CN107257630A - 包含pufa的植物脂质的修饰 - Google Patents

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Abstract

本发明广泛涉及包含PUFA的植物脂质的修饰。在此背景中，本发明尤其涉及进行这类修饰的植物和植物材料，其中该植物优选油料植物。关于植物部分，本发明尤其涉及这类植物的种子，优选油料植物的种子。本发明还涉及可通过本发明的修饰方法获得的或通过本发明的修饰方法获得的植物组合物，以及包含这类脂质组合物的食品或饲料。

Description

包含PUFA的植物脂质的修饰
本申请要求2014年11月14日提交的美国临时专利申请系列号62/079622申请号和2015年9月29日提交的美国临时专利申请系列号62/234373的优先权，该临时申请在此以其整体引入作为参考。
技术领域
本发明广泛涉及包含PUFA的植物脂质的修饰。在此背景中，本发明尤其涉及进行这类修饰的植物和植物材料，其中该植物优选油料植物。关于植物部分，本发明尤其涉及这类植物的种子，优选油料植物的种子。本发明还涉及可通过本发明的修饰方法获得的或通过本发明的修饰方法获得的植物组合物，以及包含这类脂质组合物的食品或饲料。
背景技术
普遍认为多不饱和脂肪酸(“PUFA”)提供健康裨益。在此背景中，尤其希望得到EPA和DHA；它们用作膳食补充剂来例如减轻心血管或神经病理病症或疾病。多不饱和脂肪酸目前主要从鱼油获得，因为野生型植物缺乏足量产生多不饱和脂肪酸(尤其是EPA和DHA)所需的酶。已作出努力来在植物、尤其是油料植物中产生多不饱和脂肪酸。
EPA和DHA的产生是代谢途径，其中通过去饱和酶和延伸酶(elongase)处理脂肪酸，产生更长和更不饱和的脂肪酸。该途径的示意图可见于WO 2006/012325的图9和WO2005/083093的图1中。涉及该途径的去饱和酶和延伸酶通常对ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸二者反应。产生EPA和DHA中的一个中间体通常是花生四烯酸。由于其涉及炎症过程，膳食组合物、食品和饲料中通常不希望有这种多不饱和脂肪酸。因此，通常希望获得具有高EPA和/或DHA含量和低花生四烯酸含量的组合物。但是，由于花生四烯酸是产生DHA中的代谢物，且由于花生四烯酸可以通过ω-3去饱和酶转化为EPA和从EPA转化，通常不可能避免在转基因植物代谢中同时产生花生四烯酸。
因此，本发明的目的是提供用于降低包含EPA和/或DHA的脂质组合物中花生四烯酸的含量的材料和方法。具体而言，本发明的目的是提供用于降低植物脂质组合物中、优选可从油料植物获得或从油料植物获得的脂质组合物中花生四烯酸的含量的材料和方法。
发明概述
本发明因此提供提取的植物脂质组合物，其包含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及可选的花生四烯酸(ARA)，其中：
a)EPA的含量比ARA的含量高至少5％；和/或
b)EPA+DHA的含量之和比ARA的含量高至少7％；和/或
c)ARA的含量小于4％，EPA的含量大于7％，DHA的含量大于2％。
本发明还提供植物或其部分，其包含含有二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及可选的花生四烯酸(ARA)的脂质，其中：
a)EPA的含量比ARA的含量高至少5％；和/或
b)EPA+DHA的含量之和比ARA的含量高至少7％；和/或
c)ARA的含量小于4％，EPA的含量大于7％，DHA的含量大于2％。
另外，本发明提供植物或其部分，其包含含有二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及花生四烯酸(ARA)的脂质，其中，在培养该植物或其部分时，ARA的含量降低，同时优选EPA和/或DHA的含量提高。
本发明还提供包含含有以下的核酸的植物：
a)δ-5延伸酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期维持或提高δ-5延伸酶基因的表达；和/或
b)δ-5去饱和酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期降低或阻止δ-5去饱和酶基因的表达。
本发明还提供本发明的植物的种子。
另外，本发明提供可通过包括以下步骤的方法获得的或通过包括以下步骤的方法获得的植物脂质组合物：
a)培养本发明的植物至少直至脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高；和
b)收获该植物或其部分；和
c)从所收获的材料提取脂质组合物以获得该脂质组合物。
本发明还提供包含本发明的脂质组合物的食品或饲料。
此外，本发明提供改变植物脂质组合物的方法，其包括培养本发明的植物以产生包含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及花生四烯酸(ARA)的脂质的步骤，其中培养和脂质产生的步骤持续至ARA含量降低同时优选EPA和/或DHA含量提高。
本发明提供产生植物脂质组合物的方法，其包括以下步骤：
a)培养本发明的植物；
b)在脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高时收获该植物或其部分。
发明详述
本发明提供提取的植物脂质组合物。该脂质组合物包含EPA和DHA。该提取的植物脂质组合物通常还将包含ARA，即使通常不希望此化合物作为成分，但由于其在产生EPA和/或DHA中作为中间代谢物的功能而通常不可避免。
根据本发明，EPA的含量比ARA的含量高至少5％。除非另有说明，在本发明的背景中，含量数字的比较是指各百分比数字之间的差；这种差有时也称为百分点差。因此，在示例性组合物中EPA的含量是例如7wt.-％时，该组合物中ARA的含量至多为该脂质组合物的总脂肪酸的2wt.-％。
