д12-десатурації внаслідок мутації Тад2-1. Значення ОЮР знаходилося в межах від 0,08 до 0,48 в олії з трансгенного насіння Т2, 0,07-0,32 в олії з насіння
Тз ії 0,06-0,08 в олії з насіння Те, на відміну від значення-0,75 в олії з контрольного насіння
Агарідорзіз. Істотне зменшення значень ОР у трансгенних лініях ясно вказувало на ефективний сайленсинг ендогенного гена ЕАОБ2, використовуючи підхід з використанням штучних мікроРНК. Цей експеримент також свідчив про стійкість генного сайленсингу протягом трьох поколінь. Схожі ступені генного сайленсингу також відзначалися у випадку двох інших конструкцій для зменшень експресії відповідних їм генів.
Ступінь сайленсингу гена БАЮБ2 і кількість 18:189 (63,3 - 1,06 95), відмічені в цьому дослідженні, використовуючи штучну мікроРНК, були вище, ніж у добре охарактеризованому мутанті ЕАО2-2 (59,4 9б), лінії із сайленсингом РАО2, використовуючи підхід з використанням шпилькової РНК (56,9--3,6 95) ії шпильковий-антисмисловий підхід (61,7-2,0 95). Середній вміст 18:2--18:3 95 в олії з насіння із сайленсингом ЕБАЮО2, використовуючи мікроРНК, становив 4,8--0,37 95, що нижче, ніж у мутанті ЕАО2-2, про який повідомлялося раніше, (7,5--1,1 Об) і лінії із сайленсингом ЕАО2, використовуючи шпильковий-антисмисловий підхід (7,2--1,4 965). Отже, ці дані свідчили про перевагу штучних мікроРНК по ступеню сайленсингу, а також про стійкість сайленсингу протягом поколінь потомків.
Приклад 17. Аналіз вмісту і складу стеролів в оліях
Фітостероли з 12 зразків рослинних олій, придбаних з комерційних джерел в Австралії, були охарактеризовані з використанням аналізу за допомогою (С і С-М5 як похідні О- триметилсилілилового ефіру (ОТМ5і-ефіру), як описано в прикладі 1. Стероли були ідентифіковані відповідно до даних про час утримання, у результаті інтерпретації мас-спектрів і порівняння з літературними і лабораторними даними, що стосуються стандартних мас-спектрів.
Кількість стеролів визначали, використовуючи внутрішній стандарт 5ДВ(Н)-холан-24-ол. Базова структура фітостеролу і хімічні структури деяких з ідентифікованих стеролів представлені на фіг. 14 і в таблиці 21.
Тайлиня ЗЕ.
ІСРАСспотематичні назви ідентифікованих стеролів. «бе стеролу Звичайна назва(н) Систематична назва(н) 1 холестерцн холест-5-ен-3В-ол 2 брасикастернн 243-метилхолеста-3,22(Едієн-380-ол 3 халінастероап/24-метиленхолестерня га-метнляхолеста- ЗА 25) -дієн-3р-оль 4 кампестерол/24-метилхолестерин З4-метнлхолест-д-ен-3ЗН-ол кампестанол/24-метилхолестаноя З4а-метнлхолестан-3б-ол 7 Аа-стигмастерол 24-етнаяхолеста-3,22Б-дієн-3В-вл 5 ергост-7-ен-3Д-ол г4-метнлхолест--ен-30-ол
І ебурнкол 44.14 -триметилергоста-х 2425 -дієн-3В-ол із В-ситастерол/24-етилхолестерин 24-етипхолест-3-ен-Зй-ол 13 Ах-авенастероллзофукостерол ЗА-етнлхолеста-3 ДАЕ -люн-ЗД-ол 19 А7-стигмастерол/'стигмаст-?-ен-38-ол 24-етиплхолест-7-ен-ЗВ-ол 20 зт-авенастерол 24-етнлхолеста-7 2(25)-дієн-3В-ол 5
Проаналізовані рослинні олії були з: кунжуту (безатит іпаісшт), маслини європейської (ОіІєа еигораєа), соняшнику (Неїїапіпи5 аппи5), рицини звичайної (Кісіпиє5 соттипів), каноли (Вгаззіса пари5), сафлору (Саппати»в (псіогіиб5), арахісу (Агаспі5 Ппуродаєа), льону (Гіпит изйаєйввзітит) і сої (Сіусіпе тах). У зменшуваному відносному вмісті для всіх зразків олій основними фітостеролами були: ДВ-ситостерол (діапазон 28-55595 від загального вмісту стеролів), Д5-авенастерол (ізофукостерол) (3-24 95), кампестерол (2-33 95), Д5-стигмастерол (0,7-18 95), Д7-стигмастерол (1-18 95) і Д7-авенастерол (0,1-5 90). Було ідентифіковано декілька інших, менш значних за розміром стеролів, ними були холестерин, брасикастерин, халінастерол, кампестанол і ебурикол. Були також детектовані чотири С29:2 і два С30:2 стероли, але необхідне подальше дослідження для повної ідентифікації цих менш значних за розміром стеролів. Крім того, декілька інших не ідентифікованих стеролів були присутні в деяких з олій, але внаслідок їх дуже низького відносного вмісту мас-спектри не були в достатньому ступені інтенсивними, щоб уможливити ідентифікацію їхніх структур.
Вмісти стеролів, представлені у вигляді мг/г олії у зменшуваній кількості становили: канолова олія (6,8 мг/г), кунжутна олія (5,8 мг/г), лляна олія (4,8-5,2 мг/г), соняшникова олія (3,7- 4 1 мг/г), арахісова олія (3,2 мг/г), сафлорова олія (3,0 мг/г), соєва олія (3,0 мг/г), маслинова олія (2,4 мг/г), касторова олія (1,9 мг/г). Сполуки стеролів уЗбб і загальний вміст стеролів представлені в таблиці 22.
В усіх зразках олії з насіння основним фітостеролом був, як правило, ВД-ситостерол (діапазон 30-57 90 від загального вмісту стеролів). Серед олій відзначалося коливання в широкому діапазоні відносних вмістів інших основних стеролів: кампестеролу (2-17 ув), А5-стигмастеролу (0,7-18 95), Д5-авенастеролу (4-23 У), Д7-стигмастеролу (1-18 95). Олії з різних видів мали різні профілі стеролів, при цьому деякі мали досить характерні профілі. Канолова олія мала найбільший відносний вміст кампестеролу (33,6 95), у той час як зразки інших видів, як правило, мали більш низькі рівні, наприклад, аж до 17 95 в арахісовій олії. Сафлорова олія мала відносно високу частку А7-стигмастеролу (18 95), у той час як вміст цього стеролу було звичайно низьким в оліях інших видів, аж до 9 9о у соняшниковій олії. Оскільки вони були характерними для кожного виду, профілі стеролів можна, з цієї причини, використовувати для сприяння в ідентифікації конкретних рослинних олій або перевірки їхньої справжності або підмішування в інші олії.
Були порівняні два зразки, кожний з них із соняшнику і сафлору, у кожному випадку один був отриманий за допомогою холодного віджимання з насіння і був нерафінованим, у той час як інший не був підданий холодному віджиманню і був рафінованим. Хоча відзначалися деякі розходження, два джерела олій мали схожий склад стеролів і загальний вміст стеролів, що говорить про те, що обробка і рафінування робили незначний ефект на ці два показники. Вміст стеролів у зразках відрізнявся в три рази і знаходився в межах від 1,9 мг/г до 6,8 мг/г. Канолова олія мала найбільший вміст стеролів, а касторова олія - найменший вміст стеролів.
Таблиня 223
Вмістісклад стеролів у проаналізованих рослинних оліях
Номер Звичанна Кунжут Оливк. Соня. Соняш.о Кастор Каноло Сафлосвфпо Арахіс. Лляно Лляно боєва стеролу віджим. ВЕК М. насінної насчні і копестерян КіЯч Ж пі що Зі НІЖ по М по ся па па о ов о С ПТ по п п пк п п пок хативастерслоді. до мехвленколестернно | В Не т М 4 по М по ЕЙ) ІЯ У кампестеухаліга- 4 змегалиолестерих ваз 747 йо ях пя Не щі ів кампестаналогі- й 0 метнлходестаноя НЯ п ЦЯ. я 19 п ТЕЖ ЦЕ НА по ЦІ ця бо Ся по ЩО по НІ 500 13 13 0
ТО дботипюютаює 84 740 ве НН 7 ча З З ЗК па
Х невіламо пя 13 НЯ б п НЯ й 14 ПА 07 й 13
КО ерпост-т-ев-Збохя НН НЕ іл ік по Я 27 Я 15 14 із ій 19 невідомо по мова оїо, пр м М пл 05 07
Її ебурнкол 15 1 ЖІ 34 15 16 їЯ на ЕН 15 М ПЕК сснтостеролия-
ЇХ етнахалестерия щІ жа я б З ОА ОО 5 299 ЗА що
І ож НЕ м жМшНх ПИМВ Я МИ НЯ їв 19 а по по 02 зритерпеновнй 15 сотрт НЯ ОО Ш йо по НИ ІК їх НО о У ІНН
Ів Ск їо па пт й 15 ІЗ ЗЕ НК 10 ТК бл 05 5
ЛЕТ кутю х гхЯ режи ген З я з ті ча о 23 5 іп 385.3 ІІ з ЕЛ яд 2 2 т-вевидкотероі НИК пі ей за п ЕЛ. ЕК 7 0 п 04 пе гі невічоме ат та й ве й Г5н: я 94 ба 3 Зо 5
ХХ кеітомх ал 2 пз па 20 о ка ЕК 07 п од 3 23 яквітоми НЯ пз 03 пі пл ві НЯ 02 22 3 23 3 24 вквідоми 38 за 295 13 аб 04 йг а4 ЕН іл їх о8 25 яквіломо ва 54 3 5 п. ві 55 9.7 пл НЯ ТЕ й 25 с А во я. 7 І бе 16 ЕЗ ЕК 12 ВЕ 3.7
ШК лилннкннЙ В па А ВАВ ВВ
Сука 100.6 НИ НН 10 ів ню запо і ко ха 160 НИ
Бої стероли
СИМ ІЗ озночокі ст стю пвохапоХещЕкМм Хв ЖЕ ХЖи 25 О0---стерох я пкоха похешщвими хе ик Хе, вільвілно
Був проведений окремий аналіз олій сафлору з контрольного насіння тепличного походження (5 серія), генетично модифікованого насіння з високим вмістом олеїнової кислоти (Т серія) і двох комерційних сафлорових олій. Було відзначено кілька особливостей (таблиця 23). По-перше, існував високий ступінь схожості профілю стеролів між контрольним і модифікованим насінням, і, по-друге, комерційні сафлорові олії належать до окремої групи і тому, як було встановлено, мають значно відмінний профіль фітостеролів. Подальше дослідження профілів стеролів також свідчило про схожість профілів фітостеролів зі зразків контрольного і модифікованого насіння сафлору.
Кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям буде зрозуміло, що численні варіації і/або модифікації можуть бути внесені в даний винахід, продемонстрований в конкретних варіантах здійснення, без відступу від суті або об'єму даного винаходу в широкому визначенні. Тому варіанти здійснення даного винаходу повинні розглядатися у всіх аспектах як ілюстративні і необмежуючі.
Дана заявка заявляє на пріоритет заявки на патент США з Мо 61/638447, поданої 25 квітня 2012, і заявки АО 2012903992, поданої 11 вересня 2012, обидві з яких включені сюди за допомогою посилання.
Усі публікації, що тут обговорюються і/або на які тут посилаються, включені сюди в їхньому повному об'ємі.
Будь-яке обговорення документів, актів, матеріалів, пристроїв, виробів або т. п., що було включено в опис даної заявки, служить винятково меті забезпечення контексту для даного винаходу. Не потрібно приймати як допущення, що які-небудь або усі з цих матеріалів утворюють частину основи відомого рівня техніки або були відомими загальними знаннями в галузі техніки, що стосується даного винаходу, оскільки вони існували до дати пріоритету кожного пункту формули цієї заявки.
Таблиня 23
Єжлад стерелів (95 від усіх етеролів) і вміст стерелів (мг/г) у зріна ках олії з насіння сафлеру шля 1 РЯББЕ ТТ БоБеЕ ТТ БЯНБО РЕВЕ 000 РРЕУ стералу назввін) Спстемастична назва Зві7и) 53?) тББОЗЯстТІ тЗ8О3азаАтТі тВБОЗВБ ТІ 7 холесторик холаст-в-зн-З Пол а об вад 2 Бпассувастерин 2А-метилхоласта-5 2) лін 3|3-Ол 20 оо бл по п
З халінастеухми 4 -меуаленхопестерня 24 метипхолеста-з дов дієн -3|З-сні ов ав т 31 12
А зампестероліда метипхолестеркя 24 мотипхопест-б-ен-3В-ок 305 "в о 1.8 11.8 є 0 ккапестекогі/24-метипуслестанаяй 24-метилеорестан- ЗВ. ол ва в З оо 3 5 о смкує 2.8 98 ог т.е А ро? аб-стяпаастероя мнетнахолести- ЗБ дж З ой а7 09 ва Ов 26 8 теБІДОМОЗІХ 18 241 2.3 24 22
Я ергост?вн-Зрчал 24 хетилхолест-?-ен-ЗЙ-од 2.8 за 25 23 28 10 невіщомк ех 15 16 13 18 18 11 ебурнкот я і-трииетиадреоєти В ОК іджк ЗИ ок 17 27 зо 28 26 12 й-ситостероліоб етнлхолестерня З4-етвлхрлест я ної р чад 35.3 зо 35 за 37.5 13 2 5 вонастероллзофукостерол Са -сетилхопент о ЦІВ лили Зв оп 104 БІ 106 та 93 14 труперпенаені спирт 18 15 14 12 14 15 тритерпенюовий сикру 18 2.3 13 пе їв 16 Саух 4 ОБ З.1 7.8 ЛА 17 бла" 22 2.2 24 г 37 13 сю та 8 1.8 138 241 19 дт-стипкастеродлістигоеєт.?-ен-зр-оп Зх етидхолесу? ВІЗ ДОП 114 13.4 таз ва т07 ді авенастерол за-втиляслеста 7 2Ц2В)2 -дієн З|ОЛ в 5.7 53 ЗА 49 ! 21 верідощоєї 02 04 п 05 од 22 невідомюєях оз 15 1 14 ва і 23 вевідоматтх оа о оо би о і 24 цевідомобте аг ов пз 1.5 ва невідомоєеа ва 28 23 10 в5 ! 28 сао? па 10 0.5 25 ії4
СВБ 0 Ол 0 вив сумо 1006 1500 3000 1000 1050 с10Вастраанописй0000000000011111111111111118828808 "Еозерв стеролів стосуються СК зянеїв. ЄМ СОБОХ і СЗ0О означає СЮ стероя 5 дрюма подеійними зв'язками ї СЛ стерил з двома подана зезяк мія, віисчідне. ук охначдє веБІдОМмиИ. 77» попередня гзентидфикацих.
Зразки 5317 являвуть собово не модификовхні батьківські контролі, а граю ТЗ є зразками олії модпфікованого сафлору з Кисовтюя вмістом олейнової кислоти.
ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ:
Арашпан еї а!. (1986) Віоїесі. 41087. 20 АІтвіда апа АїІ5Ніге (2005) ТАЕМОЗ5 Сеї! Віо! 15: 251-258.
Аопзо вї аї. (2010) Стеєп Спет. 12:1493-1513.
Азспетгіо апа Уміей (1997) Ат. 9. Сіїіп. Миїг. 66:10065-10105.
Ваппоіотем (1971) Тетрегаїцте еПесібв оп Ше Тацйу асій сотровійоп ої демеІоріпд зеедв5 іп заномег, Санппатиз ііпсіогіив І. 25 Вайтівїп еї а!. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 225:459-467.
Вайтівїп сеї а!. (1992) Ріапі 3. 2:233-239.
Весіїйп евї аї. (2002) Ситепі Віоіоду 12:684-688.
Веїїде еї а!. (2011) Ріапі Меїнодз 7:72.
Вегдтап еї а. (2006) Стор 5сі. 46:1818-1819.
Зо ВіаскКіоск еї а!. (2010) У Віої Снет 285: 28442-28449.
Віди апа Буеєг (1959) Сападіап уошгпаї ої Віоспетівігу апа Рпузіоіоду 37:911-7.
Вопапоте апастипау (1988). М. Еподі. Меа. 318: 1244-1248.
Вгодегзеп апа Моїіппеї (2006) Тгтепав Сепеї. 22:268-280.
Вгооїпаєтіз еї а!. (2005) Маїшге 433:629-633.
Вгошп єї а. (1998) Ріапі У). 13:201-210.
Вгошп єї а. (1999) Аппи. Нем. Миїг. 19: 197-216.
Вгомузе евї а!. (1989) Ріапі Рпузіо!. 90:522-529.
Санооп евї а!. (2003) Ріапі У). 34:671-683.
СНнартап апа Витке (2007) Емоїшіоп 61:1773-1780.
Снепа еї аї. (1996) Ріапі Сеї! Вер. 15:653-657.
Спипа єї а. (2006) ВМО Сепотісзв 7:120.
Сіоцой апа Вепі (1998) Ріапі 9. 16:735-743.
Сотаї еї а!. (2004) Ріапі У 37: 778-786.
Соши єї аї. (2007) Тгапздепіс Везвагсі 16:771-781.
Сомеїо апа Нева (1996) Ріапі Рпузіо!. 111:223-226.
Байк еї а. (2007) Ріапі бсіепсе 173:43-49. рісКкеу єї а!. (1994) Ріапі Сеї! 6:1171-1176.
Бошднепу евї а!. (1995). Ат. У. СіІїй. Миїк. 61:1120-1128.
Риїтеїї єї а. (2008) Ріапі У. 54:593-607.
Буег еїа!. (2002) Ріапі Рнузіоїоду 130:2027-2038.
ЕІегвігот еї аї. (1996) Ріапі Мо). Вісі. 32:1019-1027.
Епааєм еї а. (2011) Віотаз5 апа Віоєпегду 35:3787-3809.
ЕРаїсопе еї а. (1994) Ріапі Рпувзіо!. 106:1453-1459.
Еепапае? Зап Унап (1995). АІтепіагтіа 33: 93-98.
Еегпапае2-Мапіпе? еї аї. (1993) ЕирНуїїса 69: 115-122.
Еоїапа вї а!. (2004) Ріапі бсіепсе 166:1487-1496.
