KR20010013431A - 디아실글리세롤 아실 트란스페라제 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1,2-디아실글리세롤 및 아실-CoA로부터의 트리글리세라이드의 생산을 촉진할 수 있는 아실트란스페라제 단백질을 제공한다. 본 발명은 지방 아실-CoA 및 디아실글리세롤 기질로부터의 트리아실글리세롤의 형성에 활성이 잇는 부분적으로 정제된 디아실글리세롤 아실트란스페라제(DAGAT)를 포함한다. 본 발명은, 특히, 분자질량이 약 40kDa인 모르티에렐라 라만니아나 DAGAT에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DAGAT 단백질로부터 얻을 수 있는 아미노산 및 핵산 서열, 및 이러한 서열을 사용하여, 변화된 트리아실글리세롤 수준을 지닌 유전자 전이 숙주 세포를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

디아실글리세롤 아실 트란스페라제 단백질{DIACYLGLYCEROL ACYL TRANSFERASE PROTEINS}

식물오일은 다양한 산업에서 식용으로 사용되고 있다. 새로운 식물 오일 조성물 및/또는 생합성 또는 천연 식물 공급원으로부터 오일 조성물을 수득하는 개선된 수단이 요구되고 있다. 오일의 의도된 사용에 따라서, 다양하게 상이한 지방산 조성물이 요구되고 있다. 예를들어, 어떠한 경우에는 높은 비율의 오일 대 씨드 가루로 구성된 오일씨드가 저비용으로 요구되는 오일을 얻는데 유용할 수 있다. 이러한 오일씨드는 전형적인 고가의 오일 생성물이다. 이러한 오일씨드는 우수한 동물용 사료가 될 수 있다. 어떠한 경우에는 낮은 비율의 오일 대 씨드 가루로 구성된 오일씨드가 저칼로리 생성물에 유용할 수 있다. 다른 사용에 있어서, 높은 비율의 불포화 지방산으로 구성된 식용 식물오일은 심혈관의 건강을 위해 요구되고 있다. 또한, 팜, 코코넛 또는 코코아와 같은 높은 포화 열대 식물오일로 약간 대체된 대체물이 다양한 산업분야 및 식품분야에 사용될 수 있다.

상기된 오일 및/또는 개질된 지방산 조성물을 얻을 수 있는 것으로 가정되는 한가지 방법은 식물을 유전자 조작하는 방법이다. 그러나, 식물을 유전자 조작하기 위해서는, 유전 물질을 안정하고 유전적인 방법으로 식물에 전달하는 수단이 있어야 한다. 또한, 요구되는 표현 결과을 생성할 수 있는 핵산서열, 및 그러한 서열의 정확한 적용을 유도할 수 있는 조절 영역 등이 있어야 한다. 또한, 요구되는 표현형을 얻기 위해서는, 글리세로리피드 합성을 위한 케네디 패쓰웨이(Kennedy Pathway)가 반응물과 경로를 통한 대사 유출물의 비율이 조정되고 변화되는 범위로 변화되는 것이 요구될 것이다.

고등 식물은 일반적인 대사 경로를 통해 오일을 합성하는 듯하다. 지방산은 지방상 합성효소(Fatty Acid Synthetase: FAS)로 집합적으로 알려진 효소에 의해 촉진된 일련의 반응을 통해서 색소체에서 아세틸-CoA로부터 생성된다. 색소체에서 생성된 지방산은 세포의 세포질 구역으로 운반되고, 보조효소 A로 에스테르화 된다. 이러한 아실-CoA는 소모체(ER)에서의 글리세로리피드 합성을 위한 기질이다. 글리세로리피드 합성은 일단 포스파티드산(PA)과 디아실글리세롤(DAG)를 유도하는 일련의 반응이다. 제조된다. 이들 대사 중간체는 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜에탄올아민(PE) 또는 포스파티딜콜린(PC)와 같은 막 포스포리피드로 유도되거나, 중성 트리아실글리세롤(TAG), 즉, 씨드 발아 동안 사용되는 저장된 에너지의 형태로서 씨드에 의해 사용된 식물 오일의 일차 성분을 형성하도록 유도될 수 있다.

디아실글리세롤(DAG)은 글리세롤-3-포스페이트 아실트란스페라제(G3PAT), 및 PA를 합성하기 위한 리소포스파티드산 아실트란스페라제(DAGAT)에 의해 연속적으로 촉진된 두 단계, 이어서, DAG를 합성하기 위한 포스파티드산 포스파타제(PAP)에 의해 촉진된 추가의 가수분해 단계에 의해서 글리세롤-3-포스페이트 및 지방산-CoA로부터 합성된다. 대부분 세포에서, DAG는 막 포스포리피드를 생성시키는데 사용된다. 첫 번째 단계는 CTP-포스포콜린 시티딜트란스페라제에 의해 촉진된 PC의 합성단계이다. 저장 오일을 생성하는 세포에서, DAG는 디아실글리세롤 아실트란스페라제(DAGAT)에 의해 촉진된 반응에서 제 3의 지방산으로 아실화된다. 대체적으로, 어떠한 일부를 형성하는 반응은 일반적으로 케네디 패쓰웨이라 일컬어진다.

지방산의 위치 특이성에 관한 한 TAG의 구조는 지방 아실 CoA와 글리세롤 골격 기질을 위한 각각의 세가지 아실트란스페라제의 특이성에 의해 측정된다. 따라서, 예를 들어, 많은 온대지방 씨드 종으로부터의 아실트란스페라제는 sn-1 또는 sn-3 위치에서 포화되거나 불포화된 지방산이 형성되게 하는 경향을 나타내지만, sn-2에서는 단지 불포화된 지방산이 형성되게 하는 경향을 나타낸다. sn-2에서 불포화된 지방산에 대한 절대적인 특이성은 DAGAT 효소의 기질 선호에 의해서 측정된다. 코코아와 같의 몇가지 종에서, TAG 조성물은 이러한 경향이 수행되어, sn-1위치가 포화된 지방산으로 에스테르화되는 경우 sn-3 위치를 포화된 지방산으로 아실화시키는 명백한 선호가 있다는 것을 제시하고 있다. 따라서, USU(여기서, S는 포화된 지방산이고, U는 불포화된 지방산이다) 형태의 높은 비율의 TAG가 있으며, 이러한 사항은 불포화된 지방산으로 고정된 sn-2 위치를 지닌 전체 지방산 조성물을 기본으로 하는 무작위 분포로부터 예측될 수 있다. 이러한 결과는 DAGAT가 TAG 구조의 조절에 중요한 역할을 하며, 그렇지 않다면, TAG 합성의 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다.

DAGAT에 의해 촉진된 반응은 글리세롤리피드 생합성중의 중요한 분기점에서 일어난다. 그러한 분기점에서의 효소는 대사 조절 부위에 대한 제 1의 효소인 것으로 여겨진다. 디아실글리세롤의 합성을 통해서, TAG 및 막 지질 합성은 공통적으로 G3PAT, DAGAT, 및 PAP를 공유한다. 모든 세포는 막을 지니고 있기 때문에, 효소를 지녀야 한다. 오일합성이 독특한 것은 DAGAT 반응이다. DAGAT 활성의 존재는 막으로 유입되는 DAG를 위한 또 다른 지방을 제공한다. TAG의 합성을 유도하는 것은 DAGAT 효소의 존재이고, 직접적으로 또는 간접적으로 조절 케스케이드를 통해서 DAGAT 활성 및/또는 디아실글리세롤 농도가 글리세로리피드내로의 유출물을 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 생각하는 것이 논리적이다.

지방산을 글리세롤 골격으로 혼입시켜 오일을 생성시키는데 있어서의 표현형 결과를 생성시킬 수 있는 핵산서열을 얻는 것은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 목적하는 대사 인자의 동정, 유용한 운동 특성에 의한 단백질 공급원의 선택 및 특성화, 아미노산을 서열화할 수 있는 수준으로의 단백질의 정제, 바람직한 DNA 서열을 회복시키는 프로브로서 사용할 수 있는 핵산서열을 얻기 위한 아미노산 서열 데이타의 이용, 및 구성물의 제조, 및 생성된 식물의 형질전환 및 분석을 포함한 다양한 문제에 직면할 것이다.

따라서, 효소표적, 및 오일 구조 및 양을 변화시킬 수 있는 효소 표적의 핵산서열에 유용한 조직 공급원을 동정하는 것이 요구되고 있다. 이상적으로는, 효소 표적은 단독으로 하나 이상 사용되거나, 오일 생성의 증가/감소, TAG 구조, 지방산 풀에서의 포화 대 불포화 지방산의 비율, 및/또는 지방산 풀로의 변화의 결과로서 다른 새로운 오일 조성물과 관련된 다른 핵산 서열과 조합물로 사용될 수 있다. 효소 표적이 동정되고 정량화되면, 단백질의 양 및 정제 원안이 서열화에 요구된다. 궁극적으로, 표현형 변화를 제공하는 필요한 구성요소를 지니는 유용한 핵산 구성물 및 그러한 구성물을 함유하는 식물이 요구된다.

몇가지의 추정성 분리 방법이 DAGAT에 대해서 공개되었다. 폴로코프(Polokoff) 및 벨(Bell)(1980)은 래트의 간 마이크로소옴으로부터의 DAGAT의 용해방법 및 부분 정제 방법을 보고하였다. 이러한 제제는 활성과 관련된 특정의 단백질 인자를 동정할 만큼 충분하게 순수하지 못했다. 완유엔(Kwanyuen)과 윌슨(Wilson)(1986, 1990)은 대두 떡잎으로부터 얻은 효소의 정제방법 및 특성화 방법을 보고하였다. 그러나, 분자량(1843kDa)은 이러한 제제가 광범위하게 용해되지 않으며, 이에 함유된 DAGAT 단백질이 많은 단백질의 거대한 응집체의 일부라는 것을 시사하고 있다. 리틀(Little)(1993)등은 유채의 작은 홀씨-유도된 배아로부터 얻은 DAGAT의 용해 방법을 보고하고 있지만, 완유엔과 윌슨에서와 같이, 활성과 관련이 있는 물질의 분자량이 대단히 커서, 완전한 용해가 어렵다. 앤더슨(Andersson)(1994)등은 면역 친화성 크로마토그래피를 이용하여 래트의 간에서 얻은 DAGAT의 415-배 정제 방법 및 용해 방법을 보고하였다. 그러나, 그들이 사용한 항체가 DAGAT 에피토프를 인식한다는 증거가 없을 뿐만 아니라, 그들이 정제한 단백질이 실질적으로 DAGAT라는 증거가 없다. 그러므로, 완유엔과 윌슨의 보고에서와 같이, 제제중의 DAGAT 활성은 응집된 막 단백질에서 전형적인 분자량을 나타낸다. 마지막으로, 가미사카(Kamisaka)(1993, 1994, 1996, 1997)등은 모르티에렐라 라마니아나(Mortierella rammaniana)로부터 얻은 DAGAT의 용해 방법 및 균질한 상태로의 정제 방법을 보고하고 있다. 이들의 문헌은 이러한 균류로부터 얻은 DAGAT가 53kDa의 분자량을 지니고 있다는 것을 증명하고 있는데, 이 문헌은 실질적으로 용해될 수 있는 DAGAT를 처음으로 공개하고 있는 보고서이다. 본 발명자들은 본 발명자의 실험실에서 상기 문헌의 연구자들이 수행한 연구를 재현해보았지만(참조, 실시예 4), 균질한 제제를 얻을 수 없거나, 효소활성이 53kDa 폴리펩티드와 관련이 없었다. 그러므로, 본 발명자들은 가미사카등에 의해 청구된 것중 하나인 광범위한 53-kDa 폴리펩티드가 그들의 원안을 사용함으로써 얻은 분획중에서 DAGAT 활성과 상호관련되지 않는 다를 것을 입증할 수 있었다.

관련 문헌

발생중인 호호바 배(胚)로부터의 세포 비함유 균질물은 아실-CoA 지방 알코올 아실 트란스페라제 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 활성은 분획원심분리시에 형성된 부유 왁스 패드와 관련이 있었다 [참조: Pollard et al. (1979) supra; Wu et al. (1981) supra].

지방 아실-SCoA 트란스페라제 활성을 갖는 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis)로부터의 다중효소 복합체의 용해도는 윌드너(Wildner)와 할릭(Hallick)에 의해 보고되었다 [참조: Abstract from The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting, April 22-24, 1990, Las Cruces, NM.].

호호바 아실-CoA: 알코올 트란스페라제 단백질의 10배 정제는 푸쉬닉(Pushnik) 등에 의해 보고되어 있다 [참조: Abstract from The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting, February 7, 1989, Riverside, Ca.].

호호바 아실-CoA: 알코올 트란스페라제 활성에 대한 검정은 가버(Garver) 등에 의해 보고되었다 [참조: Analytical Biochemistry (1992) 207:335-340].

WO 93/10241호는 식물 지방 아실-CoA:지방 알코올 0-아실트란스페라제에 관한 것이다. 호호바 57kD 단백질은 호호바 지방 아실-CoA:지방 알코올 0-아실트란스페라제 (왁스 신타제)로서 확인된다. 본 발명자들은 그 후 호호바로부터의 57kD 단백질이 매우 긴 사슬의 지방산의 생합성에 관여하는 β-케토아실-CoA 신타제라는 것을 보고하였다 [참조: Lassner et al. (The Plant Cell (1996) 8:281-292)].

아실-CoA:지방 알코올 아실트란스페라제인 것으로 가정되는 57kD 호호바 종자 폴리펩티드의 광친화성 표지화는 샤키(Shockey) 등에 의해 또한 보고되었다 [참조: Plant Phys. (1995) 107:155-160].

문헌[Kamisaka and Nakahara, "Characterization of the Diacylglycerol Acyltransferase Activity in the Lipid Body Fraction from an Oleaginous Fungs", J. Biochem. (1994) 116: 1295-1301].

문헌[Kamisaka and Nakahara, "Activation of Detergent-Solubilized Diacylglycerol Acyltransferase by Anionic Phospholipids", J. Biochem. (1996) 119:520-523].

문헌[Kamisaka et al., "Purification and Characterization of Diacylglycerol Acyltransferase Activity from the Lipid Body Fraction from an Oleaginous Funus", J. Biochem. (1997) 121:1107-1114].

WO 93/10241호는 식물 지방 아실-CoA:지방 알코올 0-acyltransferase에 관한 것이다. 호호바 57kD 단백질(jojoba 57kD protein)은 호호바 지방 아실-CoA:지방 알코올 0-아실트란스페라제(와스 신타제)로 동정된다. 상기 발명의 발명자는 이후에 호호바로부터 얻은 57kD 단백질이 아주 장쇄 지방산의 생합성과 관련된 β-케토아실-CoA 신타제이다[문헌: Lassner et al., The Plant Cell (1996) 8:281-292].

본 발명은 효소, 이러한 효소를 정제하고 수득하는 방법, 이러한 효소와 연관된 아미노산 및 핵산 서열, 및 유전자를 조작하는데 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 제 1의 왁스 신타제 정제 프로토콜로부터의 칼럼 분획 중의 왁스 신타제 활성의 분석의 결과를 도시한다. 도 1a는 블루(Blue) A 아가로스 크로마토그래피의 결과를 제공한다. 도 1b는 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피의 결과를 제공한다. 도 1c는 세파크릴(Sephacryl) S-100 크기별 배제 크로마토그래피의 결과를 제공한다. 도 1a는 수산화인회석 크로마토그래피의 결과를 제공한다.

도 2는 제 2의 왁스 신타제 정제 프로토콜로부터의 칼럼 분획 중의 왁스 신타제 활성의 분석의 결과를 도시한다. 도 2a는 블루(Blue) A 아가로스 크로마토그래피의 결과를 제공한다. 도 2b는 수산화인회석 크로마토그래피의 결과를 제공한다. 도 2c는 수퍼덱스(Superdex) 75 크기별 배제 크로마토그래피의 결과를 제공한다.

도 3은 도 1에 도시된 왁스 신타제 정제 방법에 따라서 정제된 왁스 신타제 제제로부터의 분획중의 왁스 신타제 및 DAGAT 활성의 결과를 나타낸다. 결과는 히드록시애퍼타이트 크로마토그래피 단계에 따라 수득된 분획으로부터 생성된다.

도 4는 옐로우 86-아가로스 크로마토그래피(Yellow 86-Agarose Chromotography)를 이용한 DAGAT 정제 원안으로부터의 컬럼 분획중의 와스 신타제 활성에 대한 분석 결과를 나타낸다.

도 5는 제 2 왁스 신타제 정제 원안으로부터의 컬럼 분획중의 DAGAT 활성에 대한 분석 결과를 나타낸다. 도 5a는 헤파린 세파로스 CL-6B 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. 도 5b는 피크 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.

도 6a는 옐로우 86-아가로스 크로마토그래피로부터의 DAGAT 정제 결과를 나타낸다. 도 6b는 옐로우 86-아가로스 크로마토그래피로부터의 피크 분획에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.

도 7은 옐로우 86-아가로스 크로마토그래피를 이용한 모르티에렐라 라마리아나로부터의 DAGAT의 정제 결과를 나타낸다.

도 8은 제 2 왁스 신타제 정제 원안으로부터의 컬럼 분획중의 DAGAT 활성에 대한 분석결과를 나타낸다. 도 8a는 히드록시애퍼타이트 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. 도 8b는 피크 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.

도 9는 DAGAT 정제 원안으로부터의 컬럼 분획중의 DAGAT 활성의 분석 결과를 나타낸다. 도 9a는 직렬식 옐로우 86-아가로스/히드록시애퍼타이트 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. 도 9b는 직렬식 크로마토그래피로부터의 피크 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.

본 발명에 의하면, 이하 DAGAT로 일컬어지는 디아실글리세롤 아실트란스페라제의 조성물 및 이의 사용방법이 제공된다. 또한 본 발명은 생물학적 활성 DAGAT(들)과 관련된 아미노산 서열의 조성물 및 이의 사용방법이 제공된다.

특히, 상대적으로 높은 특이적 활성을 지니는 DAGAT 단백질 제제가 시험관내 및 생체내 다양한 적용에 대한 관심의 대상이 되고 있다. 특히, DAGAT 활성을 지닌 단백질 제제가 이하 설명되고 있다. 특히 관심의 대상이 되고 있는 DAGAT는 모르티에렐라 라마니아나로부터 얻을 수 있는 DAGAT이다.

