CN115820914A - 高粱SbDW3基因的SNP分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高粱SbDW3基因的SNP分子标记及应用。本发明涉及分子生物技术领域中一种与高粱耐盐碱性状地上部分干重相关的分子标记及其应用，具体涉及高粱SbDW3基因的SNP分子标记及其应用。通过检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型或检测高粱单倍体发现，含有单倍型SbDW3‑Hap2的高粱品种地上部分干重高于其他单倍型。81.11％的单倍型SbDW3‑Hap2(TT)所对应的纯合基因型高粱中地上部分干重均高于0.12kg。表明SbDW3‑Hap2单倍型分子标记可用于高粱分子标记辅助选择育种，显著提高高粱高地上部分干重品种的选择效率。

Description

高粱SbDW3基因的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域中一种与高粱地上部分干重相关的分子标记及其应用，具体涉及高粱SbDW3基因的SNP分子标记及其应用。

背景技术

分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是分子生物学和常规育种相结合的新型育种模式，其中KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测SNP位点和InDel位点。与SSR、RFLP、InDel等分子标记相比，KASP标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，是解决植物品种选育难这一问题的有效途径。其中，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加育种准确度与提高育种效率的有效手段。

高粱(Sorghum bicolor)又叫蜀黍，为禾本科高粱属一年生草本植物，是世界五大谷物作物之一，属于C4作物，广泛种植于干旱、半干旱热带、亚热带和温带地区。全球范围内，高粱被用于动物饲料、饲料以及糖浆和生物乙醇等高价值产品。由于具有耐旱、耐涝和耐盐碱等特性，它在限制其他谷物种植的环境条件下成为高产作物，同时也是食物、饲料和酿造原料的重要来源，有望成为一种有前途的生物能源作物。研究调控地上部分干重的基因，获得与地上部分干重基因紧密连锁的KASP分子标记，对高粱地上部分干重主效基因位点进行定位和检测，有效调控高粱的地上部分干重类型，选育预期地上部分干重类型的高粱新品种，对提高高粱产量具有极其重大的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定高粱的地上部分干重性状和/或如何进行高粱育种。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测高粱地上部分干重分子标记的物质在检测或辅助检测高粱地上部分干重性状中的应用，所述应用为下述P1或P2：

所述P1为检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重中的应用。所述SNP1是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第1020位核苷酸，其为T或A，SNP1位点由T突变为A，致使第26位氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为组氨酸(H)；所述SNP2是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第1021位核苷酸，其为T或A，SNP2位点由T突变为A，致使第26位氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为组氨酸(H)。

所述P2为检测单倍型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重中的应用，所述单倍型是高粱一条染色体上所述SNP1和所述SNP2这两个SNP的多态性组合。

上述SNP1、SNP2三个单核苷酸多态性位点位于高粱基因组(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)第1号染色体上的SbDW3基因中，所述SbDW3基因位于高粱第1号染色体第11339409-11340551位，与高粱地上部分干重相关，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示DNA分子。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种应用，所述应用为Q1和Q2：

所述Q1为检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重产品中的应用；所述SNP1是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQID No.1的第1020位核苷酸，其为T或A；所述SNP2是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQID No.1的第1021位核苷酸，其为T或A。

所述Q2为检测单倍型的物质在制备鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重产品中的应用；所述单倍型是高粱一条染色体上所述SNP1和SNP2这两个SNP的多态性组合。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述E1和E2的应用：

所述E1为检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在高粱育种或制备高粱育种产品中的应用；所述SNP1是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第1020位核苷酸，其为T或A；所述SNP2是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第1021位核苷酸，其为T或A。

