CN116121445A - 一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的kasp分子标记及应用 - Google Patents

一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的kasp分子标记及应用 Download PDF

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CN116121445A CN202310279501.7A CN202310279501A CN116121445A CN 116121445 A CN116121445 A CN 116121445A CN 202310279501 A CN202310279501 A CN 202310279501A CN 116121445 A CN116121445 A CN 116121445A
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徐俊杰
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王培楠
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Abstract

本发明公开了一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的KASP分子标记及应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的KASP分子标记及应用。包括检测待测小麦基因组中SNP位点的多态性或基因型，根据基因型鉴定或辅助鉴定小麦粒重和粒宽，此SNP为小麦4A染色体上的一个位点，其核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1的第143位核苷酸。本发明可用于预测小麦粒重和粒宽，进行小麦育种。可将检测所述SNP位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与小麦粒重和粒宽相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定小麦高粒重、粒宽产品。

Description

一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的KASP分子标记及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的KASP分子标记及应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上种植范围最广泛的作物，为人类提供约19％的能量。然而，由于自然环境和人类活动的影响，全球气候变化加剧，灾害气候频发，对小麦生产带来了严峻的挑战。因此，提高多环境下小麦产量对于保障全球粮食和营养安全具有十分重要的战略意义。
小麦籽粒的重量直接决定了小麦产量的高低，而小麦粒重主要由粒长、粒宽、粒厚等因素决定。因此，挖掘小麦粒重、粒长和粒宽相关基因位点，并开发与其紧密连锁的高通量分子标记对于快速挖掘高产小麦新种质资源，培育高产小麦新品种具有重要意义。
分子标记辅助选择是基于作物的基因型，直接进行选择的技术，具有不受外界环境因素干扰的优点，在育种实践中被广泛地使用。传统使用的分子标记主要有RFLP、AFLP、DArT和SSR等，具有检测周期长、检测过程繁琐和检测成本过高等缺点，不利于进行大规模的种质材料筛选。KASP技术通过在引物末端加入不同的荧光集团，基于PCR终端荧光信号的读取判断，达到对不同等位基因进行鉴定的目的，具有检测过程高效，检测成本低廉，检测方式方便的优点，可以极大地加快分子标记辅助选择的进程，在作物遗传改良与定向分子设计育种中有着广阔的应用前景。因此，开发用于鉴定小麦多环境下增加粒重和粒宽的KASP标记，将为培育高产、稳产和抗逆小麦品种提供有效的检测手段。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何高通量鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽。
为了解决以上技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的方法，包括检测待测小麦基因组中SNP的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽，所述SNP为小麦4A染色体上的一个位点，其核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1的第143位核苷酸。
所述基因型为CC或TT，所述CC是所述SNP的核苷酸为C的纯合型，所述TT是所述SNP的核苷酸为T的纯合型。
以小麦品种中国春基因组(IWGSC_RefSeq_v1.0，http://202.194.139.32/jbrowse-1.12.3-release/)序列为参考基因组，所述SNP为小麦4A染色体633,308,367bp(芯片位点AX-109375057)(具体为序列表中序列1第143位)。
作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的方法可包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物组合物进行KASP标记检测；所述引物组合物由引物A、引物B和引物C组成；
所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子；
所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子；
所述引物C为核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测小麦的所述SNP的基因型；
(3)根据基因型结果进行鉴定待测小麦的粒重和粒宽：所述SNP的基因型为CC的待测小麦的粒重和/或粒宽优于所述SNP的基因型为TT的待测小麦。
上述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了检测小麦基因组中KASP的多态性或基因型的物质在如下任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽；
(2)小麦育种；
(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的产品；