또한 본 발명에서 관심의 대상이 되고 있는 것은 본 발명의 호호바 왁스 신타제가 디아실글리세롤(DAGAT) 활성을 나타낸다는 발견이다. TAG는 호호바에서 자연적으로 분리되지 않으며, 그로 인해서, DAG 기질과의 왁스 신타제 효소의 활성은 왁스 신타제가 DAGAT, 즉, 대부분의 식물종에서, 특히 씨드가 고수준의 저장성 TAG를 함유하는 오일씨드 농작물에서 TAG의 생성에 관여하는 효소와 관련이 있다는 것을 제시하고 있다. 따라서, 호호바 왁스 신타제 단백질 및/또는 DAGAT를 암호화하는 식물 유전자의 분리를 위한 상기 단백질의 암호서열의 용도가 본 발명에서 고려되고 있다.

예시된 호호바 및 모르티에렐라 라마니아나 DAGAT는 막과는 다르게 정제되며(즉, 용해화됨), 용해화된 DAGAT 제제는 다양한 크로마토그래피 분석에 주어져서, DAGAT 활성과 연관된 단백질이 동정된다. 이러한 방법으로, 분자량이 약 40kDa인 단백질이 DAGAT 활성과 관련되어 동정된다. 컬럼 크로마토그래피 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 정제방법은 아미노산 서열 분석에 충분한 순도의 DAGAT 단백질을 얻는데 사용된다.

DAGAT 단백질로부터의 펩티드 단편은 전체 또는 일부의 DAGAT 단백질을 암호화하는 핵산서열을 얻는데 사용될 수 있는 다양한 합성 누클레오티드를 설계하는데 주형으로 사용된다. 생성된 DAGAT 암호화 서열을 사용함으로써, DAGAT 단백질을 암호화하는 다른 DAGAT 유전자를 분리하는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명은 DAGAT 펩티드 및 이러한 펩티드의 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 DAGAT 유전자 서열의 분석 및 회수를 위한 DAGAT 암호화 서열을 함유하는 올리고누클레오티드의 제조에 사용된다. DAGAT 암호화서열은 의도하는 용도에 따라서 완전한 서열 또는 부분적인 서열을 암호화할 수 있다. 모든 또는 일부 게놈성 서열, 또는 cDNA 서열이 가능하다.

특히 관심의 대상이 되는 것은 DAGAT 서열의 전사 또는 전사 및 번역(발현)을 위해 제공되는 재조합 DNA 구성물이다. 특히, 식물 숙주 세포내에서 전사 또는 전사 및 번역할 수 있는 구성물이 바람직하다. 이러한 구성물은 식물 씨드 조직내에서 우선적으로 발현된 유전자로부터 얻은 전사 개시영역을 포함한 다양한 조절 영역을 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명은 세포내에서의 구성물 발현을 통해서 숙주 세포 또는 이의 자손세포내에서 DAGAT를 생성시키는 방법에 관한 것이다. DAGAT 암호화 서열의 생성 결과로서 DAGAT를 함유하는 세포가 또한 본원에서 설명되고 있다.

또한, 본 발명은, 특히, 식물 씨드 오일 작물의 씨드 오일에서 트리글리세라이드 분자의 변화를 위한 DAGAT를 암호화하는 DNA 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다. 변화된 트리글리세라이드를 지닌 식물 세포가 또한 본원에서 설명되고 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 식물 LPAAT 단백질의 발현에 의해 수득된 변화된 식물, 씨드 및 오일에 관한 것이다.

본 발명의 디아실글리세롤 아실트란스페라제(이하 "DAGAT"라 일컬어진다)는 효소 반응성 조건하에 1,2-디아실글리세롤-3-포스페이트 및 아실-CoA 기질로부터의 트리아실글리세롤의 생성을 촉진하는 능력이 입증된 세포로부터 얻을 수 있는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 모든 아미노산 서열을 포함한다. 용어 "효소 반응성 조건"은 어떠한 필요한 조건이 효소가 작용할 수 있게 하는 환경(즉, 온도, pH, 억제 물질의 부재)에서 얻어질 수 있다는 것을 의미한다.

용어 "용해화"는 막과 관련되지 않은 효소에서 전형적인 방법으로 작용하는 방식으로 막으로부터 DAGAT 효소의 추출을 의미한다. 막은 DAGAT 단백질을 내부에 존재하는 다른 단백질에 효과적으로 결합시키기 때문에, 용해화는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 DAGAT의 동정 및 정제에 필수 요건이다. DAGAT 활성의 용해화를 시험하는데 있어서, 하기 실시예에서 보다 상세히 기재된 바와 같은 세가지의 상이한 용해화 지표가 고려되고 있다.

1) DAGAT 활성은 아주 고속 원심분리에 의해 침강되지 않는다

2) DAGAT 활성은 막과 관련되지 않은 효소에서 전형적인 분자량을 지니는 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피상에서 이동한다.

3) DAGAT 제제에 존재하는 단백질은 컬럼 크로마토그래피에 의해 적어도 부분적으로 서로 분리될 수 있다.

어떠한 각각의 상기 기준에 적용될 수 있는 가능한 또 다른 해석 때문에, 모든 세가지의 기준은 DAGAT 용해화를 확인하는데 충족되고 있다는 것을 확인하는 것이 필요하다. 예를 들어, 아주 큰 g 힘에서 침강되지 않는 첫번째 기준은 용해화에 사용된 용액의 밀도가 비용해화된 막의 밀도와 유사하여 이들이 단지 아주 서서히 침강하는 경우에 잘못 해석될 수 있다. 이러한 상황은 하기 실시예에서 예시되고 있는데, 여기서, 이러한 기준만이 관련된 공개된 용해화 방법은 세포질 막으로부터 실질적으로 분리된 DAGAT를 얻는데 불충분하다는 것을 입증하고 있다. 용해화된 활성이 최초의 막 보다는 크기 배제 컬럼을 통해서 보다 서서히 이동하는 두 번째 기준은 막 자체가 세정제에 대한 노출후에 컬럼에 약하게 결합되어 이를 통한 활성의 이동이 완만한 경우에 일치할 수 있다. 용해화된 단백질이 크로마토그래피적으로 분리 가능한 세 번째 기준은 인공 또는 예측하지 않은 상황에 의해 다협되는 듯한 최소한의 기준이다. 그러나, 막이 용해화 과정에서 부분적으로 분해되어 다양한 단백질 응집체가 방출되는 것이 가능하다. 그러한 응집체는 크로마토그래피적으로 서로 분리될 수 있다. 따라서, 모든 세가지 기준을 충족시키는데는 DAGAT 용해화가 달성되는 것을 확실하게 하는 것이 필요하다.

용해된 왁스 신타제 단백질이 수득되었기 때문에, 효소를, 기질 특이성, 조인자 요건 및 가능한 활성 억제제에 대해 특징화시키는 추가 실험이 이제 수행될 수 있는 것으로 인식될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 호호바 왁스 신타제는, 아실-ACP 및 아실-CoA 분자를 포함하여 광범위한 아실 기질을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 아실 및 지방 알코올 기질은 탄소 사슬 길이에 대해 광범위한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 활성은 C12 내지 C24의 탄소 사슬 길이를 갖는 기질을 사용하여 시험되었고, 모든 기질이 효소에 의해 사용되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 활성은 다양한 포화도를 갖는 지방 아실 및 지방 알코올에 대해 나타났다.

놀랍게도, 정제된 호호바 왁스 신타제는 TAG가 호호바 식물 조직에 존재하는 것으로 보고되지 않았음에도 디아실글리세롤(DAG) 및 지방 아실-CoA 기질과의 활성을 지녀서 트리아실글리세롤(TAG)을 생성하는 것으로 입증되었다. 따라서, 왁스 신타제는 두가지 이상의 아실트란스페라제 활성을 지니는데, 하나는 아실-CoA 분자에 대한 수용체 기질이 알코올(지방 알코올 아실트란스페라제)이고, 다른 하나는 수용체 기질이 디아실글리세롤(DAG 아실트란스페라제, 또는 DAGAT)이다. 왁스 신타제 효소의 DAGAT 활성의 존재는 왁스 신타제 단백질이 다른 식물종에서의 DAGAT 단백질과 밀접하게 관련된다는 것을 제시하고 있다.

모르티에렐라 DAGAT의 용해화는 하기 실시예에 기재되어 있다. DAGAT의 용해화는 상기 각각의 용해화 기준의 입증에 의해 확인된다.

모르티에렐라 DAGAT의 용해화된 제제는 DAGAT 단백질의 동정 및 부분 정제를 위한 다양한 크로마토그래피 시험에 이용되고 있다. 이러한 방법으로, 분자량이 약 40kDa인 단백질은 DAGAT 활성과 연관된 바와 같이 동정된다. 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 40kDa 단백질은 옐로우 86-아가로스 및 히드록시애피타이트 컬럼상에서 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제된다. 단백질은 겔 전기영동 및 니트로셀룰로오스에 대한 부분 정제된 DAGAT 제제의 블롯에 의해 실질적으로 정제된 형태로 수득된다. 40kDa 단백질은 동정된 밴드를 함유하는 니트로셀룰로오스 필터의 단백질 부분을 절단함으로써 회수된다.

전제된 단백질은 다양한 효소로 분해되어 아미노산 서열의 측정에 사용되는 펩티드를 생성시킨다.

따라서, 본원에 기재된 40kDa 단백질의 트립신 작용 펩티드는 모르티에렐라 라마니아나 DAGAT의 일부를 나타낸다. 다른 모르티에렐라 DAGAT 펩티드가 유사하게 얻어질 수 있으며, 아미노산 서열이 측정될 수 있다.

DAGAT를 암호화하는 핵산서열을 얻기 위해서 DAGAT 펩티드로부터의 아미노산 서열을 사용하는 것이 본원에서 설명되고 있다. 예를 들어, DAGAT 펩티드 서열에 상응하는 합성 올리고누클레오티드가 제조된다. 이러한 올리고누클레오티드는 DAGAT 유전자의 부분 DNA 서열을 얻기 위한 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 기술에서 프라이머로 사용된다. 생성된 부분 서열은 모르티에렐라 라마니아나 조직으로부터 제조된 유전자 라이브러리로부터 DAGAT 클론을 얻기 위한 프로부로서 사용된다. 또한, 낮은 퇴행의 올리고누클레오티드가 특정의 DAGAT 펩티드로부터 제조될 수 있는 경우에, 그러한 프로브는 DAGAT 유전자 서열에 대한 유전자 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 특히, 파아지 벡터에서 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이 낮은 수준의 바탕 혼성화로 인해 상기 방법에서 유용하다.

본 발명의 DAGAT의 핵산 서열은 게놈성 DNA, cDNA, mRNA로부터 유도된 DNA 또는 RNA이거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 유전자 서열은, 예를 들어, 적절한 공급원으로부터의 게놈성 DNA를 분리하고, 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 이용하여 서열을 증폭시키고 클로닝함으로써 클로닝될 수 있다. 또한, 유전자 서열은 특히 식물에 바람직한 서열을 제공해야 하는 경우에 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 따라서, 전체 또는 일부의 요구되는 구조 유전자(DAGAT 단백질을 암호화하는 유전자의 일부)는 선택된 숙주에 의해 선호된 코돈을 사용함으로써 합성될 수 있다. 숙주에 바람직한 코돈은, 예를 들어, 요구되는 숙주종에서 발현된 단백질에서 가장 자주 사용되는 코돈으로부터 측정될 수 있다.

본 기술 분야에 전문가라면 항체 제제 및 핵산 프로브(DNA 및 RNA) 등이 제조되어 다양한 식물 공급원으로부터의 "동족성" 또는 "관련된" DAGAT를 스크리닝하고 회수하는데 사용될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 동족성 서열은 서열의 상동성이 있는 경우에 발견되는데, 공지된 DAGAT 및 비교 대상의 공급원 사이의 혼성화 반응을 통하거나, 서열 정보, 핵산 또는 아미노산의 비교에 의해 측정될 수 있다. Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys 및 Gln/Asn과 같은 보존성 변화는 서열 동족성을 측정하는데 고려될 수 있다. 아미노산 서열이 두 가지의 완전한 성숙 단백질 사이에 25% 만큼의 서열 상동성에 의해 동족성으로 고려될 수 있다. [문헌: Doolittle, R.F., OF URFS and ORFS, University Science Books, Ca, 1986].

따라서, 다른 DAGAT는 본원에 제공된 특이적으로 예시된 모르티에렐라 단백질 제제 및 서열로부터 얻을 수 있다. 또한, 예시된 DAGAT 및 예시된 서열의 사용을 통해 얻을 수 있는 DAGAT로부터 모델링되는 합성 단백질에 대한 출발물질, 및 변화된 아미노산 서열을 포함한 천연 및 합성 DAGAT를 얻을 수 있다는 것이 자명하다. 변화된 아미노산 서열은 부분적으로 또는 전체적으로 합성되는 바와는 무관하게 돌연변이되고, 절단되고, 증가되는 서열을 포함한다. 식물 제제로부터 실질적으로 정제된 서열, 또는 단백질 또는 서열을 얻는데 사용되는 방법과는 무관하게 동일하거나 동일한 단백질을 암호화하는 서열은 자연적으로 유도된 서열과 동일하게 사용될 수 있다.

전형적으로, 핵산 프로브를 사용하여 얻을 수 있는 DAGAT 서열은 프로브로서 사용된 암호화 서열과 표적 DAGAT 서열 사이에 60-70% 서열 상동성을 나타낼 것이다. 그러나, 50-60 만큼 작은 서열 상동성을 지닌 긴 서열이 또한 얻어질 수 있다. 핵산 프로브는 핵산서열의 긴 단편이거나, 짧은 올리고누클레오티드 프로브일 수 있다. 보다 긴 핵산 단편(약 100bp 초과)이 프로브로 사용되는 경우, 프로브로 사용된 서열에서 20-50% 편차(즉, 50-80% 서열 상동성)를 지니는 표적 샘플로부터 서열을 얻는데는 낮은 엄격성으로 스크리닝될 수 있다. 올리고누클레오티드 프로브는 DAGAT 효소를 암호화하는 전체 핵산 서열 보다 짧을 수 있지만, 약 10 이상, 바람직하게는 약 15 이상, 더욱 바람직하게는 약 20 이상의 누클레오티드이어야 한다. 고도의 서열 상동성은 짧은 영역이 긴 영역에 반대로 사용되는 경우에 요구된다. 따라서, 다른 관련된 DAGAT 유전자를 검출하고 회수하기 위한 올리고누클레오티드 프로브를 디자인하기 위해서는 고도로 보존된 아미노산 서열을 동정하는 것이 바람직할 수 있다. 짧은 프로브는, 특히, 고도로 보존된 서열이 동정될 수 있을 때 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 특히 유용하다. [문헌: Gould, et al., PNAS USA (1989) 86:1934-1938].

다른 DAGAT의 분리에 추가로, 다른 관련된 아실트란스페라제 단백질에 대한 유전자는 DAGAT 및 관련된 핵산 서열로부터의 서열 정보를 이용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 다른 아실트란스페라제 효소가 색소체 DAGAT, 미토콘드리아 DAGAT, 라이소포스포스파티딜콜린 아실트란스페라제 (LPCAT), 라이소포스포스파티딜세린 아실트란스페라제 (LPSAT), 라이소포스포스파티딜에탄올아민 아실트란스페라제 (LPEAT), 및 라이소포스포스파티딜이노시톨 아실트란스페라제 (LPIAT)를 포함한 식물 지질 생합성과 관련이 있다. 이러한 효소는 모두 라이소포스포리피드의 sn-2 위치를 포함하는 아실트란스페라제 반응을 촉진하며, 이들 서열을 암호화하는 유전자가 본발명의 식물 아실-CoA DAGAT 서열 및 이로부터 얻을 수 있는 서열과 관련이 있다. 따라서, 상기 입증된 바와 같이, 호호바로부터의 지방 아실-CoA:지방 알코올 0-아실트란스페라제(왁스 신타제)를 포함한 다른 관련 아실트란스페라제는 디아실글리세롤 아실트란스페라제와 관련될 수 있다.

DAGAT 및 왁스 신타제가 동족성 단백질계의 구성원이라는 것은 일련의 유지성 균류, 즉, 모르티에렐라 라마니아나로부터의 DAGAT의 정제를 통해서 얻은 정보에 의해 지지된다(실시예 참조). 첫 번째로, 호호바 왁스 신타제와 같이, 균류 DAGAT 활성은 막의 결합이며, 세정제를 통해서 용해화될 수 있다. 두 번째로는, 호호바 왁스 신타제에 의한 바와 같이, 균류 DAGAT의 효소활성을 저장하기 위해서 용해화 다음에 검정 혼합물에 포스포리피드(예, 포스파티드산)이 포함되는 것이 바람직하다. 세 번째로, 균류 DAGAT는 정제 크로마토그래피 동안 호호바 왁스 신타제와 아주 유사하게 작용한다. 특히, 효소종은 단지 약간의 저지로 히드록시애퍼타이트 컬럼을 통해 세척되지만, 막 제제중의 대부분의 다른 단백질종은 컬럼 매트릭스에 결합된다(실시예 참조). 그러므로, 호호바 효소에 의한 실험은 히드록시애퍼타이트 크로마토그래피가 모르티에렐라 라마니아나로부터의 DAGAT의 정제에 중요한 단계일 수 있다는 것을 예측하게 한다. 이러한 단계의 부가는 균류 DAGAT의 성공적인 정제에 기본이며, 가미사카(1997)등의 원안이 DAGAT 활성과 관련된 정확한 단백질종을 동정하는데 충분하지 않았다는 결론을 내리게 한다. 최종적으로, SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같은 균류 DAGAT 폴리펩티드(33kDa)의 명백한 분자량은 SDS-PAGE상의 호호바 왁스 신타제에 대한 분자량과 동일하다.

관련된 유전자가 주어진 서열과 혼성화에 의해 분리될 수 있는 지를 측정하기 위해서, 다른 방법이 이용될 수도 있겠지만, 전형적으로 방사성 활성을 이용하여 서열을 검출 가능하게 표지화시켰다. 표지된 프로브를 혼성화 용액에 가하고, 노턴 블롯(Northern blot) 또는 써던 블롯(Southern blot)과 같은 바람직한 핵산을 함유하는 필터, 또는 스크리닝되는 cDNA 또는 게놈성 클론을 함유하는 필터와 함께 배양하였다. 혼성화 및 세척 조건은 목적하는 서열에 대한 프로브의 혼성화가 최적이 되게 다양할 수 있다. 저온 및 높은 염 농도는 보다 먼 거리의 관련된 서열의 혼성화를 가능하게 한다(낮은 엄격성). 바탕 혼성화가 낮은 엄격성 조건하의 문제라면, 온도는 혼성화 또는 세척단계에서 상승되고/거나, 염 함량은 저하되어 특정의 혼성화 서열의 검출을 개선시킬 수 있다. 혼성화 및 세척 온도는 문헌[Beltz, et al., Methods in Enzymology (1983) 100:266-285]에 기재된 바와 같은 프로브의 산정된 용융 온도에 근거해서 조절될 수 있다. 유용한 프로브 및 적절한 혼성화 및 세척 조건은 상기된 바와 같이 확인되고 있으며, cDNA 또는 게놈성 라이브러리는 표지된 서열 및 최적화된 조건을 이용함으로써 스크리닝된다.

