CN102719552B - 一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤：1）转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取；2）转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认；3）转基因香石竹Moonshade定性PCR检测；4）转基因香石竹Moonshade定量PCR检测。本发明建立了适用于转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证了该检测方法的特异性和灵敏度，为转基因香石竹的进口检测、监管及环境安全评价提供重要依据。
Description
技术领域
本发明属于转基因植物检测技术领域，具体涉及一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法。
背景技术
随着转基因植物产业化水平不断提高，其安全问题已经引起国际社会和各国政府的广泛关注，并成为国家之间环境保护、国际贸易等合作的敏感议题，致使转基因产品的安全性问题由学术观点分歧，发展到环境问题、经济问题甚至政治问题。为了加强对转基因植物的管理，世界各国纷纷制定了相应的法律法规。其中，转基因产品标识制度已成为国际公约。澳大利亚和新西兰从2001年7月开始对所有转基因食物实施标识制度，阈值为每种成分的1%，即当某一种成分内的转基因成分超过1%，则必须标识为转基因食物。巴西、以色列等国也把转基因成分阈值定为1%。韩国和日本分别为3%和5%。
建立健全转基因产品标识制度，转基因产品的检测技术是关键。目前世界上常用的转基因检测方法主要有两种：一种是基于核酸的检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。在转基因植物及其加工产品的检测过程中，以DNA检测为基础的核酸检测方法已经成为最主要、最适用的转基因植物及其加工产品的检测方法。基于DNA分子为基础的转基因产品检测方法经历了四个发展阶段，即（1）针对启动子、终止子、标记基因的筛选检测；（2）目的基因特异性检测；（3）基因构建特异性检测；（4）品系特异性（转化事件）检测。由于品系特异性检测方法具有高度特异性，目前国际上对于转基因产品检测方法已逐步过渡到品系特异性基因片段的检测方法。
品系特异性检测是通过分析外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。基于上述优点，品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并将为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。
香石竹（Dianthus caryophyllus L.)又名康乃馨，为石竹科石竹属多年生草本植物，是当代世界最主要的切花品种之一，其生产面积和销售量居切花品种之首。澳大利亚Florigene公司和日本Suntory公司从杂交矮牵牛中克隆到二氢黄酮醇-4-还原酶基因（Dihydroflavonol-4-Reductase，DFR）和类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因（Flavonoid-3′,5′-Hydroxylase，F3’5’H），构建载体pCGP1470并通过农杆菌介导转化花色为白色的香石竹品种，经筛选获得了花色呈蓝紫色的转基因香石竹。月之霓裳（Moonshade）是其中1个主要品系。
转基因香石竹是在我国进行环境安全评价试验的第一例观赏植物，在转基因植物环境安全研究领域具有重要意义。所以研究开发灵敏度高、特异性强的转基因香石竹品系特异性检测方法和标准，已成为一项重要而紧迫的任务。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种转基因花色香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法。本发明利用LM-PCR技术分离、测序分析得到了外源基因插入位点的左边界旁邻序列，并设计了一系列特异性引物和探针序列，建立了适用于转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证了该检测方法的特异性和灵敏度。
本发明的原理为：根据已知的外源插入载体，设计2条同向且退火温度较高的特异性引物MP1/MP2与试剂盒“LA-PCRTMin vitro Cloning”（TaKaRaBiotechnology Co.,Ltd.Japan）提供的引物C1/C2结合，进行LM-PCR反应，得到外源基因插入香石竹基因组DNA位点的旁邻序列。据此设计特异性引物和探针，并优化PCR扩增条件，建立标准曲线，确定检测的灵敏度，同时对混合样品进行分析检测，建立适合于转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
利用Primer Express software version3.0(Applied Biosystems,Foster City,CA)设计特异性引物和荧光探针。特异性引物和探针的序列、扩增片段长度参见表1。引物和探针由上海英骏公司（Invitrogen Co.,Ltd,Shanghai）合成。
