CN115992287A

CN115992287A - 一种与高粱株高相关基因SbPH11的分子标记及其应用

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Publication number: CN115992287A
Application number: CN202211390692.6A
Authority: CN
Inventors: 平俊爱; 党德宣; 王玉斌; 牛皓; 吕鑫; 楚建强; 樊芳芳; 巨岚
Original assignee: Sorghum Research Institute Of Shanxi Agricultural University
Current assignee: Sorghum Research Institute Of Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-11-07
Filing date: 2022-11-07
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了一种与高粱株高相关基因SbPH11的分子标记及其应用。本发明所要保护的一个技术方案是分子标记在鉴定或辅助鉴定高粱株高中应用。本发明的一个实施例中通过检测待测高粱品种中的株高基因SbPH11中单倍型组合的单倍型发现，含有单倍型SbPH11‑Hap2(CC)的高粱株高均值显著高于其他单倍型，77.69％的单倍型SbPH11‑Hap2(CC)的高粱品种中株高均高于250厘米。表明SbPH11‑Hap2单倍型分子标记可用于高粱分子标记辅助选择育种，显著提高高粱高杆品种的选择效率。

Description

一种与高粱株高相关基因SbPH11的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域中种与高粱株高相关基因的分子标记及其应用，特别涉及高粱株高相关基因SbPH11的分子标记及其应用。

背景技术

高粱(Sorghum bicolor)又叫蜀黍，为禾本科高粱属一年生草本植物，高粱是世界五大作物之一，属于C4作物，光合效率高，生物产量高。高粱的用途很广泛，可食用、饲用、酿造用、生物能源用、化工材料用等。高粱因具有耐旱涝、耐盐碱、耐贫瘠和易于种植等特性，是全球最重要的粮食作物和饲料作物。

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要问题，约20％的可用耕地已发生或正在发生不同程度的盐渍化，可用于作物种植的土地损失已成为农业可持续性的一个严重问题。种植耐盐碱作物是当前利用和改良盐碱土最有效且经济的方法之一。因此，研究高粱的耐盐碱性、选育耐盐碱高产的甜高粱新品种，对利用和改良盐碱化地区土壤资源具有广阔前景。

中国高粱新品种选育较长时间内多以高秆大穗型为主，大多品种株高在2.5～3m。株高是作物形态学调查基本指标,也是影响高粱生物产量重要因素，高粱株高越高，一般其生物产量也越高，大多数高杆品种的产量都高于矮杆品种的产量。因此，选育含有高秆单倍型的高粱亲本系及杂交种成为促进高粱产业发展的关键。

分子标记辅助选择育种可在DNA水平针对目标性状进行选择，不仅结果稳定，而且可以在苗期进行选择，降低表型评价的成本，提高高粱育种效率。单核苷酸多态性(SNP)标记具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点，适合于数量庞大的检测分析。通过遗传分析找到关键标记位点后，需要将其转化为易用的分子标记。KASP(Kompetitiveallele-specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR技术，以其高度稳定性、准确性和低成本的特点，已经被广泛应用于高通量SNP分型检测。

因此，研究调控株高的基因，获得与株高基因紧密连锁的KASP分子标记，对高粱株高主效基因位点进行定位和检测，有效调控高粱的株高类型，选育预期株高类型的高粱新品种，对提高高粱产量具有极其重大的意义。目前，在高粱中开发与目标QTL紧密连锁的分子标记并申请专利应用的报道很少，且在没有与株高相关的专利报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种与高粱株高相关基因SbPH11的分子标记。

为解决上述技术问题本发明提供了如下应用：

应用，所述应用为P1或P2；

所述P1为检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱株高，或，制备鉴定或辅助鉴定高粱株高产品，或，高粱育种或制备高粱育种产品中的应用，所述SNP1是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第425位核苷酸，其为A或C；所述SNP2是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第401位核苷酸，其为C或T；

所述P2为检测单倍型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱株高，或，制备鉴定或辅助鉴定高粱株高产品，或，高粱育种或制备高粱育种产品中的应用，所述单倍型是高粱一条染色体上所述SNP1和所述SNP2这两个SNP的多态性组合。