Ецітига еї а!. (1985) Ріапі Тізвиє Сийиге І ей. 2:74.
Сате? єї а!. (2003) Роса Рез Іпіегпайопаї! 36: 721-727.
СіІеміп еї аї. (2003) Місгобіої. Мої. Віо!. Веу. 67:16-37.
Сюопа апа Лапа (2011) Віоїеснпої. І ей. 33:1269-1284.
Стапі єї а!. (1995) Ріапі Сеї! Вер. 15:254-258.
Стеепмеї! єї аї. (2011) 9. ВА. 5ос. Іпіепасе 7:703-726.
Сюипеюпе (2001) Іптогт 11: 1287-1289.
Наїпег еї а!. (2008) Мештоавз 44:3-12.
Зо Натаап есеї а. (2009) Єорпуїїса 168: 61-69.
Непікої єї а!. (2004) РіІапі Рпувзіої! 135: 630-636.
Неррагоа еї а!. (1996) Ріапі Рпузіоїоду 110:311-319.
Нетапаве? сеї а!. (2005) Рнуїоспетівігу 66:1417-1426.
НІЇЇ апа Кпом/ез (1968) Стор 5сі. 8:275-277.
Ніпснеєе еї а!. (1988) ВіотесппоІоду 6:915-922.
Ни єг а. (1997). М. Епоаї. У. Мед. 337: 1491-1499.
Нидіу апа б5отегміе (1992) Ріапі РНузіо!. 99:197-202.
І65ПІКІ єї а. (2001) Ріапі Рпувзіої. 125:1388-1395.
Зоики еї а!. (1989) Ріапі Сеї! 1:427-435.
Кап еї а. (2011) Ріапі Рпузіоіоду апа Віоспетівгу 49:223-229.
Каптакаг єї аї. (2010) Віогезоцсе Тесппоіоду 101:7201-7210.
Кнадаке еї а!. (2009) Мої! Віоїтеснпої. 42: 168-174.
Кіт єї аї. (2006) МоіІесціаг Сепеїїс5 апа Сепотісв 276:351-368.
КпоїШе (2005) Риє! Ргосев5. Тесппої. 86:1059-1070.
Кпоїне апа 5івідІєу (2005) Риє! 84:1059-1065
Кпом/ез (1968) Есопотіс Воїапу 22: 195-200.
Кпом/ез (1969) Есопотіс Воїапу 23:324-329.
Кпомез (1972) доштпаї ої Ійе Атетгісап ОЇ Спетівів' босієїу 49:27-29.
Кпом/ез (1989) ОЇ стор5 ої Ше мога: ІНеїг бгеєдіпду апа шйігайноп/еа сі. Корбеїеп,
В. Кейп Ромпеу, А.АвнНгі. МеСтам-НІЇЇ, Мем мок.
Кпом/ез апа Нії (1964) Стор бсіепсе 4:406-409.
І асгоїх еї аї. (2008) Ргос. Май). Асад. 5сі.0.5.А. 105: 15429-15434.
Ї апдгідде еї а. (2001) А!йві у Адііс Нез 52: 1043-1077.
Ї ее єї а). (1998) Зсієпсе 280:915-918.
І етівих (2000) Ситепі Сепотісв 1: 301-311.
Ши (1998) Те ізоїаноп апа спагасієгізайоп ої Тапу асіа дезаїшгазе депев іп сойоп.
РІО. Тневів Опімегейу ої зуапеу.
Пи еї а. (1999) Рипсійопаї! Ріапі Віоіоду 26:101-106.
Ши еїаї. (2001) Атетгісап уоштаї ої Воїапу 88:92-102. (510) Ши еїа!ї. (200г2а). У. Ат. СоїІ. Миїг. 21: 2055-2115.
Ми еїгаї. (20025). Ріапі Рпузіої. 129: 1732-1743.
Ши еїаї. (2010) Рие! 89:2735-2740.
Ї одиегсіо (1998) Сцтепі депеїісв 34:241-249.
Манег апа Вгеззівг (2007) Віогезоцсе Тесппоіоду 98:2351-2368.
Магаподопі єї аї. (1995) Тгепавз іп Роса 5сі. Теснпої!. 6: 329-335.
Мапіпег2-Німаз вї аї. (2001) МоїІесшіаг Вгеєдіпд 8:159-168.
МссСапннвеу вї а). (2004) Ріапі у) 37: 156-173.
МепвзіпК апа Каїап (1990). М. Епаї. У. Мед. 323: 439-445.
МіПаг апа УУаіетоизе (2005) Рипсі Іпіваг Сепотісв 5:129-135.
МгосгкКа 6ї а!. (2010) Ріапі Рпузіоіоду 153:882-891.
Мипавеєї! апа Вегдтап (2009) Заніоумег. ОїЇ Стор: Напароок ої Ріапі Вгеєадіпа 4. Еа.
У. Моїтап апо І. НаЇсап. Зргіпдег Зсіепсе. Рр 423-447.
Меєаієтап апа У/ипз5сй (1970) 9. Мої. Віої. 48:443-453.
Мієд2 єї а. (1995) Ріапі Сеї! Верогів 14:403.
МоакКез апа Сіїйоп (1998) Ат. 9. Сііп. Миїг. 98: 242-247.
Мукіогик еї аї. (2011) Ріапі ВіоїесппоЇоду Чошитаї 9:250-263.
ОЇ УУопа Аппиаї! (2004) Іпіетаїнйопа! беєй Тевіїпд Авзосіайоп (ІЗТА) МієїКе стЬН, Натрбиго,
Септапу
ОкКиїєу єї а!. (1994) Ріапі Сеї! 6:147-158.
Ом єїа!. (1986) Зсієпсе 234:856-859.
Разаціпеїії еї а!. (2005) Си Оріп Сепеї ОємеІор 15: 200-205.
Раїегзоп еї аї. (1993) Ріапі МоїІесшіаг Віооду Неропег 11: 122-127.
Реге-Ммісн вї а. (1998) ЧАОС5 75:547-555
Реттіп еї аї. (2000) Мої! Вгеєа 6:345-352.
Реїегзоп евї аї. (1997) Ріапі Моїіесшаг Віоіоду Неропег 15:148-153.
Реїтгіє еї аї. (2010) Ріапі Меїнодз 6: 8-14.
РАЙірз еї аї. (2002) доштпаї ої Роса Сотрозйоп апа Апаїувів 12:123-142.
Роїепла ві а!. (2004) Іп Міїго Сеї! Оєу. Віої. Ріапі 40:1-22.
Ргазнег еї а!. (1985) Віоспет. Віорпувз. Ве5. Соттип. 127:31-36.
Зо Воснеє апа сСірпеу (2000) Ат. .). Сіїп. Миїг. 71: 2325-2375.
Вуап єї а). (1984) 3. Ат. ОЇЇ Снет. бос. 61:1610-1619.
Задапапаот еї а!. (1996) Ріапі доитпаї 10:235-242. зЗсапй апа Тапд (2006) Стор Зсієпсе 46:1225-1236. зепенйіег еї а. (1997) ТАС Тнеогеїїсаї! апа Арріїєд Сепеїйс5 94:583-591.
Зсптійдеп (2008) Маїшге Ргоїосої5 3: 1101-1108. зЗебедіо єї аї. (1994) Рей. М/ів5. Тесппої!. 96: 235-239.
Зетумаї еї а. (2011) Віотезошгсе ТесппоЇоду 102:2151-2161.
Зпапкіїп апа Сайооп (1998) Аппиа! Ремієм ої Ріапі Рпузіоіосду апа Ріапі Моїєсшіаг Віоіоаду 49:611-641.
ЗіІаде апа Кпаші (2005) Тгтапздепіс Вез 14: 109-115.
Зтаї! (2000а) Сепеїйсв 155: 1913-1926.
Зтаї! (20005) Моїесшціаг рпуіодепеїйсз апа емоїшіоп 16:73-84.
Зтіїй єї а. (2000) Маїшиге 407: 319-320. зЗрегапла вії а!. (2012) Ргосев5 Віоспетівігу (Іп Ргевзв5) «аїКег еї а!. (1988) бсіепсе 242: 419-423.
Зіутпе апа АрреїЇдміві (1978) Еипгореап дошгпаї ої Віоспетівігу 90:223-229.
Тапа еї аї. (2005) Тне Ріапі доитаї! 44:433-446.
Тауюог (1997) ТНе Ріапі СеїІ 9:1245-1249.
Тнеїеп апа Опігодде (2002) Мегабоїїс Епдіпеетгіпад 4: 12-21
Тпйеї еї а. (1988) 9. Віої. Спет 263:12500-12508.
ТНоїівігир еї а!. (1994) Ат. У. Сіїп. Миїг. 59: 371-377.
Топуата еї а. (1986) Тнеог. Аррі. Сепеї. 205:34.
Тайга апа Спом5Ку (2006) Ситт. Оріп. Віоїесп. 17:147-154.
Мапгооі|еп апа Моіопеу (1995) Віо-Тесппоіоду 13:72-77.
Моіппеї еї а). (2003) Ріапі доитаї 33:949-956.
Моіппеї еї аї. (2003) Ріапі дхоштаї 33: 949-956.
МоеїКег евї а!. (1990) Ріапі Сеї! 2:255-261.
М/аїетоивзе еї а!. (1998) Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 95: 13959-13964.