其中，采用ans基因作为香石竹的内标准基因。特异性引物MP1/MP2和试剂盒引物C1/C2用于LM-PCR扩增。shadeC1F/shadeC1R用于品系特异性定性PCR扩增。shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe用于品系特异性定量PCR扩增。ANS-F1/ANS-R1用于内标准基因ans定性PCR扩增。ANS-F2/ANS-R2和ANS-Probe用于内标准基因ans定量PCR扩增。GenomeC1F/GenomeC1R用于香石竹基因组DNA定性PCR扩增。
表1.PCR体系所用的特异性引物和探针
本发明所述的转基因花色香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括如下步骤：
1、提取转基因香石竹Moonshade基因组DNA。
2、转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认：
利用LM-PCR方法分离得到包括如SEQ ID No1所示的194bp未知序列和130bp的外源插入载体序列；根据该未知序列设计引物GenomeC1F/GenomeC1R进行PCR扩增，PCR扩增结果证明如SEQ ID No 1所示的序列为香石竹基因组序列，即转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列如SEQ ID No1所示；具体过程如下：
根据已知的外源插入载体设计2条特异性引物MP1/MP2，将试剂盒引物C1/C2与2条特异性引物MP1/MP2配对进行2轮LM-PCR扩增，第2轮PCR（采用MP2/C2引物对）可以得到约324bp扩增产物，再经测序、比对之后发现：第1-194位的序列为未知序列，第195-324位的序列与外源插入载体的第1-130位序列相同，其中，194bp的未知序列如SEQ ID No1所示。
其中，2条特异性引物MP1/MP2序列如SEQ ID No13和SEQ ID No15所示，2条试剂盒引物C1/C2序列如SEQ ID No12和SEQ ID No14所示。所述LM-PCR方法的扩增反应体系为：第1轮扩增反应：总体积30μL，3μL1×PCR缓冲液，3μL2mM dNTPs，1μL 10μM引物C1，1μL 10μM引物MP1，0.3μL 5U LA-Taq DNA聚合酶，2μL Moonshade DNA，19.7μL双蒸水；第2轮反应：总体积30μL，3μL 1×PCR缓冲液，3μL 2mM dNTPs，1μL 10μM引物MP2，1μL 10μM引物C2，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，19.7μL双蒸水和2μL(25ng/μL)第一轮PCR产物。
根据分离得到的如SEQ ID No1所示的未知序列设计引物GenomeC1F/GenomeC1R，其序列分别如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示，进行PCR扩增，结果证明如SEQ ID No1所示的序列为香石竹基因组序列，即为外源基因插入位点的左边界旁邻序列。
3、转基因香石竹Moonshade定性PCR检测方法的建立和验证，采用Moonshade品系特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R进行定性PCR扩增，其引物对shadeC1F/shadeC1R序列分别如SEQ ID No4和SEQ ID No5所示。
所述定性PCR检测方法的反应体系为：总体积25μL，5μL MoonshadeDNA，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs，12.7μL双蒸水，10μMMoonshade品系特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R各1μL和0.3μL，5UTaq DNA聚合酶；反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，7min。
内标准基因ans的定性PCR反应体系同所述定性PCR检测方法的反应体系，其中所用引物对为内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F1/ANS-R1，其序列如SEQ ID No16和SEQ ID No17所示；
4、转基因香石竹Moonshade定量PCR检测体系的建立和验证。
（1）为了获得高效、灵敏的定量PCR反应系统，通过不同引物、探针浓度的比例对定量PCR反应体系进行优化，从中筛选荧光信号指数期上升较快，荧光信号强且反应重复性好的体系作为最终定量PCR检测反应的体系。
其中，所用Moonshade品系特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe序列分别为SEQ ID No6、SEQ ID No7和SEQ ID No8，内标准基因ans特异性引物对ANS-F2/ANS-R2和探针ANS-Probe序列分别为SEQID No9、SEQ ID No10和SEQ ID No11；