序列1核苷酸序列如下：

CTCCAGTGTGCACCGGCCGCGGGGGTTGCAGGGTGAGGGTCCGTTGGAAGGTGGAACATAGAAGAAAGGGATGGGAAAGGGAAAAAAGAGACTGACGAGTGGGCCCCACGTGGTAAGGTGCCTCATCCAACTTTCTAGTGTCCCTCAACCAAACACAGAGGAGAGATGCTCCCATCCCTCAAAACTGGGATGGGACCGTCCCATCCCACCATGTCCCAAACCAAACACAAACTTAACTAGTTTGTATCGAGTCACATTAGGTTTGTTAAGCGCCTAAATATAAGTGTAACCATCAAAGAAATAAACTCCCGTTCATTGGCGTGAGTTGTCTTAGACCGTGGTGTGAAATCCTTCCTCATTCGATGACAACTGCCTATAGTCGTGCCTACCTCGCTACCCTCTTTGTTCTCTTTCTGACACACATATACTACTCTACTCTCCCTAGCGTTCTGTTTGTCGTGCATGCCATAACAAGTTGGCATCATAGATCGACCAATGGGCTTTGACTATGTTGGAATCAACATTACGAAGCTAAACCATATCATCGCCCAGCTCGTGACGATG。

所述物质可为产品。所述检测物质可包括检测上述单核苷酸多态性的试剂、试剂盒和仪器。具体的说，为检测上述单核苷酸多态性进行核酸体外扩增所需的引物和其他试剂和仪器。

所述SEQ ID No.1为SbPH11的基因的基因组序列，其包括内含子序列。在实际检测过程中SNP1和SNP2的多态性可通过检测由SNP1和SNP2的多态性引起的SbPH11基因转录的mRNA、SbPH11 mRNA反转录的cDNA的核苷酸多态性或SbPH11蛋白质氨基酸的多态性来检测分析。

本申请中，所述SNP1的基因型可为基因型AA或基因型CC，基因型AA是SNP1为A的纯合型；基因型CC是SNP1为C的纯合型合型。

所述SNP2的基因型可为基因型CC或基因型TT，基因型CC是SNP2为C的纯合型；基因型TT是SNP2为T的纯合型合型。

基因型CA是SNP1为C和A的杂合型；基因型TA是SNP2为T和A的杂合型。

以高粱基因组(BTx623(v3.1)为参考基因组，SNP1位于高粱自交系BTx623第4号染色体上第53908336位。

以高粱基因组(BTx623(v3.1)为参考基因组，SNP2位于高粱自交系BTx623第4号染色体上第53908312位。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品；

本身请提供的产品含上述检测高粱基因组SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质的产品或含有权利要求1中所述检测单倍型的物质的产品，且可为下述G1)-G3)中的任一种：

G1)检测高粱株高相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

G2)鉴定或辅助鉴定高粱株高的产品；

G3)用于高粱育种的产品。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定高粱株高的方法；

本发明还提供的鉴定或辅助鉴定高粱株高的方法为方法A或方法B：

所述方法A为鉴定或辅助鉴定高粱株高的方法，包括检测待测高粱中权利要求1中所述SNP1和SNP2这两个SNP的基因型，根据待测高粱的所述基因型鉴定或辅助鉴定高粱株高：

所述基因型为CCCC的高粱株高高于或候选高于所述基因型为CCTT和AACC的高粱株高，所述基因型为CCTT的高粱株高高于或候选高于所述基因型为AACC的高粱株高；所述CCCC是所述SNP1的基因型为CC且所述SNP2的基因型为CC两个SNP组合基因型，所述基因型CCTT是所述SNP1的基因型为CC且所述SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型，所述基因型AACC是所述SNP1的基因型为AA且所述SNP2的基因型为CC两个SNP组合基因型；所述SNP1的基因型为CC是序列表中SEQ ID No.1的第425位核苷酸为C的纯合型；所述SNP1的基因型为AA是序列表中SEQ ID No.1的第425位核苷酸为A的纯合型；所述SNP2的基因型为CC是序列表中SEQ ID No.1的第401位核苷酸为C的纯合型；所述SNP2的基因型为TT是序列表中SEQID No.1的第401位核苷酸为T的纯合型；

所述方法B为鉴定或辅助鉴定高粱株高的方法，包括检测待测高粱中权利要求1中所述单倍型，根据所述待测高粱的单倍型鉴定或辅助鉴定高粱株高：

单倍型SbPH11-Hap2对应的纯合基因型高粱株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap1或SbPH11-Hap3对应的纯合基因型高粱株高，单倍型SbPH11-Hap1对应的纯合基因型高粱株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap3对应的纯合基因型高粱株高；所述单倍型SbPH11-Hap2为所述SNP1为C和所述SNP2为C的单倍型，所述单倍型SbPH11-Hap1为所述SNP1为C和所述SNP2为T的单倍型，所述单倍型SbPH11-Hap3为所述SNP1为A和所述SNP2为C和的单倍型。