所述E2为检测单倍型的物质在高粱育种或制备高粱育种产品中的应用；所述单倍型是高粱一条染色体上所述SNP1和SNP2这两个SNP的多态性组合。

所述高粱地上部分干重可为高粱成熟期地上部分干重。所述高粱可为高粱自交系。

所述SNP1的基因型(即等位基因)可为基因型TT、基因型AA或基因型TA，基因型TT是SNP1为T的纯合型；基因型AA是SNP1为A的纯合型；基因型TA是SNP1为T和A的杂合型；所述SNP2的基因型(即等位基因)可为基因型TT、基因型AA或基因型TA，基因型TT是SNP2为T的纯合型；基因型AA是SNP2为A的纯合型；基因型TA是SNP2为T和A的杂合型。所述单倍型具体可为单倍型SbDW3-Hap1(AT)(简称SbDW3-Hap1)、单倍型SbDW3-Hap2(TT)(简称SbDW3-Hap2)、单倍型SbDW3-Hap3(AA)(简称SbDW3-Hap3)；所述单倍型SbDW3-Hap1(AT)为所述SNP1为A和所述SNP2为T；所述单倍型SbDW3-Hap2(TT)为所述SNP1为T和所述SNP2为T；所述单倍型SbDW3-Hap3(AA)为所述SNP1为A和所述SNP2为A。

SNP1和SNP2这两个SNP的基因型可为基因型AATT、基因型TTTT、基因型AAAA。基因型AATT是SNP1的基因型为AA且SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型；基因型TTTT是SNP1的基因型为TT且SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型；基因型AAAA是SNP1的基因型为AA且SNP2的基因型为AA的两个SNP组合基因型。SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型TTTT的高粱(如高粱自交系)的地上部分干重平均值极显著高于或候选高于基因型AATT的高粱和基因型AAAA的高粱，SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型AAAA的高粱和基因型AATT的高粱(如高粱自交系)的地上部分干重无显著差异。

单倍型SbDW3-Hap2对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)地上部分干重极显著高于或候选高于单倍型SbDW3-Hap1和单倍型SbDW3-Hap3对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)纯合基因型高粱(如高粱自交系)；单倍型SbDW3-Hap3和单倍型SbDW3-Hap1对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)地上部分干重无显著差异。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述检测高粱基因组SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质的产品或含有上述检测单倍型的物质的产品，且可为下述G1)-G3)中的任一种：

G1)检测高粱地上部分干重相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

G2)鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的产品；

G3)用于高粱育种的产品。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，所述方法为方法A或方法B。

所述方法A为鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，包括检测待测高粱中所述SNP1和SNP2这两个SNP的基因型，根据所述待测高粱的所述两个SNP的基因型鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重：所述两个SNP的基因型为基因型TTTT的高粱(如高粱自交系)的地上部分干重平均值高于或候选高于基因型AATT和基因型AAAA的高粱，所述基因型为基因型AAAA的高粱和基因型AATT的高粱(如高粱自交系)的地上部分干重无显著差异。

所述基因型TTTT是所述SNP1的基因型为TT且所述SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型；所述基因型AATT是所述SNP1的基因型为AA且所述SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型；所述基因型AAAA是所述SNP1的基因型为AA且所述SNP2的基因型为AA的两个SNP组合基因型。

所述方法B为鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，包括检测待测高粱中上述所述单倍型，根据所述待测高粱的单倍型鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重：单倍型SbDW3-Hap2对应的纯合基因型高粱地上部分干重极显著高于或候选高于单倍型SbDW3-Hap1和SbDW3-Hap3对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)；单倍型SbDW3-Hap3和单倍型SbDW3-Hap1对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)地上部分干重无显著差异。所述单倍型SbDW3-Hap1为所述SNP1为A且所述SNP2为T的单倍型，所述单倍型SbDW3-Hap2为所述SNP1为T且所述SNP2为T的单倍型，所述单倍型SbDW3-Hap3为所述SNP1为A且所述SNP2为A的单倍型。

上述鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法在高粱育种中的应用也属于本发明的保护范围。

上文所述待测高粱可为高粱自交系，上文所述应用中，选择高粱的自交系作为亲本进行育种。

本发明还提供了一种高粱育种的方法，包括：检测高粱基因组中SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型，或检测高粱基因组中上文所述的单倍型的类型，选择基因型组合为基因型TTTT的高粱自交系为亲本进行育种；或选择单倍型SbDW3-Hap2(TT)的高粱自交系为亲本进行育种。

上文所述高粱育种为培育地上部分干重较高的高粱品种。

上文所述高粱地上部分干重具体可为高粱成熟期的地上部分干重。

上述应用、方法中，所述检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，可为通过下述至少一种方法确定上述高粱基因组中SNP1和SNP2位点的核苷酸种类：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

