CN117535439A - 一种水稻感光基因se1的prams分子标记及引物组和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记及引物组和应用，通过对本发明的水稻感光基因SE1的PARMS分子标记，应用PARMS技术对水稻材料进行SE1基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻感光基因SE1。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于SE1基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
Description
技术领域
本发明涉及水稻育种领域，特别是一种水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记及引物组和应用。
背景技术
水稻是光周期敏感性作物。光周期调控水稻开花期，是决定水稻种植纬度范围和产量的主要因素。过早开花会使水稻营养生长期缩短，导致生物产量和籽粒产量降低；另一方面，延迟开花则会导致水稻生育期不足、结实率降低或下一个播种季节推迟，造成产量损失。因此，适时抽穗是粮食生产中保证粮食产量和质量的关键。水稻只有在适宜生长发育的阶段和季节开花，才能实现高产和优质。
感光性水稻育种是通过调查生育期对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助选择育种简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率，带来巨大的社会经济效益。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记及引物组和应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记，所述PRAMS分子标记为SE1-M1，所述SE1-M1的多态性位点位于水稻6号染色体的SE1基因第9338007-9338008位碱基插入，插入的碱基为TT。
本发明的第二个目的是要提供一种用于检测水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记的引物组，所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Primer Seq SE1-M1Rg和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的PrimerSeq SE1-M1Ra；所述通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Primer SE1-M1F。
优选地，所述Primer Seq SE1-M1Rg的5’端连接FAM或HEX荧光序列，PrimerSeqAlleleY的5’端连接HEX或FAM荧光序列。
本发明的第三个目的是要提供一种水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记在鉴定水稻SE1基因型中的应用。
本发明的第四个目的是要提供一种用于检测水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记的引物组在鉴定水稻SE1基因型中的应用，包括如下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用用于检测水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记的引物组，用PARMS技术对SE1-M1分子标记进行检测；若SE1-M1的序列为TT，判定测试的水稻样品为SE1功能型，纯合的光敏感SE1基因型；若SE1-M1的序列为TT缺失，判定测试的水稻样品为纯合的光钝感SE1基因型；若SE1-M1的多态位点同时检测到TT/--，判断待测水稻为杂合的SE1基因型。
优选地，所述步骤S1中水稻叶片中提取基因组DNA采用常规简化CTAB法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
通过对本发明的水稻感光基因SE1进行PRAMS分子标记，应用PARMS技术反应对水稻材料进行SE1基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻感光基因SE1。本发明利用PARMS技术对SE1基因进行分型，相比于目前最常用的基于PCR+电泳的SSR技术，PARMS检测技术免去了耗时费力的电泳技术，采用荧光扫描的方式直接读取等位基因的基因型信号，配合数据分析软件，可快速完成基因型分析工作，工作效率具有数量级的提升。PARMS技术非常适用于检测自动化，配合GeneMatrix高通量基因分型系统，可以做到每天十万个数据点的超高通量的SE1基因鉴定和稻瘟病抗性资源筛选。PARMS完美兼容LGC KASP SNP检测硬件体系以及引物，可做到无缝转换。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于SE1基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
附图说明
图1为本发明实施例的分子标记位置。
图2为PARMS检测技术流程图。
图3为本发明实施例中不同品种分子标记SE1-M1的分型图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例公开了水稻感光基因SE1的PARMS分子标记，通过全基因组关联分析定位到目标基因SE1，所述PRAMS分子标记为SE1-M1，所述SE1-M1的多态性位点位于水稻6号染色体的SE1基因第9338007-9338008位碱基插入，插入的碱基为TT，标记SE1-M1在水稻染色体上的位置如图1所示。具体设计过程如图2所示，通过已克隆目标基因SE1确定物理位置，提取多态位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：