면역학적 스크리닝에 있어서, 코코넛 DAGAT 단백질에 대한 항체는 토끼 또는 마우스에 정제된 단백질을 주입함으로써 제조될 수 있으며, 이러한 항체 제조방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 단일 클론성 또는 폴리 클론성 항체가 생성될 수 있지만, 전형적으로는 폴리클론성 항체가 유전자 분리에 모다 유용하다. 웨스턴 분석은 코코넛 DAGAT 에 대한 항체와 교차 반응시킴에 의해 측정되는 바와 같이 관련된 단백질이 요구된 식물종의 조추출물에 존재한다는 것을 측정하도록 수행될 수 있다. 교차 반응성이 관찰되는 경우에, 관련된 단백질을 암호화하는 유전자는 요구되는 식물종을 나타내는 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리된다. 발현 라이브러리는, 문헌[Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]에 기재된 바와 같이, 람다 Gtll을 포함한 다양한 시판 벡터에서 수행될 수 있다.

모든 식물은 막 포스포리피드의 생성에 DAGAT 단백질을 이용하고, 그로 인해서, 어떠한 식물종은 추가의 DAGAT 단백질의 공급원으로 여겨질 수 있다. 씨드 오일에 많은 양의 중쇄 지방산을 함유하고 있는 식물이 중쇄 지방산을 TAG의 sn-2 위치내로 혼입시킬 수 있는 식물 DAGAT를 얻는데 바람직한 식물이다. 쿠피아(Cuphea)속중의 몇가지 종은 씨드에 중쇄 지방산을 함유하는 트리글리세라이드를 축적한다. 이러한 종에는 프로쿰벤스(procumbens), 루테아(lutea), 후케리아나(hookeriana), 하이소피폴리아(hyssopifolia), 라이티(wrightii) 및 인플라타(inflata)가 있다. 중쇄 지방산의 또 다른 천연 식물 공급원은 라우라세레계(Lauraceae)의 씨드이다. 예시된 캘리포니아 베이(California Bay: Umbellularia californica)에 추가로, 피사(Pisa: Actinodophne hookeri), 스위트 베이(Sweet Bay: Laurus nobilis) 및 시나모눔 캄포라(Cinnamomum camphora: camphor)이 중쇄 지방산을 축적한다. 다른 식물 공급원에는 울마세에(Ulmaceae: elm), 팔메(Palmae), 미리스티카세에(Myristicaceae), 시마루바세에 (Simarubaceae), 보키시아세에(Vochysiaceae), 및 살바도라세에(Salvadoraceae)가 포함된다.

특히 목적하는 DAGAT중의 하나는 저장 TAG중의 특정의 장쇄 지방산을 혼입하고 있는 식물종으로부터 얻은 DAGAT이다. 예를 들어, 나스투르티움(nasturtium) 및 메도우폼(meadowfoam)은 씨드 TAG에 22:1의 아실기를 함유하며, 메도우폼은 22:1(에루크: erucic) 지방 아실기를 sn-2 위치내로 혼입시킬 수 있는 DAGAT를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 그러한 활성을 지니는 DAGAT는 "트리-에루크" 브라시카 오일(Brassica oil)의 생산에 사용될 수 있다. 이러한 사항은 오늘날 까지 밝혀지지 않았는데, 그 이유는 18:1 및 18:2와 같은 불포화된 지방산에 대한 브라시카 씨드 DAGAT의 선택적 활성 때문이다.

다양한 공급원으로부터의 식물 DAGAT는 광범위하게 다양한 생체내 적용에서 식물 지질 생합성의 TAG 생합성을 조사하는데 사용될 수 있다는 것을 주지해야 한다. 모든 식물은 공통의 대사 경로를 통해 합성되기 때문에, 이종 식물 숙주에 대한 한가지 식물 DAGAT의 연구 및/또는 사용은 다양한 종에서 용이하게 달성될 수 있다. 다른 사용에 있어서, 식물 DAGAT는 DAGAT의 본래의 식물 공급원 외부에 사용되어 시험관내 생산되거나 합성된 TAG의 생산을 증진시키고/거나 TAG 조성물을 변화시킬 수 있다.

식물 DAGAT 단백질과 관련된 핵산 서열은 많은 용도로 사용될 수 있다. 예를들어, 재조합 구성물이 제조될 수 있으며, 이러한 제조합 구성물은 프로브로서 사용되거나, 숙주 세포내의 DAGAT 단백질을 발현시켜 효소 공급원을 생성하고/거나 내부에 존재하는 트리글리세라이드의 조성을 변화시킬 수 있다. 다른 유용한 적용은 숙주 세포가 시험관내 또는 생체내에서 식물 숙주 세포인 경우이다. 예를 들어, 식물 TAG 생합성 경로에 이용될 수 있는 각각의 중쇄 선호 DAGAT의 양을 증가시킴으로써, 증가된 비율의 중쇄 지방산이 TAG에서 수득될 수 있다. 유사한 방법으로, 몇몇의 적용에 있어서, 안티-샌스 기술에 의해 식물세포내에서 내부적으로 발현된 DAGAT의 양을 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 삽입된 외래 DAGAT가 중쇄 또는 독특한 장쇄 지방아실기를 sn-2 위치에 전달할 수 있는 기회를 많게 하기 위해서, 본래의 브라시카(Brassica) 장쇄 선호 DAGAT의 증가된 발현이 요구될 수 있다.

따라서, 의도하는 사용에 따라서, 구성물은 전체 DAGAT 단백질을 암호화하는 서열 또는 그의 일부를 함유할 수 있다. 예를 들어, 주어진 DAGAT 단백질의 안티샌스 억제가 요구되는 경우에, 전체 DAGAT 서열은 요구되지 않는다. 또한, DAGAT 구성물을 프로브로 사용하고자 하는 경우에, DAGAT 암호화 서열의 특정의 일부, 예를 들어, 고도로 보존된 DAGAT 영역을 암호화하는 것으로 발견되는 서열을 함유하는 구성물을 제조하는 것이 유리할 수 있다.

상기된 바와 같이, 본 발명의 식물 DAGAT를 암호화하는 핵산서열은 게놈성의 cDNA 또는 mRNA 서열을 포함할 수 있다. 용어 "암호화"는 서열이 샌스 및 안티샌스 배향에서 특정의 아미노산 서열에 상응하는 것을 의미한다. 용어 "염색체외"는 서열이 자연적으로 관련되는 식물 게놈의 외부에 있는 것을 의미한다. 용어 "재조합"은 서열이 돌연변이 생성, 및 제한 효소등을 통해서 조작되어 유전적으로 조작된 변화를 함유함을 의미한다.

cDNA 서열은 전이 펩티드 서열 또는 표적화 서열과 같은 예비 처리된 서열을 함유하거나 함유하지 않아서, 주어진 세포기관 또는 막 위치에 DAGAT 단백질(예컨대, 미토콘드리아 DAGAT)의 전달을 촉진할 수 있다. 이러한 전구체 DAGAT DNA 서열의 사용은 식물 세포 발현에 사용하기에 바람직하다. 게놈성 DAGAT 서열은 식물 DAGAT의 전사 및 번역 개시영역, 인트론, 및/또는 전사 종결영역을 함유할 수 있으며, 서열은 DAGAT 구조 유전자가 있거나 없는 상태로 다양한 DNA 구성물에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 식물 DAGAT에 상응하는 핵산서열은 특정의 세포기관 또는 막 위치, 유용한 조직을 지니며 프로필을 타이밍하는 5' 상류 비-코딩 조절 영역(프로모터), 전사 및 번역 조절 영역으로서 유용한 3' 하류 비-코딩 조절 영역으로 단백질 전달을 유도하기에 유용한 신호 서열을 제공하고, 유전자의 다른 특징을 간파할 수 있다.

바람직한 식물 DAGAT 핵산 서열이 얻어지면, 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 서열이 비-코딩 플랭킹 영역을 포함하는 경우, 플랭킹 영역은 재절제 또는 돌연변이 유발된다. 따라서, 전이, 전사, 삭제 및 삽입은 천연 서열에서 수행될 수 있다. 또한, 모든 또는 일부의 서열이 합성될 수 있다. 구조 유전자에서, 하나 이상의 코돈은 변화된 아미노산 서열을 제공하도록 변화될 수 있거나, 하나 이상의 코돈 돌연변이체가 용이한 제한 부위 또는 구성 또는 발현과 관련된 다른 목적을 제공하도록 도입될 수 있다. 구조 유전자는 합성 어댑터, 또는 하나 이상의 편리한 제한 부위를 도입하기 위한 링커등을 사용함으로써 추가로 변화될 수 있다.

본 발명의 식물 DAGAT를 암호화하는 핵산 또는 아미노산 서열은 다양한 방법으로 다른 비-본래의 서열 또는 "이종" 서열과 혼합될 수 있다. "이종" 서열은 함께 결합된 자연에서 발견되지 않는 동일한 식물로부터의 핵산 서열의 조합물을 포함한 식물 DAGAT에 결합된 자연적으로 발견되지 않는 어떠한 서열을 의미한다.

본 발명의 식물 DAGAT를 암호화하는 DNA 거열은 DAGAT와 정상적으로 연관된 유전자 서열 전체 또는 일부와 함께 사용될 수 있다. 이의 성분 일부에서, DAGAT를 암호화하는 DNA 서열은, 5' 내지 3' 전사 방향에서, 숙주 세포, 식물 DAGAT를 암호화하는 DNA 서열 및 전사 및 번역 종결 영역에서 전사 및 번역을 촉진할 수 있는 전사 개시 조절 영역을 지니는 DNA 구조물에서 혼합된다.

효능적인 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포 모두를 포함한다. 숙주 세포는 단세포형이거나, 의도하는 사용에 따라서 다세포 분화된 또는 비분화된 유기체에서 발견될 수 있다. 본 발명의 세포는 존재하는 양생형 세포에 외래인 식물 DAGAT를 지님으로써, 예를 들어, 식물 DAGAT를 암호화하는 재조합 핵산 구성물을 지님으로써, 예를들어, 식물 DAGAT를 암호화하는 재조합 핵산 구성물을 지님으로써 구별될 수 있다.

숙주에 따라, 바이러스성, 플라스미드 또는 염색체 유전자 등으로부터의 영역을 포함한 조절 영역은 다양할 것이다. 원핵세포 또는 진핵세포 미생물에서의 발현의 경우에, 특정의 단세포숙주, 광범위하게 다양한 구성 가능한 또는 조절 가능한 프로모터가 사용될 수 있다. 미생물에서의 발현은 식물 효소의 공급원을 제공할 수 있다. 기재된 전사 개시 영역은 베타-갈락토시다제, T7 폴리머라제, 및 트립토판 E 등과 같은 유전자를 포함한, 대장균(E. coli), 비. 섭틸리스(B. subtilis), 사크로마이세스 세레비시에(Sacchromyces cerevisiae)와 같은 박테리아 및 효모 숙주로부터의 영역이다.

대부분의 경우에, 구성물은 변화된 식물 DAGAT의 생성 및 가능하게는 지방산 조성물의 변화를 제공하는 식물에서 작용성인 조절 영역을 포함할 것이다. 식물 DAGAT 또는 이의 작용성 단편을 코딩하는 개방 해독 프레임은 5' 말단에서 전사 개시 조절 영역에 결합될 것이다. DAGAT 단백질의 발현이 식물 숙주에서 요구되는 양태에서, 완전한 식물 DAGAT 유전자의 전체 또는 일부를 사용하는 것이 요구된다; 즉, 구조 유전자 서열 및 3' 하류 비-코딩 영역과 함께 5' 상류 비-코딩 영역(프로모터) 전체 또는 일부가 사용될 수 있다.

목적하는 식물 숙주로부터 유래된 프로모터 또는 변화된 프로모터, 즉, 하나의 유전자 공급원으로부터 유도된 전사 개시 영역 및 상이한 유전자 공급원으로부터 유도된 전사 개시 영역을 지니는 변화된 프로모터와 같은 상이한 프로모터가 요구되는 경우에, 구조 유전자 작용성의 광범위하게 다양한 구성 가능한 또는 조절 가능한, 예를들어, 유도 가능한 전사를 제공하는 많은 전사 개시영역이 이용될 수 있다. 그러한 구조 유전자에 상응하는 전사/번역 개시 영역은 각각의 출발 코돈에 대한 바로 5' 상류에서 발견된다. 식물에 사용된 전사 개시영역중에서, 영역은 노팔린 및 만노핀 신타제, CaMV로부터의 19S 및 35S 프로모터, 및 나핀(napin), ACP, SSU, PG, 제인(zein), 파세올린 E 등과 같은 다른 식물 유전자로부터 얻은 5' 상류 영역에 대한 바와 같은 T-DNA 구조 유전자와 결합된다. 이중 35S와 같은 증진된 프로모터는 DAGAT 서열의 발현시키는데 이용될 수 있다. 5' 상류 비-코딩 영역이 씨드 돌연변이 동안 조절된 다른 유전자로부터 얻어지는 적용의 경우에, ACP 및 나핀-유도된 전사 개시 조절 영역과 같은 식물 배아 조직에서 우선적으로 발현되는 것들이 바람직하다. 그러한 "씨드 특이적 프로모터"는 88년 1월 25일 출원된 미국특허출원 제07/147,781호 (현재, 미국특허출원 제07/550,804호), 및 1990년 3원 16일자 출원되고 발명의 명칭이 "조기 씨드 발아에서 우선적으로 발현된 신규한 서열 및 이의 이와 관련된 방법(Novel Sequences Preferentially Expressed In Early Seed Development and Methods Related Thereto)"인 미국특허출원 제07/494,722호에 교시된 바에 따라 얻고 사용될 수 있다. 본원에서는 상기 특허원을 참조로 인용한다. 씨드 조직에서 우선적으로 발현되는, 즉, 다른 식물에서 검출되지 않는 전사 개시 영역이 유전자 생성물의 파괴 또는 역효과를 최소화하기 위한 TAG 변화에 바람직한 것으로 사료된다.

조절성 전사 종결 영역은 본 발명의 DNA 구성물에서 제공될 수 있다. 전사 종결 영역은 식물 DAGAT를 암호화하는 DNA 서열 또는 상이한 유전자 공급원으로부터 유도된 편리한 전사 종결 역역, 예를 들어, 전사 개시 영역과 자연적으로 관련되는 전사 종결 영역에 의해 제공될 수 있다. 전사 종결 영역이 상이한 유전자 공급원으로부터 유도되는 경우, 종결 영역이 유도되는 구조 유전자에 대해 약 0.5kb, 바람직하게는 약 1-3kb의 서열 3'를 함유할 것이다.

증가되거나 감소된 발현을 위한 목적하는 DNA 서열로서 식물 DAGAT를 지니는 식물 발현 또는 전사 구성물이 광범위하게 다양한 살아 있는 식물, 특히, 식용 및 산업용의 식물 오일 생산과 관련된 살아있는 식물과 함께 사용될 수 있다. 온대지방 오일씨드 작물이 가장 바람직하다. 관심의 대상이 되는 식물에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 평지씨(Canola and High Erucic Acid varieties), 해바라기, 홍화, 면화, 대두, 땅콩, 코코넛 및 기름아자나무, 및 옥수수가 포함된다. 재조합 구성물을 숙주 세포내로 도입시키는 방법에 따라서, 다른 DNA 서열이 요구될 수 있다. 중요하게는, 본 발명은 디코틸레디온 및 모노코틸레돈종에 적용될 수 있고 새롭고/거나 개선된 형질 전환 및 조절 기술에 용이하게 적용될 것이다.

특히 관심에 대상이 되는 것은 식물 씨드 오일중의 특정의 지방산을 생성하도록 유전자 조작되는 식물에서 식물 DAGAT 구성물의 사용에 있으며, 여기서, 조작된 종의 비조작된 식물의 씨드에서의 TAG는 특정의 지방산을 자연적으로 함유하지 않는다. 따라서, 식물중의 새로운 DAGAT의 발현은 독특한 지방 아실기를 sn-3 위치내로 혼입하는데 바람직할 수 있다.

본 발명의 DAGAT 단백질을 위한 식물 유전자 조작 적용은 TAG 분자상에서 특정의 위치내로 혼입된 요구되는 지방 아실기를 지니는 TAG 분자를 함유하는 구성된 식물 지질의 제제로 사용하는 것을 포함한다.

유전자 변이 식물을 얻는데 있어서의 형질 전환 방법은 본 발명에서 중요하지 않으며, 다양한 식물 형질 전환 방법이 현재 이용될 수 있다. 또한, 작물을 형질 전환시키는 새로운 방법이 사용되고 있으므로, 이러한 방법이 직접적으로 적용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 어그로박테리움(Agrobacterium) 감염에 민감한 많은 식물종이 어그로박테리움 중재된 형질전환의 3부 및 2부 벡터 방법을 통해서 성공적으로 형질 전환될 수 있다. 많은 경우에, 좌우 경계, 특히 우측 경계를 지니는 T-DNA에 의한 한쪽 또는 양쪽에서 경계된 구성물을 제조하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 방법은, T-DNA 경계가 다른 형질 전환 방식으로 사용될 수도 있지만, 구성물이 형질 전환을 위한 모드로서 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 또는 에이. 리조게네시스(A. rhizogenes)를 사용하는 경우에 특히 유용하다. 또한, 다양한 외떡잎 및 쌍떡잎 식물종의 전사를 가능하게 하는 미세주입, DNA 입자충격, 및 전기영동 기술이 개발되어 왔다.

정상적으로는, DNA 구성물은 숙주내에서의 발현에 필요한 조절 영역을 지니며 형질 전환 세포의 선택을 제공하는 구조 유전자를 포함할 것이다. 유전자는 세포독성제, 예를들어, 항생제, 중금속, 독소 등에 대한 내성, 영양 요구성 숙주에 대한 기본 유기 영양을 제공하는 보충물, 또는 바이러스 면역성 등을 제공할 수 있다. 상이한 숙주종의 수에 따라서, 발현 구성물 또는 이의 성분이 도입되며, 하나 이상의 마아커가 사용될 수 있고, 상이한 선택 조건이 상이한 숙주에 대해 이용된다.

