CN115896335A

CN115896335A - 高粱SbSOS1基因的SNP分子标记及应用

Info

Publication number: CN115896335A
Application number: CN202211535751.4A
Authority: CN
Inventors: 何振艳; 许文秀; 闫慧莉; 平俊爱; 牛皓; 王玉斌
Original assignee: Sorghum Research Institute Of Shanxi Agricultural University; Institute of Botany of CAS
Current assignee: Sorghum Research Institute Of Shanxi Agricultural University; Institute of Botany of CAS
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明公开了一种高粱耐盐碱相关性状地上部分干重相关基因SbSOS1中的SNP分子标记及应用。本发明涉及分子生物技术领域中与高粱地上部分干重相关的SNP分子标记及其应用。本发明通过检测高粱品种中的地上部分干重基因SbSOS1中SNP的基因型发现，基因型为CC的高粱品种的地上部分干重显著高于基因型为GG的高粱品种。68.05％的基因型为CC高粱品种中地上部分干重均高于0.12kg。表明本发明的SbSOS1基因中的SNP分子标记可用于高粱分子标记辅助选择育种，显著提高高粱高地上部分干重品种的选择效率。

Description

高粱SbSOS1基因的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域中一种与高粱地上部分干重相关的分子标记及其应用，具体涉及高粱SbSOS1基因的SNP分子标记及其应用。

背景技术

盐胁迫是世界范围内一个日益严重的环境问题，全球约有10亿hm²的耕地受到盐碱化的不同影响。盐胁迫是影响作物生长、分布和生产的关键因素，主要影响一些细胞内过程，如光合作用、离子平衡、蛋白质和脂质合成，以及激素和代谢失衡。这些由盐分引起的有害影响最终导致作物产量的降低。盐胁迫作为一类重要的非生物胁迫，严重制约了农业的可持续发展。

高粱(Sorghum bicolor)又叫蜀黍，为禾本科高粱属一年生草本植物，是世界五大谷物作物之一，属于C4作物，广泛种植于干旱、半干旱热带、亚热带和温带地区。全球范围内，高粱被用于动物饲料、饲料以及糖浆和生物乙醇等高价值产品。高粱作为一种重要的粮食兼经济作物，具有较强的抗旱、耐涝和耐盐碱等特性，其中，甜高粱被认为是最具有耐盐碱品种开发潜力的C4饲用作物之一。高粱作为一种粮食、饲草和能源作物备受关注。尤其是目前我国草牧业发展对饲草需求的不断增加,使得产量高、含糖量高、营养丰富的饲草甜高粱受到越来越多的关注,它也被广泛认为是具有发展潜力的新型饲草作物。

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测SNP位点和InDel位点。与SSR、RFLP、InDel等分子标记相比，KASP标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点。KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳检测方法的步骤相对繁琐，低通量的缺点，适用于高通量分子检测平台。因此，研究调控地上部分干重的基因，获得与地上部分干重基因紧密连锁的KASP分子标记，对高粱地上部分干重主效基因位点进行定位和检测，有效调控高粱的地上部分干重类型，选育预期地上部分干重类型的高粱新品种，对于提高我国高粱的育种效率和育种水平具有重要应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定高粱的地上部分干重性状或如何进行高粱育种。

为了解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，包括检测待测高粱中SNP的基因型，根据基因型鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重：所述基因型CC的高粱的地上部分干重高于或候选高于基因型GG的高粱。

所述SNP是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸，其为C或G；所述CC是序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸为C的纯合型，所述GG是序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸为G的纯合型。

本发明还提供了一种高粱育种的方法，包括检测高粱基因组中SNP的多态性或基因型，选择基因型为基因型CC的高粱为亲本进行育种。

上述鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法在高粱育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了检测高粱地上部分干重分子标记的物质在检测或辅助检测高粱地上部分干重性状中的应用，所述应用为下述P1或Q1：

所述P1为检测SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重中的应用。所述SNP是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸，其为C或G。

上述SNP单核苷酸多态性位点位于高粱基因组(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)第8号染色体上的SbSOS1基因中，所述SbSOS1基因位于高粱第8号染色体第62626697-62654054位，与高粱地上部分干重相关，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示DNA分子。

所述Q1为检测SNP的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重产品中的应用；所述SNP是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸，其为C或G。

本发明还提供了一种检测SNP的多态性或基因型的物质在高粱育种或制备高粱育种产品中的应用，所述SNP是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸，其为C或G。

所述高粱地上部分干重可为高粱成熟期地上部分干重。所述高粱可为高粱自交系。所述SNP的基因型(即等位基因)可为基因型CC、基因型GG或基因型CG，基因型CC是SNP为C的纯合型；基因型GG是SNP为G的纯合型；基因型CG是SNP为C和G的杂合型。SNP的基因型为基因型CC的高粱(如高粱自交系)的地上部分干重高于或候选高于基因型GG的高粱。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述检测高粱基因组SNP的多态性或基因型的物质，且可为下述G1)-G3)中的任一种：