Мевіву 6ї аї. (2001) Ріапі доштпаї 27: 581-590. 60 моса (2009) Ріапі ВіоїесппоІоду Чошгтпаї 7: 914-924.
моса еї а. (2009) Ріапі Віоїтесппоіоду Чошттаї 7:914-924. 7пои єї аї. (2006) Ріапі бсієпсе 170:665-673. 2пои еї аї. (2011) удоштпаї ої Віоіодіса! Спетівігу 286:2877-2885. 7осК апа Каїап (1992) 9. Ііріа Не. 33:399-410. 7осСК еї а. (1994) Апегіозсієг Тпготрб. 14: 567-575.

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Насінина сафлору, склад олії якої включає і/або яка здатна утворювати рослину, яка утворює насінину, склад олії якої включає триацилгліцерини (ТАС), які складаються з жирних кислот, етерифікованих до гліцерину, і причому ї) жирні кислоти включають пальмітинову кислоту і олеїнову кислоту, ії) щонайменше 95 95 у ваговому відношенні від складу олії насінини становить ТАС, ії) 90-95 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот складу олії насінини становить олеїнова кислота, ім) менше ніж 3,1 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот в складі олії насінини становить пальмітинова кислота, і м) склад олії насінини характеризується часткою десатурації олеїнової кислоти (ООР), що становить менше ніж 0,037, і/або значенням відношення пальмітинова кислота ї- лінолева кислота/олеїнова кислота (РІ С), що складає менше ніж 0,063, мі) насінина сафлору включає введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який зменшує продукцію і/або активність гена Л12-десатурази (ЕАОЗ), і мії) насінина сафлору включає введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який зменшує продукцію і/або активність гена пальмітоїл-АСР-тіоестерази (РАТВ).
2. Насінина сафлору за п. 1, де склад олії насінини має одну або декілька з наступних характеристик: а) 90-94 95 або 91-94 95, або 91-92 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот в складі олії насінини становить олеїнова кислота, Б) менше ніж 3 95 або менше ніж 2,75 95, або менше ніж 2,5 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот в складі олії насінини становить пальмітинова кислота, с) 0,1-3 95 або 2-3 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот в складі олії насінини становлять поліненасичені жирні кислоти (РОЕА), а) менше ніж 1 95 або менше ніж 0,5 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот в складі олії насінини становить лінолева кислота (І А), е) 90-96 95 або 92-96 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот в складі олії насінини становлять мононенасичені жирні кислоти, І) склад олії характеризується часткою олеїнової кислоти в мононенасиченості (ОМР) менше ніж 0,02 або менше ніж 0,015, або 0,005-0,05, або 0,005-0,02, 9) ООР складу олії насінини становить 0,033-0,01 або 0,033-0,016, або 0,033-0,023, і І) значення РІО складу олії насінини становить 0,063-0,020 або 0,055-0,020, або 0,050-0,020, або 0,055-0,050.
З. Насінина сафлору за п. 1 або 2, де склад олії насінини характеризується ліпідом, який додатково відрізняється однією або декількома з наступних характеристик: а) а-ліноленова кислота не виявляється в складі жирних кислот ліпіду, і р) 55-80 95 або 60-80 95, або 70-80 95, або щонайменше 60 95, або щонайменше 70 95 складу ТА ліпіду становить триолеїн.
4. Насінина сафлору за будь-яким з пп. 1-3, яка містить а) перший екзогенний полінуклеотид, який кодує першу РНК, що викликає генний сайленсинг, яка здатна знижувати експресію гена 412-десатурази (БАО2) в насінині сафлору, що розвивається, порівняно з відповідною насіниною сафлору, у якої відсутній перший екзогенний полінуклеотид, і де перший екзогенний полінуклеотид функціонально пов'язаний з промотором, який керує експресією полінуклеотиду в насінині сафлору, яка розвивається, і р) другий екзогенний полінуклеотид, який кодує другу РНК, що викликає генний сайленсинг, яка здатна знижувати експресію гена пальмітоїл-АСР-тіоестерази (ЕБАТВ) в насінині сафлору, що розвивається, порівняно з відповідною насіниною сафлору, у якій відсутній вказаний другий екзогенний полінуклеотид, і де другий екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний з промотором, який керує експресією полінуклеотиду в насінині сафлору, яка розвивається.
5. Насінина сафлору за п. 4, яка містить третій екзогенний полінуклеотид, який здатний знижувати експресію гена пластидної десатурази 06 жирних кислот (ЕАОб) в насінині сафлору, бо що розвивається, порівняно з відповідною насіниною сафлору, у якій відсутній третій екзогенний полінуклеотид, і де третій екзогенний полінуклеотид функціонально зв'язаний з промотором, який керує експресією полінуклеотиду в насінині сафлору, яка розвивається.
6. Насінина сафлору за п. 4 або 5, яка додатково відрізняється однією або декількома з наступних характеристик: а) перша РНК, яка викликає генний сайленсинг, знижує експресію більше одного ендогенного гена, який кодує ЕАб2 в насінині сафлору, що розвивається, і/або де друга РНК, яка викликає генний сайленсинг, знижує експресію більше одного ендогенного гена, який кодує ЕАТВ в насінині сафлору, яка розвивається, Б) перший екзогенний полінуклеотид і один із двох або обидва з другого екзогенного полінуклеотиду і третього екзогенного полінуклеотиду ковалентно з'єднані в одній молекулі ДНК, с) перший екзогенний полінуклеотид і один із двох або обидва з другого екзогенного полінуклеотиду і третього екзогенного полінуклеотиду знаходяться під контролем одного промотору, так що, коли перший екзогенний полінуклеотид і другий екзогенний полінуклеотид іабо третій екзогенний полінуклеотид транскрибуються в насінині сафлору, яка розвивається, перша РНК, яка викликає генний сайленсинг, і друга РНК, яка викликає генний сайленсинрг, і/або третя РНК, яка викликає генний сайленсинг, ковалентно зв'язані у вигляді частин одного РНК- транскрипту, а) насінина містить одну транспортну ДНК, інтегровану в геном насінини сафлору, і причому одна транспортна ДНК містить перший екзогенний полінуклеотид і один із двох або обидва з другого екзогенного полінуклеотиду і третього екзогенного полінуклеотиду, е) насінина є гомозиготною по транспортній ДНК згідно з а), 7 кожну з першої РНК, яка викликає генний сайленсинг, другої РНК, яка викликає генний сайленсинг, і третьої РНК, яка викликає генний сайленсинг, незалежно вибирають з групи, що складається з антисмислового полінуклеотиду, смислового полінуклеотиду, каталітичного полінуклеотиду, мікроРНК і дволанцюгової РНК, 9) будь-який один або більше з промоторів, переважно всі, є специфічними для насінини, і переважно промоторами, які переважно експресуються в зародку насінини сафлору, яка розвивається, Зо Р) насінина містить одну або більше мутацій в одному або більше генах ЕАЮ2, причому мутація(ї) зменшує активність одного або більше генів БАЮБ2 в насінині сафлору, яка розвивається, порівняно з відповідною насіниною сафлору, в якій відсутня мутація(ї), де мутація являє собою делецію, вставку, інверсію, зсув рамки зчитування, стоп-кодон передчасної трансляції або одну або більш неконсервативних амінокислотних замін, нуль-мутацію в гені ЕАО2, ї) білок ЕАОбАІ є таким, що не виявляється в насінині, і ) перша РНК, яка викликає генний сайленсинг, зменшує експресію обох генів ЕАЮО2-1 і ЕАЮ2-2 сафлору, що кодують поліпептиди, які містять амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО:27 і 28, відповідно.
7. Насінина сафлору за будь-яким з пп. 4-6, де 1) геном ЕАб2 є один або більше з гена ЕАЮ2-1 сафлору, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО:27, гена ЕАЮ2-2 сафлору, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО:28, і гена ЕАО2-10 сафлору, що кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО:З6, і/або 2) ген ЕАТВ являє собою ген ЕАТВ-3 сафлору, що кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО:45, і/або 3) ген ЕАЮбЄ являє собою ген ЕАЮб сафлору, що кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО 10 МО:48.
8. Рослина сафлору, здатна утворювати насінину відповідно до будь-якого з пунктів 1-7.
9. Спосіб одержання олії, який включає ї) одержання насінини сафлору згідно з будь-яким з пп. 1-7, і ії) екстракцію олії з насінини сафлору, щоб таким чином одержати вказану олію.
10. Спосіб за п. 9, який додатково включає стадію очищення олії, екстрагованої з насінини сафлору, причому стадія очищення включає одну або більше або всі з групи, що складається з: рафінування гідратацією, дезодорації, знебарвлення, сушіння і/або фракціонування екстрагованої олії, і/або видалення щонайменше деяких, переважно по суті всіх, восків і/або воскових ефірів з екстрагованої олії.
11. Ліпід, екстрагований з насінини сафлору за будь-яким з пунктів 1-7, де ліпід містить триацилгліцерини (ТАС), які складаються з жирних кислот, етерифікованих до гліцерину, причому ї) жирні кислоти включають пальмітинову кислоту і олеїнову кислоту, ії) щонайменше 95 95 у ваговому відношенні ліпіду становить ТАС, ії) 90-95 до у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становить олеїнова кислота, ім) менше ніж 3,1 9о у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становить пальмітинова кислота, і м) ліпід характеризується часткою десатурації олеїнової кислоти (ООР), що становить менше ніж 0,037, і/або значенням відношення пальмітинова кислота ї- лінолева кислота/олеїнова кислота (РІ 0), що становить менше ніж 0,063.