作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定高粱株高方法可包括如下步骤：

(1)以待测高粱的基因组DNA为模板，采用引物组F1和引物组F2进行KASP；

引物组F1可包括引物F1-A、引物F1-B和引物F1-C；所述引物组合F2可包括引物F2-A、引物F2-B和引物F2-C；

所述引物F1-A可为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子；

所述引物F1-B可为核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子；

所述引物F1-C可为核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子；

所述引物F2-A可为核苷酸序列是序列表中序列5的单链DNA分子；

所述引物F2-A可为核苷酸序列是序列表中序列6的单链DNA分子；

所述引物F2-A可为核苷酸序列是序列表中序列7的单链DNA分子。

(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测高粱的所述SNP1和所述SNP2位点的基因型；

(3)根据基因型结果进行鉴定或辅助鉴定高粱株高：所述SNP1和所述SNP2这两个SNP位点的基因型为基因型CCCC的待测高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于所述基因型CCTT或AACC的待测高粱株高(如高粱自交系)；所述基因型CCTT的待测高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于所述基因型AACC的待测高粱株高(如高粱自交系)。

上述的应用、产品或的方法种，所述高粱为高粱纯系或自交系。

上述方法在高粱育种中的应用。

上述的应用、产品、方法中或上述的应用、产品或方法中，所述育种的目的包括培育或选育低株高或高株高的高粱。

上述的应用、产品、方法中或上述的应用、产品或方法中，所述检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，为如下D1)、D2)、D3)或D4)：

D1)含有特异性扩增SNP1和SNP2位点的体外核酸扩增引物；

D2)含有D1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；

D3)含有D1)所述体外核酸扩增引物或D2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；

D4)含有D1)所述体外核酸扩增引物、D2)所述体外核酸扩增试剂或D3)所述试剂盒的检测仪器。

本申请中，所述体外核酸扩增技术可为聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环核酸扩增(RCA)、环介导等温扩增(lamp)、依赖解旋酶的等温扩增技术(HDA)或Qβ复制技术。

本申请以聚合酶链式反应(PCR)为扩增手段，进行多态性检测。

D1)中所述特异性扩增可通过扩增产物的有无或者通过扩增产物的有无再结合探针等辅助试剂来检测SNP1和SNP2多态性位点的核苷酸序列。

上述应用、方法和产品中，所述体外核酸扩增引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测。

上述应用、产品或方法中，所述体外核酸扩增引物包括引物组F1-1、引物组F1-2、引物组F2-1和/或引物组F2-2组：

所述引物组F1-1为F1-1-1或F1-1-2：

F1-1-1、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-44位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；

F1-1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；

所述引物组F1-2为F1-2-1或F1-2-2：

F1-2-1、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第22-46位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；

F1-2-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；

所述引物组F2-1为F2-1-1或F2-1-2：

F1-2-1、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的第22-40位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA组成的引物组合物；

F1-2-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA组成的引物组合物；

所述引物组F2-2为F2-2-1或F2-2-2：

F1-2-1、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的第22-41位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA组成的引物组合物；

F1-2-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA组成的引物组合物。

本申请中，所述引物F1-1组为检测SNP1多态性位点为A的体外核酸扩增引物，可为F1-1-1或F1-1-2：F1-1-1由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-44位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA(名称为通用引物F1-C)组成的引物组合物；

F1-1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的单链DNA(第1-21位为FAM标签序列，名称为F1-A)和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；

所述引物F1-2组为检测SNP1多态性位点为C的体外核酸扩增引物，可为F1-2-1或F1-2-2：F1-2-1由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第22-46位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA(名称为通用引物F1-C)组成的引物组合物；

F1-1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA(第1-21位为FAM标签序列，名称为F1-B)和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；

所述引物F2-1组为检测SNP2多态性位点为T的体外核酸扩增引物，可为F2-1-1或F2-1-2：F2-1-1由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的第22-40位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA(名称为通用引物F2-C)组成的引物组合物；

F2-1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的单链DNA(第1-21位为FAM标签序列，名称为F2-A)和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA组成的引物组合物；

所述引物F2-2组为检测SNP2多态性位点为C的体外核酸扩增引物，可为F2-2-1或F2-2-2：F2-2-1由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的第22-41位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA(名称为通用引物F2-C)组成的引物组合物；

F2-1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的单链DNA(第1-21位为FAM标签序列，名称为F2-B)和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA组成的引物组合物。

所述SNP1可为高粱自交系BTx623第4号染色体上第53908336位，SNP2可为高粱自交系BTx623第4号染色体上第53908312位。

上述应用、产品及方法中，所述高粱可为纯系或高粱自交系。

上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PARMS master mix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物、PARMS master mix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测高粱基因组中SNP1和SNP2位点的多态性或基因型的物质。

为了解决上述问题，本身请提供了一种植物育种的方法。

所述植物育种的方法包括将目的植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸和第401位核苷酸替换为第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为T、第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为C或第425位核苷酸为A且第401位核苷酸为C，得到株高高或低于所述目的植物；