本发明的具体优势是提供用于产生显示EPA和ARA之间的这种强含量差异的脂质组合物的手段。尤其惊人的是，这种显著差异可以保持在植物脂质组合物中，即本文所述在植物材料中产生或从其提取的脂质组合物中，因为ARA和EPA二者都通过同一类酶(即δ-5去饱和酶)产生，且产生EPA的δ-5去饱和酶通常也将产生ARA。另外，ARA和EPA通过天然存在于材料中或为了产生多不饱和脂肪酸的目的而引入植物基因组中的ω-3去饱和酶的作用相互转换。因此预期植物脂质组合物不会倾向于高EPA含量而不同时提高ARA含量。但是，本发明人惊奇地发现并在本文中提供不仅提高EPA含量，而且还不相应地提高不想要的ARA含量的方式；相反，本发明惊人地提供用于在脂质产生期间实际上已经在植物中降低脂质ARA含量的手段。持续合成EPA时的这种ARA含量降低在之前完全未观察到或预期其可能。
本发明因此还有利地提供提取的植物脂质组合物，其中EPA加DHA的总含量比ARA的含量高至少7％。提供这种显著的含量差异甚至更惊人，因为EPA通过δ-5延伸酶和δ-4去饱和酶的作用转化为DHA。因此，EPA在产生DHA中有效地消耗；因此本发明的具体优势是保持EPA、DHA和ARA含量的高差异。如后文所述，通过在进行EPA和DHA合成期间出乎意料地消耗ARA，达到含量的这种高差异是可能的。
本发明还提供提取的植物脂质组合物，其中ARA含量小于4％，EPA含量大于7％。甚至更优选地，本发明提供提取的植物脂质组合物，其中ARA含量小于4％，EPA含量大于7％，DHA含量大于2％。这类组合物是本发明提供的出乎意料的植物脂质产生机制的尤其有利的结果，同时达到了高EPA/DHA含量和低ARA含量。
多不饱和脂肪酸(PUFA)为技术人员公知，没有任何限制的意图，重要的多不饱和脂肪酸分为ω-3、ω-6和ω-9系列。ω-6系列的多不饱和脂肪酸包括但不限于例如亚油酸(18:2n-6；LA)、γ-亚麻酸(18:3n-6；GLA)、双-高-γ-亚麻酸(C20:3n-6；DGLA)、花生四烯酸(C20:4n-6；ARA)、肾上腺酸(也称为二十二碳四烯酸或DTA；C22:4n-6)和二二十碳五烯酸(C22:5n-6)。ω-3系列的多不饱和脂肪酸包括但不限于例如α-亚麻酸(18:3n-3,ALA)、十八碳四烯酸(18:4n-3；STA或SDA)、二十碳三烯酸(C20:3n-3；ETA)、二十碳四烯酸(C20:4n-3；ETA)、二十碳五烯酸(C20:5n-3；EPA)、二二十碳五烯酸(C22:5n-3；DPA)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3；DHA)。多不饱和脂肪酸还包括具有超过22个碳和4个或更多个双键的脂肪酸，例如但不限于C28:8(n-3)。ω-9系列的多不饱和脂肪酸包括但不限于例如mead acid(20:3n-9；5,8,11-二十碳三烯酸)、芥酸(22:1n-9；13-二十碳单烯酸)和神经酸(24:1n-9；15-二十四碳单烯酸)。其他多不饱和脂肪酸有二十碳二烯酸(C20:2d11,14；EDA)和二十碳三烯酸(20:3d11,14,17；ETrA)。
在本发明的背景中，脂质含量表示为在各脂质组合物中测定的具体脂肪酸相对于总脂肪酸的重量百分比。优选地，所测试的总脂肪酸为：14:0、16:0、16:1n-7、16:1n-9、16:3n-3、17:0、18:0、18:1n-7、18:1n-9、18:2n-6(LA)、18:2n-9、18:3n-3(ALA)、18:3n-6(GLA)、18:4n-3(SDA)、20:0、20:1n-9、20:2n-6、20:2n-9、20:3n-3、20:3n-6(DGLA)、20:3n-9、20:4n-3(ETA)、20:4n-6(ARA)、20:5n-3(EPA)、22:0、22:1n-9、22:2n-6、22:4n-3、22:4n-6、22:5n-3(DPA)、22:5n-6、22:6n-3(DHA)、24:0和24:1n-9。
本发明的具体优势是，除非另有明确说明，本文所述的脂质含量是在未人工富集或消耗一种或多种脂肪酸的情况下测定；脂肪酸的脂质含量因此基本上与提取前的植物或其部分中相同。
提取的脂质优选是油的形式，其中该油以重量计的至少90％、更优选以重量计的至少95％和甚至更优选以重量计的至少约98％、或以重量计的95％至98％是脂质。这类油可以通过技术人员已知和/或本文所述的方法从植物材料获得。
根据本发明，该提取的植物脂质组合物是通过植物或植物材料产生(本文还描述在植物和植物材料中产生这类脂质组合物的优选方式)的组合物、从这类脂质提取和可选地纯化的组合物。优选地，该提取的植物脂质组合物是未向其加入附加脂肪酸的组合物。本发明的具体优势是，可在不向组合物中加入“外来”EPA的情况下，即在不加入并非由从其获得该提取物的植物或植物材料产生的EPA的情况下，达到EPA和ARA含量间的高差异。具体而言，可以按照本发明达到EPA和DHA的含量而不加入鱼油或从鱼油获得的相应的多不饱和脂肪酸。
在本发明的背景中，参考植物和相应的植物材料。植物(和相应的植物材料)优选指属于十字花科(Brassicaceae)。本发明的具体优势是，可以在此科的植物中产生并从此科的植物提取本发明的脂质组合物，因为这类植物允许尤其是在其种子油中产生高含量脂肪酸。另外，隶属于此科的许多物种具有作为作物植物的长期传统，因此通常认为其油含量对消费有用和/或易于为了技术目的或为了消费目的而获得和纯化。