本发明最终确定的moonshade品系特异性定量PCR检测方法的PCR反应体系为：总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs，5μL25mMMgCl2，10μM定量引物对shadeR1F/shadeR1R各0.5μL，1.0μL10μM探针shade-Probe，0.25μL5U Taq DNA聚合酶，5μL DNA和7.75μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环。在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。
本发明最终确定的内标准基因ans定量PCR反应体系为：总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs，5μL25mM MgCl2，10μM引物对ANS-F2/ANS-R2各0.5μL，0.5μL10μM探针ANS-Probe，0.3μL5U Taq DNA聚合酶，5μL DNA和8.2μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环。在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。
（2）定量PCR检测极限、标准曲线的建立和重复性分析。
在定量分析中，检测极限(Limit of Detection,LOD)和定量极限(Limit ofQuantitation,LOQ)指的是定量分析过程的最低检测极限和最低有效定量极限，即被检测的样品在95%的精确度水平上能被检测出和可被定量的最低含量或质量。LOD和LOQ是评价定量方法有效检测范围和准确定量范围的重要参数，可通过低浓度样品多次重复数值的再现性来确定。
定量检测体系的重复性(Repeatability)是指在不同时间段重复实验之间的差异，用标准偏差(Standard Deviation,SD)来表示。每个浓度试样平行做3个反应，重复试验3次。
利用最终定量PCR反应条件，以5μL连续稀释的基因组DNA作为模板，其连续稀释的浓度为20ng/μL，4ng/μL，0.8ng/μL，0.16ng/μL，0.032ng/μL，0.0064ng/μL。经过三次重复试验，三组定量PCR检测方法的LOD和LOQ分别为0.032ng和0.16ng，约为香石竹单倍体基因组51和254个拷贝。
（3）混合样品的定量PCR分析
本发明中，实际样品的定量分析是采用相对定量法，即用外源基因和内标准基因含量的比值来表示检测样品中转基因成分的含量。首先将非转基因香石竹基因组DNA与转基因香石竹Moonshade基因组DNA混合，配制含转基因香石竹5%、3%、1%（W/W）的混合样品。再次，将混合样品在相同阈值下的Ct值分别代入建立的内标准ans的PCR反应体系和Moonshade品系特异性PCR反应体系的标准曲线，得到对应值。最后，根据公式（转基因成分含量=转基因成分拷贝数/内标准基因拷贝数）进行转基因含量的计算。
经过上述方法可检测得：本发明中定性PCR检测方法的灵敏度0.05ng，约为香石竹单倍体基因组79拷贝；定量PCR检测方法的LOD和LOQ分别为0.032ng和0.16ng，为香石竹单倍体基因组51和254个拷贝，且重复性好，具有很高的稳定性，同时，计算值与真实值的偏差小于25%，可见本发明所述的定量PCR检测方法具有高的精确性和准确性。
本发明的有益效果：
1.本发明通过LM-PCR方法分离获得转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的194bp香石竹基因组DNA序列，设计了定性、定量PCR反应引物、探针，并优化了定性、定量PCR检测体系，首次建立了转基因香石竹Moonshade品系特异性的检测方法。
2.其灵敏度更高、特异性更强、重复性好，并具有高的精确性和准确性。
3.可为转基因香石竹的监管提供检测依据，为转基因香石竹检测标准的制定及转基因香石竹的定性、定量检测试剂盒的开发提供技术支持。
附图说明
图1为本发明中转基因香石竹Moonshade的外源插入载体示意图；
图2为本发明中转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法所用的引物和探针示意图；
图3为本发明香石竹基因组DNA的定性PCR扩增结果，其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1-6：Moonshade，Moonlite，FE123，BT11，MON531，空白对照（NTC）；
图4为本发明Moonshade品系特异性定性PCR扩增结果（采用特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R），其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1-6：Moonshade，Moonlite，FE123，BT11，MON531，空白对照（NTC）；
图5为Moonshade品系特异性定性PCR扩增结果（采用参照引物C1F/C1R），其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1-6：空白对照（NTC），Moonshade，Moonlite，FE123，BT11，MON531；