上述应用或方法中，所述检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，可为如下D1)、D2)或D3):

D1)含有扩增包括所述SNP1和SNP2位点在内的高粱基因组DNA片段的PCR引物；

D2)含有D1)所述PCR引物的PCR试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

上述PCR引物为F1-1、F1-2、F2-1、F2-2：

F1-1、由序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物组；

F1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-43位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第22-43位的单链DNA和序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物组；

F2-1、由序列表中SEQ ID No.5所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物组；

F2-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的第22-42位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的第22-42的单链DNA和序列表中SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物组。

上述应用和方法中，所述PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PARMS master mix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物、PARMS master mix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测高粱基因组中SNP1和SNP2位点的多态性或基因型的物质。

上述应用、方法中，所述地上部分干重高的高粱品种中的地上部分干重是相对于杂交亲本高粱而言。如果两个杂交亲本高粱的地上部分干重相同，所述地上部分干重高的高粱品种的地上部分干重可等于或高于杂交亲本高粱的地上部分干重；如果两个杂交亲本高粱的地上部分干重不相同，所述地上部分干重高的高粱品种的地上部分干重可等于或高于两个杂交亲本高粱中地上部分干重较高的杂交亲本高粱。

本发明还提供了DNA分子，核苷酸序列如序列表的序列1所示。

上述的DNA分子的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用具体为在如下任一中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重；

(2)筛选或选育高地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种；

(3)筛选或选育感地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种；

(4)高粱育种；

(5)制备鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的产品；

(6)制备筛选或选育高地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种的产品；

(7)制备筛选或选育低地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种的产品；

(8)制备高粱育种的产品。

可选地，在上述应用中，该DNA分子作为检测靶标。

本发明的实施例中，通过对高粱自交系关联群体中SbDW3基因的遗传变异分析，发现2个SNP，SNP1和SNP2分别位于高粱基因组中与地上部分干重相关的基因SbDW3基因中，即序列表SEQ ID No.1的第1020位和第1021位，这2个SNP组合共存在三种单倍型：单倍型SbDW3-Hap1(AT)、单倍型SbDW3-Hap2(TT)和单倍型SbDW3-Hap3(AA)。通过实验证明，单倍型SbDW3-Hap2所对应的纯合基因型高粱的地上部分干重极显著高于其他单倍型所对应的纯合基因型高粱，单倍型SbDW3-Hap3和单倍型SbDW3-Hap1对应的纯合基因型高粱地上部分干重无显著差异。81.11％的单倍型SbDW3-Hap2(TT)所对应的纯合基因型高粱中地上部分干重均高于0.12kg，54.78％的SbDW3-Hap1(AT)单倍型所对应的纯合基因型高粱品种地上部分干重均小于等于0.12kg。单倍型SbDW3-Hap2(TT)分子标记可用于高粱地上部分干重的早期预测和筛选，也可用于高粱分子标记辅助选择育种和地上部分干重高的高粱品种的选育。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的226份高粱自交系关联群体：由中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室景海春实验室提供，该关联群体的详细信息见已发表的文章:XiaoyuanWu,et al..Genomic footprints of sorghum domestication and breeding selectionfor multiple end uses.Molecular Plant,2022,VOLUME 15,ISSUE3,P537-551(DOI:https://doi.org/10.1016/j.molp.2022.01.002)，品种详细信息如表1所示。

实施例1、与高粱地上部分干重相关单倍型组合及相关单倍型分子标记的发现

一、供试材料的地上部分干重统计

1、供试材料的种植

2021年在中国山东省东营市农高新区的轻度盐碱地土壤中种植226份高粱自交系关联群体种质资源，采用随机完全区组设计，试验小区长3m、宽2m，种植5行，每行10株，株距0.3m，行距0.5m，正常灌溉。

2、供试材料的地上部分干重统计

待226份高粱自交系关联群体完全成熟后，每份材料选取3株，统计每株主茎的地上部分干重，三次重复的平均值作为该样品地上部分干重的最终结果，如表1中地上部分干重所示。