本发明的植物和相应的植物材料优选隶属于以下族(tribus)：Aethionemeae、庭荠族(Alysseae)、Alyssopsideae、Anastaticeae、Anchonieae、Aphragmeae、南芥族(Arabideae)、Asteae、Biscutelleae、Bivonaeeae、Boechereae、Brassiceae、Buniadeae、Calepineae、Camelineae、Cardamineae、Chorisporeae、Cochlearieae、Coluteocarpeae、Conringieae、Cremolobeae、Crucihimalayeae、播娘蒿族(Descurainieae)、Dontostemoneae、糖芥族(Erysimeae)、乌头荠族(Euclidieae)、Eudemeae、Eutremeae、Halimolobeae、Heliophileae、Hesperideae、Iberideae、Isatideae、Kernereae、独行菜族(Lepidieae)、Malcolmieae、Megacarpaeeae、Microlepidieae、Noccaeeae、Notothlaspideae、Oreophytoneae、Physarieae、Schizopetaleae、Scoliaxoneae、大蒜芥族(Sisymbrieae)、Smelowskieae、Stevenieae、Thelypodieae、Thlaspideae、Turritideae或Yinshanieae，甚至更优选隶属于以下属：Ammosperma、芸苔属(Brassica)、芸苔属x萝卜属(Raphanus)、卡克勒属(Cakile)、Carrichtera、Ceratocnemum、Coincya、Cordylocarpus、两芦荠属(Crambe)、Crambella、Didesmus、双趋芥属(Diplotaxis)、Douepea、Enarthrocarpus、Eremophyton、芝麻菜属(Eruca)、Erucaria、Erucastrum、Euzomodendron、Fezia、Foleyola、Fortuynia、Guiraoa、Hemicrambe、Henophyton、Hirschfeldia、Kremeriella、Moricandia、Morisia、Muricaria、Nasturtiopsis、诸葛菜属(Orychophragmus)、Otocarpus、Physorhynchus、Pseuderucaria、Psychine、Raffenaldia、萝卜属、锤果芥属(Rapistrum)、Rytidocarpus、Savignya、Schouwia、Sinapidendron、芥子属(Sinapis)、Succowia、Trachystoma、Vella或Zilla。前面提到的分类单元的植物隶属于十字花科，因此由于该分类家族而可允许容易地表现上文所述的优势。
甚至更优选地，本发明的植物或植物材料隶属于亚麻荠属(Camelina)或芸苔属的作物植物。这些属的植物传统上用于农业，它们的油已长期用于人或动物消费。另外，关于这些属的农业实践早已建立，例如用于防御真菌、昆虫和杂草的材料和方法。因此，使得在这类属中产生本发明的植物脂质对农业技术人员而言尤其容易。
甚至更优选地，本发明的植物和相应的植物材料隶属于任意以下物种：亚麻荠(Camelina sativa)、Brassica aucheri、Brassica balearica、Brassica barrelieri、埃塞俄比亚芥菜(Brassica carinata)、埃塞俄比亚芥菜x欧洲油菜(Brassica napus)、埃塞俄比亚芥菜x芜菁(Brassica rapa)、Brassica cretica、Brassica deflexa、Brassicadesnottesii、Brassica drepanensis、Brassica elongata、Brassica fruticulosa、Brassica gravinae、Brassica hilarionis、Brassica hybrid cultivar、Brassicaincana、Brassica insularis、芥菜型油菜(Brassica juncea)、Brassica macrocarpa、Brassica maurorum、Brassica montana、欧洲油菜(油菜、卡诺拉)、欧洲油菜x芜菁、黑芥(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleracea)、甘蓝x芜菁北京亚种(Brassica rapasubsp.Pekinensis)、Brassica oxyrrhina、Brassica procumbens、芜菁、芜菁x黑芥、Brassica repanda、Brassica rupestris、Brassica ruvo、Brassica souliei、Brassicaspinescens、Brassica tournefortii或Brassica villosa，甚至更优选隶属于任意以下物种：埃塞俄比亚芥菜、埃塞俄比亚芥菜x欧洲油菜或欧洲油菜，最优选隶属于物种欧洲油菜。欧洲油菜属的植物也称为油菜(rape seed)或卡诺拉(canola)，作为便宜和容易获得的适合人或动物消费的植物油和脂质来源有很长的传统。
尤其优选的植物和植物材料源自本文所述的作为ATCC命名“PTA-121703”保藏的转基因芸苔属事件LBFLFK(芸苔属事件LBFLFK包含实施例章节中所述的二元T质粒VC-LTM593-1qcz rc的两个插入)，或源自也在本文中描述的作为ATCC命名“PTA-122340”保藏的转基因芸苔属事件LBFDAU。对于这些事件，可以达到尤其高的EPA和DHA含量，以及低ARA含量。
可以通过将这些事件繁殖入其他亚麻荠属和甚至更优选芸苔属植物种质来获得本发明也优选的植物和植物材料。尤其优选将本发明的转基因事件(尤其是LBLFK事件)与埃塞俄比亚芥菜物种植物杂交、甚至更优选回交入欧洲油菜而产生的植物用作本发明的植物和植物材料。对于这类植物，可以达到本发明的植物脂质中尤其高的EPA和/或DHA含量和低ARA含量。