图6为本发明Moonshade品系特异性定性PCR检测的灵敏度分析（采用特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R），其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1-6：10.0、1.0、0.1、0.05、0.01%转基因香石竹的混合样品和空白对照（NTC）；
图7为Moonshade品系特异性定性PCR检测的灵敏度分析（采用参照引物C1F/C1R），其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1-6：空白对照（NTC）、10.0、1.0、0.1、0.05、0.01%转基因香石竹的混合样品；
图8为本发明Moonshade品系特异性定量PCR扩增曲线（采用特异性定性引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe）：5个浓度曲线a、b、c、d、e分别代表以100、20、4、0.8、0.16ng的转基因香石竹Moonshade基因组DNA扩增结果；
图9为本发明Moonshade品系特异性定量PCR扩增标准曲线（采用特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R和探针shade-Probe）；
图10为Moonshade品系特异性定量PCR扩增曲线（采用参照引物R1F/R1R和探针Probe）：5个浓度曲线a、b、c、d、e分别代表以100、20、4、0.8、0.16ng的转基因香石竹Moonshade基因组DNA扩增结果；
图11为Moonshade品系特异性定量PCR扩增标准曲线（采用参照引物R1F/R1R和探针Probe）；
图12为本发明内标准基因ans定量PCR扩增曲线：5个浓度曲线a、b、c、d、e分别代表以100、20、4、0.8、0.16ng的转基因香石竹Moonshade基因组DNA扩增结果；
图13为本发明内标准基因ans定量PCR扩增标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
本发明以转基因香石竹Moonshade品系特异性检测研究为例，具体方法如下：
实施例1
1、提取转基因香石竹Moonshade基因组DNA。
转基因香石竹品系Moonshade、转基因香石竹品系Moonlite、非转基因香石竹亲本FE123的插条由澳大利亚Florigene公司提供，转基因玉米BT11、转基因棉花MON531由先正达生物科技有限公司提供。
采用植物基因组提取试剂盒“Plant DNA Mini-prep kit”（瑞丰生物科技有限公司，上海）从转基因香石竹Moonshade中提取转基因香石竹Moonshade基因组DNA（即Moonshade DNA）。利用分光光度计（Thermo Company EV60）测定Moonshade DNA浓度和纯度分别为10ng/μL-50ng/μL和OD260/280=1.7-2.0，根据香石竹基因组Moonshade DNA大小（Royal botanicGardens,Kew.Plant c-DNA value database(release4.0,October2005）确定其拷贝数与质量关系为：1copy=0.63pg。
采用上述相同的方法分别从转基因香石竹Moonlite、非转基因香石竹亲本FE123、转基因玉米BT11、转基因棉花MON531中提取Moonlite DNA、FE123DNA、BT11DNA、MON531DNA，备用。
2、外源基因插入位点的左边旁邻序列的分离和确认
本发明中，转基因香石竹Moonshade中插入的外源载体为pCGP1470，如图1所示，包含以下元件：花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子，突变型乙酰乳酸合成酶基因（SuRB），查尔酮合成酶基因（CHS）启动子，二氢黄酮醇-4-还原酶基因（DFR）、类黄酮-3',5'-羟基化酶基因（F3'5＇H），来源于矮牵牛编码磷脂转移蛋白基因的D8终止子，来源于农杆菌的MAC组成型启动子和MAS终止子。
根据如图1所示的外源插入载体，设计2条特异性引物MP1/MP2。以提取的Moonshade DNA为模板，将试剂盒引物C1/C2与2条特异性引物MP1/MP2配对进行2轮LM-PCR扩增，可以得到约324bp扩增产物，而以提取的FE123DNA为模板进行LM-PCR扩增的对照亲本材料没有得到扩增片段。对第2轮的PCR扩增产物经过回收试剂盒（申能博彩生物科技有限公司）回收、克隆至pMD18-T载体（宝生物工程（大连）有限公司），送测序公司（上海生工生物技术有限公司）测序。所得序列经过网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对后，结果表明：第1-194位的序列为未知序列，第195-324位的序列与外源插入载体的第1-130位序列相同，其中，194bp未知序列如SEQ ID No1所示。