G1)检测高粱地上部分干重相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

G2)鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的产品；

G3)用于高粱育种的产品。

上文所述待测高粱为高粱自交系，选择高粱自交系作为亲本进行育种。

上文所述高粱育种为培育地上部分干重较高的高粱品种。

上文所述高粱地上部分干重具体可为高粱成熟期的地上部分干重。

上述应用、方法中，所述检测SNP的多态性或基因型的物质，可为通过下述至少一种方法确定上述高粱基因组中SNP位点的核苷酸种类：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

上述应用、方法或产品中，所述检测SNP的多态性或基因型的物质，可为如下D1)、D2)或D3):

D1)含有扩增包括所述SNP位点在内的高粱基因组DNA片段的体外核酸扩增引物；

D2)含有D1)所述PCR引物的体外核酸扩增试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒。

所述体外核酸扩增可为聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环核酸扩增(RCA)、环介导等温扩增(lamp)、依赖解旋酶的等温扩增技术(HDA)或Qβ复制。

上述体外核酸扩增引物为F1-1、F1-2：

F1-1、由序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物组；

F1-2、由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-41位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第22-41位的单链DNA和序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物组。

上述应用和方法中，所述体外核酸扩增引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如³²P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PARMS master mix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物、PARMS master mix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测高粱基因组中SNP的多态性或基因型的物质。

上述应用、方法中，所述地上部分干重高的高粱品种中的地上部分干重是相对于杂交亲本高粱而言。如果两个杂交亲本高粱的地上部分干重相同，所述地上部分干重高的高粱品种的地上部分干重可等于或高于杂交亲本高粱的地上部分干重；如果两个杂交亲本高粱的地上部分干重不相同，所述地上部分干重高的高粱品种的地上部分干重可等于或高于两个杂交亲本高粱中地上部分干重较高的杂交亲本高粱。

本发明的实施例中，通过对高粱自交系关联群体中SbSOS1基因的遗传变异分析，发现1个SNP，SNP位于高粱基因组中与地上部分干重相关的基因SbSOS1基因中，即序列表SEQ ID No.1的第880位。通过实验证明，SNP的基因型为基因型CC的高粱的地上部分干重平均值显著高于或候选高于基因型GG的高粱。68.05％的基因型为CC高粱中地上部分干重均高于0.12kg，55.84％的基因型为GG高粱品种地上部分干重均低于0.12kg。本发明的SNP分子标记可用于高粱地上部分干重的早期预测和筛选，也可用于高粱分子标记辅助选择育种和高地上部分干重高粱品种的选育。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用GraphPad Prism v8.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-tests检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

下述实施例中的246份高粱自交系关联群体：由中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室景海春实验室提供，该关联群体的详细信息见已发表的文章：XiaoyuanWu,et al..Genomic footprints of sorghum domestication and breeding selectionfor multiple end uses.Molecular Plant,2022,VOLUME 15,ISSUE 3,P537-551(DOI:https://doi.org/10.1016/j.molp.2022.01.002)，品种详细信息如表1所示。

实施例1、与高粱地上部分干重相关SNP分子标记的发现

一、供试材料的地上部分干重统计

1、供试材料的种植

2021年在中国山东省东营市农高新区轻度盐碱地土壤中种植246份高粱自交系关联群体种质资源，采用随机完全区组设计，试验小区长3m、宽2m，种植5行，每行10株，株距0.3m，行距0.5m，正常灌溉。

2、供试材料的地上部分干重统计

待246份高粱自交系关联群体完全成熟后，每份材料选取3株，统计每株主茎的地上部分干重，三次重复的平均值作为该样品地上部分干重的最终结果，如表1中地上部分干重所示。

二、基因SbSOS1相关的SNP分子标记的发现

1、246份高粱自交系关联群体的全基因组测序

246份高粱自交系关联群体的全基因组测序数据由中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室景海春实验室提供。

2、基因SbSOS1相关的SNP分子标记的发现

根据高粱自交系地上部分干重和其基因组测序结果，筛选出一个与高粱地上部分干重相关基因SbSOS1的SNP位点。该SNP对应于高粱自交系BTx623第8号染色体上第62627576位(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为C或G，对应序列表中SEQ IDNo.1的第880位。序列表中SEQ ID No.1的s表示g或c。

各个高粱品种的基因型检测结果如表1所示。结果显示SNP位点有2种基因型(简称SNP基因型)，即CC或GG，基因型CC是SNP为C的纯合型，基因型GG是SNP为G的纯合型。

选择将上述得到的与基因SbSOS1相关的基因型用于鉴定或辅助鉴定不同品系高粱的地上部分干重；将基因型为CC的高粱作为鉴定或辅助鉴定不同品系高粱的地上部分干重的分子标记，含有基因型为CC的高粱的高粱品系的地上部分干重可能高于0.12kg。

三、基因SbSOS1相关的SNP分子标记专用引物的设计及其方法的建立

1、基因SbSOS1相关SNP位点的基因组特异引物设计

设计SNP的特异引物序列(序列表中的SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4)，均由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司合成。