根据本发明，ARA含量在植物或植物材料生长期间、优选在种子发育期间优选降低至少5％。因此，通过分析该植物或植物材料中植物脂质的组成，可以观察到ARA含量的峰值。例如，在观察到4％的ARA峰值含量时，只有在ARA含量降低至至多3.5％后才收获该植物或植物材料。本发明的优势是，可以达到脂质ARA含量降低0.5个百分点，而不减少总脂质产生，尤其是不减少可从这种植物或植物材料获得的EPA和/或DHA的量和含量。
优选地，在培养本发明的植物或植物材料时，脂质EPA含量甚至在ARA含量降低期间得到保持。甚至更优选地，在ARA含量降低的时期内，脂质EPA含量提高至少1％。因此，例如，植物种子中的脂质EPA含量从6％提高至7％，同时该植物材料中的脂质ARA含量从4％降低至至多3.5％。甚至更优选地，在培养本发明的植物或植物材料时，在ARA脂质含量降低期间，脂质EPA和DHA含量提高。如前文所指出，即使代谢中间体ARA的含量降低，本发明也允许进行这种EPA和DHA合成，这是本发明的具体优势。
如上文所述，本发明的植物和植物材料优选是油料植物。在培养本发明的植物时，优选它们在种子发育晚期之前达到其最大ARA脂质含量。因此，剩余足够的时间使本发明的植物在其种子中产生希望得到的EPA和/或DHA的量和含量，同时降低脂质ARA含量。根据本发明，优选在开花后25至35天内在发育中的种子中达到最大ARA脂质含量，其中本发明的植物隶属于欧洲油菜。相应地，种子发育晚期在欧洲油菜中优选始于开花后38天，甚至更优选开花后36天和甚至更优选开花后35天。技术人员理解，油料植物发育许多花，单朵花在不同天开始开放。因此，术语“开花后…天”指开出单朵花后的天数，而不是在例如本发明的植物的大田中检测到第一朵花。
本发明的植物或植物材料优选包含含有以下的核酸：
a)δ-5延伸酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期维持或提高δ-5延伸酶基因的表达；和/或
b)δ-5去饱和酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期降低或阻止δ-5去饱和酶基因的表达。
本发明人发现，通过仔细调节尤其δ-5延伸酶活性的表达，有可能达到希望的ARA脂质含量降低，同时保持进行EPA和/或DHA的合成。
本发明的启动子优选是种子特异性启动子。可以通过技术人员可用的任意手段来调节基因表达。例如，通过产生适当的构建体拓扑结构，使得转化的核酸(本领域中也称为“T-DNA”)将通过其自身的启动子、基因和终止子排列(也统称为“表达盒”)达到希望的调节模式，可以达到基因表达。例如，邻近另一显示强种子发育晚期基因表达的启动子定位的包含启动子和与之有效连接的δ-5延伸酶基因的表达盒可允许在种子发育晚期保持或提高δ-5延伸酶基因的表达。在包含δ-5延伸酶基因的表达盒与T-DNA的一个边界相隔至多一个表达盒且与T-DNA的另一个边界相隔至少5个表达盒时尤其如此。这样，T-DNA的长度足以使T-DNA的表达盒与T-DNA所整合入的植物染色体的伤害作用(teen effect)有效隔绝。优选地，包含δ-5基因的表达盒与T-DNA的一个边界相隔至多3个、更优选1个或2个和甚至更优选1个其他表达盒。为了本发明的目的，此段落中的表达盒优选包含合成多不饱和脂肪酸所需的基因，尤其是编码去饱和酶和延伸酶的基因。
还可以通过诱导物的作用来达到提高δ-5延伸酶基因表达，使得至少一个δ-5延伸酶基因处于诱导型启动子的控制下；还可以通过去除阻遏物来达到提高，使得阻遏物仅在种子发育早期产生。优选地，通常存在至少一个δ-5延伸酶基因，并在组成型和强活性启动子的控制下表达，以在种子发育早期和中期也达到高δ-5延伸酶基因表达。
相应地可以通过T-DNA拓扑结构、和/或通过将δ-5去饱和酶基因置于诱导型启动子控制下(其中在种子发育晚期不产生或以较低程度产生诱导物)、和/或通过将δ-5去饱和酶基因置于阻抑型启动子控制下(其中阻遏物主要在或仅在种子发育晚期产生)来达到降低δ-5去饱和酶表达。
相应的启动子、诱导物和阻遏物及其相互作用的实例描述于Hull等,PlantScience 114,181-192,Fujiwara等,Plant Molecular Biology 20,1059-1069和Vilardell等,Plant Molecular Biology 24,561-569中，所有文献在此引入作为参考。
本发明还提供本发明的植物的种子。这类种子用于种植本发明的新植物来产生多不饱和脂肪酸。本发明的种子还用于提取的目的，以获得本发明的提取的植物脂质组合物。在每种情况下，可以通过本发明的种子来达到上文所述裨益。
本发明还提供可通过包括以下步骤的方法获得的或通过包括以下步骤的方法获得的植物脂质组合物：
a)培养本发明的植物至少直至脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高；和
b)收获该植物或其部分；和
c)从所收获的材料提取脂质组合物以获得该脂质组合物。
在这种方法中，可以达到本发明所提供的植物脂质中ARA含量的有益降低，并可实现植物脂质组合物的相应裨益。
该方法还可选地包括保存所收获的材料(优选植物种子)的步骤。本发明的具体优势是，可以保存植物种子而不减少植物种子油和脂质的量和组成。这尤其惊人，因为多不饱和脂肪酸尤其易氧化。因此，有利的是，在该方法中作为所收获的材料获得的本发明的植物种子可以在室温保存例如一个月或至少7天，而不损失种子油含量，尤其是不减少种子脂质和种子油中的EPA和/或DHA。
该方法还优选包括种子座(seat)的脱粒和收集步骤。尤其是对于在房沟(housegutter)中产生种子并因此需要分开不想要的植物材料的芸苔属植物。本发明的优势是，可以通过例如脱粒来将种子与不想要的植物材料分开，而不减少种子脂质和种子油中不饱和脂肪酸的量和组成。