어그로박테리움이 식물 세포 형질전환에 사용되는 경우에, 어그로박테리움 숙주에 존재하는 T-DNA 또는 Ti- 또는 Ri-플라스미드와 함께 동족성 재조합을 위한 어그로박테리움 숙주내로 도입될 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 재조합을 위한 T-DNA를 함유하는 Ti- 또는 Ri-플라스미드가 아암(arm)되거나(gall 형성을 유발할 수 있는), 디스아암(disarm)될 수 있는데(gall 형성을 유발할 수 없는), vir 유전자가 형질 전화된 어그로박테리움 숙주에 존재하는 한 후자가 허용될 수 있다. 아암된(armed) 플라스미드는 정상의 식물 세포와 gall의 혼합물을 줄 수 있다.

어그로막테리움이 숙주 식물 세포를 형질전환시키기 위한 비히클로서 사용되는 경우에, T-DNA 경계 영역(들)에 의해 경계된 발현 또는 전사 구성물이 대장균 및 어그로박테리움에서 복제될 수 있는 광범위한 숙주 범위 벡터내로 삽입될 수 있는데, 광범위한 숙주 범위 벡터는 문헌에 기재되어 있다. pRK2 또는 이의 유도체가 일반적으로 사용된다. 이에 관해서는 본 발명에서 참조로 인용되고 있는 문헌 [Ditta, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. (1980) 77:7347-7351] 및 EPA 0 120 515호를 참조할 수 있다. 또한, 식물 세포에서 발현되는 서열을 분리된 복제 서열을 함유하는 벡터내로 삽입할 수 있으며, 이중 하나는 대장균내의 벡터를 안정화시키며, 다른 하나는 어그로박테리움을 안정화시킨다. 참조예[Mcbride and Summerfelt, Plant Mol. Biol. (1990) 14:269-276]. 상기 문헌에서, 복제에 의한 pRiHRI[문헌: Jouanin, et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201:370-374]가 이용되며, 숙주 어그로박테리움 세포에서 식물 발현 벡터의 부가된 안전성을 제공한다.

형질 전화된 어그로박테리움 및 형질 전환된 식물 세포의 선택을 가능하게 하는 발현 구성물 및 T-DNA는 하나 이상의 마아커를 포함할 것이다. 많은 마아커가 클로람페니콜, 카나마이신, 아미노글리코시드 G418, 또는 하이그로마이신 등에 대한 내성과 같은 식물 세포와 함께 사용되도록 개발되어 왔다. 사용된 특정의 마아커는 본 발명에 필수가 아니며, 하나 또는 다른 마아커가 특정의 숙주 및 구성 방법에 따라 바람직하다.

어그로박테리움을 사용한 식물 세포의 형질전환에 있어서, 외식편은 형질 전환된 어그로박테리움과 혼합되고, 형질 전환에 충분한 시간 동안 인큐베이션되며, 박테리아가 치사되고, 식물세포가 적절하게 선택된 배지에서 배양된다. 유합조직이 형성되면, 발아물 형성이 공지된 방법에 따라 적절한 식물 호르몬을 사용함으로써 촉진될 수 있으며, 발아물은 식물 재생을 위한 발아 배지로 옮겨질 수 있다. 식물은 이어서 씨드로 성장될 수 있으며, 씨드는 반복적인 재생을 가능하게 하고 식물성 오일을 분리하는데 사용된다.

본 발명이 일반적으로 설명되고 있는데, 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니며, 단지 예시 목적으로 기재되고 있는 하기 실시예를 참조하면 본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있을 것이다.

실시예 1 - 왁스 신타제 검정

마이크로솜 막 제제 또는 용해된 단백질 제제에서 왁스 신타제 활성을 검정하기 위한 방법이 기술된다.

A. 방사성표지된 물질

왁스 신타제 검정에 일반적으로 사용되는 기질인 [1-¹⁴C]팔미토일-CoA를 아머샴(Amersham, Arlington Heights, IL)로부터 구입하였다. 다른 사슬 길이 기질을 사슬 길이 특이성 실험을 수행하기 위해 합성하였다. 장쇄 [1-¹⁴C] 지방산 (비활성 51-56 Ci/mole), 즉, 11-cis-에이코세노산, 13-cis-도코세노산 및 15-cis-테트라코세노산을, 칼륨 [¹⁴C]시아나이드를 상응하는 알코올 메실레이트와 반응시킨 후, 알코올 니트릴을 유리 지방산으로 가수분해시킴으로써 제조하였다. 유리 지방산을 에테르성 디아조메탄에 의해 이들의 메틸 에스테르로 전환시키고, 제조용 질산은 박막 크로마토그래피 (TLC)에 의해 정제시켰다. 지방산 메틸 에스테르를 유리 지방산으로 다시 가수분해시켰다. 방사화학적 순도를 3가지 TLC 방법에 의해 평가하였다: 규정상(normal phase) 실리카 TLC, 질산은 TLC 및 C18 역상 TLC. 이들 방법에 의해 측정된 방사화학적 순도는 92 내지 98% 였다. 장쇄 [1-¹⁴C] 아실-CoA를, 상응하는 [1-¹⁴C] 유리 지방산으로부터 영(Young)과 리넨(Lynen)의 방법 [참조: J. Bio. Chem. (1969) 244:377]에 의해 비활성 10Ci/mole이 되도록 제조하였다. [1-¹⁴C]헥사데카날을, 플레쳐(Pletcher)와 테이트(Tate)의 방법 [참조: Tet. Lett. (1978) 1601-1602]의 미세규모 변형법에 따라, [1-C]헥사데칸-1-올의 디크로메이트 산화에 의해 제조하였다. 생성물을 제조용 실리카 TLC에 의해 정제하고, 헥산 용액으로서 -70℃에서 저장한 후, 사용하였다.

B. 마이크로솜 막에서의 왁스 신타제 활성에 대한 검정

제제

마이크로솜 막 제제 중의 왁스 신타제 활성을, 40μM [1-¹⁴C]아실-CoA (보통, 팔미토일-CoA, sp. act. 5.1-5.6 mCi/mmol) 및 200mM 올레일 알코올을 검정하려는 샘플과 전체 부피 0.25㎖ 중에서 인큐베이팅시킴으로써 측정하였다. 인큐베이션 혼합물은, 완충제로서 25mM HEPES (4-[2-히드록시에틸]-1-피페라진에탄-술폰산), pH 7.5을 20% w/v 글리세롤, 1mM DTT, 0.5M NaCl와 함께 함유하거나, 완충제로서 25mM 트리신-NaOH, pH 7.8을 0.28M NaCl, 10% 글리세롤 및 2mM β-메르캅토에탄올과 함께 또한 함유하였다. 초기 실험을 제 1의 완충 시스템으로 수행하였고, 이 때, pH는 아실-CoA 환원효소의 선택성을 수용하도록 선택되었다. 막 제제는 왁스 신타제의 높은 pH 최적조건을 수용하기 위해 제 2의 완충 시스템으로 후에 교환하였다.

기질을 혼합물을, 사용 직전에 참가되는 올레일 알코올과 함께 유리병에 제조하고, 샘플에 첨가하였다. 인큐베이션을 30℃에서 1시간 이하 동안 수행하였다. 검정을, 검정 튜브를 얼음상에 놓고, 이소프로판올:아세트산 (4:1 v/v) 0.25㎖를 즉시 첨가함으로써 종결시켰다. 비표지된 왁스 에스테르(0.1㎎) 및 올레일 알코올 (0.1㎎)을 캐리어로서 첨가하였다. [¹⁴C] 지질을 하라(Hara)와 라딘(Radin)의 스케일 다운 프로토콜 [참조: Anal. Biochem. (1978) 90:40]에 의해 추출하였다. 헥산/이소프로판올 (3:2, v/v) 2㎖를 종결된 검정에 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱시키고, 황산나트륨 수용액 1㎖ (6.6% w/v)를 첨가하고, 샘플을 다시 볼텍싱시켰다.

C. 용해된 왁스 신타제 활성에 대한 검정

용해된 왁스 신타제를, 40μM 1-¹⁴C-16:0 CoA (5 Ci/mol), 200μM 18:1-OH, 0.07% 대두 포스포리피드 (Sigma, P-3644), 0.2% CHAPS, 280mM NaCl, 25mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 2mM β-ME 및 5.6% 글리세롤을 함유하는 250㎕ 검정에서 샘플 50㎕ 까지 사용하여 검정하였다. 포스포리피드 (0.5% CHAPS 중의 50㎎/㎖)를 1% CHAPS에 존재하는 샘플에 직접 첨가한 후, 나머지 검정 성분을 함유하는 칵테일에 의해 희석시켰다. 활성의 재구성은, 왁스 신타제의 포스포리피드 소낭내로의 혼입을 기초로 하여 가정되었다. 왁스 신타제는 세정제에 대해 민감하였고, 포스포리피드(PL)와 세정제(CHAPS)의 양이 최대 활성을 위한 검정에서 2.8/1 (CHAPS/PL, w/w)로 균형을 이뤄질 필요가 있었다. 한외여과에 의해 농축된 샘플에서의 왁스 신타제 활성의 검정에는 CHAPS의 농도로 인해 검정되는 샘플 부피가 재조정될 필요가 있다. 너무 많은 CHAPS를 검정에 도입시키면, 활성이 억제된다. 샘플이 한외여과에 의해 농축되는 경우, 검정하려는 샘플의 최적 부피를, 소량의 샘플을 사용하여 검정에서 %CHAPS의 농축 곡선을 작도하고, 포스포리피드와 NaCl의 고정 농도에서 검정함으로써 재확정할 수 있다. 왁스 신타제는, CHAPS 농도의 변화 보다 PL 농도의 변화에 덜 민감하다.

D. 검정 생성물의 분석

마이크로솜 막 제제 왁스 신타제 검정 또는 용해된 왁스 신타제 검정의 생성물을 분석하기 위해, 두 가지 프로토콜을 개발하였다. "광역 검정"으로서 하기 기재된 한 프로토콜은 보다 시간 소모적이지만, 더욱 고도의 정량적 결과를 생성시킨다. "신속 검정"으로서 하기 기재된 나머지 프로토콜은 왁스 신타제 활성의 측정치를 또한 제공하며, 신속하고, 보다 편리하지만, 덜 정량적이다.

1. 광역 분석: 황산나트륨을 첨가하고, 샘플을 볼텍싱시킨 후, 상부 유기상을 제거하고, 하부 수성상을 헥산/이소프로판올 (7:2 v/v)로 세척하였다. 유기상을 풀링시키고, 질소하에 증발 건조시켰다. 액체 잔류물을 소분획의 핵산 중에 재현탁시키고, 분액을 액체 신틸레이션 계수에 의해 방사능에 대해 검정하였다. 샘플의 나머지를 표지된 클래스의 TLC 분석을 위해 사용함으로써, 생성된 전체 왁스를 측정할 수 있었다.

지질 클래스 분석을 위해, 샘플을 실리카 TLC 플레이트에 적용하고, 플레이트를 헥산/디에틸 에테르/아세트산 (80:20:1 또는 70:30:2 v/v/v)에서 전개시켰다. 지질 클래스, 즉, 주로 왁스 에스테르, 유리 지방산, 지방 알코올 및 착점에 있는 극성 지질 간의 방사능의 분포를 AMBIS 방사분석 이매징 시스템 (radioanalytic imaging system) (AMBIS Systems Inc., San Diego, CA)을 사용하여 측정하였다. 필요에 따라, 개개의 지질 클래스가 추가 분석을 위해 TLC 플레이트로부터 회수될 수 있다. 메탄올 중에서 전개된 C18 플레이트를 사용하는 역상 TLC 시스템을 분석을 위해 또한 사용하였다.

2. 신속 분석: 황산나트륨을 첨가하고, 샘플을 볼텍싱시킨 후, 유기상의 공지된 백분율을 분리하여, 액체 신틸레이션 계수에 의해 계수하였다. 이 계산치를 사용하여, 유기상 중의 전체 계수를 평가하였다. 그 후, 유기상의 또 다른 부분을 분리하고, 질소하에 건조시키고, 핵산 중에 재용해시키고, TLC 플레이트상에 스포팅하고, 상세 검정에 대해 기술된 바와 같이 전개시키고, 스캐닝하였다.

실시예 2 - 왁스 신타제 활성을 특징화하기 위한 추가 실험

A. 종자 발육 및 왁스 신타제 활성 프로파일

배 발육을 5종의 식물에 대해 데이비스(Davis, CA)에서 2회의 여름에 걸쳐 추적하였다. 배의 생체중량 및 건조중량은 매우 꾸준한 속도로 약 80일째부터 약 130일째까지 증가하는 것으로 발견되었다. 액체 추출 결과, 배의 생체중량이 약 300㎎에 이르는 경우 (약 80일째), 액체 중량 대 건조 중량의 비는 50%의 최대 수준에 도달하는 것으로 나타났다.

왁스 신타제 활성을 실시예 1b에 기재된 바와 같이 발육중인 배에서 측정하였다. 호호바 종자 피막이 인자(들)을 억제하는 공급원으로 결정되었기 때문에, 종자 피막을 제거한 후, 배를 액체 질소에서 저장을 위해 -70℃에서 동결건조시켰다.

세포 비함유 균질물 또는 막 분획에서 측정된 왁스 신타제 활성에 대한 발육 프로파일은 개화한 지 약 110 내지 115일 후에 피크가 되는 활성의 큰 유도를 나타낸다. 따라서, 효소학 시험을 위한 배를 개화 후 약 90일 내지 110일 사이에, 즉, 왁스 신타제가 높고, 지질 침착이 최대 수준에 도달하지 않고, 종자 피막이 쉽게 제거되는 기간에 수거하였다. 왁스 신타제 활성의 증가의 최고 속도는 개화 후 80일째 및 90일째 사이에 나타난다. 따라서, cDNA 라이브러리 구성을 위한 배를, 아마도 왁스 신타제 단백질의 합성 속도가 최대가 되는 개화 후 약 80일 내지 90일 사이에 수거하였다. 상응하게는, 왁스 신타제를 코드화하는 mRNA의 수준은 이 단계에서 최대인 것으로 가정될 것이다.

B. 마이크로솜 막 제제

호호바 배를, 배의 수분 함량 (45 -70%)을 측정함으로써 평가하여, 개화 후 약 90일 내지 110일째에 수거하였다. 외피 및 종자 피막을 제거하고, 떡잎을 액체 질소에서 급속 냉동시키고, 추후 사용을 위해 -70℃에서 저정하였다. 초기 단백질 제제를 위해, 냉동된 배를 액체 질소 온도에서 강철 약절구중에서 분쇄시킴으로써 분말화시켰다. 전형적 실험에서, 배 70g을 처리하였다.

분말을 배 70g 당 용액 280㎖의 비로 하기 고 염 용액에 첨가하였다: 3M NaCl, 0.3M 수크로오스, 100mM HEPES, 2mM DTT 및 프로테아제 억제제, 1mM EDTA, 0.7㎎/㎖ 루펩틴, 0.5㎎/㎖ 펩스타틴 및 17㎎/㎖ PMSF. 세포 비함유 균질물 (CFH)을 분말화된 배를 완충액에서 조직 균질기 (Kinematica, Switzerland; model PT10/35)로 약 30초간 분산시킨 후, 마라클로쓰(Miraclothe)(CalBioChem, LaJolla, CA)의 세층을 통해 여과시킴으로써 형성시켰다. 여액을 100,000 x g에서 1시간 동안 원심분리시켰다.

생성된 샘플은 펠레트, 상층액 및 부유 지방 패드로 구성되어 있었다. 지방 패드를 제거하고, 상층액 분획을 수거하고, 1M NaCl, 100mM HEPES, 2mM DTT 및 0.5M EDTA를 함유하는 용액에 대해, 밤새 투석시켰다 (완충 용액을 3회 교환하면서). 투석물을 200,000 x g에서 30분간 원심분리시켜서, 펠레트 DP2를 생성시켰다. 펠레트를 25mM HEPES 및 10% 글리세롤 중에서 본래 CFH 부피의 1/20로 현탁시켜서, 마이크로솜 막 제제를 생성시켰다.

활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 검정하였다. 왁스 신타제 활성의 회복율은 세포 비함유 균질물에서 본래 활성의 34%로 평가되었다. 이 제제 중에서의 왁스 신타제 활성은 -70℃에서 저장되는 경우에 안정하다.

C. 기질 특이성

다양한 탄소 사슬 갈이 및 포화도를 갖는 아실-CoA 및 알코올 기질을 상기 기술된 바와 같이 제조된 마이크로솜 막 분획에 첨가하여, 호호바 왁스 신타제에 의ㅎ 인식되는 기질의 범위를 결정하였다. 왁스 신타제 활성을, 80mM 아실-CoA 기질 및 100mM 방사성표지된 올레일 알코올을 사용하여 측정된 아실 특이성에 대해 실시예 1b에 기재된 바와 같이 측정하였다. 알코올 특이성을 100mM 알코올 기질 및 40mM 방사성표지된 에이코세노일-CoA를 사용하여 측정하였다. 이들 실험의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1

아실 및 알코올 기질 특이성

기질	왁스 신타제 활성(pmoles/분)
구조	아실 그룹	알코올 그룹
12:0	12	100
14:0	95	145
16:0	81	107
18:0	51	56
20:0	49	21
22:0	46	17
18:1	22	110
18:2	7	123
20:1	122	72
22:1	39	41
24:1	35	24

상기 결과는 호호바 왁스 신타제가 광범위한 지방 아실-CoA 및 지방 알코올 기질을 이용함을 입증한다.

또한, 다수의 아실-티오에스테르 기질에 대한 왁스 신타제 활성을 팔미토일-CoA, 팔미토일-ACP 및 N-아세틸-S-팔미토일 시스테아민을 아실 기질로서 사용하여 유사하게 시험하였다. 최대 활성이 아실-CoA 기질에 의해 관찰되었다. 현저한 활성 (아실-CoA에 의한 활성의 10% 이하)이 아실-ACP에 의해 관찰되었지만, N-아세틸-S-팔미토일 시스테아민 기질에 의해서는 활성이 검출되지 않았다.