二、基因SbDW3相关的单倍型组合及其单倍型分子标记的发现

1、226份高粱自交系关联群体的全基因组测序

226份高粱自交系关联群体的全基因组测序数据由中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室景海春实验室提供。

2、基因SbDW3相关的单倍型组合及其相关单倍型分子标记的发现

根据高粱自交系地上部分干重和其基因型数据的全基因组关联分析结果，筛选出一个与高粱耐盐碱性状地上部分干重相关基因SbDW3的单倍型组合。该单倍型组合包括2个SNP位点，分别为SNP1和SNP2，其中SNP1对应于高粱自交系BTx623第1号染色体上第11340378位(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为T或A，对应序列表中SEQ IDNo.1的第1020位；SNP2对应于高粱自交系BTx623第1号染色体上第11340379位，其核苷酸为T或A，对应序列表中SEQ ID No.1的第1021位。序列表中SEQ ID No.1的w表示t或a。

各个高粱品种的基因型检测结果如表1所示。结果显示SNP1位点有2种基因型(简称SNP1基因型)，即TT或AA，基因型TT是SNP1为T的纯合型，基因型AA是SNP1为G的纯合型；SNP2位点有2种基因型(简称SNP2基因型)，即TT或AA，基因型TT是SNP2为T的纯合型,基因型AA是SNP2为A的纯合型。

在供试群体中，这2个SNP组合即单倍型组合共存在3种单倍型：单倍型SbDW3-Hap1(AT)(简称SbDW3-Hap1)、单倍型SbDW3-Hap2(TT)(简称SbDW3-Hap2)和单倍型SbDW3-Hap3(AA)(简称SbDW3-Hap3)。单倍型SbDW3-Hap1(AT)是SNP1为A且SNP2为T的组合，单倍型SbDW3-Hap2(TT)是SNP1为T且SNP2为T的组合，单倍型SbDW3-Hap3(AA)是SNP1为A且SNP2为A的组合。

单倍型SbDW3-Hap2(TT)所对应的纯合基因型高粱的地上部分干重高于其他单倍型所对应的纯合基因型高粱，单倍型SbDW3-Hap3和单倍型SbDW3-Hap1对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)地上部分干重无显著差异。

单倍型SbDW3-Hap1(AT)对应的纯合基因型高粱的基因型是AATT，基因型AATT是SNP1基因型为AA且SNP2基因型为TT的两个SNP组合基因型；单倍型SbDW3-Hap2(TT)对应的纯合基因型高粱的基因型是TTTT，基因型TTTT是SNP1基因型为TT且SNP2基因型为TT的两个SNP组合基因型；单倍型SbDW3-Hap3(AA)对应的纯合基因型高粱的基因型是AAAA，基因型AAAA是SNP1基因型为AA且SNP2基因型为AA的两个SNP组合基因型。

因此，选择将上述得到的与基因SbDW3相关的单倍型组合用于鉴定或辅助鉴定不同品系高粱的地上部分干重；将单倍型组合中的SbDW3-Hap2(TT)单倍型作为鉴定或辅助鉴定不同品系高粱的地上部分干重的分子标记，含有SbDW3-Hap2(TT)单倍型分子标记的高粱品系的地上部分干重可能高于0.12kg。

三、基因SbDW3相关的单倍型组合及SbDW3-Hap2(TT)单倍型分子标记专用引物的设计及其方法的建立

1、单倍型组合相关SNP位点的基因组特异引物设计

设计SNP1的特异引物序列(序列表中的SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4)，SNP2的特异引物序列(序列表中的SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7)，均由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司合成。

鉴定SNP1位点多态性的引物组F1如下：

特异性引物F1-A(SEQ ID No.2)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAACAACGAGACCCTCGAGCAT-3’

特异性引物F1-B(SEQ ID No.3)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAACAACGAGACCCTCGAGCAA-3’

通用引物F1-C(SEQ ID No.4)：5’-CCAGCGAGAACGAAACGAAACGAAA-3’

鉴定SNP2位点多态性的引物组F2如下：

特异性引物F2-A(SEQ ID No.5)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAACAACGAGACCCTCGAGCT-3’

特异性引物F2-B(SEQ ID No.6)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAACAACGAGACCCTCGAGCA-3’

通用引物F2-C(SEQ ID No.7)：5’-CCAGCGAGAACGAAACGAAACGAAA-3’

上述鉴定SNP1位点多态性的引物组F1是根据序列SEQ ID No.1设计，鉴定SNP2位点多态性的引物组F2是根据序列SEQ ID No.1设计。

上述引物F1-A和F2-A中下划线序列为FAM序列；F1-B和F2-B中下划线序列为HEX序列。

上述序列SEQ ID No.2与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ IDNo.1中SNP1位点为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；

上述序列SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ IDNo.1中SNP1位点为A的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。

上述序列SEQ ID No.5与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ IDNo.1中SNP2位点为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；

上述序列SEQ ID No.6与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列SEQ ID No.1中SNP2位点为A的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。

2、检测方法的建立

2.1DNA提取

提取供试品种高粱基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板用于PCR扩增。

2.2PCR扩增和荧光信号检测

使用步骤1中SNP1引物组F1和SNP2引物组F2分别进行PCR扩增2.1中得到的模板，检测SNP1位点和SNP2位点的多态性(核苷酸种类)和基因型；利用Douglas-Araya高通量流水线式荧光信号扫描仪对F1和F2两组引物组的PCR产物进行荧光数据读取，用Douglas专用软件-Kraken进行荧光信号处理。

配制引物混液：先将引物F1-A、引物F1-B、引物F1-C、引物F2-A、引物F2-B和引物F2-C这6条引物分别用ddH₂O稀释成100mmol·L^-1，分别得到引物F1-A溶液、引物F1-B溶液、引物F1-C溶液、引物F2-A溶液、引物F2-B溶液和引物F2-C溶液。取引物F1-A溶液60μL、引物F1-B溶液60μL、引物F1-C溶液150μL，加入10mM Tris-HCL 230μL，得到引物混液F1。取引物F2-A溶液60μL、引物F2-B溶液60μL、引物F2-C溶液150μL，加入10mM Tris-HCL 230μL，得到引物混液F2。

2μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.02μL，LGC公司1×KASP Mix(Low Rox)0.6μL，其余为ddH₂O。按照Douglas-Nexar及Soellex水浴系统的操作手册，编辑程序并运行，保存数据。

若F1引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为TT(即高粱基因组中SNP1位点为T的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为AA(即高粱基因组中SNP1位点为A的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为TA(即高粱基因组中SNP1位点为T和A的杂合型)。

若F2引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为TT(即高粱基因组中SNP2位点为T的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为AA(即高粱基因组中SNP2位点为A的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为AT(即高粱基因组中SNP2位点为A和T的杂合型)。

确定基因SbDW3相关的单倍型组合的单倍型和基因型从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的的地上部分干重：待测高粱SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型TTTT的高粱(如高粱自交系)的的地上部分干重高于或候选高于SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型AATT或基因型AAAA的高粱(如高粱自交系)。单倍型SbDW3-Hap2(TT)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)的地上部分干重高于或候选高于单倍型SbDW3-Hap1(AT)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)和单倍型SbPDW3-Hap3(AA)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)。

实施例2、高粱地上部分干重显著关联单倍型组合和SbDW3-Hap2(TT)单倍型分子标记的应用

待测高粱：226份高粱自交系关联群体

一、高粱的地上部分干重测定

方法同实施例1。结果表明，在中国山东省东营市农高新区的轻度盐碱地土壤中种植226份高粱自交系，不同高粱品种的的地上部分干重存在显著差异，高粱地上部分干重范围0.045-0.3kg，其中139个高粱自交系的地上部分干重超过0.12kg，约占该关联群体的61.50％。