所述目的植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为C的植物株高高于或候选高于所述目的植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为T的植物或植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为A且第401位核苷酸为C的植物。，所述目的植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为T的植物株高高于或候选高于所述目的植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为A且第401位核苷酸为C的植物。

本申请中，所述植物为纯合植株。

所述植物育种的方法可为将所有染色体上的序列1区域的425位核苷酸和401位核苷酸均进行替换得到纯合植株。或先将一条染色体上的序列1区域的进行替换再通过有性繁殖进行纯合筛选获得纯合植株。

为了解决上述问题，本身请还提供了如下应用。

植物基因组中序列1区域第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为T、第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为C或第425位核苷酸为A且第401位核苷酸为C对应不同株高在下任一中的应用：

(1)调控高粱株高；

(2)制备调控高粱株高的产品；

(3)高粱育种；

(4)制备高粱株高育种产品；

(5)检测高粱株高相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

(6)鉴定或辅助鉴定高粱株高的产品。

本申请中，所述植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为C的植物株高高于或候选高于所述目的植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为C且第401位核苷酸为T的植物或所述目的植物基因组中序列1区域的第425位核苷酸为A且第401位核苷酸为C的植物。

所述植物为纯合植株。

所述高粱可为下述中的至少一种：

高粱101、高粱108、高粱11、高粱122、高粱124、高粱125、高粱141、高粱144、高粱147、高粱150、高粱167、高粱16、高粱170、高粱174、高粱181、高粱190、高粱197、高粱2002、高粱2005、高粱2007、高粱2009、高粱2010、高粱2012、高粱2018、高粱2023、高粱2026、高粱2030、高粱2035、高粱2037、高粱204、高粱2052、高粱2056、高粱205、高粱2062、高粱2066、高粱2071、高粱2081、高粱2088、高粱20、高粱24、高粱251、高粱262、高粱265、高粱271、高粱272、高粱277、高粱30、高粱31、高粱36、高粱37、高粱392、高粱394、高粱396、高粱40、高粱41、高粱45、高粱47、高粱51、高粱53、高粱54、高粱56、高粱59、高粱5、高粱60、高粱63、高粱6、高粱76、高粱77、高粱79、高粱7、高粱80、高粱81、高粱88、高粱89、高粱91、高粱92、高粱95、高粱98、高粱J130、高粱J142、高粱J59、高粱MHMD、高粱Tu5、高粱WSC100、高粱WSC102、高粱WSC106、高粱WSC29、高粱WSC50、高粱WSC59、高粱WSC75、高粱WSC81、高粱WSC86、高粱WSC93、高粱WSC94、高粱WSC97、高粱WSC98、高粱107、高粱110、高粱123、高粱127、高粱132、高粱159、高粱163、高粱164、高粱183、高粱192、高粱194、高粱2008、高粱2016、高粱2017、高粱2019、高粱2021、高粱2027、高粱2029、高粱2036、高粱2038、高粱2040、高粱2042、高粱2043、高粱2045、高粱2048、高粱2054、高粱2059、高粱2061、高粱2065、高粱2067、高粱2068、高粱2069、高粱2070、高粱2074、高粱2075、高粱2078、高粱2080、高粱2082、高粱2086、高粱243、高粱252、高粱254、高粱255、高粱256、高粱257、高粱258、高粱259、高粱261、高粱267、高粱275、高粱279、高粱281、高粱286、高粱346、高粱351、高粱353、高粱354、高粱355、高粱356、高粱363、高粱364、高粱367、高粱370、高粱374、高粱382、高粱384、高粱395、高粱48、高粱4、高粱61、高粱62、高粱67、高粱70、高粱86、高粱GW102、高粱GW59、高粱J136、高粱J146、高粱J14、高粱J150、高粱J158、高粱J20、高粱J22、高粱J25、高粱J26、高粱J27、高粱J28、高粱J2、高粱J30、高粱J40、高粱J42、高粱J44、高粱J49、高粱J50、高粱J53、高粱J54、高粱J55、高粱J57、高粱J5、高粱J66、高粱J67、高粱J69、高粱J77、高粱J81、高粱J85、高粱J93、高粱J95、高粱J97、高粱J99、高粱J9、高粱SL129、高粱SL136、高粱SL37、高粱SL43、高粱SL47、高粱SL62、高粱Tu14、高粱Tu17、高粱WSC10、高粱WSC16、高粱WSC19、高粱WSC24、高粱WSC25、高粱WSC2、高粱WSC32、高粱WSC38、高粱WSC56、高粱WSC5、高粱WSC66、高粱WSC6、高粱128、高粱131、高粱136、高粱137、高粱139、高粱157、高粱175、高粱176、高粱177、高粱2031、高粱2050、高粱2084、高粱2085、高粱264、高粱268、高粱269、高粱372、高粱383、高粱386、高粱400、高粱8、高粱J101、高粱SL105、高粱SL12、高粱WSC105、高粱WSC18、高粱WSC68、高粱WSC8。