1)全基因组关联分析
利用基因芯片确定280份种质资源的DNA指纹图谱，对材料的光周期敏感表型进行全基因组关联分析，定位结果如图1所示，在第6号染色体的第9338007位碱基处检测到一个显著性位点,该位点附近存在一个调控水稻感光性的主效基因SE1。
2)引物设计
根据文献的定位标记信息，确定SE1(GenBank：AB041838.1)物理位置是日本晴(MSU7.0)的6号染色体9336359-9338643区间，提该区间多态位点和侧翼序列，并利用在线引物设计网站http://www.snpway.com/对其进行引物设计。SE1-M1的引物设计如表1所示，每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托武汉市景肽生物科技有限公司合成。
表1
3)样品检测
DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
PARMS反应测试：10ul PCR反应体系。在PCR反应板中加入20ng DNA样品，烘干后加入PARMS MasterMix反应混合液(由武汉市景肽生物科技有限公司生产)，反应体系见表2。
表2
| 体积 | 终浓度 | |
| 10μMPrimerSE1-M1Rg | 0.15μL | 150nM |
| 10μMPrimerSE1-M1Ra | 0.15μL | 150nM |
| 10μMPrimerSE1-M1F | 0.4μL | 400nM |
| 2xPARMSMasterMix | 5μL | 1x |
| 超纯水 | 补至10μL |
PCR扩增在ABI 7500荧光定量PCR系统中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，32个循环。PCR反应完成后进行荧光数据读取，若SE1-M1的序列为TT，判定测试的水稻样品为SE1功能型，纯合的光敏感SE1基因型；若SE1-M1的序列为TT缺失，判定测试的水稻样品为纯合的光钝感SE1基因型；若SE1-M1的多态位点同时检测到TT/--，判断待测水稻为杂合的SE1基因型。
4)自然群体验证
根据上述检测方法，用标记SE1-M1对含有SE1基因的94个水稻品种进行PARMS初筛反应验证，结果如表3所示，分型图如图3所示。
表3
由表3可以看出，携带SE1基因品种在SE1-M1测试位点检测出FAM信号，如辽星1号和越光；不携带SE1基因的品种在SE1-M1测试位点检测出HEX信号，如中科发6号和稻花香；空白对照全部为阴性对照。SE1基因是东北稻区中影响抽穗期的主效基因，后续可以通过SE1基因定向改良水稻光周期敏感性从而改变水稻的生育期，SE1-M1可以用于水稻SE1基因分型的高效检测。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种水稻感光基因SE1的PARMS分子标记，其特征在于：所述PRAMS分子标记为SE1-M1，所述SE1-M1的多态性位点位于水稻6号染色体的SE1基因第9338007-9338008位碱基插入，插入的碱基为TT。
2.一种用于检测权利要求1所述的水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记的引物组，其特征在于：所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Primer Seq SE1-M1Rg和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Primer SeqSE1-M1Ra；所述通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Primer SE1-M1F。
3.根据权利要求2所述的用于检测水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记的引物组，其特征在于：所述Primer SeqPizt-M1Rg的5’端连接FAM或HEX荧光序列，Primer SeqAllele Y的5’端连接HEX或FAM荧光序列。
4.一种如权利要求1所述的水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记在鉴定水稻SE1基因型中的应用。
5.一种如权利要求2或3所述的用于检测水稻感光基因因SE1的PRAMS分子标记的引物组在鉴定水稻SE1基因型中的应用。
6.根据权利要求5所述的用于检测水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记的引物组在鉴定水稻SE1基因型中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用用于检测水稻感光基因SE1的PRAMS分子标记的引物组，用PARMS技术对SE1-M1分子标记进行检测；若SE1-M1的序列为TT，判定测试的水稻样品为SE1功能型，纯合的光敏感SE1基因型；若SE1-M1的序列为TT缺失，判定测试的水稻样品为纯合的光钝感SE1基因型；若SE1-M1的多态位点同时检测到TT/--，判断待测水稻为杂合的SE1基因型。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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