(4)制备小麦育种的产品。
本发明还提供了小麦育种的方法。
本发明所提供的小麦育种的方法，包括检测小麦基因组中所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种，所述CC是所述SNP为C的纯合型。
作为一种实施方法，小麦育种的方法可包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述引物组进行PCR扩增；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测小麦所述SNP的基因型；
(3)选择CC基因型的小麦种质进行小麦粒宽粒重优势小麦育种。
上述方法中，引物溶解与配制方法可为：先将3条引物分别用ddH2O稀释成100μM，再按如下配制引物工作液：引物A12μL、引物B12μL、引物C 30μL、ddH2O 46μL，作为KASP标记的引物工作液，-20℃保存备用。
上述方法中，PCR的反应体系可为：模板DNA 1.5μL，引物工作液0.0417μL，2×KASPMaster Mix(LGC公司，Lot No.13426773)0.75μL，用无菌超纯水补充反应体系至3μL。
上述方法中，PCR扩增可在高通量PCR仪上进行。
上述方法中，PCR的反应程序可为：
第一步：94℃预变性15min；
第二步：94℃变性20s、复性20s(第一次的复性温度为61℃，每个循环降温0.6℃)共10个循环；94℃变性20s、55℃复性1min共26个循环；
第三步：72℃延伸3min、4℃保存。
上述方法中，确定待测小麦所述SNP的基因型的方法可为：PCR反应完成后，利用荧光信号阅读仪(Omega)和荧光检测系统(Araya)将荧光信号转变为可分析的数值对反应产物进行荧光数据读取(数据读取温度为40℃以下)。荧光扫描结果利用R软件包进行图形化展示，T碱基类型带有FAM荧光，分布于x轴附近；C碱基类型带有HEX荧光，分布于y轴附近；无检出信号的样本分布于原点附近。
本发明还提供了用于检测小麦基因组中SNP的多态性或基因型的产品。
本发明所提供的用于检测小麦基因组中所述SNP的多态性或基因型的产品，含有上述检测小麦基因组中SNP的多态性或基因型的物质，所述产品为任一种：
C1)检测小麦粒重和/或粒宽相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
C2)鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的产品；
C3)用于小麦育种的产品。
上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述SNP位点的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
可选地，所述物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述物质为扩增包括前文所述SNP在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
D2)所述物质为含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；
D3)所述物质为含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
可选地，所述扩增可为PCR扩增。所述引物组合物由所述引物A、所述引物B和所述引物C组成。
D3)所述试剂盒还可包括KASP Master Mix。
上述应用、方法和产品中，所述引物组合物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。如所述引物组合物可为由核苷酸序列是序列表中序列2的第22-42位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中序列3的第22-42位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA组成的引物组合物，所述引物组合物也可为由序列表中序列2所示的单链DNA、序列表中序列3所示的单链DNA和由序列表中序列4所示的单链DNA的引物组。序列表中序列2由42个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为FAM序列(作为标记物)，第22-42位核苷酸为特异序列；序列表中序列3由42个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为HEX序列(作为标记物)，第22-42位核苷酸为特异序列。
本发明还提供了DNA分子，核苷酸序列如序列表的序列1所示。
上述的DNA分子的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用具体为在如下任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽；
(2)小麦育种；
(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的产品；
(4)制备小麦育种的产品。
可选地，在上述应用中，该DNA分子作为检测靶标。
可将检测所述SNP的多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与小麦粒宽和产量相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定小麦粒重和/或粒宽的小麦品种的产品。
本文中，所述育种的目的可包括培育高产小麦。所述小麦可为纯系或自交系。
本发明提供了一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的KASP标记，利用KASP标记鉴定或辅助鉴定小麦粒重和粒长。本发明建立的方法可用于预测小麦粒重和粒宽，可以对待筛选的小麦进行早期筛选，用于小麦分子标记辅助育种，在发掘粒宽增加、粒重产量提高的小麦种质资源和选育粒宽增加、产量提高的小麦品种的研究中具有重要的应用价值。本发明为多环境下快速、准确筛选小麦粒重和粒宽种质资源提供了高效的检测手段。
附图说明
图1为普通小麦粒重和粒宽位点AX-109375057不同等位类型在4A染色体的KASP引物位置。字体加粗并标识下划线核苷酸代表4A染色体物理位置633,308,367bp(芯片位点AX-109375057)处的SNP，KASP标记上、下游引物位置以方框标识。图中序列为小麦4A染色体物理位置633,308,225-633,308,454bp的序列。