上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述SNP的多态性或基因型所需的试剂和/或试剂盒和/或仪器：体外核酸扩增、DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

上文所述应用及方法中，可选择高粱自交系作为亲本进行育种。

上文所述高粱株高具体可为高粱成熟期的株高。

所述育种的目的包括培育或选育低株高或高株高的高粱。

上述应用和方法中，所述PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PARMS master mix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物、PARMS master mix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测高粱基因组中SNP1和/或SNP2位点的多态性或基因型的物质。

本发明的实施例中，通过对高粱自交系关联群体中SbPH11基因的遗传变异分析，发现2个SNP，SNP1和SNP2分别位于高粱基因组中与株高相关的基因SbPH11基因中，即序列表SEQ ID No.1的第425位和第401位，这2个SNP组合共存在三种单倍型：单倍型SbPH11-Hap1(CT)、单倍型SbPH11-Hap2(CC)、单倍型SbPH11-Hap3(AC)。通过实验证明，单倍型SbPH11-Hap2(CC)所对应的纯合基因型高粱株高显著高于单倍型SbPH11-Hap1(CT)所对应的纯合基因型高粱株株高或单倍型SbPH11-Hap3(AC)所对应的纯合基因型高粱株株高，单倍型SbPH11-Hap1(CT)所对应的纯合基因型高粱株高显著高于单倍型SbPH11-Hap3(AC)所对应的纯合基因型高粱株株高。77.69％的单倍型SbPH11-Hap2(CC)所对应的纯合基因型高粱株高均高于250厘米。单倍型SbPH11-Hap2(CC)分子标记可用于高粱株高的早期预测和筛选，也可用于高粱分子标记辅助选择育种和高杆高粱品种的选育。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用GraphPad Prism v8.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

下述实施例中的254份高粱自交系关联群体：由中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室景海春实验室提供，并记载于如下文献及其附件资料中：XiaoyuanWu,YuanmingLiu,HongLuo,LiShang,ChuanyuanLeng,ZhiquanLiu,ZhigangLi,XiaochunLu,HongweiCai,Huaiqin gHao,Hai-ChunJing，(2022，5)，Genomic footprints of sorghumdomestication and breeding selection for multiple end uses，Molecular Plant，Volume 15,Issue 3,7March 2022,Pages 537-551。品种详细信息如表1所示。公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、与高粱株高相关单倍型组合及相关单倍型分子标记的发现

一、供试材料的株高统计

1、供试材料的种植

2021年在中国山东省东营市农高新区轻度盐碱地的农田土壤中种植254份高粱自交系关联群体种质资源，采用随机完全区组设计，试验小区长3m、宽2m，种植5行，每行10株，株距0.3m，行距0.5m，正常灌溉。

2、供试材料的株高统计

待254份高粱(如表1所示)自交系关联群体完全成熟后，每份材料选取3株，统计每株主茎的株高，三次重复的平均值作为该样品株高的最终结果，如表1中株高所示。

二、基因SbPH11相关的单倍型组合及其单倍型分子标记的发现

1、254份高粱自交系关联群体的全基因组测序

254份高粱自交系关联群体的全基因组测序数据由中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室景海春实验室提供。

2、基因SbPH11相关的单倍型组合及其相关单倍型分子标记的发现

根据高粱自交系株高和其基因组测序结果，筛选出一个与高粱株高相关基因SbPH11的单倍型组合。该单倍型组合包括2个SNP位点，分别为SNP1和SNP2，其中SNP1对应于高粱自交系BTx623第4号染色体上第53908336位(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为A或C(A/C二元多态性)，对应序列表中SEQ ID No.1的第425位，其第21位氨基酸为酪氨酸或天冬氨酸(即SAP1位点，酪氨酸/天冬氨酸二元多态性，对应SEQ ID No.1的第425位核苷酸为A或C)；SNP2对应于高粱自交系BTx623第4号染色体上第53908312位，其核苷酸为C或T，对应序列表中SEQ ID No.1的第401位，其第29位氨基酸为谷氨酸突变或赖氨酸(即SAP2位点，谷氨酸突变/赖氨酸二元多态性，对应SEQ ID No.1的第401位核苷酸为C或T)。序列表中SEQ ID No.1的m表示a或c，y表示t或c。