在此方法中，提取优选用压力且最优选在与室温相比氧气含量降低的气体下进行；优选地，在缺氧下例如在保护性气体下进行提取。相应的提取方法为技术人员已知，本文也描述了一些提取方法。
在该方法中，植物材料的收获和优选种子的收获优选对成熟种子(即处于种子发育晚期)进行。在成熟种子中，脂质ARA含量有足够的时间降低，EPA和/或DHA的含量可以提高。在将这种方法应用于本发明的芸苔属植物时，优选在首批开花30天后、优选35天后、甚至更优选40天后、甚至更优选42天后、甚至更优选在植物首批开花第43天或43天后、甚至更优选44天后或第44天、甚至更优选地45天后或45天后、甚至更优选第46天或46天后进行收获。
该方法优选进一步包括脱胶、除臭、漂白、脱色、干燥、冬化(winterizing)和/或分级分离所提取的脂质，以获得该脂质组合物。这样，可以去除脂质和/或油的不想要的杂质。相应的方法和技术为技术人员已知。
本发明还提供包含本发明的脂质组合物的食品或饲料。这种食品和饲料受益于通过本发明达到的高EPA和/或DHA脂质含量和低ARA脂质含量。
相应地，本发明还提供改变植物脂质组合物的方法，其包括培养本发明的植物以产生包含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及花生四烯酸(ARA)的脂质的步骤，其中培养和脂质产生的步骤持续至ARA含量降低同时优选EPA和/或DHA含量提高。如上文所述，ARA的含量优选降低至少0.5％，且优选最终为以总脂质重量计的至多4％、优选以总脂质重量计的至多3％和甚至更优选以总脂质重量计的至多2.6％。同样如上文所述，EPA的含量优选提高至少1％，且优选最终为总脂质的至少7％、甚至更优选为总脂质的至少7.5％。
本发明还提供产生植物脂质组合物的方法，其包括以下步骤：
a)培养本发明的植物；
b)在脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高时收获该植物或其部分。
该方法允许实现本文所述的优势和裨益。
优选地，将本发明的芸苔属植物培养在优选至少一英亩大小的商业化规模的大田中。首批现花后25天，按本文所述分析发育中的种子及其脂质的样品。在随后15天内，优选在随后10天内，采集发育中的种子的至少两份附加样品，并同样分析其脂质。这样，可以检测到ARA脂质含量的峰值，可以适当推迟收获，以允许本发明的植物降低发育中的种子的脂质中的ARA含量，并提高EPA和/或DHA含量。
另外，本发明提供产生种子的方法，其包括以下步骤：
a)培养本发明的植物；和
b)在脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高时，收获该植物的种子。
该方法允许实现本文所述的优势和裨益。
后文通过实施例的方式进一步描述本发明；提供该实施例仅是为了说明的目的，并非只在限制本发明或权利要求的范围。
实施例
实施例1：植物生长和采样
将LBFLFK事件的纯合T3植物(包含两个拷贝的VC-LTM593-1qczrc)、LBFGKN事件的纯合T3植物(包含一个拷贝的VC-LTM593-1qcz rc)、LANPMZ事件的纯合T4植物(包含各一个拷贝的VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc)和LAODDN事件的纯合T4植物(包含各一个拷贝的VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc)播种在大田中。按优先权文件的实施例中所述获得和繁殖这些事件的植物；这些文件在此引入作为参考。所有事件都包含一个编码δ-5延伸酶的基因，该基因基于从Ostreococcus tauri获得的δ-5延伸酶基因(“d5EloOT_GA3”)。所有事件都进一步包含一个编码δ-5去饱和酶的基因，该基因基于从破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)获得的δ-5去饱和酶基因(“d5Des Tc_GA2”)。事件LBFLFK和LBFGKN包含另一拷贝的处于另一启动子(SETL而不是Conlinin)控制下的δ-5去饱和酶基因。首批开花后一周内，在最近开放的花上方的茎上清晰标记各个总状花序。对于每个总状花序，认为刚好在标记下方的三个荚果果龄相同(即在同一天开花或传粉)。标记后14天开始，直至标记后46天，在多个时间点采集每个总状花序上的标记下方的三个荚果。在每个时间点，从50株植物采样约150个荚果。每一单株植物在其一生中只采样一次。从总状花序取下后立即从荚果分离出未成熟的种子，并在干冰上迅速冷冻。通过总状花序上标记的年龄来确定种子年龄，即认为从刚好15日龄标记下采集的三个荚果(和内部的种子)处于开花后15天。对于每个事件，在每个时间点，将来自约150个荚果的种子混合为单个样品。对于分析，将每份种子样品破碎为粉末同时仍保持冷冻，将粉末分装为整分试样的量，用作用于脂质分析和定量实时PCR基因表达分析的技术副本。
实施例2：植物油的脂质提取和脂质分析