其中，LM-PCR方法的扩增反应体系为：第1轮扩增反应：总体积30μL，3μL1×PCR缓冲液，3μL2mM dNTPs，1μL10μM引物C1，1μL10μM引物MP1，0.3μL5U LA-Taq DNA聚合酶，2μL Moonshade DNA，19.7μL双蒸水；第2轮反应：总体积30μL，3μL1×PCR缓冲液，3μL2mM dNTPs，1μL10μM引物MP2，1μL10μM引物C2，0.3μL5U Taq DNA聚合酶，19.7μL双蒸水和2μL(25ng/μL)第一轮PCR产物。LM-PCR反应程序参见表2。所有PCR反应在GeneAmp PCR9700PCR仪进行(Applied Biosystems)。
表2.LM-PCR反应程序
依据194bp的未知序列，设计引物GenomeC1F/1R（如图2所示），进行PCR扩增，其PCR反应体系：反应体系总体积25μL，5μL DNA模板，2.5μL1×PCR缓冲液(50mM KCl,10mM Tris-HCl,pH8.3,1.5mMMgCl2)，2.5μL2mM dNTPs，12.7μL双蒸水，10μM引物GenomeC1F/GenomeC1R各1μL和0.3μL5U Taq DNA聚合酶(TakaraBiotechnology Co.,Ltd,Dalian,China)。PCR仪为GeneAmp PCR9700systems(Applied Biosystems)。反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，7min。反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，100v，20min。
其中，DNA模板分别为Moonshade DNA、Moonlite DNA、FE123DNA、BT11DNA和MON531DNA。
PCR扩增结果参见图3：转基因香石竹Moonshade、转基因香石竹Moonlite、非转基因香石竹亲本FE123均可以得到扩增146bp的产物，而转基因玉米BT11和转基因棉花MON531中均无扩增产物。因此，可以证明194bp的未知序列为香石竹基因组序列，即转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列如SEQ ID No1所示。
3、转基因香石竹Moonshade定性PCR检测和验证
（1）品系特异性定性引物对的确定和定性PCR检测特异性分析
根据外源插入载体与外源基因插入位点的左边界旁邻序列，设计多组特异性定性引物对，分别对转基因香石竹Moonshade进行品系特异性定性PCR检测，其中，两个引物对为特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R和参照引物C1F/C1R。经过筛选最终确定特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R的特异性很好，适合转基因香石竹Moonshade定性PCR检测。
特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R序列如SEQ ID No4和SEQ IDNo5所示，参照引物C1F/C1R序列如SEQ ID No18和SEQ ID No19所示。
定性PCR反应体系：总体积25μL，5μL DNA模板，2.5μL1×PCR缓冲液(50mM KCl,10mM Tris-HCl,pH8.3,1.5mM MgCl2)，2.5μL2mMdNTPs，12.7μL双蒸水，10μM引物对各1μL和0.3μL5U Taq DNA聚合酶(Takara Biotechnology Co.,Ltd,Dalian,China)。PCR仪为GeneAmp PCR9700systems(Applied Biosystems)。反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，7min。反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，100v，20min。
DNA模板分别为Moonshade DNA、Moonlite DNA、FE123DNA、BT11DNA和MON531DNA。引物对为Moonshade品系特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R或参照引物C1F/C1R。
对于内标准基因ans，设计特异性定性引物ANS-F1/ANS-R1，其序列如SEQ ID No16和SEQ ID No17所示，PCR反应体系同上，进行定性PCR反应。结果显示：对于内标准基因ans特异性定性引物ANS-F1/ANS-R1，Moonshade、Moonshade和亲本FE123均扩增到356bp的条带，而Bt11、Mon531中没有扩增到目的条带，表明前述提取的模块Moonshade DNA质量很好，其Moonshade DNA可用于PCR检测。
对于特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R，其定性PCR结果参见图4，转基因香石竹Moonshade可以扩增到450bp的条带，其他转基因香石竹Moonlite，其他转基因植物BT11、MON531以及亲本FE123中没有扩增到目的条带。
对于参照引物C1F/1R，其定性PCR结果参见图5，转基因香石竹Moonshade可以扩增到460bp的条带，但是同时出现几条非特异性杂带，其他转基因植物BT11、MON531以及亲本FE123中均出现几条非特异性杂带，可见，这对引物特异性较差，不可以用于Moonshade的特异性检测。