D. 활성의 이펙터

다수의 술프히드릴 제제가 왁스 신타제 활성에 대한 이들의 효과에 대해 스크리닝되었다. 유기수은 화합물은 활성을 강력하게 억제시키는 것으로 나타났다. 요오드아세트아미드 및 N-에틸말레아미드는 훨씬 덜 효과적이었다. 파라-히드록시머큐리벤조에이트에 의한 억제가 관찰되었지만, 이 억제는 DTT의 후속 첨가에 의해 역전될 수 있다. 이들 결과는 파라-히드록시머큐리벤조에이트에 의한 억제에는 필수 술프히드릴 그룹의 블록킹이 포함됨을 입증한다.

실시예 3 - 호호바 왁스 신타제의 정제

왁스 신타제 활성을 갖는 호호바 막 제제의 단리, 왁스 신타제 활성의 용해 및 왁스 신타제 단백질의 추가 정제를 위해 사용될 수 있는 방법이 기재된다.

A. 마이크로솜 막 제제

실시예 2에 기재된 방법의 하기 변형법을 이용하여, 용해된 막으로부터의 왁스 신타제의 정제에 유용한 개선된 막 분획을 제공한다.

전형적으로, 호호바 배 100g을 추출 완충액 (40mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 200mM KCl, 10mM EDTA, 5mM β-메르캅토에탄올) 400㎖에 첨가하고, 블렌더 중에서 분쇄시키고, 폴리트론(Polytron) 조직 파쇄기에 의해 균질화시켰다. 모든 후속 단계를 4℃에서 수행하였다. 블렌딩된 물질을 미라클로쓰 (CalBioChem)을 통해 여과시켰다. 여액을 원심분리시켜서 (20,000 x g; 20분), 부유 왁스층, 흐린 상층액 분획 및 암녹색 펠레트를 생성시켰다. 상층액 분획을 수거하고, 원심분리시켜서 (100,000 x g; 2시간), 막 펠레트를 수득한 후, 이것을 50% (w/v) 수크로오스를 함유하는 완충액 A (25mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 200mM KCl, 5mM EDTA, 5mM β-메르캅토에탄올) 40㎖ 중에 재현탁시켰다. 이 균질물을 4개의 SW28 원심분리 튜브 (Beckman)내에 분포시키고, 각각을 20% 수크로오스르 함유하는 완충액 A 10㎖로 오버레이시킨 후, 완충액 A 13㎖로 오버레이시켰다. 원심분리 (28,000 rpm; 2시간) 후, 막 분획을 20%/50% 수크로오스 경계면으로부터 수거하고, 완충액 A 4부피로 희석시키고, 원심분리 (200,000 x g; 1시간)에 의해 수거하였다. 그 후, 막을 저장 완충액 [25mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 1M NaCl, 10% (w/v) 글리세롤, 5mM β-메르캅토에탄올] 중에서 균질화시켰다. 이 프로토콜에 의해 제조된 막의 단백질 농도는 전형적으로 7 내지 9㎎/㎖ 이다. 단백질 농도는 BSA를 단백질 표준으로 사용하여 문헌[Bradford, 1976]에 기재된 바와 같이 평가하였다.

B. 왁스 신타제 단백질의 용해

막 현탁액을 저장 완충액 (25mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 1M NaCl, 10% 글리세롤, 5mM β-메르캅토에탄올)으로 희석시킴으로써 1㎖ 당 단백질 약 0.83㎎이 되도록 조정하였다. 고체 3-([3-콜아미도프로필]디메틸-암모니오)-1-프로판설페이트 (CHAPS)을 첨가하여, 최종 농도 2% (w/v) 및 세정제 대 단백질 비 24:1을 달성하였다. 얼음상에서 1시간 인큐베이팅 후, 샘플을 원심분리시키고 (200,000g, 1시간), 상층액 분획을 수거하였다.

C. 왁스 신타제 활성의 정제

200,000g 상층액 분획을 (0.57% CHAPS, 25mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 20% 글리세롤로) 희석시켜서, NaCl과 CHAPS의 최종 농도가 각각 0.3M 및 1%가 되게 하였다. 샘플을, 0.3M NaCl을 함유하는 완충액 B (25mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 1% CHAPS, 20% 글리세롤)로 평형시켜놓은 Blue A-아가로오스 (Amicon, Inc., Beverly, MA) 상에 로딩시켰다. 평형화 완충액으로 세척시킨 후, 왁스 신타제 활성을 2M NaCl을 함유하는 완충액 B로 용리시켰다. Blue A 칼럼으로부터 용리된 활성 분획을 풀링시키고 (블루 풀(Blue Pool)), 추가 크로마토그래피를 위해 사용하였다.

두 가지 정제 프로토콜을 밴드 확인 및 왁스 신타제 단백질의 추가 정제를 위해 사용하였다. 프로토콜 1 (도 1)의 경우, 블루 풀을 YM 30 막 (Amicon, Inc., Beverly, MA)이 갖추어진 압력 셀에서 한외여과에 의해 5.4배로 농축시켰다. 농축액의 절반을, 2M NaCl을 함유하는 완충액 B 중에서 평형된 세라믹 수산화인회석 (CHT) 칼럼 (Bio-Scale CHT-2; Bio-Rad, Hercules, CA)에 적용시켰다. 칼럼을 평형 완충액 6 칼럼 부피로 세척하고, 결합된 단백질을 0.1M 디포타슘 포스페이트와 2M NaCl을 함유하는 완충액 B로 용리시켰다. CHT 칼럼의 재평형 후, 블루 풀 농도의 나머지 절반을 동일한 방식으로 크로마토그래피시켰다. 활성을 검출하기 위해, 왁스 신타제를 한외여과에 의해 농축된 샘플에 대한 프로토콜에 따라 검정하였다. CHT-런(Run) 1에서 측정된 왁스 신타제 활성은 플로오 쓰루 및 세척액에서 발견되었다. 2회의 CHT 런의 단백질 프로파일은 동일하여, CHT-런 2를 검정하지 않게 하였다. 2회의 CHT 런으로부터의 활성 분획을 풀링시키고, 10배 농축시키고, 1.0M NaCl에 의해 완충액 B 중에서 평형된 세파크릴 S100 HR 칼럼 (2.5 x 90cm)에 적용시켰다. 단백질 및 활성을 결정하고, 활성 분획을, 활성을 최대화시키고, 단배질을 최소화시키는 런의 보유된 부분으로부터 선택하였다. S100 풀 (분획 64-70)을 완충액 B 중에서 1M NaCl에 의해 평형된 결정성 수산화인회석 (HA) 칼럼 (Bio-Gel HT; Bio-Rad, Hercules, CA, 1 x 19.3cm)에 적용시켰다. 다시, 대부분의 왁스 신타제 활성은 통과액 및 세척액에 존재하였다. 결합된 단백질을, 완충액 B 중에서 0.1M 디포타슘 포스페이트 및 1M NaCl로 용리시켰다. 최종 HA 런으로부터의 분획을 SDA-PAGE에 의해 조사하였다. SDS-PAGE에서 33kD로 이동하는 하나의 단백질은 왁스 신타제 활성의 존재와 상호 관련이 있었다.

제 2의 제제 (프로토콜 2, 도 2)에서, 블루 풀을, 농축 없이, 완충액 B 중에서 1M NaCl로 평형시킨 결정성 HA 칼럼 (1 x 11.7cm)에 직접 적용시켰다. 두 분획을, 25mM 트리신-NaOH, pH 7.8, 1% CHAPS, 20% 글리세롤, 1M NaCl로 평형시킨 수퍼덱스 75 HR 10/30 칼럼 (Bio-Rad, Hercules, CA; 크기 범위: 5000 - 75,000 달톤) 상에서 크기별 배제 크로마토그래피에 의한 추가 정제를 위해 선택하였다. 왁스 신타제 활성을 실시예 1C에 있는 용해된 샘플에 대해 기술된 프로토콜에 따라 측정하였다. 한 분획을 HA 칼럼의 통과액에서 초기에 용리시키고 (분획 31), 다른 분획을 세척액에서 용리시켰다 (분획 67). 두 분획의 단백질 프로파일은 SDS-PAGE 분석을 기초로 하여 상이하였다. 수퍼덱스 75 런 둘 모두를 구배 SDS-PAGE에 의해 조사하고, 약 33kD의 단백질을 확인하고, 활성에 대해 크로마토그래피시켰다. 보정 곡선을 동일한 완충액 및 칼럼 조건하에 크로마토그래피된 분자량 표준을 사용하여 작도하였다. 이 표준 곡선에 대한 왁스 신타제 활성의 피크의 용리 부피를 비교하여, 용해된 효소의 분자량에 대해 48kDa의 값을 수득하였다.

프로토콜 1로부터의 왁스 신타제의 정제를 나타내는 차트 (표 2)는 용해된 단백질 분획으로부터의 효소의 150배 정제를 나타낸다.

표 2

호호바 왁스 신타제의 정제

정제 단계	효소 활성(nmol/분)	수율%	단백질(mg)	비활성(nmol/분/mg)	정제(배수)
용해된 분획	274.4	100	415	0.7	1
블루 A 아가로오스	24.7	78.2	15	14.3	22
세라믹 수산화인회석 e	176.6	64.3	6.4	27.6	42
세파크릴 S-100 (정립)	41.3	15.1	1.2	33.1	50
수산화인회석 e	18.8	6.9	0.2	99.2	150

D. SDS PAGE 분석

칼럼 분획으로부터의 샘플을 SDS PAGE 샘플 완충액 (1x 완충액 = 2% SDS, 250mM β-메르캅토에탄올, 0.0025% 브로모페놀 블루) 중에서 희석시키고, 전기영동에 의해 분석하였다. 폴리아크릴아미드 구배 겔 전기영동 (10-13%)을 델레펠라이레(Delepelaire) (Proc. Nat. Acad. Sci. (1979) 76: 111-115)를 약간 변형시킨 래밀리(Laemmli)의 방법 (Nature (1970) 227:680-685)에 따라 수행하였다. 소듐 도데실 설페이트를 상부 저장기 완충액에서는 0.1%로 사용하였지만, 하부 저장기 완충액, 스태킹 및 분해 겔로부터는 생략되었다. 스태킹 겔은 30% 아크릴아미드 원액 (29.2% 아크릴아미드, 0.8% N,N'-비스-메틸렌아크릴아미드, w/v)의 5%, 0.06% 암모늄 퍼설페이트 (w/v) 및 0.1% TEMED (v/v)을 함유하였다. 분해 겔은 수크로오스의 0 내지 10% 선형 구배에 의해 안정된 아크릴아미드 원액의 10 내지 13% 선형 구배를 함유하였다. 전기영동을 실온에서, 150V의 일정 전압에서 9 내지 10시간 동안 수행하였다. 단백질을, 블럼(Blum) 등의 방법 [참조: Electrophoresis (1987) 8:93-99]에 따른 은 또는 쿠마시 블루 (0.1% 쿠마시 블루 R-250, 50% 메탄올, 10% 아세트산)로 염색시킴으로써 가시화시켰다. 왁스 신타제로서 확인된 33 kDa 단백질은 수산화인회석 칼럼을 통해 정제될 때까지 활성 분획의 주 성분으로서 나타나지 않는다. 정제 프로토콜 1 후 (실시예 3C), 최종 칼럼 상의 활성과 서로 관련되는 유일한 단백질은 33 kDa에 있는 단백질이었다.

실시예 4 - 겔내 분해를 위한 단백질의 제조

A. 농축에 의한 SDS-PAGE를 위한 샘플의 제조

최종 HA 칼럼의 통과액/세척액으로부터의 기수 분획 (프로토콜 1)을 풀링시키고, YM 30 막 (Amicon, Inc., Beverly, MA)이 갖추어진 압력 셀에서 한외여과에 의해 3배 농축시켰다. 샘플을 2개의 센트리콘(Centricon)-30 유닛 (Amicon, Inc., Beverly, MA)을 사용하여 약 50㎕의 부피로 추가 농축시켰다. 각각의 샘플을 6㎕ SDS 칵테일 (4㎕ 20% SDS, 1㎕ 14.3M β-메르캅토에탄올 및 1㎕ 0.1% 브로모페놀 블루)을 사용하여 처리하였다. 실온에서 15분간 방치시킨 후, 샘플을 10 내지 13% 아크릴아미드 구배 겔 (실시예 3D) (16 x 16cm x 1mm 두께)에 적용시키고, 단백질을 150V의 일정 전압에서 9.5시간 동안 전기영동시킴으로써 분석하였다. 겔을, 50% 메탄올, 10% 아세트산 중의 0.1% 쿠마시 블루로 15분간 염색시킨 후, 50% 메탄올, 10% 아세트산 중에서 2 x 20분간 탈염색시켰다. 33kD 왁스 신타제 밴드를 겔로부터 절제시키고, 50% 에탄올 중에서 3 x 20분간 탈염색시켰다. 한 레인은 일련의 단백질을 함유하였으며, 최종 분해에서 사용되지 않았다.

B. 침전에 의한 SDS-PAGE를 위한 샘플의 제조

최종 HA 칼럼으로부터의 서수 분획의 분액 (0.8㎖) (프로토콜 1)을 칼럼 프로파일에 대해 3개 군에서 풀링시켰다. 풀을 3개의 1.5㎖ 들이 바이알내에 동등하게 나누었다. 단백질을 40% TCA 0.2㎖를 첨가함으로써 침전시켰다. 얼음상에서 30분간 방치시킨 후, 샘플을 원심분리하여 (12,000 x g, 4℃에서 15분간), 침전된 단백질을 펠레트화시켰다. 상층액을 제거하고, 펠레트를 빙온 아세톤 0.6㎖로 2회 세척시켰다. 샘플의 각각의 풀링된 세트에 대한 최종 3개 펠레트를, 완충액을 한 바이알부터 다음 바이알로 옮김으로써 SDS 샘플 완충액의 동일한 50㎕로 재현탁시켰다. 샘플을 12% 아크릴아미드 트리스/글리신 미니-겔 (Novex, San Diego, CA, 1.5mm x 10 웰)에 적용시키고, 단백질을, 겔의 풋으로부터의 염료의 용리를 지나서 150V의 일정 전압에서 20분간 전기영동시킴으로써 분석하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색시키고, 겔-클리어(Gel-Clear) (Novex, San Diego, CA)를 사용하여 탈염색시켰다. 왁스 신타제를, 피크를 나타내고, 칼럼으로부터의 분획을 테일링(tailing)하는 겔 상의 3개의 비균등 레인으로부터 절제시켰다. 겔 슬라이스를 1.5㎖ 바이알에 넣고, 50% 메탄올, 10% 아세트산 1㎖로 탈염색시켰다. 탈염색 용액을 제거하고, 겔 슬라이스를 액체 질소중에서 동결시키고, 드라이아이스로 저장하여, 예일 대학에 있는 더블유 엠 켁 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 라보라토리 (W M Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory)로 겔내 분해를 위해 보냈다. 한외여과에 의해 농축된 샘플로부터의 하나의 겔 슬라이스 및 침전에 의해 농축된 샘플로부터의 3개의 겔 슬라이스를 겔내 트립신 분해를 위해 풀링시켰다.

실시예 5 - 아미노산 서열의 결정

단백질 시퀀싱을 예일 대학에 있는 더블유. 엠. 켁 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 라보라토리에서 수행하였다. 과정은, 정량 및 아미노산 조성에 대한 겔 슬라이스의 일부 (10-15%)의 아미노산 분석, 단백가수분해 효소 (트립신 또는 리실(lysyl) 엔도펩티다아제) 중의 하나에 의한 단백질의 분해, 및 역상 HPLC에 의한 생성물의 분별을 포함한다. 흡광도 피크를 HPLC 런으로부터 선택하고, 레이저 탈흡수 질량 분광계에 적용하여, 펩티드의 존재, 양 및 질량을 결정한 후, 단백질 시퀀싱을 수행하였다. 최장 펩티드를 마이크로시퀀싱에 대해 선택하였다.

트립신 분해에 의해 수득한 호호바 왁스 신타제 펩티드의 아미노산 서열을 1문자 코드를 사용하여 하기 표 3에 나타내었다.

표 3

호호바 왁스 신타제의 트립신에 의한 펩티드의 아미노산 서열

WSpep29 FVPAVAPHGGALR

WSpep33 TIDEYPVMFNYTQK

cDNA 라이브러리 또는 게놈성 DNA로부터 왁스 핵산 서열을 분리하는 방법이 기재되어 있다.

A. 호호바 cDNA 라이브러리의 구성

RNA를 문헌[Jackson and Larkins, Plant Physiol. (1976) 57:5-10]에서 처음 기재되고, 문헌[Goldberg et al., Developmental Biol. (1981) 83:201-217]에 의해 변화된 폴리리보좀 분리 방법을 사용하여 개화 80-90일 후에 수거된 호호바 배아로부터 분리하였다. 이러한 과정에서, 달리 명시되지 않는 한, 모든 단계는 4℃에서 수행된는 것이다. 10g의 조직을 조직이 미세한 분말이 될 때가지 워링 혼합기(Waring blender)내의 액체 질소중에서 분쇄시켰다. 액체 질소를 증발시킨 후에, 170ml의 추출 완충액(200mM 트리스 pH 9.0, 160mM KCl, 25mM EGTA, 70mM MgCl₂, 1% 트리톤 X-100, 0.5% 나트륨 디옥시클로레이트, 1mM 스페르미딘, 10mM β-메르캅토에탄올, 및 500mM 수크로스)을 가하고, 조직을 약 2분 동안 균질화시켰다. 균질물을 무균의 미라클로쓰(miracloth)를 통해 여과하고, 12,000 x g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등물을 500ml 무균 플라스크내로 따라내고, 1/19 용적의 20% 세정 용액(20% Brij 35, 20% 트윈 40, 20% 노이디트 p-40 w/v)을 실온에서 가하였다. 용액을 4℃에서 30분 동안 온화한 속도로 교반하고, 상등물을 12,000 x g에서 30분 동안 원심분리하였다.