按标准文献中所述提取脂质，该标准文献包括Ullman,Encyclopedia ofIndustrial Chemistry,Bd.A2,S.89-90und S.443-613,VCH:Weinheim(1985)；Fallon,A.等,(1987)“Applications of HPLC in Biochemistry“in:Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology,Bd.17；Rehm等(1993)Biotechnology,Bd.3,Kapitel III:“Product recovery and purification“,S.469-714,VCH:Weinheim；Belter,P.A.等(1988)Bioseparations:downstream processing for Biotechnology,John Wiley和Sons；Kennedy,J.F.,und Cabral,J.M.S.(1992)Recovery processes forbiological Materials,John Wiley和Sons；Shaeiwitz,J.A.,und Henry,J.D.(1988)Biochemical Separations,in:Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,Bd.B3；Kapitel 11,S.1-27,VCH:Weinheim；及Dechow,F.J.(1989)Separation andpurification techniques in biotechnology,Noyes Publications。
应该承认，脂质和脂肪酸的提取可以用上文引用的那些之外的其他流程进行，如Cahoon等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22):12935-12940和Browse等(1986)Analytic Biochemistry 152:141-145。用于定量和定性分析脂质或脂肪酸的流程描述于Christie,William W.,Advances in Lipid Methodology,Ayr/Scotland:Oily Press(Oily Press Lipid Library；2)；Christie,William W.,Gas Chromatography andLipids.A Practical Guide-Ayr,Scotland:Oily Press,1989,Repr.1992,IX,307S.(OilyPress Lipid Library；1)；“Progress in Lipid Research,Oxford:Pergamon Press,1(1952)-16(1977)u.d.T.:Progress in the Chemistry of Fats and Other LipidsCODEN中。
所分析的脂肪酸是：14:0、16:0、16:1n-7、16:1n-9、16:3n-3、17:0、18:0、18:1n-7、18:1n-9、18:2n-6(LA)、18:2n-9、18:3n-3(ALA)、18:3n-6(GLA)、18:4n-3(SDA)、20:0、20:1n-9、20:2n-6、20:2n-9、20:3n-3、20:3n-6(DGLA)、20:3n-9、20:4n-3(ETA)、20:4n-6(ARA)、20:5n-3(EPA)、22:0、22:1n-9、22:2n-6、22:4n-3、22:4n-6、22:5n-3(DPA)、22:5n-6、22:6n-3(DHA)、24:0、24:1n-9。
脂肪酸的含量(水平)在本发明通篇中表示为(具体脂肪酸的重量)占(所有脂肪酸的总重量)的百分比。
实施例3：定量实时PCR流程
使用Spectrum Plant Total RNA-KIT part number STRN50(SIGMA-ALDRICHGmbH,Munich,德国)，按照流程“SG-MA_0007-2009RNA isolation”提取RNA。总RNA的浓度平均为约450ng/μl。260/280比值为2.2，260/230比值为2.3。
对于用于qPCR的cDNA合成，按照供应商的流程用DNAseI(DEOXYRIBUNUCLEASE I(AMP-D1,来自SIGMA-Aldrich,GmbH的扩增级))处理1μg总RNA。DNAseI处理后，用SuperScriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen,目录号11752-250)及oligo dT和随机六聚物的组合进行反转录反应，以确保全面和平等地代表所有转录物，不考虑长度。
用本领域技术人员视为标准的方法进行定量实时PCR转录物测量；参见Livak和Schmittgen(2001)。qPCR反应作为单重TaqMan反应进行。由于根据观察到的对应于拟南芥中直向同源物的转录物在发育期间的稳定性预测的转录物稳定性，内部分离和使用了内源参考基因。分离了欧洲油菜直向同源物，该基因(SEQ ID)是糖基-磷脂酰肌醇氨基转移酶途径(GPI)的部分。将上述cDNA反应产物1:4稀释。每10μl含JumpStart TAQ ReadyMix(P2893-400RXN Sigma-Aldrich,GmbH)的qPCR反应使用2μl cDNA(其对应于25ng总RNA)。引物/探针浓度：正向和反向引物为900nmol，TaqMan探针为100nmol。用于目的靶标的TaqMan探针用FAM/BHQ1标记，参考基因用Yakima Yellow/BHQ1标记。
每个qPCR测定包括用来自库(pool)VC-RTP10690-1qcz_F的cDNA进行的1:1稀释曲线(5个稀释步骤)、无模板对照、三个RT对照(VC-RTP10690-1qcz_F、VC-LTM593-1qcz rc(～4w)和共转化VC-LJB2197-1qcz+VC-LLM337-1qcz rc)。对于每个库，测量三个独立的cDNA整分试样作为技术重复。按以下PCR条件使用序列检测系统(AppliedBiosystem)：
初始变性 95℃30秒 1个循环
扩增 95℃15秒/60℃60秒 重复40个循环
原始数据分别是靶标和内源参考基因的Ct值。通过减法计算dCt值：Ct(GOI)-Ct(Ref)。参考dCt值设置为等于零，其解释为意指如果GPI和目的基因之间不存在差异(dCt＝0)，则表达为＝1。倍数表达等于2-dCt(其中dCt＝(Ct(GOI)-Ct(Ref)-0))。从每个库取三个样品，计算几何平均数。针对每个目的基因和内源参考基因(GPI)计算稀释曲线的斜率，作为扩增效率的测量值。表PCR1、表PCR2和表PCR3显示用来扩增进行qPCR测定的基因的探针和引物。