以上结果表明，特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R的特异性好，可用于Moonshade的特异性定性PCR检测。
（2）品系特异性定性引物对的确定和定性PCR检测灵敏度分析
最低检测限（LOD）是衡量定性PCR检测方法是否理想的一个重要指标。用非转基因香石竹DNA分别稀释转基因香石竹Moonshade的DNA，分别配制成含有10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%（W/W）转基因香石竹Moonshade基因组DNA的混合样品（浓度为20ng/μL）。将此浓度梯度的混合样品作为模板，测试转基因香石竹Moonshade品系特异性定性PCR检测方法的检测下限。
结果表明：对于特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R，除了0.01%样品不能被检测到，其他混合样品中在450bp处均能扩增到比较清晰、特异的条带，且随着DNA质量浓度的增加，扩增条带亮度增加（参见图6）。可见，采用定性引物对shadeC1F/shadeC1R，转基因香石竹Moonshade定性PCR检测的灵敏度0.05ng（5μL（混合样品DNA体积）×20ng/μL（混合样品DNA浓度×0.05%（质量比）），约为香石竹单倍体基因组79拷贝。
对于参照引物C1F/C1R，除了0.01%和0.05%样品不能被检测到，其他混合样品中在460bp处均能扩增到条带，但均出现几条非特异性杂带（参见图7）。采用此对引物，转基因香石竹Moonshade定性PCR检测的灵敏度0.1ng（5μL（混合样品DNA体积）×20ng/μL（混合样品DNA浓度×0.1%（质量比）），约为香石竹单倍体基因组158拷贝。
结果再次表明，特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R具有更低的检测限，适合用于Moonshade的灵敏度检测。
4、转基因香石竹Moonshade定量PCR检测体系的建立和验证
本发明在筛选特异性定量引物对和探针时设计了多组引物对和探针，其中两组为特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R、探针shade-Probe和参照引物R1F/1R、参照探针probe，经过筛选最终确定特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R、探针shade-Probe的特异性很好，适合转基因香石竹Moonshade定量PCR检测。
特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R、探针shade-Probe的序列如SEQID No6、SEQ ID No7和SEQ ID No8所示；参照引物R1F/R1R和参照探针probe的序列如SEQ ID No20、SEQ ID No21和SEQ ID No22所示。内标准基因ans特异性引物对ANS-F2/ANS-R2和探针ANS-Probe序列分别为SEQ ID No9、SEQ ID No10和SEQ ID No11；
为了获得高效、灵敏的定量PCR反应系统，通过不同引物、探针浓度的比例对定量PCR反应体系进行优化，从中筛选荧光信号指数期上升较快，荧光信号强且反应重复性好的体系作为最终定量PCR检测反应的体系。本发明最终确认的定量PCR反应体系如下：
（1）最终内标准基因ans定量PCR反应体系为：总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs,5μL25mM MgCl2，10μM所述内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2各0.5μL，0.5μL10μM所述探针ANS-Probe，0.3μL5U Taq DNA聚合酶，5μL DNA和8.2μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环。在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。采用ABI7500software versionV2.0.1(Applied Biosystems)对数据进行分析。
（2）最终moonshade品系特异性定量PCR检测方法的PCR反应体系为：总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs，5μL25mM MgCl2，10μM引物对shadeR1F/shadeR1R或参照引物R1F/R1R各0.5μL，1.0μL10μM所述探针shade-Probe或Probe，0.25μL5U Taq DNA聚合酶，5μL DNA和7.75μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环。在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。采用ABI7500software version V2.0.1(Applied Biosystems)对数据进行分析。