약 30ml의 상등물을 무균 Ti 60 원심분리 튜브에 분취하고, 40mM 트리스 pH 9.0, 5mM EGTA, 200mM KCl, 30mM MgCl₂, 1.8M 수크로스, 5mM β-메르캅토에탄올을 함유하는 7ml의 용액을 밑에 깔았다. 튜브의 상부를 추출 완충액으로 충전시키고, Ti60 회전기내에서 4℃로 4시간(h) 동안 60,000rpm으로 회전시켰다. 원심분리후에, 상등물을 흡인해 내고, 0.5ml의 재현탁 완충액(40mM 트리스 pH9.0, 5mM EDTA, 200mM KCl, 30mM MgCl₂, 5mM β-메르캅토에탄올)을 각각의 튜브에 가하였다. 튜브를 얼음상에 10분 동안 위치시키고, 펠릿을 재현탁시켜서 모았다. 상등물을 120 x g에서 10분 동안 원심분리하여 불용물질을 제거하였다. 20mM 트리스 pH7.6, 200mM EGTA, 2% N-라우릴-사코시네이트둥의 1 용적의 자가 분해된 1mg/ml 단백질 분해효소 K를 상등물에 가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

RNA는 1/10 용적의 나트륨 아세테이트 및 2 용적의 에탄올을 가함으로써 침전시켰다. 20℃에서 수시간 후에 RNA를 4℃에서 12,000 x g로 30분동안 원심분리함으로써 펠릿화시켰다. 펠릿을 10ml의 TE 완충액(10mM 트리스, 1mM EDTA)에 재현탁시키고, 동일한 용적의 트리스 pH7.5 포화된 페놀로 추출하였다. 상을 4℃에서 20분 동안 10,000 x g에서 원심분리함으로써 분리하였다. 수성상을 제거하고 유기상을 1 용적의 TE 완충액으로 재추출하였다. 수성상을 모아서 1용적의 클로로포름으로 추출하였다. 상을 원심분리하여 분리하고, 수성상 에탄올을 상기된 바와 같이 침전시켜서, 폴리리보좀 RNA를 수득하였다.

폴리리보좀 RNA 제제중의 폴리사카라이드 오염물을 고염 완충액(0.5M NaCl, 20mM 트리스 pH 7.5, 1mM EDTA, 0.1% SDS)중의 셀롤로오즈 컬럼(Sigma-cell 50)상에서 RNA를 용리시킴으로써 제거하였다. 오염물은 컬럼에 결합하며, RNA는 용리물로 수거된다. 용리물 분획을 모아서 RNA를 에탄올 침전시켰다. 침전된 전체 RNA를 소량으로 재현탁시키고, 올리고 d(T) 셀룰로오스 컬럼에 가하여 폴리아데닐화된 RNA를 분리하였다.

폴리아데닐화된 RNA는 시판중의 클로닝 벡터 블루우스크라이브 M13-(Stratagene Cloning Systems; San Diego, CA)으로부터 유도되고 하기된 바와 같이 제조된 플라스미드 클로닝 벡터 pCGN1703중에 cDNA 라이브러리를 구성시키는데 사용하였다. 블루우스크라이브 M13-의 폴리링커는 BamHI에 의한 분해, 녹두 엔도누클레아제로 처리, 블런트-말단 결찰에 의해 변화시켜서 BamHI-삭제된 플라스미드, pCGN1700을 형성시켰다. pCGN1700을 EcoRI 및 SstI(인접한 제한 부위)로 분해시키고, BamHI, PstI, XbaI, ApaI 및 SmaI, AATT의 5' 돌출부 및 TCGA의 3' 돌출부에 대한 제한부위를 함유하는 합성 링커로 어닐링하였다. pCGN1700내로 링커를 삽입하면 EcoRI 부위가 제거되고, 블루우스크라이브에서 발견된 SstI(또한, 이하 "SacI"라고도 일컬어진다) 부위가 재생되고, 링커에 함유된 새로운 제한 부위가 추가된다. 생성되는 플라스미드 pCGN1702는 HindIII에 의해 분해되고, 클레노우 (Klenow) 효소에 의해 블런트 말단되고; 선형 DNA는 PvuII에 의해 부분적으로 분해되고, 묽은 용액중의 T4 DNA 왁스 신타제에 의해 결찰된다. 삭제된 lac 프로모터 영역을 함유하는 형질 전환체가 선택되고(pCGN1703), 플라스미드 클로닝 벡터로서 사용된다.

요약하면, cDNA 합성을 위한 클로닝 방법은 다음과 같다. 플라스미드 클로닝 벡터를 SstI로 분해시키고, 단일중합체 T-테일은 말단 데옥시누클레오티딜 트란스페라제를 사용함으로써 3'-돌출부 스틱-말단상에서 생성된다. 테일된 플라스미드는 올리고(dA)-셀룰로오스 크로마토그래피에 의해 비분해된 또는 비-테일된 플라스미드로부터 분리된다. 생성물 벡터는 벡터 플라스미드의 말단에 공유 결합된 cDNA 제 1 가닥의 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. cDNA-mRNA-벡터 복합체는 데옥시구아노신 트리포스페이트의 존재하에 말단 트란스페라제로 처리되어, cDNA 가닥의 말단에 G-테일을 생성시킨다. BamHI 부위에 인접한 외부 cDNA-mRNA 복합체는 BamHI 분해에 의해 제거되어, 한쪽 말단에 BamHI 스틱 말단 및 다른쪽 말단에 G-테일을 지닌 cDNA-mRNA-벡터 복합체를 생성시킨다. 이러한 복합체는 5' BamHI 스티키-말단, 제한 효소 NotI, EcoRI 및 SstI에 대한 인식 서열, 및 3' C-테일 말단을 지니는 어닐링된 합성 고리화 링커를 사용함으로써 사이클링된다. 결찰 및 복구 후에, 순환 복합체는 대장균 균주 DH5a(BRL, Gaithersburg, MD)내로 형질전환되어, cDNA 라이브러리를 생성시킨다. 호호바 배아 cDNA 뱅크는 약 500 염기쌍의 평균 cDNA 삽입 크기의 약 1.5 x 10⁶클론을 함유한다.

또한, 호호바 폴리아데닐화된 RNA는 클로닝 벡터 1ZAPII/EcoRI(Stratagene, San Diego, CA)에서 cDNA 라이브러리를 구성시키는데 사용된다. 이러한 라이브러리는 원안, 제조자에 의해 제공된 DNA 및 박테리아 균주를 사용함으로써 구성된다. 클론은 제조자의 설명에 따라서 기가팩 골드 패키징 추출물(Gigapack Gold packaging extracts)을 사용함으로써 패키징된다. 이러한 방법으로 구성된 cDNA 라이브러리는 약 400 염기쌍의 평균 cDNA 삽입 크기를 지닌 약 1 x 10⁶클론을 함유한다.

B. 합성 올리고누클레오티드

일반적으로, mRNA로부터 역 전사된 단일 가닥 DNA 주형으로부터의 PCR 프라이머로서 사용하기 위해서, 신타제 펩티드 암호화 서열에 상응하는 샌스 배향 서열을 함유한 올리고누클레오티드를 제조하였다. 이러한 올리고누클레오티드는 샌스 가닥 DNA를 생성하는 "정방향" 증폭 반응을 위한 프라이머로서 사용된다.

비-코딩 DNA 가닥의 증폭을 위한 "역" 반응의 경우에, 올리고누클레오티드는 PCR을 위한 DNA 주형을 제조하는데 사용된 프라이머의 일부와 동일하게 디자인 될 수 있다. 또한, 왁스 신타제 펩티드 안호화 서열에 대해 상보성인 서열을 함유하는 올리고누클레오티드가 상기된 바와 같은 "정방향" 왁스 신타제 올리고누클레오티드 프라이머와 함께 사용될 수 있다.

왁스 신타제 펩티드 서열이 많은 상이한 코돈에 의해 암호화될 수 있는 아미노산을 함유하는 경우에, 정방향 또는 역방향 프라이머가 올리고누클레오티드, 즉, 특정의 펩티드 영역의 위한 모든 또는 일부의 가능한 암호화 서열의 혼합물을 함유하는 올리고누클레오티드를 "퇴행"시킬 수 있다. 이러한 혼합물에 존재하는 상이한 올리고누클레오티드의 수를 감소시키기 위해서, PCR 프라이머를 위한 합성 올리고누클레오티드를 제조할 때 최소한의 가능한 암호화 서열을 지니는 펩티드 영역을 선택하는 것이 바람직하다. 유사하게, 합성 올리고누클레오티드가 왁스 신타제 서열을 위한 라이브러리를 직접적으로 스크리닝하는데 사용되는 경우에, 보다 적은 퇴행성 올리고누클레오티드가 바람직하다.

이하의 설명은 펩티드 WSpep29(중심 라인)의 서열 및 펩티드 WSpep29를 암호화할 수 있는 정방향(상부 라인) 및 역방향(바닥 라인) DNA 서열의 예를 나타낸다.

이하의 설명은 펩티드 WSpep33(중심 라인)의 서열 및 펩티드 WSpep33을 암호화할 수 있는 정방향(상부 라인) 및 역방향(바닥 라인) DNA 서열의 예를 나타낸다.

이하의 설명을 왁스 신타제 서열을 얻는데 사용될 수 있는 합성 올리고누클레오티드의 서열을 나타낸다. 올리고누클레오티드의 명칭은 실시예 6에 열거된 바와 같이 특정의 확스 신타제 펩티드 단편의 수를 반영한다. 올리고누클레오티드 명칭에서 문자 "F"는 PCR 정방향 반응 프라이머를 나타낸다. 문자 "R"은 PCR 역방향 반응 프라이머를 나타낸다.

올리고누클레오티드, TSYN은 폴리(A)+ 또는 전체 RNA로부터의 역전사에 사용되어, PCR 주형으로 사용되는 단일 가닥 DNA를 형성시킨다. mRNA 폴리(A) 테일에 결합하는 폴리(T) 영역에 추가로, 올리고누클레오티드는 HindIII, PstI 및 SstI에 대한 제한 분해 서열을 함유한다. TSYN의 서열은 다음과 같다.

올리고누클레오티드, TAMP는 왁스 신타제 암호화 서열의 안티샌스 가닥의 증폭을 위한 PCR의 역반응에 유용하다. PCR에 대한 주형이 mRNA로부터 역 전사된 단일 가닥 DNA인 경우, 역 반응은 제 1 정방향 반응이 완료될 때까지 발생되지 않는다. 제 1 가닥 반응은 역 프라이머로부터의 안티샌스 DNA 가닥의 증폭에 사용될 수 있는 샌스 가닥 주형을 생성시킨다. TAMP의 서열은 다음과 같다.

상기 올리고누클레오티드에 대한 누클레오티드 염기 코드는 하기된 바와 같은 IUPAC 표준에 따른다.

A=아데닌 T=티민 Y=시토신 또는 티민

C=시토신 U=우라실 R=아데닌 또는 구아닌

G=구아닌 I=이노신 O=이노신 또는 시토신

H=아데닌, 시토신 또는 티민

D=아데닌, 구아닌 또는 티민

N=아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민

W=아데닌 또는 티민

S=구아닌 또는 시토신

B=구아닌, 시토신 또는 티민

K=구아닌 또는 티민

M=아데닌 또는 시토신

C. PCR 반응

폴리(A)+RNA는 상기된 바와 같은 호호바 조직으로부터 제조된 전체 RNA로부터 분리된다. 단일 가닥 cDNA는 올이고누클레오티드 프라이머로서의 TSYN 및 수퍼스크립트 역 트랜스크립타제(BRL)을 사용함으로써 역 전사에 의해서 폴리(A) + 또는 전체 RNA로부터 제조된다. 이러한 반응은 반응이 37℃가 아닌 45℃에서 수행됨을 제외하고는 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 호호바 단일 가닥 cDNA는 하기된 PCR 반응 1-12에서 사용된다.

PCR은 주형으로서 역 전사된 단일 가닥 cDNA를 사용함으로써 퍼킨 엘머 세투스 진에이앰피 PCR 시스템 9600 PCR 장치에서 수행된다. 시판중의 PCR 반응 및 최적화 시약은 제조자의 설명에 따라 사용된다. 상기 프라이머의 cDNA 위치된 3'의 부분이 다음 반응에 의해 증폭될 수 있다.

추가의 증폭이 요구되는 경우, 프라이머 분해된 -F1을 함유하는 반응의 PCR 생성물이 프라이머 분해된 -F2를 사용한 PCR 반응의 제 2 라운드를 위한 주형으로 사용될 수 있다. 유사하게, 프라이머 분해된 -R1을 함유하는 반응물의 PCR 생성물은 프라이머 분해된 -R2를 사용한 PCR 반응물의 제 2 라운드에 대한 주형으로 사용될 수 있다.

또한, 전체 cDNA는 제조자의 지시에 따른 마라톤 cDNA 증폭 키트(Clontech Laboraties Inc.)를 사용한 5' 및 3' RACE(Frohman et al., 1988)을 사용함으로써 증폭될 수 있다. 프라이머 WSpep29-F1, WSpep29-F2, WSpep33-F1, 및 WSpep33-F2는 3'RACE 반응에 사용된다. 프라이머 WSpep29-R1, WSpep29-R1, WSpep33-R1 및 WSpep33-R2는 5'RACE 반응에 사용된다.

PCR 반응에서 생성된 DNA 단편은 제조자의 원안(Invitrogen Corp.)에 따라 pCR2.1내로 클로닝된다. 클로닝된 단편의 DNA 서열은 클로닝된 단편이 왁스 신타제 펩티드를 암호화하는 것을 확인하는데 사용된다.

D. 왁스 신타제 서열에 대한 라이브러리 스크리닝

PCR에 의해 얻은 왁스 신타제 DNA 단편은 표지되며, 상기된 바와 같은 cDNA 라이브러리로부터 클론을 스크리닝하는데 프로브로 사용된다. DNA 라이브러리스크리닝 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다. 이러한 방법으로, 왁스 신타제 핵산 서열이 얻어지며, 핵산 서열에 대해 분석될 수 있고 다양한 숙주, 즉 원핵 및 진핵 숙주에서 왁스 신타제를 발현시키는데 사용될 수 있다.

실시예 6 - 식물 발현을 위한 왁스 신타제 및 환원효소 구성물

식물 세포에서 왁스 신타제 및 환원효소 서열을 발현시키는 구성물은 다음과 같이 제조될 수 있다.

씨드 조직에서 우선적으로 발현된 유전자로부터의 5' 및 3' 조절 영역을 함유하는 발현 카세트는, 예를들어, WO 92/03564호에 기재된 나핀, Bce4 및 ACP로부터 제조될 수 있다.

예를들어, 왁스 신타제 또는 환원효소 유전자 구성물의 발현에 사용될 수 있는 나핀 발현 카세트, pCGN1808은 문헌[Kridl et al., Seed Science Research (1991) 1:209-219]에 기재되어 있다. 추가의 나핀 발현 카세트, pCGN3223은 암피실린 내성 바탕, 및 pCGN1808에서 발견된 바와 같은 기본적으로 동일한 1.725 나핀 5' 및 1.265 3' 조절 서열을 함유한다. 조절 영역은 HindIII, NotI 및 KpnI 제한 부위로 플랭킹되며, 독특한 SalI, BglII, PstI 및 XhoI 클로닝 부위가 5' 및 3' 비코딩 영역 사이에 위치한다.

올레오신 유전자로부터의 5' 및 3' 영역의 조절하에 전사 조절을 위한 서열을 클로닝하는 카세트가 또한 사용될 수 있다. 브라시카 나프스 (Brassica napus) 올레오신 유전자의 서열은 문헌[Lee and Huang, Plant Phys. (1991) 96:1395-1397]에 보고되어 있다. 올레오신 카세트, pCGN7636의 서열은 USPN 5,445,947호의 도 4에 기재되어 있다. 올레오신 카세트는 BssHII, KpnI 및 XbaI 제한 부위에 의해 플랭킹되며, 5' 및 3' 올레오신 영역 사이의 목적하는 왁스 신타제, 환원효소 또는 다른 DNA 서열의 삽입을 위한 SalI, BamHI 및 PstI 부위를 함유한다.

왁스 신타제 및 환원효소 유전자 서열은 그러한 카세트내로 삽입되어 식물 형질전환 방법을 위한 발현 구성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 나핀 유전자로부터의 5' 및 3' 조절 영역을 사용하는 식물 세포에서의 환원효소의 발현을 위한 구성물은 USPN 5,445,947호에 기재되어 있다.

2중 벡터 구성물이 문헌[Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978) 163:181-187]의 방법에 의해서, 균주 EHA101[문헌: Hood et al., J. Bacteriol (1986) 168:1291-1301]와 같은 어그로박테리움 세포내로 형질 전환되고, 하기된 식물 형질전환 방법에 사용된다.

실시예 7 - 디아실글리세롤 아실트란스페라제 (DAGAT) 검정

비-용해화되거나 용해화된 단백질 제제에서 DAGAT 활성을 검정하는 방법이 모르티에렐라 라마니아나에 대해 기재되어 있다.

A. 비-용해화된 샘플

DAGAT 활성은 문헌[Kamisaka et al. (1993,1994)]에 기재된 바와 같이 전체 100μl의 양으로 10mM 인산칼륨 (pH 7.0), 100-150mM KCl, 및 0.1% TX-100(w/v)를 함유하는 완충액중의 3.67μM 1-¹⁴C-18:1-보조효소 A(53.5-54.5 Ci/mol, New England Nuclear, Boston, MA) 및 1.5mM 1,2-18:1 디아실글리세롤(DAG)(2-메톡시에탄올중의 150mM 원액으로 제조됨, Sigma D-0138)로 검정하였다. 검정은 30℃에서 5분 동안 수행되고, 1.5ml의 헵탄:이소프로파놀:0.5M H₂SO₄(10:40:1, v/v/v)를 첨가함으로써 종결된다. 필요한 경우, 샘플을 검정전에 완충액으로 희석하여, 검정 동안에 선형 생성물 형성 속도가 유지되게 할 수 있다.

B. 용해화된 샘플

검정은 하기된 바와 같은 변화를 주면서 비용해화된 샘플에 대한 바와 같이 수행하였다: 1,2-18:1 DAG의 양은 0.5mM로 감소되고, 트리톤 X-100의 양은 0.2%로 증가되고, KCl의 농도는 100-125mM 사이로 유지된다. 가키사카(1996, 1997)등이 기재한 바와 같이 세정제로 용해화시킨 후에 활성을 회복하게 하기 위해서 L-α-포스파티드산(1% 트리톤 X-100(w/v)중의 50mM 원액으로 제조된 Sigma P-9511)을 포함하는 것이 필요하다. 본 발명자들은 500μM이 아닌 300μM의 포스파티드산을 사용하면 트리톤 X-100에 의한 처리후에 DAGAT 활성을 보다 높게 자극한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 DAGAT 활성이 100-125mM 사이의 최적의 수준으로 검정에 도입된 KCl의 양에 민감하다는 것을 발견하였다. 검정은 30℃에서 5-30분 동안 수행되고, 비-용해화된 샘플에 대해 기재된 바와 같이 종결된다.