表PCR1：用于qPCR反应的探针
表PCR2：用于qPCR的正向引物
目的靶标 正向引物名称 正向引物寡聚物
D12Des(PS-GA) D12DESPS-112F CGTGTACATGTTGGTTGTTGGAT
d6-Des(Otfebit) D6DES-629F TGGCTGGATCTGGAGATATGTG
d6Elo(Pp GA) D6Elo-271F TTCTGCTTCGCTTTGTCTCTTTAC
d6Elo(Tp GA) D6Elo-259F GAGGCTGGATTCCTCGCTTA
d5DES(Tc_GA) D5DES-631Fa CACCACGCTGCTCCAAACAG
d5DES(Tc_GA)3’ D5DES-1120F ACTTCCAAATCGAGCACCACTT
o3DES(Pi_GA2) o3DES-572F CCGCTGTGGTTATCTCTTTGC
o3DES(PIR_GA) o3DESPIR-160F CTTGGGAGGCTATGTATGTTAGAAGA
d5Elo(Ot_GA3) MA54 GCAATCGTTGGTAGCCATGA
d4DES(TC_GA) D4DES-Tc-F CAAATCGATGCTGAGTGCAGAT
d4Des(Eg_GA) D4DES-EG-F TGACAAGTAAGCCATCCGTCAGT
d4Des(Pl_GA2) D4DES-PI-746-F CTGGTGAGGCTATGTACGCTTTT
GPI Exp 3-52F GATGAATATCCTCCTGATGCTAACC
表PCR3：用于qPCR的反向引物
目的靶标 反向引物名称 反向引物寡聚物
D12Des(PS-GA) D12DESPS-201R TGAGACCTAGACTTTCCCCAGTACTT
d6-Des(Otfebit) D6DES-706R CCATATCGTGCCTCACTTTTTG
d6Elo(Pp GA) D6Elo-345R CCACAAGGAATATCTCCAGGTGAT
d6Elo(Tp GA) D6Elo-330R TGGATCGTTCACGTTGAAGTG
d5DES(Tc_GA) D5DES-695R AAAGCAACGAGTGGCAAGGT
d5DES(Tc_GA)3’ D5DES-1200R AGAGAGCCTCAACTCTTGGAGAGA
o3DES(Pi_GA2) o3DES-652R TCTTAAGTCCCAACTGGAGAGACA
o3DES(PIR_GA) o3DESPIR-262R AAACCAAGGAGCGTCAAGTCTAGA
d5Elo(Ot_GA3) MA55 CGTGTACCACCACGCTTTGT
d4DES(TC_GA) D4DES-Tc-988R AACACGGTCAAAGCCTTCATAATC
d4Des(Eg_GA) D4DES-Eg-R ACTTTTCACCACCGACGAAGTT
d4Des(Pl_GA2) D4DES-PI-817R CCTCCCACCTCCAAGCAA
GPI Exp 3-128R CTTGCATGATGATCAGGAAAGC
实施例4：
按照实施例3中的方法，测定了开花后多个时间点每种事件的种子中的mRNA浓度。表QPCR1和QPCR2分别描述编码δ-5延伸酶和δ-5去饱和酶基因的mRNA的量。缺失值表示在该事件的植物的该天未进行测量。mRNA浓度以随意单位给出；在QPCR1和QPCR2的每个表格内，值因此相当；表格内的绝对值不可比较，但可有效进行趋势和倾向比较。
表QPCR1显示，仅事件LBFGKN和LBFLFK的δ-5延伸酶基因的表达持续至甚至开花后30天，而事件LANPMZ和LAODDN的δ-5延伸酶基因的表达在开花后30天严重降低或仅轻微检测到。表QPCR2显示，对于所有事件，在所有测定日期都可检测到明显可检测到的δ-5去饱和酶mRNA。
表QPCR1：总δ-5延伸酶(d5Elo(Ot_GA3))mRNA量，测定特异性单位
表QPCR2：总δ-5去饱和酶mRNA量，测定特异性单位
实施例5：脂质组合物数据
按上文实施例2中所述分析了这些事件的种子脂质的组成。如表FA1中可见，事件LANPMZ和LAODDN的总提取种子脂质的ARA含量未随时间推移显著降低，而事件LBFGKN和LBFLFK的总提取种子脂质中ARA的含量分别降低0.53％和0.72％。表FA2显示，对于所有事件，总提取种子脂质中的EPA含量持续提高；表FA3显示，对于所有事件，总提取种子脂质中的DHA含量也提高。
表FA4总结每种事件获得的最终提取物中的种子脂质组成。表格显示，仅对于事件LBFGKN和LBFLFK，可以达到大于5％的EPA和ARA含量差，及可达到大于7％的(EPA+DHA)和ARA含量差。
表FA1：种子脂质的ARA含量
表FA2：种子脂质的EPA含量
表FA3：DHA种子脂质含量
表FA4：每种事件获得的最终脂质提取物的组成
仅供受理局使用
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.提取的欧洲油菜植物脂质组合物，其包含二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)及可选的花生四烯酸(ARA)，其中：
a)EPA的含量比ARA的含量高至少5％；和/或
b)EPA+DHA的含量之和比ARA的含量高至少7％；和/或
c)ARA的含量小于4％，EPA的含量大于7％，DHA的含量大于2％。
2.欧洲油菜植物或其部分，其包含含有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)及可选的花生四烯酸(ARA)的脂质，其中：
a)EPA的含量比ARA的含量高至少5％；和/或