其中，所述引物对为Moonshade品系特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R或参照引物R1F/1R，探针为shade-Probe或参照探针probe。
（3）检测极限分析和标准曲线的建立
利用上述最终确定的moonshade品系特异性定量PCR反应条件，分别以5μL不同浓度的转基因香石竹Moonshade基因组样品（20ng/μL，4ng/μL，0.8ng/μL，0.16ng/μL,0.032ng/μL,0.0064ng/μL）为模板，确定定量PCR的最低检测极限（LOD）和定量极限（LOQ）。
对于特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe，经过三次重复试验，三组定量PCR检测方法的LOD和LOQ分别为0.032ng和0.16ng，约为香石竹单倍体基因组51和254个拷贝，具体结果参见表3。对于参照引物R1F/R1R和探针Probe，三组定量PCR检测方法的LOD和LOQ分别为0.16ng和0.8ng，约为香石竹单倍体基因组254和1270个拷贝（具体参见表4）。
结果表明，特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe具有更低的检测限，更适合用于Moonshade的特异性检测。
表3.定量PCR的检测极限和定量极限的分析
表4.定量PCR的检测极限和定量极限的分析
在确定了定量PCR检测的LOD和LOQ值后，在定量允许范围内选择合适浓度的转基因香石竹Moonshade基因组DNA作为标准DNA样品，进行定量PCR检测。标准DNA浓度分别为20ng/μL、4ng/μL、0.8ng/μL、0.16ng/μL、0.032ng/μL，每个定量PCR反应中加入5μL模板，因此每个反应中转基因香石竹基因组DNA绝对含量分别是100ng、20ng、4ng、0.8ng、0.16ng，对应的香石竹基因组单倍体拷贝数约为158730、31746、6349、1270、254。
对于特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe，由转基因香石竹基因组DNA作为标准品建立Moonshade品系特异性定量PCR的分析方法，其扩增曲线和标准曲线如图8、图9。其中，扩增效率为0.92，相关系数为0.9994。
对于参照引物R1F/R1R和探针Probe，其扩增曲线和标准曲线如图10、图11。其中，扩增效率为0.89，相关系数为0.9825，相关系数＜0.99，这样就不能保证由该曲线及其方程求出的样品浓度具有可信性，说明参照引物R1F/1R和探针Probe不能用于Moonshade的定量PCR检测。
由转基因香石竹基因组DNA作为标准品建立内标准基因ans定量PCR的分析方法，其扩增曲线和标准曲线如图12、图13。其中扩增效率为0.91，相关系数为0.9999。
结果再次说明，特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe适合于转基因香石竹Moonshade的定量PCR检测。
（3）定量PCR检测方法的重复性分析
在上述优化后的最终内标准基因ans和品系特异性定量PCR反应条件下，分别以不同浓度的转基因香石竹Moonshade基因组DNA（20ng/μL，4ng/μL，0.8ng/μL，0.16ng/μL,0.032ng/μL）作为标准品进行重复性测试，每次实验重复三次，每次设立三个平行。结果如表5所示，Ct的范围是23.66-34.30，标准偏差（SD）的范围是0.12-0.21。内标准基因ans定量PCR的Ct的范围是20.17-30.84，标准偏差（SD）的范围是0.02-0.12（参见表5）。结果表明：最终确定的品系特异性定量PCR反应体系的重复性很好，具有很高的稳定性，可以用于样品的定量分析。
表5.Moonshade品系特异性定量PCR反应的重复性分析
（4）转基因香石竹Moonshade品系特异性定量PCR检测体系对混合样品的定量分析
基于Moonshade品系特异性定量PCR检测体系建立品系特异性定量标准曲线和内标准基因ans的定量标准曲线，利用相对定量法分别对含有不同含量水平的（5%、3%、1%，W/W）转基因香石竹品系Moonshade和非转基因香石竹的混合样品进行了定量分析。
如表6所示，根据建立的标准曲线，混合样品中转基因香石竹含量的计算值与其真实值之间的偏差小于25%。因此，本发明的转基因香石竹品系Moonshade的品系特异性定量检测方法具有高的精确性和准确性。
表6.混合样品的定量PCR分析
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (5)
1.一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1）转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取；
2）转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认：利用LM-PCR方法分离得到包括如SEQ ID No 1所示的194bp未知序列和130bp的外源插入载体序列；根据该未知序列设计引物GenomeC1F/GenomeC1R进行PCR扩增，PCR扩增结果证明如SEQ ID No 1所示的序列为香石竹基因组序列，即转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列如SEQ ID No 1所示；
