CN117305502A - 一种水稻粒型基因gw5的parms分子标记及引物组和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记及引物组和应用，通过对本发明的水稻粒型基因GW5的分子序列，应用PARMS技术对水稻材料进行窄粒型GW5基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻窄粒型GW5基因。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择和背景选择，提高背景回复率，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于GW5基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
Description
技术领域
本发明涉及水稻育种领域，特别是一种水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记及引物组和应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的谷类作物之一，也是世界约一半人口的主要食物来源。随着我国人民生活水平的提高，稻米需求呈现多样化趋势，在产量仍作为重要指标的同时，稻米外观品质也受到越来越高的重视。粒形作为外观品质性状还会影响垩白和正精米率等指标，严重影响加工品质,降低稻米的产量和市场价值。GW5能够通过油菜素内酯信号通路调控水稻籽粒外颖细胞数，从而调节粒宽，在水稻育种中具有较高的利用价值。
水稻品种的粒型改良是通过鉴定籽粒长宽表型对植株进行选择，耗费时间长，选择效率较低。利用分子标记辅助选择育种简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率，带来巨大的社会经济效益。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记及引物组和应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记，所述PARMS分子标记为GW5-M1，所述GW5-M1的多态性位点位于水稻5号染色体的第5360573至第5360574位碱基，第5360573位和第5360574位碱基间存在如SEQ ID NO.3所述的1212bp碱基序列。
本发明的第二个目的是要提供一种用于检测水稻窄粒型GW5基因的分子标记引物组，所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQID NO.4所示的GW5-M1Fg和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的GW5-M1Ft；所述通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的GW5-M1R。
进一步地，所述GW5-M1Fg的5’端连接FAM荧光序列，Primer GW5-M1Ft的5’端连接HEX荧光序列。
本发明的第三个目的是要提供一种水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记在鉴定水稻GW5基因型中的应用。
本发明的第四个目的是要提供一种用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组在鉴定水稻GW5基因型中的应用。
具体地，用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组在鉴定水稻GW5基因型中的应用，包括如下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组，用PARMS技术对GW5-M1分子标记进行检测：若GW5-M1检测为HEX荧光，判定测试的水稻样品为纯合的窄粒型GW5基因型；若GW5-M1检测为FAM荧光，判定测试的水稻样品为纯合的宽粒型GW5基因型；若GW5-M1的多态位点同时检测到HEX和FAM荧光，判断待测水稻为杂合的窄粒型GW5基因型。
本发明的第五个目的是要提供一种水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记在水稻育种中的应用，具体地，利用用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组在鉴定水稻GW5基因型中的应用鉴定出水稻样品的基因型，然后选择携带GW5基因的水稻品系进行后续育种。
与现有技术相比，通过对本发明的水稻粒型基因GW5的分子序列，应用PARMS技术对水稻材料进行窄粒型GW5基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻窄粒型GW5基因。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择和背景选择，提高背景回复率，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于GW5基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
附图说明
图1为本发明实施例的全基因组关联分析曼哈顿图。
图2为本发明实施例的分子标记位置。
图3为PARMS检测技术流程图。
图4为本发明实施例中不同品种分子标记GW5-M1的分型图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例公开了水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记，通过全基因组关联分析定位到目标基因GW5，所述PARMS分子标记为GW5-M1，所述GW5-M1的多态性位点位于水稻5号染色体的第5360573位和第5360574位碱基，第5360573位和第5360574位碱基间存在1212bp的插入(SEQ ID NO.3)，窄粒型GW5核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和宽粒型GW5核苷酸序列(SEQ IDNO.2)如表1所示，标记GW5-M1在水稻染色体上的位置如图2所示。