图2为不同小麦种质材料KASP_AX-109375057标记检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
以下实施例中的小麦材料为公知品种，全部记载于下列参考文献中：“Jie Zhao,Lijing Sun,Huimin Gao,Mengyun Hu,Liming Mu,Xiaohu Cheng,Jianbing Wang,YunZhao,Qianying Li,Peinan Wang,Hui Li1,Yingjun Zhang.Genome-wide associationstudy of yield-related traits in common wheat(Triticum aestivum L.)undernormal and drought treatment conditions.2023,13:1098560”。普通小麦种质均为河北省农林科学院粮油作物研究所小麦研究中心保存。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、应用KASP标记KASP_AX-109375057检测调控小麦粒重和粒宽的不同等位类型
1.QTL定位和芯片位点AX-109375057的发现
利用中玉金标记生物技术有限公司联合多家科研单位研发的小麦15K精选芯片对429份普通小麦品种进行基因型分型，并结合3年小麦品种粒重和粒宽表型数据，采用全基因组关联分析方法进行小麦粒重和粒宽QTL定位，在小麦4A染色体物理位置633,308,367bp处的SNP位点AX-109375057定位到控制小麦粒重和粒宽的QTL，因此将其转化为KASP分子标记，用于分子标记辅助选择育种。SNP位点AX-109375057位于序列1的第143位，其核苷酸种类为C或T。序列表中序列1的y表示c或t。
2.KASP分子标记KASP_AX-109375057的引物组的获得
设计基于KASP技术检测SNP位点AX-109375057的引物组(即KASP标记KASP_AX-109375057)，简称KASP引物组。KASP引物组由两条上游引物(引物A和引物B)和一条下游引物(引物C)组成，具体序列见表1。
表1、用于鉴定普通小麦芯片标记AX-109375057处等位变异的KASP标记引物序列
Figure BDA0004137638890000061
引物A为5’端带有FAM荧光标签序列(斜体部分的碱基)的引物，和引物C扩增SNP位点AX-109375057为T的片段，用荧光信号阅读仪可读取到FAM基团的荧光信号；
引物B为5’端带有HEX荧光标签序列(斜体部分的碱基)的引物，和引物C扩增SNP位点AX-109375057为C的片段，用荧光信号阅读仪可读取到HEX基团的荧光信号。
实施例2、应用KASP标记检测SNP位点AX-109375057基因型方法的建立
利用KASP标记KASP_AX-109375057检测调控小麦粒重和粒宽在4A染色体物理位置633,308,367bp(芯片标记AX-109375057)处的不同等位类型。具体分为以下步骤：
1、PCR扩增体系及程序
利用CTAB法提取普通小麦叶片基因组DNA，分别采用1％琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪对提取的DNA进行质量检测和浓度检测，所提DNA要求无明显杂质、条带清晰、无降解。随后将DNA稀释到28.3ng/μL，将其作为模板，进行PCR扩增。
引物序列见表1。KASP标记引物工作液制备：先将3条引物分别用ddH2O稀释成100μM，再按如下配方配制引物工作液：引物A12μL、引物B12μL、引物C 30μL、ddH2O46μL。-20℃保存备用。
PCR扩增体系为：模板DNA 1.5μL，引物工作液0.0417μL，2×KASP Master Mix(LGC公司，Lot No.13426773)0.75μL，用无菌超纯水补充反应体系至3μL。
PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、复性20s(第一次的复性温度为61℃，每个循环降温0.6℃)共10个循环；94℃变性20s、55℃复性1min共26个循环；72℃延伸3min、4℃保存。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(CK)，每个板设置1个对照。
2.基因分型
PCR反应完成后利用微型板荧光信号阅读仪(Omega,BMG LABTECH,德国)和荧光检测系统(Araya)将荧光信号转变为可分析的数值对反应产物进行荧光数据读取。数据结果利用R软件包ggplot2进行图形化展示，T碱基类型带有FAM荧光，分布于x轴附近；C碱基类型带有HEX荧光，分布于y轴附近；无检出信号的样本分布于原点附近(图2)。
FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm。HEX激发波长为535nm，发射波长为556nm。系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。
结果如图2所示，若显示只有FAM基团的荧光信号，则所述待测小麦的AX-109375057的基因型为TT(即小麦基因组中SNP位点AX-109375057为T的纯合型)；若显示只有HEX基团的荧光信号，则所述待测小麦的AX-109375057基因型为CC(即小麦基因组中SNP位点AX-109375057为C的纯合型)。
实施例3、KASP标记KASP_AX-109375057辅助鉴定小麦粒重和粒宽在育种中的应用
1.429份小麦种质粒重和粒宽表型分型
429份种质材料于2019-2020年、2020-2021年和2021-2022年分别播种于正常水地(足墒播种，拔节期和灌浆期各浇水一次)和旱地(足墒播种，全生育期不浇水)，采用完全随机区组设计，行长3米，行间距0.22米，每行播种84粒。种子成熟收获后，利用万深SC-G自动种子考种及千粒重分析仪(万深检测科技)测量种子的粒宽和粒重，不同年份水地小麦种质等位类型和千粒重、粒宽见表2。不同年份旱地小麦种质等位类型和千粒重、粒宽见表3。采用双尾t-test检验方法统计分析各组重复的籽粒宽度和粒重,P＜0.05表示差异达到显著水平；P＜0.01表示差异达到极显著水平。
2.用KASP标记鉴定小麦SNP位点AX-109375057的基因型
按实施例2所述的方法，提取各实验材料基因组DNA，并采用上述分子标记检测受试小麦的基因型。结果见表2和图2。图2中，CC为小麦材料的SNP位点AX-109375057的基因型为CC，TT为小麦材料的SNP位点AX-109375057基因型为TT的小麦，CK为反应体系中不添加模板DNA的空白对照。
表2、小麦种质KASP_AX-109375057标记检测结果和水地千粒重和粒宽