二、分子鉴定或辅助鉴定高粱自交系的的地上部分干重

提取待测高粱基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板。采用实施例1中的单倍型组合相关SNP位点的基因组特异引物SNP1引物组F1和SNP2引物组F2分别进行PCR扩增，得到SbDW3基因相关单倍型组合中两个SNP位点的多态性信息，从而确定待测高粱的基因SbDW3相关的单倍型组合的单倍型和基因型，从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的的地上部分干重：待测高粱SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型TTTT的高粱的的地上部分干重高于或候选高于SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型AAAA、或基因型AATT的高粱。单倍型SbDW3-Hap2(TT)对应的纯合基因型高粱的地上部分干重高于或候选高于单倍型SbDW3-Hap1(AT)对应的纯合基因型高粱和单倍型SbDW3-Hap3(AA)对应的纯合基因型高粱。

226份待测高粱中2个SNP位点基因型和高粱的地上部分干重如表1和表2所示，待测高粱的SNP1位点包含TT和AA两种基因型(SNP1基因型列所示)；SNP2位点包含TT和AA两种基因型(SNP2基因型列所示)。供试高粱基因组中2个SNP位点按基因组顺序共存在3种单倍型组合，即单倍型SbDW3-Hap1(AT)、SbDW3-Hap2(TT)和SbDW3-Hap3(AA)。检测结果表明，226份高粱品种中，90个单倍型SbDW3-Hap2(TT)的高粱品种中，有73个单倍型SbDW3-Hap2(TT)的高粱品种地上部分干重高于0.12kg；115个单倍型SbDW3-Hap1(AT)型的高粱品种中，有63个高粱品种地上部分干重小于等于0.12kg，81.11％的单倍型SbDW3-Hap2(TT)的高粱品种中地上部分干重高于0.12kg，54.78％的单倍型SbDW3-Hap1(AT)的高粱品种中地上部分干重小于等于0.12kg。这表明利用单倍型SbDW3-Hap2(TT)选育高地上部分干重的高粱品种，淘汰单倍型SbDW3-Hap1(AT)的低地上部分干重的高粱品种，并作为单倍型分子标记用于高粱地上部分干重辅助选择是切实有效的。

表1、226份高粱自交系的地上部分干重和2个SNP位点的基因型

备注：IS:Sweet Sorghum；IG:Grain Sorghum；LG:Grain Sorghum；AL:unknown；LB:Broom Sorghum

对三种单倍型与地上部分干重进行差异显著性分析，单倍型SbDW3-Hap2对应的纯合基因型高粱地上部分干重与单倍型SbDW3-Hap1对应的纯合基因型高粱存在显著差异(P<0.0001)，单倍型SbDW3-Hap2对应的纯合基因型高粱地上部分干重与单倍型SbDW3-Hap3对应的纯合基因型高粱存在显著差异(P<0.05)。单倍型SbDW3-Hap2对应的纯合基因型高粱地上部分干重高于或候选高于单倍型SbDW3-Hap1对应的纯合基因型高粱和单倍型SbDW3-Hap3对应的纯合基因型高粱。

表2按基因SbDW3的基因型和单倍型组合纯合类型统计的226份高粱自交系的地上部分干重

基因型	单倍型类型	单倍型组合	品种数/个	干重(kg)
					AATT	SbDW3-Hap1	AT	115	0.1202±0.04155<sup>a</sup>
TTTT	SbDW3-Hap2	TT	90	0.1634±0.04714<sup>b</sup>
					AAAA	SbDW3-Hap3	AA	21	0.137±0.05895<sup>a</sup>

对单独的SNP1的基因型或SNP2的基因型与地上部分干重进行差异显著性分析，结果表明SNP1的纯合基因型(AA)高粱地上部分干重与纯合基因型(TT)高粱存在极显著差异(P<0.0001)，基因型SNP1-TT对应的高粱地上部分干重高于或候选高于SNP1-AA对应的高粱。SNP2的纯合基因型(TT)高粱地上部分干重与纯合基因型(AA)高粱存在显著差异(P<0.05)，基因型SNP2-AA对应的高粱地上部分干重高于或候选高于SNP2-TT对应的高粱。

表3基因SbDW3的2个SNP位点不同基因型对应的226份高粱自交系的地上部分干重及差异分析

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.应用，其特征在于：所述应用为P1或P2；

所述P1为检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重中的应用，所述SNP1是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ IDNo.1的第1020位核苷酸，其为T或A；所述SNP2是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第1021位核苷酸，其为T或A；