12. Ліпід за п. 11, який має одну або більше, або всі з наступних особливостей: а) 90-94 95 або 91-94 95, або 91-92 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становить олеїнова кислота, Б) менше ніж 3 95 або менше ніж 2,75 95, або менше ніж 2,5 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становить пальмітинова кислота, с) 0,1-3 95 або 2-3 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становлять поліненасичені жирні кислоти (РОБЕА), 4) менше ніж З 96 або менше ніж 2,5 95, або менше ніж 2,25 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становить лінолева кислота, е) менше ніж 1 95 або менше ніж 0,5 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становить а-ліноленова кислота (АГА), І) 0,5-1 до у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становить 181411, 9) ООР складу жирних кислот ліпіду становить 0,033-0,01 або 0,033-0,016, або 0,033-0,023, Р) значення РІО складу жирних кислот ліпіду становить 0,063-0,020 або 0,055-0,020, або 0,050- 0,020, або 0,055-0,050, ї) 90-96 95 або 92-96 95 у ваговому відношенні від загального вмісту жирних кислот ліпіду становлять мононенасичені жирні кислоти, Зо Ї) ліпід характеризується часткою олеїнової кислоти в мононенасиченості (ОМР) менше ніж 0,02 або менше ніж 0,015, або 0,005-0,02, К) ліпід знаходиться в формі очищеної олії, І) ліпід є негідрогенізованим, і т) має об'єм щонайменше 1 літр і/або масу щонайменше 1 кг, і/або екстрагований з насінини, зібраної з рослин, вирощених на полі.
13. Ліпід за п. 11 або 12, який додатково містить один або більше стеролів і який знаходиться у формі олії, і який містить менше ніж 5 мг стеролів/г олії або 1,5 мг стеролів/г олії - 5 мг стеролів/г олії, і який містить одне або більше або всі з а) 2,3-4,5 95 від загального складу стеролів ергост-7-ен-3р-ол, і Б) 1,5-3 95 від загального складу стеролів тритерпеновий спирт.
14. Макуха, екстрагована з насінини сафлору за будь-яким з пп. 1-7.
15. Композиція, яка містить перший компонент, яким є ліпід за будь-яким з пунктів 11-13, і другий компонент, переважно, де композицію одержують шляхом змішування ліпіду з другим компонентом, де другим компонентом є речовина, яка не є ліпідом, така як фермент, небілковий каталізатор або хімічна речовина, або один або більше інгредієнтів їжі.
16. Спосіб виробництва промислового продукту, який включає стадії: її одержання ліпіду відповідно до будь-якого з пунктів 11-13, композицій за пунктом 15 або насінини сафлору відповідно до будь-якого з пунктів 1-7, і) перетворення щонайменше деякої частини ліпіду відповідно до будь-якого з пунктів 11-13 або ліпіду композиції за пунктом 15, або ліпіду насінини сафлору відповідно до будь-якого з пунктів 1-7, або ліпіду, підданого фізичній обробці продукту, одержаного з насінини за будь-яким з пунктів 1-7, в промисловий продукт за допомогою використання нагрівання, хімічного або ферментативного способу або будь-якої їх комбінації відносно ліпіду, і ії) одержання промислового продукту, тим самим здійснюючи виробництво промислового продукту.
17. Спосіб виробництва палива, який включає здійснення реакції ліпіду відповідно до будь- якого з пунктів 11-13 або ліпіду з композиції за п. 15, або ліпіду з насінини сафлору відповідно до будь-якого з пунктів 1-7 зі спиртом для утворення алкілових ефірів.
18. Спосіб за п. 17, де ліпід піддають реакції зі спиртом в присутності каталізатора.
19. Спосіб за п. 17 або 18, який додатково включає змішування алкілових ефірів з паливом на нафтовій основі. ян ГГ г АЕАКІ- З 0089) і пот ЯРА Я (0008 й попутно ЗЕАЮТ (01598) ш інтен ДВО 19Б6У пеетнннннттнтттнттннтнн « ОО ВВ стат ОВ) ГТ нн ЛЯ о (РОК ЮТОІЗ рун соту і роко Гр нн ПОЕТ ВІ? Її ов лові -1 рн КАСЕТ КМ пивних ПОН Ї рен іон ЯЕМОЮ ВО 203) ! нн ОЕАВО В ОЇ ї | ЧЕАПО І О837) я ГО фево во) -7- - аОК5З ЛАД) пуд нн БК О і ртеннетітттнтнтттьнннно ДЕДОДА (ВОВТО) і -- Я А А - «6.50 Юа) ОГО ВаДБКА (ЛОВІ ртннктннттонннннннь ПЕПЕКЦЮ ОВО веде 0705) Щ птн ВОВНИ (рн А Н ОБ5У ВОЗ Горинич ОН В ВИО) піііотнк ИОЕВНО. ОВО) НО одетиновв пою) І -Яо « « О6 5 «525 сен ОВО ЕВ. З ОРЗ)
Фіг. 1 ії а зав бо нс 'бї с ж Жде - ее ЩЕ рани Г00ояннн- зп хКеко ік Й М сс чи -- | по св с. ШИ --41855 ше ш-- в го шо ши ЗУ
Фіг. 2 в Ї - іє Векор х ЕД ни нКснютнн й - - ЗУ КВ а ЗШ НИ нн и и нн ісп жи нин ни в п ія пас р кн й нин і ши и а: З б я в в и х СЕАФО ж Й СІЕАЮТВ
! |. з 2 і Її хі о м ! 5 Е ' і | є Н ; о - 5 Ії ! | і Я о раса со лов лава ПС т ас р при ет соту ту : 5 ше не Ве РДА ї М и ти с Р х СТВА т Я СІРАДИЯ І . | | 5 : Її» е ЕЕ ві в ; Х Ї І 1: г 5 ' г ї КЗ, і : й СН НН ЕЗ : ЖЕ І | її. фінали тини травинки а ви а в оди З З 8 Ки в КК 6 4 й г ід ле її 5 . ня Й Б Т 500 БЛВУ суміш 4 повує се ! ї їв: ЩЕ ллють ДО днини нення дяннчннн 4 У КО Ми г
Фіг. З н вна а а а а о Б то в -- тво зав - і! і оно ка і сі Ї і зо вза БО 3 В - ОВУ Ї що Е ї Е зі 140 як отв Е в 1.1 185. з3в | Ї 2 і ОО Мо 196 о в бе 3 що зів ЗВ ро Ева 06000005 50035005 ї Бо 16 бен тов 48 7 ЖК кон рію щ 156 236 з Кі . - Бо ; ж Е 1їз що 50 Би як щ о. ш Н Н ярої | 7 тв ж ' , 54 іо я 1 236 за яв! д 1 лолаи В за Я» 0 змозі З с й: с - - за 125 450 375 аю 26 250 зу Зо о сті»
Фіг. З (продовження)
рія лит пакті аалалкі лі даллкою мя Хонтроль: Іво х з | г 2 я з, І їх зі ; 13 ва я у вві | ях ав Я І доз 8о та 5.0 с Я їз І Вр т ттттфрваюв , і : св) | Е! ! ше я ше о 5 . | п : 5 шк и ще шк ЛА АМЮ Ад ся с 55 50 7 ва 8 зай чо 12 Еф т тт халви яг я кі сСтанларти
З.З я їх - ше ше г! 11 І щк Н ї і Е Ех я і Її І ще С ії, і. п. НО ба тя РЕ и г ние Ваг ТИ їз Час / 58 ШК ША Ж яв з ; ! В ще ще Новий пролукт В 78 | : Н
Е і. ! і що зай | Ї і 107 ря Ко в: Н до є МИМО сі о ев да в за 75 то 125 т58 178 ой ІБ 250 275 ЗИ Е іднентетнт тн пекінес ко об М му А ЕЕ ЩЕ | з Стандарт мегилюреленілат ЩІ в ШИ х Її з «Її " | ПО зві | і / Її і в 148 д ЗЛЕ: ЕН т 2 мії ж й І й не я ШИНИ зва --ї во т ча з їБб57в 200 ТР 256 Еге Зав ща те Фіг, 4
І: я Ук ЧІ Що кт : Її ' СА?
Щі. хо ! т і І їх. пон Я МІШНЕЧА ВК В Ж я ЗНА 7 екцдекх гідоютиях КОДУ днстіасввіха. зарсоікне зародок ЗАЙодох: 7 пасніих сіврхотазе КОРІ; «мих свіумя ЗЙДОМНК МАРКОЮ ЗАрАЙЮНХ чутка яка дайюв пасерелнік вний пуста «дної ма середній ся Звіщій Ще стдай семи тої ТВі сто стор кекдії Фо ! «Ома кі «АСХЯ
4. В-
3 . Я» Ї ЩІ В - ск й згини не Е щ ШИ у Мо. пли и п п--о а вом однак кліті «одних тн вена Здноею, ЗАрНяох закін воском Жоріне клю ровек рних ЗНюМ, зкакх МКК УК вк скревня па. пізній а штидії сек тод 23 слжайй стащ «соді 5 «М З ЯКА Кк. : що
М. К ж і 1.