各个高粱品种的基因型检测结果如表1所示。结果显示SNP1位点有2种基因型(简称SNP1基因型)，即AA或CC，基因型AA是SNP1为A的纯合型，基因型CC是SNP1为C的纯合型；SNP2位点有2种基因型(简称SNP2基因型)，即CC或TT，基因型CC是SNP2为C的纯合型,基因型TT是SNP2为T的纯合型。在供试群体中，这2个SNP组合即单倍型组合共存在3种单倍型：单倍型SbPH11-Hap1(CT)(简称SbPH11-Hap1)、单倍型SbPH11-Hap2(CC)(简称SbPH11-Hap2)和单倍型SbPH11-Hap3(AC)(简称SbPH11-Hap3)。单倍型SbPH11-Hap1(CT)是SNP1为C且SNP2为T的组合，单倍型SbPH11-Hap2(CC)是SNP1为C且SNP2为C的组合，单倍型SbPH11-Hap3(AC)是SNP1为A且SNP2为C的组合。

单倍型SbPH11-Hap2(CC)所对应的纯合基因型高粱的株高极显著高于单倍型SbPH11-Hap1(CT)所对应的纯合基因型高粱的株高或单倍型SbPH11-Hap3(AC)所对应的纯合基因型高粱的株高，单倍型SbPH11-Hap1(CT)所对应的纯合基因型高粱显著高于单倍型SbPH11-Hap3(AC)所对应的纯合基因型高粱的株高。单倍型SbPH11-Hap2(CC)对应的纯合基因型高粱的基因型是CCCC，基因型CCCC是SNP1基因型为CC且SNP2基因型为CC的两个SNP组合基因型；单倍型SbPH11-Hap1(CT)对应的纯合基因型高粱的基因型是CCTT，基因型CCTT是SNP1基因型为CC且SNP2基因型为TT的两个SNP组合基因型；单倍型SbPH11-Hap3(AC)对应的纯合基因型高粱的基因型是AACC，基因型AACC是SNP1基因型为AA且SNP2基因型为CC的两个SNP组合基因型。

因此，选择将上述得到的与基因SbPH11相关的单倍型组合用于鉴定或辅助鉴定不同品系高粱株高；将单倍型组合中的SbPH11-Hap2(CC)单倍型作为鉴定或辅助鉴定不同品系高粱株高的分子标记，含有SbPH11-Hap2(CC)单倍型分子标记的高粱品系株高可能高于250厘米。

三、基因SbPH11相关的单倍型组合及SbPH11-Hap2(CC)单倍型分子标记专用引物的设计及其方法的建立

1、单倍型组合相关SNP位点的基因组特异引物设计

设计SNP1的特异引物序列(序列表中的SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4)，SNP2的特异引物序列(序列表中的SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7)，均由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司合成。

鉴定SNP1位点多态性的引物组F1如下：

特异性引物F1-A(SEQ ID No.2)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGTTCTCTTTCTGACACACATA-3’

特异性引物F1-B(SEQ ID No.3)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTTGTTCTCTTTCTGACACACATC-3’

通用引物F1-C(SEQ ID No.4)：

5’-GAACGCTAGGGAGAGTAGAGTAGTA-3’

鉴定SNP2位点多态性的引物组F2如下：

特异性引物F2-A(SEQ ID No.5)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCCTACCTCGCTACCCTC-3’

特异性引物F2-B(SEQ ID No.6)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGCCTACCTCGCTACCCTT-3’

通用引物F2-C(SEQ ID No.7)：

5’-GAACGCTAGGGAGAGTAGAGTAGTA-3’

上述鉴定SNP1位点多态性的引物组F1是根据序列SEQ ID No.1(正义链)设计，鉴定SNP2位点多态性的引物组F2根据序列SEQ ID No.1(正义链)设计。

上述引物F1-A和F2-A中下划线序列为FAM序列；F1-B和F2-B中下划线序列为HEX序列。

上述序列SEQ ID No.2与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ IDNo.1中SNP1位点为A的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；

上述序列SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ IDNo.1中SNP1位点为C的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。

上述序列SEQ ID No.5与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ IDNo.1中SNP2位点为C的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；

上述序列SEQ ID No.6与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列SEQ ID No.1中SNP2位点为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。

2、检测方法的建立

2.1DNA提取

提取供试品种(表1所示)高粱叶片基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板用于PCR扩增。

2.2PCR扩增和荧光信号检测

使用步骤1中SNP引物组F1和引物组F2分别进行PCR扩增2.1中得到的模板，检测SNP位点的多态性(核苷酸种类)和基因型；利用Douglas-Araya高通量流水线式荧光信号扫描仪对F1引物组和F2引物组的PCR产物进行荧光数据读取，用Douglas专用软件-Kraken进行荧光信号处理。

配制引物混液：先将引物F1-A、引物F1-B、引物F1-C这3条引物分别用ddH₂O稀释成100mmol·L^-1，分别得到引物F1-A溶液、引物F1-B溶液、引物F1-C溶液。取引物F1-A溶液60μL、引物F1-B溶液60μL、引物F1-C溶液150μL，加入10mM Tris-HCL 230μL，得到引物混液F1。使用上述方法获得引物F2-A溶液、引物F2-B溶液、引物F2-C溶液，取引物F2-A溶液60μL、引物F2-B溶液60μL、引物F2-C溶液150μL，加入10Mm Tris-HCL 230μL，得到引物混液F2。

2μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：供试样品基因组DNA 50ng，引物混液F1或F20.02μL，LGC公司1×KASP Mix(Low Rox)0.6μL，其余为ddH₂O。按照Douglas-Nexar及Soellex水浴系统的操作手册，编辑程序并运行，保存数据。

若F1引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为AA(即高粱基因组中SNP1位点为A的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为CC(即高粱基因组中SNP1位点为C的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为CA(即高粱基因组中SNP1位点为C和A的杂合型)。若F2引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为CC(即高粱基因组中SNP2位点为C的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为TT(即高粱基因组中SNP2位点为T的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为TC(即高粱基因组中SNP2位点为T和C的杂合型)。

确定基因SbPH11相关的单倍型组合的单倍型和基因型从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的株高：待测高粱SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型CCCC的高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型CCTT或基因型AACC的高粱(如高粱自交系)。单倍型SbPH11-Hap2(CC)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap1对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)或单倍型SbPH11-Hap3对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)。

实施例2、高粱株高显著关联单倍型组合和SbPH11-Hap2(CC)单倍型分子标记的应用待测高粱：254份高粱自交系关联群体

一、高粱株高测定

方法同实施例1。结果表明，在中国山东省东营市农高新区轻度盐碱地的农田土壤中种植254份高粱自交系，不同高粱品种的株高存在显著差异，高粱株高范围111-382厘米，其中153个高粱自交系的株高超过250厘米，约占该关联群体的60.24％。

二、分子鉴定或辅助鉴定高粱自交系的株高

提取待测高粱基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板。采用实施例1中的单倍型组合相关SNP位点的基因组特异引物SNP1引物组F1和SNP2引物组F2分别进行PCR扩增，得到SbPH11基因相关单倍型组合中两个SNP位点的多态性信息，从而确定待测高粱的基因SbPH11相关的单倍型组合的单倍型和基因型，从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的株高：待测高粱SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型CCCC的高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型CCTT的高粱(如高粱自交系)或SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型AACC的高粱(如高粱自交系)，待测高粱SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型CCTT的高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于SNP1和SNP2这两个SNP的基因型为基因型AACC的高粱(如高粱自交系)。单倍型SbPH11-Hap2(CC)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap1(CT)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)或单倍型SbPH11-Hap3(AC)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)，单倍型SbPH11-Hap1(CT)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap3(AC)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)。

254份待测高粱中2个SNP位点基因型和高粱株高如表1和表2所示，待测高粱的SNP1位点包含CC和AA两种基因型(SNP1基因型列所示)；SNP2位点包含TT和CC两种基因型(SNP2基因型列所示)。供试高粱基因组中2个SNP位点按基因组顺序共存在3种单倍型组合，即单倍型SbPH11-Hap1(CT)、SbPH11-Hap2(CC)和SbPH11-Hap3(AC)。检测结果表明，254份高粱品种中，130个单倍型SbPH11-Hap2(CC)的高粱品种中，有101个单倍型SbPH11-Hap2(CC)的高粱品种株高高于250厘米，即77.69％的单倍型SbPH11-Hap2(CC)的高粱品种中株高均高于250厘米。

96个单倍型SbPH11-Hap1(CT)型的高粱品种中，有45个高粱品种株高高于250厘米，即46.87％的单倍型SbPH11-Hap1(CT)的高粱品种中株高均高于250厘米。

28个单倍型SbPH11-Hap3(AC)型的高粱品种中，有21个高粱品种株高低于250厘米，即75％的单倍型SbPH11-Hap3(AC)的高粱品种中株高均低于250厘米。

这表明利用单倍型SbPH11-Hap2(CC)可淘汰低株高的高粱品种，选择单倍型SbPH11-Hap2(CC)的高株高的高粱品种，并作为单倍型分子标记用于高粱株高辅助选择是切实有效的。

表1、254份高粱自交系的株高和2个SNP位点的基因型

备注：

IS:Sweet Sorghum；IG:Grain Sorghum；LG:Grain Sorghum；AL:unknown；LB:Broom Sorghum

下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

对三种单倍型与株高进行差异显著性分析，单倍型SbPH11-Hap1对应的纯合基因型高粱株高与单倍型SbPH11-Hap2对应的纯合基因型高粱存在极显著差异(P<0.0001)，单倍型SbPH11-Hap1对应的纯合基因型高粱株高与单倍型SbPH11-Hap3对应的纯合基因型高粱存在显著差异(P<0.05)，单倍型SbPH11-Hap2对应的纯合基因型高粱株高与单倍型SbPH11-Hap3对应的纯合基因型高粱存在极显著差异(P<0.0001)，单倍型SbPH11-Hap2(CC)对应的纯合基因型高粱株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap1(CT)对应的纯合基因型高粱和单倍型SbPH11-Hap3(AC)对应的纯合基因型高粱。单倍型SbPH11-Hap1(CT)对应的纯合基因型高粱株高高于单倍型SbPH11-Hap3(AC)对应的纯合基因型高粱的株高(如表2所示)。