Figure BDA0004137638890000081
Figure BDA0004137638890000091
Figure BDA0004137638890000101
Figure BDA0004137638890000111
Figure BDA0004137638890000121
Figure BDA0004137638890000131
Figure BDA0004137638890000141
Figure BDA0004137638890000151
Figure BDA0004137638890000161
Figure BDA0004137638890000171
Figure BDA0004137638890000181
注：NA代表缺失。
表3、小麦种质KASP_AX-109375057标记检测结果和旱地千粒重和粒宽
Figure BDA0004137638890000182
Figure BDA0004137638890000191
Figure BDA0004137638890000201
Figure BDA0004137638890000211
Figure BDA0004137638890000221
Figure BDA0004137638890000231
Figure BDA0004137638890000241
Figure BDA0004137638890000251
Figure BDA0004137638890000261
Figure BDA0004137638890000271
Figure BDA0004137638890000281
注：NA代表缺失。
经KASP标记检测，携带AX-109375057等位类型TT(即SNP位点AX-109375057基因型为TT)的小麦种质在不同年份的两种环境中粒重和粒宽均值都低于携带AX-109375057等位类型CC(即SNP位点AX-109375057基因型为CC)的小麦种质粒重和粒宽均值，两者具有显著或极显著差异(P＜0.05或P＜0.01)(表4和表5)。
在选育高粒重和粒宽的小麦育种中，最好选择SNP位点AX-109375057基因型为CC的小麦作为亲本进行育种。
表4、普通小麦AX-109375057处等位基因类型与千粒重关系的统计分析结果
Figure BDA0004137638890000282
表5、普通小麦AX-109375057处等位基因类型与粒宽关系的统计分析结果
Figure BDA0004137638890000283
Figure BDA0004137638890000291
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的方法，其特征在于：包括检测待测小麦基因组中SNP的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽，所述SNP为小麦4A染色体上的一个位点，其核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1的第143位核苷酸。
2.检测小麦基因组中SNP位点的多态性或基因型的物质在如下任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽；
(2)小麦育种；
(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的产品；
(4)制备小麦育种的产品；
所述SNP位点为小麦4A染色体上的一个位点，其核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1的第143位核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法或权利要求2所述的应用，其特征在于：所述SNP的基因型为CC或TT，所述CC是所述SNP为C的纯合型，所述TT是所述SNP为T的纯合型；所述SNP的基因型为CC的待测小麦的粒重和/或粒宽高于所述SNP的基因型为TT的待测小麦。
4.小麦育种的方法，其特征在于：所述方法包括检测小麦基因组中权利要求1中所述SNP的基因型，选择所述SNP的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种，所述CC是所述SNP为C的纯合型。
5.权利要求1或4所述的方法在小麦育种中的应用。
6.产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1中所述物质，所述产品为任一种：
C1)检测小麦粒重和/或粒宽相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
C2)鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的产品；
C3)用于小麦育种的产品。
7.根据权利要求2所述的应用或权利要求6所述的产品，其特征在于：所述物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述物质为扩增包括权利要求1中所述SNP在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
D2)所述物质为含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；
D3)所述物质为含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用或产品，其特征在于：所述引物组合物由引物A、引物B和引物C组成；
所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子；
所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子；
所述引物C核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子。
9.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。
10.权利要求9所述的DNA分子在如下任一中的应用，
(1)鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽；
(2)小麦育种；
(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦粒重和/或粒宽的产品；
(4)制备小麦育种的产品。
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