в. : Е їх й й | сяк Я ЯЩЕ ШО ЩЕ ШИНИ она пон; 21 оно они зЖсїнкя мфжоткях ворін зістоє хюсий заридоютародим 0 чяромох ниючі: пісокюсчих КРІНН: каток хитка зкродок зароміж. таром часте а ранніх ни сере ча пізній частка за ранній ня середній ка паній шткии ЕТАЛЙ віках стахко тої стад В , жом) Сця і КО ? сх ШИ і щу: 4 4 і І: | 13 пн. я Ши ж кине ) си. ж С Ж о тв : й Ме Я се Щі хо родом пвкімні ткхоіотмих КЕТрІНк Котов кнітсй ХКрОйКУХ запою Зарежик, вм тідижитні) водії» ласк: віта званні соеленійне ин п а оеотмоь КІЕЮкНк пкт: тла Місія чена ЩІ ства їянк ства ттвяй стаді гугї ія - З Й х ЧА : з :
я. Ї СОНЯ гу каш Ко Не 5 : її м : нн 0 НН НН Й т кої жна пол ЖБЇКЬ ліюток ккоскх зкртдоя пйрожоюк о ларолик вастоня слокмюю ХОріТЬ десунк евітну Заролик аріює: ЗВРОДОЄ двсосе і ранкій ми середній на пізні. муєтка, ма раїні; не серевнік мазей що свй «теці; стайй стадію сстада хлиліу щі; ТАСІ Є їх: !
щі. васівнх нійскиунию корихм лесгих кайуха Таросєх кролем хо зарукй. ча рюхиній. вассереум ма тиви хтали пд «таз
Фіг. 5 БИ (анкий тип) бо ха й ши 7 Ї501) ТОТСТТТСААСОТЕТССОПААСАСЕСТАТОАССОТТОВССТОСКАСТАЄ, в-317 1501) ЖКОТТУТСААСОТСТСТОВАХОАСС ТАСААССОТУТСВССТОССАСТАТ сиза-9 501 1 ЖСТСТТТСААСОТСТСТОЗАЛОАССТВСААССОТТТСОССТОсСАСТАХ тетьх55 (595) ТОТІСТТТСААСОТСТОСТООААСАСС- АсАТ СОсСТВОСАСТАТ
Фіг. 6 ї | бо Сежаре-іїхво (12 ОТОСАТІСТСТСАТТСТСАЛАЛОСТТТСТОСТАТТСАТСТІАТСВАТСТ беВАра-1-81 215 ЄТОСАТЕСТСТОД нн АССТТОСТУ ТЕ ССТСТОАТСААТОСТІ к сни СМИСЛОВИЙ праймер тво пекар ї-5И їЖОу -----АТТСЯСТКАТОСТТ ОАЕ них ть Секдрееіїтої 1 ААТСТАТРСАВТ АСОМ АТТ ТАТ ТК ЕКС ати М ї5о пьяАрен 1-5 805 ТТОТТТОТТАТТІТААТТІТТАКТТЕТТАВОТТОАТІТАСТОСАТТВІТО СЕВАЮЕ-ї-ох ОЗ) ТССтТуУТСТТАТТ---- ТТ ТТАнУ ТТ АСПТАСАТТТАССТОСАТІ СТО
151. Шк гра сеЖвро-і-БИ 4303 ОТСОАТСААТАСАТСТСТОСАТТАСССТОТІС ОСС ТСАСІ ТТ ох ПоЕКНг-і-61 137) СТІСАТОААТАСЬТСТОТАСУТТАСОСОТСТСТОСОСТТТСАСІТТТ ТОД 201 250 СеТАрг-1-Бу 178) ТІТТАТТТСАСТСССТТТІТСТССТоТАААТТТСТСТАТСТАТСТСТоТТо седаро-їеої (187 ТТСАТТТОВСТСОсТТТТ- СТО ТААКТТТОТСТАТСТАТОТОТОСТЕ "і Зоо СеваАВо-1-80 (228) САТОТААТТТТВТТТССТТТАСАТТАТАСАААТСВАААТССАТААТТТТА ЖЕАрені-ві 18355 СЕХОТААТТТТОТТТОСТТТАСАТТАТАСАКАТСААКІТССАТЕАТТТТА зі 350 СсетАре-ї- (геть БОБСТОСТІТСТТОТТТОСАТТОТСТТАТТАБОТТТІСАТСАБАСТ КА СЕРАВЕ- 1-5 ее; БОССТОСТІСТСТТОТТЕОСМТТОЇСТТАТТАССТТТТААТТАСАТТАХ зві | | | 406 сенАренІ1- и (528, СТЕОССТАССТІТАКТАТСТТАВАТОСТАВАСЬЬААТОАТТТАКТІТІТА СЕЖАВО-ізої (3351 СУКТСЕСТАССТІТААТАТСТОАВАТОСТАЛАСАКААТСАЛТТСТІТТТТА 481 ши | | «ка ПЕЖКрені-ту (378) ТАТІТАТОССТІСТСОИТОСТСООАТІТСТСТТІТТТААТТССТОКАСТТІ СботАро-іної (ЗВ) ТАТТТАТССОТІСТОССІОСТОЦОАТІ ОТО ТТААТІССТОВАСТІТ «51 Ю СевАрае-1-И (4ж8) СТОТАТАОЗАТОАТТТОСААТТТТСССЛАТТАСОСАТСТСТТТАСТТТОЄ ГЕЖАрІ-ї-ої (436) СТСТАТАСКАТЛАТТТССААТТТТЕССпАТТАСОСКТСТСТІТАСТттОС Ба Ен) СеЖАбВо-і- ВУ (ав) ААСОДАТТТОАЕКТЕТУСТТ. т тт ААХСТСАТАСАСАВОТО СЕЕАре-ітої (4861 ААССАТТТСТАСАТЕТТЄТТТОСОССАТТОСТТААТСТІВТАТАСАЛАТО 55Е Бо СсЖАрОНІщЩІ (БІ5)У Срдуеся тре ОВАТТХ ОСТ АМЕСАТАТАКОСАСТТТІСАЙ сеЖАВЕ-І-о1 (536) АТСАТАТСАТІСАСКААТОССААТТОСТІААКСАТАСАКОСАТТТТТСА 501 Бо СЕЖКрО-і-850 (554) ТІСАТІСАТТСТТТСАТеСАСАТСАбА-ТОСТІТТЕТОСТОТОСОо СеРАБЕ-І-ОЮ С58Б) ТІТСАТТОААТСТТІСАТОСАСАТСВАКАТОПАТТТТТТОСТОАТО НЯ г з--- Ні сантйсмисловий праймер СеВАБЕ-1-80 (503) АТОЇСТАТТСТСТІСААТСТАТСТТСААТДАВТССС СВК ТАТСТАТАВІ ОЗ
Фіг. 7
СежКОнь-ої (6315 -есТКоТАСТОТСТТОАКТСТАССТІС КТК ВЕН Еи т Шон 75о Седдра-і1-5у (653) САЙААСТСАССТААВОСТСТОТТТСОСЛААСТАССТОАТАКССТАТАТЕТ Севдре-їі-ої (ЄЮ 777 ОТТО НЕТ ЕЕООСАТССТАССТ АКА ння ня "НО-смисловий праймер 7Б3 ва? СЕБАФА- НВО 1703) ТОВСТА ЗАССТАСТТТ СТ ОАКТАААТТ АТО ТТ ОВСАЛАВАСТАВСЯХ сеВАЮаніної (594) ---СТСАТАВОСТАССТТАТСААТАААТТАТИТТТОСІКААААСТАССТТ зві 856 Совари-і-ВИ 3753 АТСАОТАТОТААКАТОАСТАЛАЛАСОСТАТСТТССССТАТААТАСТТААТ СеЕАрО-ї-ої ТЯМ АТСАСТАТОТААВАТОАСЬАКЕВАВОТАССТССОАСТОТЬАТАКТТААЇ В | Ен СЕЖАрЕ-1-5И 50035 АТТРАТААССАТАСААТТОВАСАВНТАСКАВАВОТСЄТТСАААТОСТА сЕНАДе-ітої 1790) АТТААТЛЬОССТАТЬАТТОСААСАСССТАСТААААЄСТОСТА МАСА я зо СЕБАрені-ВИ (ВБЗ) СТОСААСТАОТСТТТСВАТААОСТОС СТТАТОСТСТАТССААВСКТЄТА СеЕАра-і ої (80) СТОСЛАСТААССТТТСААТААССТТАВСЕТАТССТССАТОСАААСАТСТА зв Мо СевАВа-ь-яИ (502) СТАСАТТАТСАТСТАССТ ТАТІ ТТ ОССАДАСАСІЮССТАМАТО Тра СЕЖАОЕ--ої (8901 СТАССТТАТААСССАЄСТТАТІ ТТ ОССАВАСАСАСССЬКАСТАСТ ТІСТА 1091 1050 СеВАре-і-ЯП (351) ТОФТОБАТЕЮС тло ТЕСТІ Сежког-їі-с1 (840) ТОСТТСАТАТОСТ НН ОСССАВСТСВЦТАААТССТОСОАТОСТОСАЄ """НОчантисмисновий праймер зо5 І | Мо СеБАРЕ-1-5И (573 ААТЕУТОАСАТСАТТАТААСТ я нн ОАААСЬАТАК не нення сейдри-і-ої 550) ЗАОТІБАСАТСАТТАТААТТАТАТАТТ ТТ ЖАТЕСТТААСОСТАВОСТІ мої зї5а СОЖАРЕ-І-ВЮ. 11003) сени ТАТЕОАЮСТТ тини я ТАСАТАКСАТІСАССТ СотАЮЕ-і1-ої. 10943) ТССІТАСТТУТТАТТТАТСТІСТОАТОСТОССАТТЕСАТАКТАТТСКОСТ зіБі моб СЕЖАВЕ-і-5 СО29) ТІАСССАААВАСТАСАТОТЕСАССТАЄСААСТОВТОСАТАТОСААСАТТІ СежАвЕ-і-зі (1090) ТІЛОСТААЛААСТАВАТСТІСАЄСТАССЬАСТОВТССАТАІБСКАСАТТТ ігзї СЕТАре-і-5у 1078) ТОСАб СеТАрФ-і-о) (1140) ТОСАВ фіг. 7 (продовження)
-а -- й ї2е . е з Б стара З вія -х шо м пон божі З яд Ех й Ба М щ . в о В 20 хі як. щ- голи 2. В Ок Е рання середня пізня рання середня пізня рання середня пня орзння оеродня пізня сі стадія ствлія осталія стадію стадія остядів стадія сталі остання старія жтидія. сталі ї ї Й Шк и 5 51 СМуВаюї і езачмой
ФНг. 8 і 15 Н ла 7 не: к ! І І '
5 І. сф 1 й ов ' 5 ов | ЛЕЩВ о В : : ТЕ | ІЗРоно сво і ! щ г і ага Е: пк | | : Ї п ; : : | ще Й Н о - й що Гм ! : листок о корінь Зародок назародок на зародок на Я анти еередніІй тиЗНІН й : стадії стадії стад : тканини сафлору
Фіг. 9 і А. Пуродава (0.0689)
О. ецгорава (0.1148)
А. Інайзпа (0.0255)
! р. зорніа (0.017903
В. парив (0.0308)
б. Віоба (0.2363) - ж р, оіегасеа (0.1809) І " пе, Ниссогів (0.4487) пиши сигсаб5 (0,0965)
-Р., ніспосагра (0.0408)
Фіг. 10 7 лад діжуялглінсринів (ОО) У 8317 порівняно з 53174605, визначення з використанням аналізу за : допомогою 1С-М5 одного насіння А ї тона а опо отитті нуту спішіть шелкєкинт и ; 50 - по інтер м розд тд пот ока о оті г дит педпорто пшенітоссот- 0 БАХ У Насіння З і ща що. До у В п ПИ пеннннннани дням педа б5яло Лавсіних З ! ї я : ц Г15317 Насіння З : ; Е то го пниижжнлжжчжлжлжлдлдлдлжлжлдт линии лм нини о пи я шІ5БО3а Насіння З І 20 Дод опиту тотожне окт якоттнтятя сл пеки І" щоаоопетеннояю ШЕ БОДа Насіння? : Кн ! хорт сід для туонтттиттятиттяити тут . --Ї ооо пон пня ШЕ їхБох я Насіння є ! ІЙ ЇЇ її | и м жтебо3а Насінні 5 В й І й І й й Й Ж5603.3 Бішіння б : ПАС ОО ВАб ПАБ ПАС бле о бде Або раб раб б ЗАб пПАб ЗА брАдб ПАБ : Іза) 13) (32:23 (3450) (34:1) (34:2) (3а:3) (344) (360) (36:21) (3622) (36:3) (36:4) (36:53 (3Б:БІ :
Фіг. 1
UAA201412633A 2012-04-25 2013-04-24 Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти UA116538C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261638447P 2012-04-25 2012-04-25
AU2012903992A AU2012903992A0 (en) 2012-09-11 High oleic acid oils
PCT/AU2013/000426 WO2013159149A1 (en) 2012-04-25 2013-04-24 High oleic acid oils

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA116538C2 true UA116538C2 (uk) 2018-04-10

Family