C. 샘플 검정의 과정

검정이 중지된 후에, 검정물은 이후의 처리를 위해 4℃에서 저장되거나, 0.1ml 1M NaHCO₃를 가한 다음, 추출을 위한 담체로서 15nmol/ml 트리올레인을 함유하는 1ml의 헵탄을 가함으로써 즉각적으로 처리될 수 있다. 함유물은 진탕시키고, 수성상과 유성상을 분리한 후에, 상부 유성상을 새로운 유리 바이알에 제거하고 1ml NaCl로 세척하였다. 40%의 최종 유기상이 액체 신틸레이션 계수를 위해 제거되고, 나머지 유기상을 깨끗한 바이알에 옮겨서 질소가스하에 건조한 상태로 증발시켰다. 잔류물을 45μl 헥산에 재현탁시키고, 예비 흡착된 부하 영역(Analtech #31011, Newark, Delaware)이 있는 실리카겔-G, 유리, 박층크로마토그래피 (TLC)판에 점적하였다. TLC판을 헥산:디에틸 에테르:아세트산(50:50:1, v/v/v)에서 상부로 전개시켜, 건조시키고, 라디오-영상 분석기(AMBIS 3000, San Diego, CA)로 스캐닝하여, 트리아실글리세롤내로 혼입된 방사성 활성 부분을 측정하였다.

실시예 8 - 모르티에렐라 라마니아나 배양물의 성장 및 수거

모르티에렐라 라마니아나를 1L의 표준 글루코스 배지(역삼투(pH 5.7)에 의해 정제된 1L의 물중의 30g 글루코스, 1.5g (NH₄)₂SO₄, 3g K₂HPO₄, 0.3g MgSO₄·7H₂O, 0.1g NaCl, 5g CH₃COONa·3H₂O, 10mg FeSO₄·7H₂O, 1.2mg CaCl₂·2H₂O, 0.2mg CuSO₄·5H₂O, 1.0mg ZnSO₄·7H₂O, 1.0mg MnCl₂·4H₂O, 2mg 티아민-HCl 및 0.02mg 비오틴)를 1.5-3 x 10⁶스포어로 접종시키고, 200rpm에서 9-11일 동안 진탕시키면서 30℃에서 인큐베이션함으로써 배양하였다. 배양물을 한층의 미라클로쓰(Miracloth: Calbiochem, La Jolla, CA)를 통해 여과함으로써 수거하였다. 과량의 액체를 손으로 짜서 제거하였다. 수거된 리터당 충전 세포의 평균 수득량은 22.5g이었다.

실시예 9 - 구배 겔 나트륨 도데실 술페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)

컬럼 분획으로부터의 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액(1 x 완충액=2% SDS, 250mM β-메르캅토에탄올, 0.0025% 브롬페놀 블루우)으로 희석시키고, 전기영동으로 분석하였다. 폴리아크릴아미드 구배 겔 전기영동(10-13%)은 약간의 델레펠레어(Delepelaire(1979))의 변형법이 가미된 라에믈리(Laemmli(1970)의 방법에 따라 수행된다. 나트륨 도데실 술페이트는 0.1%의 상부 저장 완충액에 사용되지만, 하부 저장 완충액으로부터는 생략되어, 겔을 스태킹하고 용해시킨다. 스태킹 켈은 5%의 30% 아크릴아미드 원액(아크릴아미드:N,N'-메틸렌아크릴아미드, 37.5:1, Bio-Rad, Hercules, CA), 0.06% 암노늄 퍼술페이트 및 0.1% TEMED(v/v)를 함유한다. 용해 겔은 0-10% 선형구배의 수크로스에 의해 안정화된 10-13% 선형구배의 아크릴아미드 원액을 함유한다. 전기 영동은 실온에서 150V의 일정한 전압으로 7-9 시간(h) 동안 수행된다. 단백질은 블럼(Blum; 1987)의 방법에 따라 은으로 염색하거나, 쿠마시에 블루우(Coomassie Blue; 0.1% Coomassie Blue R-250, 50% 메탄올 (v/v), 10% 아세트산(v/v))로 염색함으로써 가시화된다.

실시예 10 - 모르티에렐라 라마니아나로부터의 DAGAT의 정제에서 가미사카(1997)에 의해 사용된 크로마토그래피 평가

A. 지질체 분획의 제조

하기의 단계를 4℃에서 수행하였다.

전형적으로, 70-75g의 습윤 충전 세포(-70℃에서 저장)를 각각의 지질체 제제에 대해 사용하였다. 사용 직전에, 세포를 얼음상에서 해동시키고 150ml의 완충액 A(10mM 인산칼륨(pH 7.0), 0.15 M KCl, 0.5M 수크로스, 및 1mM EDTA)에 재현탁시켰다. 하기 프로테아제 억제제를 가하여 단백질 분해를 감소시켰다: 0.1μM 아프로티닌, 1μM 리유펩틴, 및 100μM 페파블록(Pefabloc)(모두 Boehringer Mannheim, Germany). 세포를 5개의 50-ml 튜브로 분할하고, 폴리트론 조직 균질화기(Polytron Tissue Homogenizer: Kinematic GmbH, Brinkman Instruments, Switzerland)로 7 x 1 min에 대한 1cm 직경 프로브로 설정 #7로 용해시켰다. 생성된 슬러리를 원심분리 튜브(29 x104mm)에 옮기고, 고형물 조각을 1500 x g(Beckman Instruments, J2-21, JA-20 로터, 3500rpm)에서 10분 동안 4℃로 회전시킴으로써 펠릿으로 형성시켰다. 상등물을 제거하고 펠릿을 다른 5ml의 완충액 A로 세척하였다. 원심분리 후에, 상등물을 합하였다. 이러한 분획을 'S1'이라 일컷는다. S1을 6개의 초원심분리 튜브(25 x 89mm, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 분할하여, 각각에 5ml의 완충액 B(10mM 인산칼륨 pH7.0, 0.15M KCl, 0.3M 수크로스, 및 1mM EDTA)를 가하였다. 샘플을 4℃에서 3시간 동안 100,000 x g(Beckman Instruments, L8-M, SW-28 로터, 21000rpm)으로 원심분리하였다. 상층의 상부에 떠 있는 지질체 분획(LBF)을 스파툴라(spatula)로 회수하여, 유리 균질화기(Potter-Elvehjem)에 옮겼다. 원심분리 튜브에 잔류하는 소량의 LBF를 4ml의 완충액 B 상층을 제거하고, 이를 균질화기내의 LBF와 합함으로써 피펫으로 수거하였다. 최종 LBF는 40ml의 완충액 B에서 균질화된다. 나머지 분획을 다음과 같이 수거하였다: 상간 분획(0.3 내지 0.5M 수크로스 완충액 사이의 상간 분획), 가용성 분획(상간 분획 아래의 액체 분획), 막 분획(각 튜브의 바닥에 있는 황갈색/갈색 펠릿). 상기 분획 모두를 동결시키고, -70℃에서 저장하여, 용해화 및 추가의 정제에 사용하였다.

B. 지질체 분획으로부터의 DAGAT 활성의 용해화

LBF를 얼음상에서 해동시키고, 용해화는 트리톤 X-100(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)을 10% (w/v) 원액으로부터 최종 농도 1.3%(w/v)까지 가함으로써 달성하였다. 고체 수크로스(Mallinckrodt, Paris, Kentucky)를 가하여 0.5M의 최종 농도가 되게 하였다. 세정제 처리된 샘플을 4℃에서 1시간 동안 고정시키고, 6개의 원심분리 튜브(25 x 89mm, Beckman Instruments)로 옮겼다. 각각의 튜브를 5ml의 완충액 B로 덮었다. 샘플을 4℃에서 3시간 동안 100,000 x g(Beckman Instruments, L8-M, SW-28 로터, 21000 rpm)으로 원심분리하였다. '트리톤 X-100 추출물'로 일컬어지는 용해화된 물질을 얇은 튜브를 오버레이를 통해 1cm의 바닥의 각각의 초원심분리 튜브에 삽입하고, 하부 0.5M 수크로스 층을 온화하게 흡인하여 제거하면서, 상부 0.3M 수크로스 오버레이(부유 지방층을 포함) 및 펠릿을 남김으로써 회수하였다.

가미사카(1997) 등에 의해 기재된 원안에서, 지질페 분획은 0.1% 트리톤 X-100으로 용해화시키고, 100,000 x g에서 원심분리하거나, 0.2㎛ 필터를 통해 여과되었다. 가미사카등은 트리톤 X-100 농도를 DAGAT의 활성을 위해 1.5%로 증가시켜서 제 1 컬럼과 결합시키는 것이 필요하다는 것을 발견하였다.

C. 모르티에렐라 라마니아나로부터의 DAGAT의 정제에 사용된 크로마토그래피

크로마토그래피에 사용된 완충액 C는 10mM 인산칼륨(pH7.0), 0.1% 트리톤 X-100(w/v)(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 10% 글리세롤 (w/v), 0.1μM 아프로티닌, 1 μM 리유펩틴, 100μM 페파블록(모두 Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 및 나머지 염화칼륨(75-500mM)을 함유한다. 이러한 완충액은 글리세롤이 에틸렌 글리콜로 치환되며, EDTA, DTT 및 PMSF가 생략되면서, 아프로티닌, 리유펩틴 및 페파블록이 포함된다는 점에서 가마사카(1997)등에 의해 사용된 상응하는 컬럼 완충액과는 다르다. 가미사카(1997) 등의 원안 후에, 예로우 86-아가로스 (Sigma R-8504, St. Louis, MO) 컬럼을 제조하고(1.5cm x 5.8cm), 완충액 C중의 150mM KCl로 평형시켰다. 본 발명자들은 이러한 조건하에 트리톤 X-100 추출물에 존재하는 DAGAT 활성을 예로우 86-아가로스 컬럼에 결합시키고자 하였지만, 대부분의 DAGAT가 컬럼과 결합하지 않는다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 상당한 양의 DAGAT 활성이 적용된 샘플의 KCl 농도를 동일한 양의 완충액 C(KCl 없이)으로 75mM로 희석시킴으로써 컬럼에 결합시킬 수 있었다. 따라서, 예로우 86-아가로스 컬럼은 완충액 C에서 75mM KCl중에 평형될 수 있다. 0.56ml/min의 샘플을 적용한 후에, 컬럼을 4 컬럼의 평형 완충액으로 세척하였다. 컬럼에 결합된 DAGAT 활성 및 단백질은 완충액 C중의 500mM KCl로 희석시켰다(도 4).

예로우 86-아가로스 컬럼(분획 17-20)으로부터 희석된 DAGAT 활성을 완충액 C 로 1:3.33으로 희석하여, KCl 농도를 150mM로 감소시켰다. 희석된 푸울(103ml)을 완충액 C중의 150mM KCl로 0.2ml/min으로 평형된 헤파린-세파로스 CL-6B 컬럼(Pharmacia, Uppsala, Sweden, 0.5cm x 4.8cm)에 가하였다. 이러한 컬럼을 5 용적의 평형 완충액으로 세척하고, DAGAT 활성 및 단백질을 완충액 C중의 150-500mM KCl의 15ml 선형 구배로 희석시켰다. DAGAT 활성은 두개의 중첩 피크로 용리된다. 첫번째 피크는 가미사카(1997)에 의해 발견된 바와 같이 구배 동안 용리되고, 가미사카에 의해 발견되지 않은 두 번째 피크는 아주 적은 단백질이 구배의 마지막 부분에서 용리된다(도 5a).

헤파린 컬럼으로부터의 두개의 피크 분획중 일부(250μl)를 완충액 C중의 150mM KCl로 평형된 0.2ml/min의 수퍼덱스-200 컬럼(1 x 30cm, Bio-Rad, Hercules, CA)상의 크기 배제 크로마토그래피로 추가로 정제된다. 단지 측정을 위해서, 컬럼은 트리톤 X-100이 트리톤 X-100 R(Calbiochem, La Jolla, CA)로 대체된 변형된 완충액 C중의 150mM KCl로 평형시켰다. 이러한 컬럼을 바이오-라드 겔 여과 표준을 이용하여 측정하였다. 헤파린-세파로스 CL-6B로부터의 두개의 피크의 각각으로부터의 DAGAT 활성을 산정된 분자질량 99kDa에서 용리시켰다.

추가의 크로마토그래피는 보다 높은 특이적 활성으로 DAGAT를 함유한 헤파린 컬럼으로부터의 후자 용리 피크상에서 수행하였다. 이러한 경우에, 헤파린 컬럼(분획 36-41)로부터의 제 2 피크는 완충액 C로 1:6.6으로 용적 46.7ml로 희석된다. 샘플을 0.5ml/min으로 완충액 C의 75mM KCl로 평형된 옐로우 86 아가로스 컬럼(1.0cm x 6.4cm)에 가하였다. 5 컬럼 용적의 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 단백질 및 모든 DAGAT 활성을 완충액 C중의 75-500mM KCl의 40ml 선형 구배로 용리시켰다. DAGAT 활성을 단일 피크로서 용리시켰다(도 6a).

헤파린 및 제 2 옐로우 86 컬럼으로부터 얻은 DAGAT 활성을 함유하는 분획의 단백질 조성물을 실시예 3중의 원안에 따른 구배 SDS-PAGE에 의해 분석된다. 단백질 밴드는 은 염색에 의해서 검출된다. 이러한 컬럼으로부터 용리되는 밴드의 패턴은 분획 대 분획으로 각각의 DAGAT 활성 특징에 대해 비교된다. DAGAT 활성의 존재와 상호 관련된 많은 단백질이 존재한다. 정제 원안은 DAGAT 활성과 연관된 특정의 단백질을 동정하기에 불충분하다는 것이 본 발명자들의 의견이다(도 5B, 6b).

실시예 11 - 모르티에렐라 라마니아나로부터 정제된 DAGAT 단백질을 동정하는 새로운 정제 원안

하기의 단계를 4℃에서 수행하였다.

전형적으로, 70-75g의 습윤 충전 세포(-70℃에서 저장)를 각각의 지질체 제제에 대해 사용하였다. 사용 직전에, 세포를 얼음상에서 해동시키고 150ml의 완충액 A(10mM 인산칼륨(pH 7.0), 0.15 M KCl, 0.5M 수크로스, 및 1mM EDTA)에 재현탁시켰다. 하기 프로테아제 억제제를 가하여 단백질 분해를 감소시켰다: 0.1μM 아프로티닌, 1μM 리유펩틴, 및 100μM 페파블록(Pefabloc)(모두 Boehringer Mannheim, Germany). 샘플을 0.5mm 글래스 비드를 사용하는 세포 파괴기(Bead-Beater, Biospec Products, Bartlesville, OK)로 용해시켰다. 샘플 챔버를 180ml의 글래스 비드로 충전시켰다. 습윤 충전된 세포를 얼음상에서 해동시키고, 150ml의 완충액 A에 재현탁시켰다. 세포 슬러리를 글래스 비드상에 붓었다. 일반적으로 추가의 40-50ml의 완충액 A가 적절한 작용을 위한 챔버를 충전시키는데 요구된다. 이러한 용적은 최초의 용기로부터 나머지 세포 슬러리를 린스하는데 사용되어, 나머지 샘플과 합해질 수 있다. 세포를 샘플의 점도에 따라 45-90초 동안 분쇄('균질화' 세팅)하였다. 글래스 비드를 함유하는 세포슬러리를 튜브들(29 x 104mm)에 분할하고, 500 x g(Beckman Instruments, GPcentrifuge, GH 3.7 수평 로터, 1500rpm) 및 4℃에서 원심분리하였다. 상등물을 제거하고 펠릿을 다른 5ml의 완충액 A로 세척하였다. 원심분리 후에, 상등물을 합하였다. 이러한 분획을 'S1'이라 일컷는다. S1을 6개의 초원심분리 튜브(25 x 89mm, Beckman Instruments)로 분할하여, 각각에 5ml의 변형된 완충액 B(10mM 인산칼륨 pH7.0, 0.15M KCl, 0.3M 수크로스)를 가하였다. EDTA가 완충액 B로부터 제거되는데(참조 실시예 4), 그 이유는 히드록시애퍼타이트 크로마토그래피를 방해하기 때문이다. 샘플을 4℃에서 3시간 동안 100,000 x g(Beckman Instruments, L8-M, SW-28 로터, 21000rpm)으로 원심분리하였다. 상층의 상부에 떠 있는 지질체 분획(LBF)을 스파툴라(spatula)로 회수하여, 유리 균질화기(glass homogenizer)에 옮겼다. 원심분리 튜브에 잔류하는 소량의 LBF를 4ml의 완충액 B 상층을 제거하고, 이를 균질화기내의 LBF와 합함으로써 피펫으로 수거하였다. 최종 LBF는 40ml의 완충액 B에서 균질화된다. 나머지 분획을 다음과 같이 수거하였다: 상간 분획(0.3 내지 0.5M 수크로스 완충액 사이의 상간 분획), 가용성 분획(상간 분획 아래의 액체 분획), 및 막 분획(각 튜브의 바닥에 있는 황갈색/갈색 펠릿). 상기 분획 모두를 동결시키고, -70℃에서 저장하여, 용해화 및 추가의 정제에 사용하였다.

B. 지질체 분획으로부터의 DAGAT 활성의 용해화

용해화전에, 표준 알루민으로서 소 혈청 알부민을 사용한 브래드 포드의 방법(Bradford: Bio-Rad Reagent, Hercules, CA)에 의한 지질체 분획의 분취량으로 단백질을 측정하였다. LBF를 얼음상에서 해동시키고, 1mg 단백질/ml의 농도로 희석시키고, 15:1의 세정제 대 단백질 비율의 트리톤 X-100(w/w, 1.3%dml 트리톤 X-100과 동일)으로 처리하였다. 고체 수크로스(Mallinckrodt, Paris, Kentucky)를 가하여 0.5M의 최종 농도가 되게 하였다. 세정제 처리된 샘플을 4℃에서 1시간 동안 고정시키고, 6개의 원심분리 튜브(25 x 89mm, Beckman Instruments)로 옮겼다. 각각의 튜브를 5ml의 완충액 B로 덮었다. 샘플을 4℃에서 3시간 동안 100,000 x g(Beckman Instruments, L8-M, SW-28 로터, 21000 rpm)으로 원심분리하였다. '트리톤 X-100 추출물'로 일컬어지는 용해화된 물질을 얇은 튜브를 오버레이를 통해 1cm의 바닥의 각각의 초원심분리 튜브에 삽입하고, 하부 0.5M 수크로스 층을 온화하게 흡인하여 제거하면서, 상부 0.3M 수크로스 오버레이(부유 지방층을 포함) 및 펠릿을 남김으로써 회수하였다.