表1
具体设计过程如图3所示，通过已克隆目标基因GW5确定物理位置，提取多态位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：
1)全基因组关联分析
利用基因芯片确定280份种质资源的DNA指纹图谱，对材料的籽粒宽度表型进行全基因组关联分析，定位结果如图1所示，在第5号染色体的第5400007位碱基处检测到一个显著性位点，该位点附近存在一个调控水稻籽粒宽度的主效基因GW5。
2)引物设计
根据文献的定位标记信息，确定GW5(GenBank：DQ991205.1)物理位置是日本晴(MSU7.0)的5号染色体5365122-5366701碱基，提该区间的侧翼序列，并利用在线引物设计网站http://www.snpway.com/对其进行引物设计。GW5-M1的引物设计如表2所示，每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托武汉市景肽生物科技有限公司合成。
表2
3)样品检测
DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
PARMS反应测试：10ul PCR反应体系。在PCR反应板中加入20ng DNA样品，烘干后加入PARMS Master Mix反应混合液(由武汉市景肽生物科技有限公司生产)，反应体系见表3。
表3
| 体积 | 终浓度 | |
| 10μM Primer GW5-M1R | 0.4μL | 400nM |
| 10μM Primer GW5-M1Fg | 0.15μL | 150nM |
| 10μM Primer GW5-M1Ft | 0.15μL | 150nM |
| 2x PARMS Master Mix | 5μL | 1x |
| 超纯水 | 补至10μL |
PCR扩增在ABI 7500荧光定量PCR系统中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，32个循环。PCR反应完成后进行荧光数据读取，荧光数据的结果转化成图形。若GW5-M1检测为HEX荧光，判定测试的水稻样品为纯合的窄粒型GW5基因型；若GW5-M1检测为FAM荧光，判定测试的水稻样品为纯合的宽粒型GW5基因型；若GW5-M1的多态位点同时检测到GW5-M1Fg、GW5-M1Ft，判断待测水稻为杂合的窄粒型GW5基因型。
4)自然群体验证
根据上述检测方法，用标记GW5-M1对含有GW5基因的92个水稻品种进行PARMS初筛反应验证，结果如表4所示，分型图如图4所示。
表4
由表4可以看出，携带窄粒型GW5基因品种在GW5-M1测试位点检测出HEX信号，如龙粳21、中科发5号；携带宽粒型GW5基因品种在GW5-M1测试位点检测出FAM信号，如秋田小町、辽开79；空白对照全部为阴性对照。GW5基因是东北稻区中影响粒型的主效基因，后续可以通过GW5基因定向改良水稻粒型，GW5-M1可用于水稻GW5基因分型的高效检测。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记，其特征在于：所述PARMS分子标记为GW5-M1，所述GW5-M1的多态性位点位于水稻5号染色体的第5360573至第5360574位碱基，第5360573位和第5360574位碱基间存在如SEQ ID NO.3所述的1212bp碱基序列。
2.一种用于检测权利要求1所述的水稻窄粒型GW5基因的分子标记引物组，其特征在于：所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQID NO.4所示的GW5-M1Fg和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的GW5-M1Ft；所述通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的GW5-M1R。
3.根据权利要求2所述的用于检测水稻窄粒型GW5基因的PARMS分子标记的引物组，其特征在于：所述GW5-M1Fg的5’端连接FAM荧光序列，Primer GW5-M1Ft的5’端连接HEX荧光序列。
4.一种如权利要求1所述的水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记在鉴定水稻GW5基因型中的应用。
5.一种如权利要求2或3所述的用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组在鉴定水稻GW5基因型中的应用。
6.根据权利要求5所述的用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组在鉴定水稻GW5基因型中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组，用PARMS技术对GW5-M1分子标记进行检测：若GW5-M1检测为HEX荧光，判定测试的水稻样品为纯合的窄粒型GW5基因型；若GW5-M1检测为FAM荧光，判定测试的水稻样品为纯合的宽粒型GW5基因型；若GW5-M1的多态位点同时检测到HEX和FAM荧光，判断待测水稻为杂合的窄粒型GW5基因型。
7.一种如权利要求1所述的水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记在水稻育种中的应用。
8.根据权利要求7所述的水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记在水稻育种中的应用，其特征在于：利用如权利要求6所述的用于检测水稻粒型基因GW5的PARMS分子标记的引物组在鉴定水稻GW5基因型中的应用鉴定出水稻样品的基因型，然后选择携带GW5基因的水稻品系进行后续育种。
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