3）转基因香石竹Moonshade的定性PCR检测：采用Moonshade品系特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R进行定性PCR扩增；
4）转基因香石竹Moonshade的定量PCR检测：由转基因香石竹Moonshade基因组DNA作为标准品，采用Moonshade品系特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe进行定量PCR扩增，同时，采用内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe进行内标准基因定量PCR，并建立品系特异性定量标准曲线和内标准基因ans的定量标准曲线；再利用相对定量法对样品进行定量检测；
其中，引物GenomeC1F/GenomeC1R，其序列分别如SEQ ID No2和SEQID No3所示；引物对shadeC1F/shadeC1R序列分别如SEQ ID No 4和SEQ IDNo 5所示；定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe序列分别如SEQ ID No 6、SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示；内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe序列如SEQ ID No 9、SEQID No 10和SEQ ID No 11所示。
2.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述LM-PCR方法的扩增反应体系为：第1轮扩增反应：总体积30μL，3μL1×PCR缓冲液，3μL 2mM dNTPs，1μL 10μM引物C1，1μL 10μM引物MP1，0.3μL 5U LA-Taq DNA聚合酶，2μL Moonshade DNA，19.7μL双蒸水；第2轮反应：总体积30μL，3μL 1×PCR缓冲液，3μL 2mM dNTPs，1μL 10μM引物MP2，1μL 10μM引物C2，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，19.7μL双蒸水和2μL25ng/μL第一轮PCR产物；其中，引物C1的序列如SEQ ID No 12所示，引物MP1的序列如SEQ ID No 13所示，引物C2的序列如SEQ ID No 14所示，引物MP2的序列如SEQ ID No 15所示。
3.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述定性PCR检测的反应体系为：总体积25μL，5μL Moonshade DNA，2.5μL 1×PCR缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs，12.7μL双蒸水，10μM定性引物对shadeC1F/shadeC1R各1μL和0.3μL 5U Taq DNA聚合酶；反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，7min。
4.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述定量PCR检测的反应体系为：总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL 2mM dNTPs，5μL 25mM MgCl2，10μM定量引物对shadeR1F/shadeR1R各0.5μL，1.0μL10μM探针shade-Probe，0.25μL5U TaqDNA聚合酶，5μL DNA和7.75μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环，在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。
5.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述内标准基因定量PCR的反应条件为：反应体系总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL 2mM dNTPs，5μL 25mM MgCl2，10μM引物对ANS-F2/ANS-R2各0.5μL，0.5μL 10μM探针ANS-Probe，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，5μL DNA和8.2μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环，在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。
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