所述P2为检测单倍型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重中的应用，所述单倍型是高粱一条染色体上所述SNP1和所述SNP2这两个SNP的多态性组合。

2.应用，其特征在于：所述应用为Q1、Q2、E1或E2；

所述Q1为检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重产品中的应用；所述SNP1是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ IDNo.1的第1020位核苷酸，其为T或A；所述SNP2是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ IDNo.1的第1021位核苷酸，其为T或A；

所述Q2为检测单倍型的物质在制备鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重产品中的应用；所述单倍型是高粱一条染色体上所述SNP1和SNP2这两个SNP的多态性组合；

所述E1为检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在高粱育种或制备高粱育种产品中的应用；所述SNP1是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第1020位核苷酸，其为T或A；所述SNP2是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第1021位核苷酸，其为T或A；

所述E2为检测单倍型的物质在高粱育种或制备高粱育种产品中的应用；所述单倍型是高粱一条染色体上所述SNP1和SNP2这两个SNP的多态性组合。

3.产品，其特征在于所述产品含有权利要求1中所述检测高粱基因组SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质的产品或含有权利要求1中所述检测单倍型的物质的产品，且可为下述G1)-G3)中的任一种：

G1)检测高粱地上部分干重相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

G2)鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的产品；

G3)用于高粱育种的产品。

4.鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，所述方法为方法A或方法B：

所述方法A为鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，包括检测待测高粱中权利要求1中所述SNP1和SNP2这两个SNP的基因型，根据所述待测高粱的所述两个SNP的基因型鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重：所述两个SNP的基因型为基因型TTTT的高粱的地上部分干重高于或候选高于基因型AATT和基因型AAAA的高粱，所述SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型AAAA的高粱和基因型AATT的高粱的地上部分干重无显著差异；所述基因型TTTT是所述SNP1的基因型为TT且所述SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型；所述基因型AATT是所述SNP1的基因型为AA且所述SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型；所述基因型AAAA是所述SNP1的基因型为AA且所述SNP2的基因型为AA的两个SNP组合基因型；

所述方法B为鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，包括检测待测高粱中权利要求1中所述单倍型，根据所述待测高粱的单倍型鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重：单倍型SbDW3-Hap2对应的纯合基因型高粱地上部分干重高于或候选高于单倍型SbDW3-Hap1和单倍型SbDW3-Hap3对应的纯合基因型高粱；单倍型SbDW3-Hap3和单倍型SbDW3-Hap1对应的纯合基因型高粱地上部分干重无显著差异。所述单倍型SbDW3-Hap1为所述SNP1为A且所述SNP2为T的单倍型，所述单倍型SbDW3-Hap2为所述SNP1为T且所述SNP2为T的单倍型，所述单倍型SbDW3-Hap3为所述SNP1为A且所述SNP2为A的单倍型。

5.权利要求4所述的方法在高粱育种中的应用。

6.根据权利要求2和5任一权利要求所述的应用、权利要求3所述的产品、权利要求4中权利要求所述的方法，其特征在于：所述高粱育种为培育高地上部分干重高粱或选育地上部分干重高的高粱品种。

7.权利要求1-2或5任一权利要求所述的应用、权利要求3所述的产品、权利要求4或6任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，可为如下D1)、D2)或D3)：

D1)含有扩增包括所述SNP1和SNP2在内的高粱基因组DNA片段的PCR引物；

D2)含有D1)所述PCR引物的PCR试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用或产品或方法，其特征在于：所述PCR引物为F1-1、F1-2、F2-1、F2-2：

F1-1、由序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物组；

F1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-43位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第22-43位的单链DNA和序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物组；

F2-1、由序列表中SEQ ID No.5所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物组；

F2-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的第22-42位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的第22-42的单链DNA和序列表中SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物组。

9.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。

10.权利要求9所述的DNA分子在如下任一中的应用，

(1)鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重；

(2)筛选或选育高地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种；

(3)筛选或选育低地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种；

(4)高粱育种；

(5)制备鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的产品；

(6)制备筛选或选育高地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种的产品；

(7)制备筛选或选育低地上部分干重的高粱单株或株系或品系或品种的产品；

(8)制备高粱育种的产品。