ID=49477642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201412633A UA116538C2 (uk) 2012-04-25 2013-04-24 Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти

Country Status (18)

Country Link
US (2) US10323209B2 (uk)
EP (1) EP2840886B1 (uk)
JP (1) JP6458218B2 (uk)
KR (1) KR102208924B1 (uk)
CN (1) CN104619164B (uk)
AU (1) AU2013252489B2 (uk)
BR (1) BR112014026900A2 (uk)
CA (1) CA2871503C (uk)
EA (1) EA035715B1 (uk)
HK (1) HK1207938A1 (uk)
IN (1) IN2014MN02355A (uk)
MX (2) MX2014012941A (uk)
NZ (1) NZ631696A (uk)
PH (1) PH12014502381B1 (uk)
SG (1) SG11201406843WA (uk)
UA (1) UA116538C2 (uk)
WO (1) WO2013159149A1 (uk)
ZA (1) ZA201408233B (uk)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2693630C (en) 2006-07-14 2021-08-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Altering the fatty acid composition of rice
WO2009129582A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
NZ631696A (en) 2012-04-25 2017-02-24 Grains Res & Dev Corp High oleic acid oils
EP3080250A1 (en) 2013-12-10 2016-10-19 The University of York Desaturase nucleic acids and polypeptides
ES2969618T3 (es) 2014-07-07 2024-05-21 Nuseed Global Innovation Ltd Procesos para producir productos industriales de lípidos vegetales
WO2017083920A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Rice grain with thickened aleurone
CN105532924A (zh) * 2015-12-09 2016-05-04 四川飚毅中药材科技有限公司 一种白芍子油
US11859193B2 (en) 2016-09-02 2024-01-02 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants with modified traits
US10844224B2 (en) * 2017-07-17 2020-11-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Bio-based composites, composite materials, and adhesives
US11913006B2 (en) 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids
EP3890492A4 (en) * 2018-12-03 2022-11-09 Newleaf Symbiotics, Inc. METHODS FOR OBTAINING AND USING PLANTS AND PARTS OF PLANTS WITH INCREASED NUTRIENT, OIL AND/OR PROTEIN CONTENT
CN110106019A (zh) * 2019-05-20 2019-08-09 无限极（中国）有限公司 一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法
WO2022251893A1 (en) * 2021-05-31 2022-12-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Elite safflower event
CN116121092B (zh) * 2022-11-01 2024-07-02 四川大学 多重胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0714349B2 (ja) 1983-01-17 1995-02-22 モンサント カンパニ− 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US4918811A (en) 1986-09-26 1990-04-24 General Electric Company Multichip integrated circuit packaging method
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US4948811A (en) 1988-01-26 1990-08-14 The Procter & Gamble Company Salad/cooking oil balanced for health benefits
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5276264A (en) * 1991-01-09 1994-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower products having lower levels of saturated fatty acids
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
AU3073592A (en) 1991-11-15 1993-06-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Beta -ketoacyl-acp synthetase ii genes from plants
AU6178194A (en) 1993-03-11 1994-09-26 National Research Council Of Canada Enhanced regeneration system for cereals
CA2092588C (en) 1993-03-26 2008-07-08 Narender S. Nehra Enhanced regeneration system for cereals
GB9524938D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Zeneca Ltd Modification of starch synthesis in plants
CA2547678A1 (en) 1996-07-03 1998-01-04 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
US7109392B1 (en) 1996-10-09 2006-09-19 Cargill, Incorporated Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
KR20010013431A (ko) 1997-06-05 2001-02-26 칼진 엘엘시 디아실글리세롤 아실 트란스페라제 단백질
US5912416A (en) * 1997-08-05 1999-06-15 California Oils Corporation Safflower products with very high levels of unsaturated fatty acids
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6100447A (en) 1998-02-12 2000-08-08 Applied Phytologics, Inc. Method of barley transformation
JP2002528048A (ja) 1998-03-20 2002-09-03 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー リムナンテス属油の遺伝子
KR20010042069A (ko) 1998-03-20 2001-05-25 베니텍 오스트레일리아 리미티드 유전자 발현 조절방법
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
DE69939426D1 (de) 1998-06-24 2008-10-09 David Gladstone Inst Diacylglycerin o-acyltransferase
US6344548B1 (en) 1998-06-24 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Diacylglycerol o-acyltransferase
US7135617B2 (en) 1998-07-02 2006-11-14 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
ATE442435T1 (de) 1998-07-02 2009-09-15 Calgene Llc Diacylglyzerin-acyltransferase proteine
DE69943392D1 (de) 1998-08-20 2011-06-09 Du Pont Gene für fettsäuremodfizierende enzyme von planzen und damit verbundene bildung von konjugierten doppelbindungen
US6100077A (en) 1998-10-01 2000-08-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of a gene encoding diacylglycerol acyltransferase
CA2703147C (en) 1998-12-02 2014-07-29 Karlene H. Butler Plant diacylglycerol acyltransferases
AU2166400A (en) 1998-12-04 2000-06-19 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
CA2355845C (en) 1998-12-17 2008-08-05 National Research Council Of Canada Diacylglycerol acyltransferase gene from plants
JP2002541783A (ja) 1999-04-01 2002-12-10 ビーエーエスエフ プランド サイエンス ゲーエムベーハー トリアシルグリセロール生成の生合成経路における新規クラスの酵素および該酵素をコードする組換えｄｎａ分子
AUPQ005299A0 (en) 1999-04-29 1999-05-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor
CA2372632C (en) 1999-05-04 2011-02-15 Basil S. Shorrosh Plant acyltransferases
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
AUPQ574200A0 (en) 2000-02-21 2000-03-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Starch branching enzyme
US6974898B2 (en) 2000-04-18 2005-12-13 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method of modifying the content of cottonseed oil
EP1331845B1 (en) 2000-11-09 2012-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with reduced ssii activity and starch containing products with a reduced amylopectin content
AUPR324101A0 (en) 2001-02-21 2001-03-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel gene and uses therefor to modify pasture qualities of crops
US20030161831A1 (en) 2001-02-23 2003-08-28 Sylvaine Cases Mono-and diacylglycerol acyltransferases and methods of use thereof
US7045326B2 (en) 2001-02-23 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Mono- and diacylglycerol acyltransferases and methods of use thereof
EP2302060B1 (en) 2002-03-16 2012-07-25 The University of York Desaturases
US7566813B2 (en) * 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
AUPS219802A0 (en) 2002-05-09 2002-06-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products with a reduced amylopectin content
AR039716A1 (es) 2002-06-21 2005-03-09 Monsanto Technology Llc Secuencias de acidos nucleicos relacionadas con tioesterasas y metodos de uso para la produccion de plantas con composicion de acidos grasos modificada
MXPA05001239A (es) 2002-07-31 2005-06-08 Monsanto Technology Llc Secuencias de acidos nucleicos de diacilglicerol aciltransferasa y productos asociados.