b)EPA+DHA的含量之和比ARA的含量高至少7％；和/或
c)ARA的含量小于4％，EPA的含量大于7％，DHA的含量大于2％。
3.欧洲油菜植物或其部分，其包含含有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)及花生四烯酸(ARA)的脂质，其中在培养所述欧洲油菜植物或其部分时，ARA的含量降低以总脂质重量计的至少0.5％，同时优选EPA和/或DHA的含量提高。
4.权利要求3的欧洲油菜植物或其部分，其中EPA的含量提高以总脂质重量计的至少1.0％。
5.权利要求2至4中任一项的欧洲油菜植物，其包含含有以下的核酸：
a)δ-5延伸酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期维持或提高δ-5延伸酶基因的表达；和/或
b)δ-5去饱和酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期降低或阻止δ-5去饱和酶基因的表达。
6.权利要求2至5中任一项的欧洲油菜植物的种子。
7.欧洲油菜植物脂质组合物，其可通过包括以下步骤的方法获得或通过包括以下步骤的方法获得：
a)培养权利要求2至5中任一项的欧洲油菜植物至少直到脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高；和
b)收获该植物或其部分；和
c)从所收获的材料提取脂质组合物，以获得所述脂质组合物。
8.权利要求7的欧洲油菜植物脂质组合物，其中方法进一步包括脱胶、除臭、漂白、脱色、干燥、冬化和/或分级分离所提取的脂质，以获得所述脂质组合物。
9.食品或饲料，其包含权利要求1、7或8中任一项的欧洲油菜植物脂质组合物。
10.改变植物脂质组合物的方法，其包括培养权利要求2至5中任一项的欧洲油菜植物，以产生包含二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)及花生四烯酸(ARA)的脂质的步骤，其中培养和脂质产生的步骤持续至ARA含量降低同时优选EPA和/或DHA含量提高。
11.产生欧洲油菜植物脂质组合物的方法，其包括以下步骤：
a)培养权利要求2至5中任一项的欧洲油菜植物；
b)在脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高时，收获该植物或其部分。
12.权利要求10或11的方法，其中ARA降低至少0.5wt.-％，优选从至多4wt.-％降低到至多3.5wt.-％，同时优选EPA提高至少1wt.-％，优选从至少6wt.-％提高到至少7wt.-％。

Claims (12)

1.提取的植物脂质组合物，其包含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及可选的花生四烯酸(ARA)，其中：
a)EPA的含量比ARA的含量高至少5％；和/或
b)EPA+DHA的含量之和比ARA的含量高至少7％；和/或
c)ARA的含量小于4％，EPA的含量大于7％，DHA的含量大于2％。
2.植物或其部分，其包含含有二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及可选的花生四烯酸(ARA)的脂质，其中：
a)EPA的含量比ARA的含量高至少5％；和/或
b)EPA+DHA的含量之和比ARA的含量高至少7％；和/或
c)ARA的含量小于4％，EPA的含量大于7％，DHA的含量大于2％。
3.植物或其部分，其包含含有二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及花生四烯酸(ARA)的脂质，其中，在培养该植物或其部分时，ARA的含量降低，同时优选EPA和/或DHA的含量提高。
4.权利要求2或3中任一项的的植物，其包含含有以下的核酸：
a)δ-5延伸酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期维持或提高δ-5延伸酶基因的表达；和/或
b)δ-5去饱和酶基因，其处于启动子控制下，使得在种子发育晚期降低或阻止δ-5去饱和酶基因的表达。
5.权利要求2至4中任一项的植物，其中植物隶属于亚麻荠属或芸苔属。
6.权利要求2至5中任一项的植物的种子。
7.植物脂质组合物，其可通过包括以下步骤的方法获得或通过包括以下步骤的方法获得：
a)培养权利要求2至5中任一项的植物至少直至脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高；和
b)收获该植物或其部分；和
c)从所收获的材料提取脂质组合物，以获得所述脂质组合物。
8.权利要求7的植物脂质组合物，其中方法进一步包括脱胶、除臭、漂白、脱色、干燥、冬化和/或分级分离所提取的脂质以获得所述脂质组合物。
9.食品或饲料，其包含权利要求1至8中任一项的脂质组合物。
10.改变植物脂质组合物的方法，其包括培养权利要求2至5中任一项的植物以产生包含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及花生四烯酸(ARA)的脂质的步骤，其中培养和脂质产生的步骤持续至ARA含量降低，同时优选持续至EPA和/或DHA含量提高。
11.产生植物脂质组合物的方法，其包括以下步骤：
a)培养权利要求2至5中任一项的植物；
b)在脂质ARA含量降低和优选脂质EPA和/或DHA含量提高时，收获该植物或其部分。
12.权利要求10或11的方法，其中ARA降低至少0.5wt.-％，优选从至多4wt.-％降低到至多3.5wt.-％，同时优选EPA提高至少1wt.-％，优选从至少6wt.-％提高到至少7wt.-％。
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