C. DAGAT 컬럼 크로마토그래피

식물종으로부터의 아실트란스페라제 단백질을 정제하는 상기 방법을 모르티에렐라 라마니아나로부터의 DAGAT 정제의 경우에 적용시켰다. 본 발명자들은 호호바로부터의 왁스 신타제(Simmondsia chinensis, WO 공보 95/15387호, 본 발명에서 참조로 인용), 및 코코넛(Cocos nucifera)으로부터의 라이소포스파티드산 아실트란스페라제(LPAAT)(미국특허출원 제08/231,196호, 본 발명에서 참조로 인용)의 정제에 히드록시애퍼타이트 크로마토그래피를 이용하는데 성공하였다. 정제 단계는 예로우 86-아가로스 컬럼후에 도입된다. 옐로우 86-아가로스 다음에 이어지는 히드록시애퍼타이트의 정제원안은 두 가지 방법으로 수행된다. 원안 A에서, 활성은 제 1 컬럼에 결합되고, 용리후에, 분획이 활성에 대해 검정된다. 활성 분획을 모아서 제 2 컬럼에 가하였다. 원안 B에서, 활성은 제 1 컬럼에 결합되고, 모이거나 검정됨이 없이 제 2 컬럼상으로 직접적으로 용리되고 흐른다. 본 발명자들은 이를 직렬식 용리라 일컷는다.

원안 A에서, 트리톤 X-100 추출물을 2ml/min으로 완충액 C(실시예 4.C)중의 75mM KCl로 평형된 옐로우 86-아가로스 컬럼(2.5cm x 6.4cm)에 가하였다. 컬럼을 5배 컬럼 용적의 평형 완충액으로 세척하고, 0.5ml/min으로 완충액 C중의 500mM KCl로 용리시켰다(도 7). 95%의 용리된 활성을 함유하는 두개의 가장 활성이 있는 분획(64 및 65)을 모아서, 0.5ml/min으로 완충액 C중의 500mM KCl로 평형된 히드록시애퍼타이트 컬럼(Bio-Gel HT, Bio-Rad, 1cm x 25.5cm)상으로 부하하였다. DAGAT 활성은 컬럼을 따라서 흐르지만, 대부분의 단백질은 컬럼에 결합된다. 컬럼을 3배 용적의 평형 완충액으로 세척하였다. 결합된 단백질을 0.5ml/min으로 완충액 C중의 500mM KCl 및 100mM 인산이칼륨으로 용리시켰다(도 8a). DAGAT 활성 피크를 함유하는 분획의 일부를 실시예 3에 기재된 바와 같이 구배 겔 SDS-PAGE상에서 용리시켰다. 단백질을 은으로 염색하고, 밴드의 패턴을 분획 대 분획에 대해서 활성 특성에 대해 비교하였다(도 8B). 몇가지 DAGAT 단백질을 활성과 상호 관련이 있었다. 특히, 43kD, 36.5kD, 33kD, 29kD, 28kD 및 27kD에 상응하는 위치에서 이동하는 밴드에 관심을 두었다. 활성과 상호 관련되는 53kD의 영역에서 단백질이 있는 것으로 나타나지 않았다.

원안 B에서, 트리톤 X-100 추출물을 1ml/min으로 완충액 C중의 75mM KCl로 평형된 옐로우 86-아가로스 컬럼(1.5cm x 5.8cm)에 가하였다. 이러한 컬럼으로 5 컬럼 용적의 평형 완충액으로 세척하였다. 이어서, 옐로우 86-아가로스 컬럼으로부터의 출구를 완충액 C중의 500mM KCl로 평형된 히드록시애퍼타이트 컬럼(1.0cm x 26.2cm, 바이오-라드, Hercules, CA)의 유입구에 연결하였다. 옐로우 86 컬럼에 결합된 DAGAT 활성을 500mM KCl을 함유하는 110ml의 완충액 C로 용리시키고, 0.2ml/min으로 히드록시애퍼타이트 컬럼을 통해 직접적으로 통과시켰다. 마지막으로, 히디록시애퍼타이트 컬럼을 옐로우 86-아가로스 컬럼으로부터 분리시키고, 히드록시애퍼타이트 컬럼에 결합된 단백질을 완충액 C중의 500mM KCl 및 100mM 인산이칼륨으로 용리시켰다. DAGAT 활성은 500mM KCl을 함유하는 완충액 C의 110ml 세척 동안에 수거된 히드록시애퍼타이트 컬럼으로부터의 분획에 존재한다.

트리톤 X-100 추출물중의 대부분의 단백질은 옐로우 86-아가로스 컬럼에 결합되지 않으며, 버려진다. DAGAT을 포함한 소량의 단백질이 옐로우 86-아가로스 컬럼에 결합되고 완충액 C중의 500mM KCl로 용리된다. 이러한 용리액이 히드록시애퍼타이트 컬럼에 가해지는 경우, DAGAT 활성은 대부분의 잔류 단백질이 컬럼에 결합되는 동안 흘러내려 분리된다(도 9a). DAGAT 활성 피크를 함유하는 일부의 분획은 구배 겔 SDS-PAGE상에서 용리되며, 은으로 염색된다. 이러한 컬럼으로부터 용리되는 밴드의 패턴은 분획별로 각각의 DAGAT 활성 특성에 대해 비교하였다. 염색된 단백질 밴드의 시험은 33 kDa의 단백질이 DAGAT 활성과 최상으로 상호 관련된다는 것을 나타낸다(도 9b).

실시예 12 - 겔내 분해을 위한 단백질 제제

A. 농축에 의한 SDS-PAGE를 위한 샘플의 제조

최종 HA 컬럼 (원안 1)의 흐름물/세척액으로부터의 홀수 번호 분획을 모아서 YM 30막(Amicon, Inc., Beverly, MA)이 장착된 압력 셀에서 초여과에 의해 3배로 농축시켰다. 샘플을 두개의 센트리콘-30 장치(Centricon-30 units; Amicon, Inc., Beverly, MA)를 사용하여 약 50μl의 용적으로 추가로 농축시켰다. 각각의 샘플을 6μl의 SDS 칵테일(4μl 20%SDS, 1μl 14.3M β-메르캅토에탄올, 및 1μl 0.1% 브로모페놀 블루우)로 처리하였다. 실온에서 15분 동안 교반시킨 후에, 샘플을 10-13 % 아크릴아미드 구배 겔(실시예 3D)(16 x 16cm x 1mm 두께)에 가하고, 단백질을 150V의 일정한 전압에서 9.5시간 동안 전기영동에 의해 용해시켰다. 이러한 겔을 50% 메탄올, 10% 아세트산중의 0.1% 쿠마시에 블루우로 15분동안 염색시키고, 50% 메탄올, 10% 아세트산중에서 2 x 20 동안 달염색시켰다. 33kD 왁스 신타제 밴드를 겔로부터 절단해내고, 50% 에탄올중에서 3 x 20분 동안 탈염색시켰다. 한 래인이 한 가닥의 단백질을 함유하였고 최종 분해에서 사용되지 않았다.

B. 침전에 의한 SDS-PAGE에 대한 샘플의 제조

최종 HA 컬럼(원안 1)으로부터 얻은 짝수 번호 분획의 분취액(0.8ml)을 컬럼 특징에 대해서 세개의 그룹으로 모았다. 푸울을 세개의 1.5ml 바이알로 동일하게 분할하였다. 단백질을 0.2ml 40%TCA를 가하여 침전시켰다. 얼음상에서 30분 후에, 샘플을 원심분리(12,000 x g, 4℃에서 15분)하여 침전된 단백질을 펠릿화시켰다. 상등물을 제거하고, 펠릿을 0.6ml 빙냉 아세톤으로 2회 세척하엿다. 각각 수거된 샘플에 대한 최종 세개의 펠릿을 완충액을 하나의 바이알에서 다음 바이알로 옮김으로써 동일한 50μl의 SDS 샘플 완충액으로 재현탁시켰다. 이미 재현탁된 빈 바이알을 각각의 수거된 샘플에 대한 60μl의 전체 재현탁된 용적에 대한 10μl의 샘플 완충액으로 세척하였다. 샘플을 12% 아크릴아미드 트리스/글리신 미니-겔 (Novex, San Diego, CA, 1.5mm x 10웰)에 가하고, 단백질은 겔의 바닥으로부터 염료의 용리후에 150V의 일정한 전압에서 20분 동안 전기영동시켜 용해시켰다. 겔을 쿠마시에 블루우로 염색시키고, 겔-클리어(Gel-Clear; Novex, San Diego, CA)를 사용하여 탈염색시켰다. 왁스 신타제는 켈럼으로부터의 테일링 분획과 피크를 나타내는 겔상에 있는 세개의 비-동일성 래인으로부터 절제해냈다. 겔 슬라이스를 1.5ml 바이알에 위치시키고, 1ml의 50% 메탄올, 10% 아세트산으로 2시간 동안 탈염색시켰다. 탈염색 용액을 제거하고, 겔 슬라이스를 액체 질소중에서 동결시키고, 겔내 분해를 위해서 예일 유니버시티(Yale University)의 더블유. 엠. 케크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 라보라토리(W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory)의 드라이 아이스상에 밤새 유지시켰다. 초여과에 의해 농축된 샘플로부터의 하나의 겔 슬라이스 및 침전에 의해 농축된 샘플로부터의 세개의 겔 슬라이스를 겔내 트립신 분해를 위해 수거하였다.

실시예 13 - 아미노산 서열의 측정

단백질 서열화를 예일 유니버시티의 더블유. 엠. 케크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 라보라토리에서 수행하였다. 과정은 정량화 및 아미노산 조성에 대한 일부(10-15%)의 겔 슬라이스의 아미노산 분석, 즉, 단백질 분해 효소(트립신 또는 리실 엔도펩티다제)중 하나에 의한 단백질의 분해, 및 역상 HPLC에 의한 생성물의 분별화를 포함한다. 흡착 피크는 HPLC로부터 선택되며, 레이저 탈착 질량 분광분석에 주어져서 단백질 서열화 전의 펩티드의 존재, 양 및 질량을 측정한다. 가장 긴 펩티드가 미세서열화를 위해 선택된다.

실시예 14 - 모르티에렐라 라만니아나 DAGAT 핵산 서열의 분리

일반적으로, mRNA로부터 역전사된 단일 가닥 DNA 주형으로부터의 PCR 프라이머로서 사용하기 위해, DAGAT 펩티드 코드화 서열에 상응하는 센스 배향 서열을 함유하는 올리고누클레오티드를 제조하였다. 이들 올리고누클레오티드를 "정방향" 증폭 반응에 대한 프라이머로서 사용하여, 센스 가닥 DNA를 생성시켰다.

비코딩 DNA 가닥의 증폭을 위한 "역방향" 반응을 위해, 올리고누클레오티드가 PCR을 위한 DNA 주형을 제조하는데 사용되는 프라이머의 일부와 동일하도록 고안될 수 있다. 대안적으로, DAGAT 펩티드 코드화 서열에 상보적인 서열을 함유하는 올리고누클레오티드가 상기 기재된 "정방향" DAGAT 올리고누클레오티드와 조합된 형태로 사용될 수 있다.

DAGAT 펩티드 서열이 다수의 상이한 코돈에 의해 코드화될 수 있는 아미노산을 함유하는 경우, 정방향 또는 역방향 프라이머는 "축중" 올리고누클레오티드일 수 있으며, 즉, 특정 펩티드 영역에 대한 가능한 코드화 서열의 일부 또는 전부의 혼합물을 함유한다. 이러한 혼합물에 존재하는 상이한 올리고누클레오티드의 수를 줄이기 위해, PCR 프라이머에 대한 합성 올리고누클레오티드를 제조할 때 가능한 코드화 서열의 최소 개수를 갖는 펩티드 영역을 선택하는 것이 바람직하다. 유사하게는, 합성 올리고누클레오티드가 DAGAT 서열에 대해 라이브러리를 직접 스크리닝하는데 사용되는 경우, 낮은 축중 올리고누클레오티드가 바람직하다.

PCR에 의해 수득되는 DAGAT DNA 단편을 cDNA 라이브러리로부터의 클론을 스크리닝하기 위해 표지시키고, 프로브로서 사용하였다. 상보적 DNA 및 DNA 구성 및 라이브러리 스크리닝 기법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다. 이 방식으로, 핵산 서열을 위해 분석되고, 다양한 숙주, 즉, 원핵세포 및 진핵세포 둘 모두에서 DAGAT의 발현을 위해 사용될 수 있는 DAGAT 핵산 서열을 수득하였다.

실시예 15 - 식물 발현을 위한 모르티에렐라 DAGAT 구성물

식물 세포에서 DAGAT 서열을 발현시키는 구성물은 하기와 같이 제조될 수 있다.

종자 조직에서 우선적으로 발현되는 유전자로부터의 5' 및 3' 조절 영역을 함유하는 발현 카세트는 예를 들어, WO 92/03564호에 기재된 바와 같이, 나핀, Bce4 및 ACP 유전자로부터 제조될 수 있다.

예를 들어, 왁스 신타제 또는 환원효소 유전자 구성물의 발현을 위해 사용될 수 있는 나핀 발현 카세트인 pCGN1808은 크리들(Kridl) 등의 문헌 [Seed Science Research (1991) 1:209-219]에 기재되어 있다. 또 다른 나핀 발현 카세트인 pCGN3223은 암피실린 내성 백그라운드 및 pCGN1808에서 발견되는 본질적으로 동일한 1.725 나핀 5' 및 1.265 3' 조절 서열을 함유한다. 조절 영역은 HindIII, NotI 및 KpnI 제한 부위로 플랭킹되며, 유일한 SalI, BglII, PstI 및 XhoI 클로닝 부위는 5' 내지 3' 비코딩 영역 사이에 위치한다.

올레신 유전자로부터의 5' 및 3' 영역의 조절을 받는 전사 조절을 위한 서열을 클로닝하기 위한 카세트가 또한 사용될 수 있다. 브라시카 나푸스 올레신 유전자의 서열은 리(Lee)와 후앙(Huang)의 문헌 [Plant Phys. (1991) 96:1395-1397]에 보고되었다. 올레신 카세트의 서열인 pCGN7636은 USPN 5,445,947의 도 4에 제공되어 있다. 올레신 카세트는 BssHII, KpnI 및 XbaI 제한 부위에 의해 플랭킹되며, 왁스 신타제, 환원효소 또는 그 밖의 관심있는 DNA 서열의 삽입을 위한 SalI, BamHI 및 PstI 부위를 5' 내지 3' 올레신 영역 사이에 함유한다.

DAGAT 유전자 서열을 이러한 카세트내에 삽입시켜서, 식물 형질전환 방법을 위한 발현 구성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 나핀 유전자로부터의 5' 및 3' 조절 영역을사용하는 식물 세포내에서의 환원효소의 발현을 위한 구성물은 USPN 5,445,947에 기재되어 있다.

이중 벡터 구성물을, 홀스터스(Holsters) 등의 문헌 [Mol. Gen. Genet. (1978) 163:181-187]에 기재된 방법에 의해, 예를 들어, 스트레인 EHA101의 아그로박테리움 세포 (Hood et al., J. Bacteriol (1986) 168:1291-1301)내로 형질전환시키고, 하기 기재된 식물 형질전환 방법에서 사용하였다.

실시예 16 - 식물 형질전환 방법 및 분석

다수의 방법이, 관심있는 DNA 서열을 식물 숙주의 게놈내에 삽입시켜서, 표현형 변화를 초래하는 서열의 전사 또는 전사와 번역을 수득하기 위해 개발되었다.

높은 에루크산 변종, 예를 들어 재배종 레스톤(Reston) 또는 브라시카 나푸스의 카놀라 타입 변종은 라드케(Radke) 등의 문헌[Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (1992) 11:499-505]에 기재된 아그로박테리움 매개성 형질전환을 사용하여 형질전환될 수 있다. 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 식물은 발베켄스(Valverkens) 등의 문헌 [Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540]에 기재된 아그로박테리움 매개성 형질전환에 의해 수득될 수 있다. 그 밖의 식물종은 관련 기법을 사용하여 유사하게 형질전환될 수 있다.

대안적으로, 미세투사 충격 방법, 예를 들어 클레인(Klein) 등의 문헌 [Bio/Technology 10:286-291]에 기재된 방법이 본원에 기재된 환원효소 및 왁스 신타제 발현 구성물을 포함하는 형질전환된 식물을 수득하기 위해 또한 사용될 수 있다.

형질전환된 식물로부터의 종자 또는 그 밖의 식물체는 실시예 1에 기재된 DAGAT 검정법을 이용하여 DAGAT 활성에 대해 분석될 수 있다.

상기 결과는 지방 아실 및 디아실글리세롤 기질로부터의 트리아실글리세롤의 형성에 활성인 부분 정제된 DAGAT 단백질을 수득하는 능력을 입증한다. DAGAT 단백질 및 이것의 아미노산 서열을 수득하는 방법이 제공된다. 또한, DAGAT 핵산 서열이 본원에 제공된 PCR 및 라이브러리 스크리닝 방법을 사용하여 아미노산 서열로부터 또한 수득될 수 있다. 이러한 핵산 서열은 숙주 세포에서의 서열의 전사 및/또는 DAGAT 단백질의 발현을 제공하기 위해 조작될 수 있으며, 이들 단백질은 다수의 응용을 위해 사용될 수 있다. 이러한 응용으로는, 숙주 세포에서의 트리글리세롤 수준 및 조성의 변형이 있다.

본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허 출원은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다.

본 발명이 명료함 및 이해를 위해 어느 정도 상세하게 설명되었지만, 당업자라면, 첨부된 청구의 범위를 벗어남이 없이 특정 변화 및 변형이 본 발명에 대해 이루어질 수 있음을 인식할 것이다.

Claims (5)

1. 디아실글리세롤 및 지방 아실-CoA 기질로부터의 TAG의 형성에서 활성이 있는 실질적으로 정제된 아실트란스페라제.
2. 제 1항에 있어서, 10/10-TAG에 대한 활성을 지님을 특징으로 하는 아실트란스페라제.
3. SDS-PAGE상에서의 외관 분자질량이 약 33 kDa이고, 막 및 본래의 세포중의 다른 단백질로부터 실질적으로 정제되며, 1,2-디아실글리세롤 및 아실-CoA로부터의 트리글리세라이드의 생성을 촉진할 수 있는 아실트란스페라제 단백질.
4. 제 3항에 있어서, 18:1의 지방 아실-CoA 기질에 대해 활성을 지님을 특징으로 하는 디아실글리세롤 아실트란스페라제.
5. 제 4항에 있어서, 모르티에렐라 라만니아나로부터 수득될 수 있음을 특징으로 하는 디아실글리세롤 아실트란스페라제.