CN1705748A (zh) 2002-08-12 2005-12-07 孟山都技术有限公司 用于增加植物中总的油类水平的方法
KR101228720B1 (ko) 2003-06-30 2013-02-01 리마그라인 씨리알레스 인그리디언츠 에스에이 변경된 분지 효소작용과 녹말을 가지는 소맥과 이로부터유도된 생성물을 포함하는 녹말
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
EP1692289B1 (en) 2003-10-27 2012-01-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Rice and products thereof having starch with an increased proportion of amylose
WO2005063988A1 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of oil traits in plants
CA2497087A1 (en) 2004-03-09 2005-09-09 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel genes encoding proteins involved in proanthocyanidin synthesis
US8049069B2 (en) 2004-03-31 2011-11-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes involved in plant fibre development
CA3056110C (en) 2004-04-22 2020-07-14 Surinder Pal Singh Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US7700139B2 (en) 2004-12-30 2010-04-20 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization Method and means for improving bowel health
US7993686B2 (en) 2004-12-30 2011-08-09 Commonwealth Scientific And Industrial Organisation Method and means for improving bowel health
AU2006249983B2 (en) 2005-05-23 2011-03-17 Arcadia Biosciences, Inc. Safflower with elevated gamma-linolenic acid
US7932440B2 (en) 2005-09-08 2011-04-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Cotton variety
CA2626304C (en) 2005-10-20 2015-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Cereals with altered dormancy
EP1806398A1 (en) 2006-01-04 2007-07-11 Monsanto S.A.S. Fad-2 mutants and high oleic plants
RU2392795C2 (ru) * 2006-02-13 2010-06-27 Монсанто Текнолоджи Ллс Конструкции нуклеиновой кислоты и способы получения масла с измененным составом из семян
GB2436068A (en) 2006-03-18 2007-09-19 Ernest Mark Talbot Surgical contact lens
EP1837397A1 (en) 2006-03-21 2007-09-26 Monsanto S.A.S. FAD-2 mutants and high oleic plants
CA2693630C (en) 2006-07-14 2021-08-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Altering the fatty acid composition of rice
BRPI0716075A2 (pt) 2006-08-29 2013-08-06 Commw Scient Ind Res Org sÍntese de Ácidos graxos
CA2592533A1 (en) 2007-01-11 2008-07-11 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel gene encoding myb transcription factor involved in proanthocyanidin synthesis
EP1944375A1 (en) 2007-01-11 2008-07-16 Monsanto S.A.S. FAD2 mutants and high oleic acid plants
NZ554114A (en) 2007-04-23 2010-01-29 Agres Ltd Plants with an increased ratio of oleosin to TAG synthesising enzymes
US8143473B2 (en) 2007-05-24 2012-03-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company DGAT genes from Yarrowia lipolytica for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in soybean
US8847010B2 (en) 2007-06-15 2014-09-30 Biotechnology Foundation, Inc. Engineered tobacco biomass with increased oil production
WO2008157827A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Michigan State University Modified composition of plant extracellular lipids using acyltransferases and fatty acid omega-oxidases
EP2181349B1 (en) 2007-08-06 2019-05-29 Canon Kabushiki Kaisha Image sensing apparatus
WO2009027335A2 (en) 2007-08-28 2009-03-05 Basf Plant Science Gmbh Polypeptides, such as lipases, capable of altering the seed storage content in transgenic plants
CA2706805A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Plants with modified starch metabolism
CA2712284C (en) * 2007-12-20 2021-08-31 Dow Agrosciences Llc Low saturated-fat sunflower and associated methods
ES2610482T3 (es) 2007-12-21 2017-04-27 National Research Council Of Canada Genes de la diacilglicerol aciltransferasa 2 y proteínas codificadas por los mismos procedentes de algas
US8115067B1 (en) 2008-03-27 2012-02-14 Syngenta Participations Ag Soybean cultivar 05KG030123
US7993666B2 (en) 2008-04-18 2011-08-09 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods and compositions for treating pain comprising a statin
WO2009129582A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
CA2722276A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
CA2990650C (en) 2008-05-23 2021-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel dgat genes for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in oilseed plants
CA2653883C (en) 2008-07-17 2022-04-05 Colin Leslie Dow Jenkins High fructan cereal plants
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
CA2768737A1 (en) 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
BR122021003836B1 (pt) 2008-11-18 2022-02-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polinucleotídeo isolado e/ou exógeno que não ocorre de forma natural, vetor e método para produzir óleo contendo ácidos graxos insaturados
US8507754B2 (en) 2009-01-31 2013-08-13 University Of North Texas Engineering lipids in vegetative tissues of plants
SG178164A1 (en) 2009-07-30 2012-03-29 Commw Scient Ind Res Org Barley and uses thereof
WO2011062748A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Sucrose transporter genes for increasing plant seed lipids
AU2011274301B2 (en) 2010-06-28 2015-06-11 Nuseed Global Innovation Ltd Methods of producing lipids
CN103298940B (zh) 2010-11-04 2015-11-25 阿里斯塔谷类科技有限公司 高直链淀粉的小麦
US9311457B1 (en) 2011-11-02 2016-04-12 Google Inc. Platform for cloud application software
US9357722B2 (en) 2011-11-04 2016-06-07 Arista Cereal Technologies Pty Limited High amylose wheat-II
US8735111B2 (en) 2011-12-27 2014-05-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing hydrocarbon products
US8809026B2 (en) 2011-12-27 2014-08-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
EP2798063B1 (en) 2011-12-27 2022-03-30 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof
NZ631696A (en) 2012-04-25 2017-02-24 Grains Res & Dev Corp High oleic acid oils

Also Published As

Publication number Publication date
EA201491956A1 (ru) 2015-04-30
HK1207938A1 (en) 2016-02-19
WO2013159149A1 (en) 2013-10-31
AU2013252489B2 (en) 2018-04-26
KR20150023296A (ko) 2015-03-05
MX2014012941A (es) 2015-06-03
KR102208924B1 (ko) 2021-01-29
NZ631696A (en) 2017-02-24
EP2840886A4 (en) 2015-12-23
CA2871503A1 (en) 2013-10-31
PH12014502381A1 (en) 2015-01-26
AU2013252489A1 (en) 2014-11-13
EA035715B1 (ru) 2020-07-29
JP6458218B2 (ja) 2019-01-30
SG11201406843WA (en) 2014-11-27
US10323209B2 (en) 2019-06-18
CA2871503C (en) 2023-08-29
EP2840886A1 (en) 2015-03-04
US20130288318A1 (en) 2013-10-31
CN104619164A (zh) 2015-05-13
MX2020003964A (es) 2020-08-03
US11124737B2 (en) 2021-09-21
JP2015520257A (ja) 2015-07-16
ZA201408233B (en) 2016-03-30
US20190330558A1 (en) 2019-10-31
PH12014502381B1 (en) 2015-01-26
IN2014MN02355A (uk) 2015-08-14
EP2840886B1 (en) 2020-08-12
BR112014026900A2 (pt) 2017-07-11
CN104619164B (zh) 2018-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA116538C2 (uk) Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти
JP7086329B2 (ja) エリートイベントキャノーラｎｓ－ｂ５００２７－４
US20220162630A1 (en) Inbred transgenic canola line ns-b50027-4 and seeds thereof
CN105475117B (zh) 大豆种子和油的组成以及产生所述种子的方法
CN102202498B (zh) 改良的棉籽油及应用
UA119739C2 (uk) Метод отримання ліпідів
UA124137C2 (uk) Спосіб одержання вуглеводневого продукту
US20160186195A1 (en) Modification of soybean seed composition to enhance feed, food and other industrial applications of soybean products
US20240237600A1 (en) Elite safflower event
CA3220877A1 (en) Elite safflower event
WO2023077199A1 (en) Modified cereal grain
TR2023016185T2 (tr) Seçkin Aspir Olayı
NZ788009A (en) Elite event canola ns-b50027-4