表2按基因SbPH11的基因型和单倍型组合纯合类型统计的254份高粱自交系的株高及差异分析

基因型	单倍型类型	单倍型组合	品种数/个	株高(cm)
					CCTT	SbPH11-Hap1	CT	96	<![CDATA[242.2±58.39<sup>a</sup>]]>
CCCC	SbPH11-Hap2	CC	130	<![CDATA[281.6±43.16<sup>b</sup>]]>
					AACC	SbPH11-Hap3	AC	28	<![CDATA[206.2±44.71<sup>c</sup>]]>

对单独的SNP1的基因型或SNP2的基因型与株高进行差异显著性分析，结果表明SNP1的纯合基因型(CC)高粱株高与纯合基因型(AA)高粱存在显著差异(P<0.05)，基因型SNP1-CC对应的高粱株高高于或候选高于SNP1-AA对应的高粱。SNP2的纯合基因型(TT)高粱株高与纯合基因型(CC)高粱存在显著差异(P<0.05)，基因型SNP2-CC对应的高粱株高高于或候选高于SNP2-TT对应的高粱。

表3基因SbPH11的2个SNP位点不同基因型对应的254份高粱自交系的株高及差异分析

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.应用，其特征在于，所述应用为P1或P2；

2.产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1中所述检测高粱基因组SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质的产品或含有权利要求1中所述检测单倍型的物质的产品，且可为下述G1)-G3)中的任一种：

G1)检测高粱株高相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

G2)鉴定或辅助鉴定高粱株高的产品；

G3)用于高粱育种的产品。

3.鉴定或辅助鉴定高粱株高的方法，所述方法为方法A或方法B：

所述基因型为CCCC的高粱株高高于或候选高于所述基因型为CCTT的高粱株高，所述基因型为CCTT的高粱株高高于或候选高于所述基因型为AACC的高粱株高；所述CCCC是所述SNP1的基因型为CC且所述SNP2的基因型为CC两个SNP组合基因型，所述基因型CCTT是所述SNP1的基因型为CC且所述SNP2的基因型为TT的两个SNP组合基因型，所述基因型AACC是所述SNP1的基因型为AA且所述SNP2的基因型为CC两个SNP组合基因型；所述SNP1的基因型为CC是序列表中SEQ ID No.1的第425位核苷酸为C的纯合型；所述SNP1的基因型为AA是序列表中SEQ ID No.1的第425位核苷酸为A的纯合型；所述SNP2的基因型为CC是序列表中SEQID No.1的第401位核苷酸为C的纯合型；所述SNP2的基因型为TT是序列表中SEQ ID No.1的第401位核苷酸为T的纯合型；

单倍型SbPH11-Hap2对应的纯合基因型高粱株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap1对应的纯合基因型高粱株高，单倍型SbPH11-Hap1对应的纯合基因型高粱株高高于或候选高于单倍型SbPH11-Hap3对应的纯合基因型高粱株高；所述单倍型SbPH11-Hap2为所述SNP1为C和所述SNP2为C的单倍型，所述单倍型SbPH11-Hap1为所述SNP1为G和所述SNP2为T的单倍型，所述单倍型SbPH11-Hap3为所述SNP1为A和所述SNP2为C和的单倍型。

4.根据权利要求1所述的应用、权利要求2所述的产品或权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高粱为高粱纯系或自交系。

5.权利要求3所述方法在高粱育种中的应用。

6.根据权利要求1或5所述的应用、权利要求2所述的产品、权利要求3所述的方法或权利要求4所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述育种的目的包括培育或选育低株高或高株高的高粱。

7.权利要求1或5所述的应用、权利要求2所述的产品、权利要求3所述的方法或权利要求4或6所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，为如下D1)、D2)、D3)或D4)：

D1)含有特异性扩增SNP1和SNP2位点的体外核酸扩增引物；

D2)含有D1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；

8.根据权利要求7所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述体外核酸扩增引物包括引物组F1-1、引物组F1-2、引物组F2-1和/或引物组F2-2组：

所述引物组F1-1为F1-1-1或F1-1-2：

所述引物组F1-2为F1-2-1或F1-2-2：

F1-1-1、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第22-46位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；

F1-1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA组成的引物组合物；