鉴定SNP位点多态性的引物组F1如下：

特异性引物F1-A(SEQ ID No.2)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTGCAGGGCCCTGGAAGAC-3’

特异性引物F1-B(SEQ ID No.3)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTGCAGGGCCCTGGAAGAG-3’

通用引物F1-C(SEQ ID No.4)：5’-CAACCTAGGCCTAGCAGCTGAGAT-3’

上述鉴定SNP位点多态性的引物组F1是根据序列SEQ ID No.1正义链设计。

上述引物F1-A中下划线序列为FAM序列；F1-B中下划线序列为HEX序列。

上述序列SEQ ID No.2与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ IDNo.1中SNP位点为C的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；上述序列SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ ID No.1中SNP位点为G的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。

2、检测方法的建立

2.1 DNA提取

提取供试品种高粱的叶片基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板用于PCR扩增。

2.2 PCR扩增和荧光信号检测

使用步骤1中SNP引物组F1分别进行PCR扩增2.1中得到的模板，检测SNP位点的多态性(核苷酸种类)和基因型；利用Douglas-Araya高通量流水线式荧光信号扫描仪对F1引物组的PCR产物进行荧光数据读取，用Douglas专用软件-Kraken进行荧光信号处理。

配制引物混液：先将引物F1-A、引物F1-B、引物F1-C这3条引物分别用ddH₂O稀释成100mmol·L^-1，分别得到引物F1-A溶液、引物F1-B溶液、引物F1-C溶液。取引物F1-A溶液60μL、引物F1-B溶液60μL、引物F1-C溶液150μL，加入10mM Tris-HCL 230μL，得到引物混液F1。

2μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.02μL，LGC公司1×KASP Mix(Low Rox)0.6μL，其余为ddH₂O。按照Douglas-Nexar及Soellex水浴系统的操作手册，编辑程序并运行，保存数据。

若F1引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP位点的基因型为CC(即高粱基因组中SNP位点为C的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP位点的基因型为GG(即高粱基因组中SNP位点为G的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP位点的基因型为CG(即高粱基因组中SNP位点为C和G的杂合型)。

确定基因SbSOS1相关的基因型从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的的地上部分干重：待测高粱SNP的基因型为基因型CC的高粱(如高粱自交系)的地上部分干重高于或候选高于SNP基因型为基因型GG的高粱(如高粱自交系)。

实施例2、高粱地上部分干重显著关联的SbSOS1基因的SNP分子标记的应用

待测高粱：246份高粱自交系关联群体

一、高粱的地上部分干重测定

方法同实施例1。结果表明，在中国山东省东营市农高新区轻度盐碱地的农田土壤中种植246份高粱自交系，不同高粱品种的地上部分干重存在显著差异，高粱地上部分干重范围0.045-0.3kg，其中150个高粱自交系的地上部分干重超过或等于0.12kg，约占该关联群体的60.98％。

二、分子鉴定或辅助鉴定高粱自交系的的地上部分干重

提取待测高粱基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板。采用实施例1中的SNP位点的基因组特异引物SNP引物组F1进行PCR扩增，得到SbSOS1基因的SNP位点的多态性信息，从而确定待测高粱的基因SbSOS1相关的基因型，从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的地上部分干重：待测高粱SNP的基因型为CC的高粱(如高粱自交系)的地上部分干重高于或候选高于SNP基因型为GG的高粱(如高粱自交系)。

246份待测高粱中SNP位点基因型和高粱的地上部分干重表型如表1所示，待测高粱的SNP位点包含CC和GG两种基因型(SNP基因型列所示)。

检测结果表明，246份高粱品种中，169个基因型为CC的高粱品种中，有115个基因型为CC的高粱品种地上部分干重高于等于0.12kg，即68.05％的基因型为CC的高粱品种中地上部分干重高于等于0.12kg；77个基因型为GG型的高粱品种中，有42个高粱品种地上部分干重低于0.12kg，即54.55％的基因型为GG的高粱品种中地上部分干重低于0.12kg。这表明可利用SNP分子标记选育基因型为CC的高地上部分干重的高粱品种，淘汰基因型为GG的低地上部分干重的高粱品种，本发明中的SNP分子标记用于高粱地上部分干重辅助选择是切实有效的。

表1 246份高粱自交系的地上部分干重和SNP位点的基因型

备注：IS:Sweet Sorghum；IG:Grain Sorghum；LG:Grain Sorghum；AL:unknown；LB:Broom Sorghum

对两种基因型与地上部分干重进行差异显著性分析，结果表明SNP的纯合基因型(CC)高粱地上部分干重与纯合基因型(GG)高粱存在显著差异(P<0.05)，基因型SNP-CC对应的高粱地上部分干重高于或候选高于SNP-GG对应的高粱。

表2基因SbSOS1的SNP位点不同基因型对应的246份高粱自交系的地上部分干重及差异分析

基因型	品种数/个	中位数(kg)	干重(kg)
				CC	169	0.14	<![CDATA[0.1447±0.05021<sup>a</sup>]]>
GG	77	0.1133	<![CDATA[0.1254±0.04787<sup>b</sup>]]>

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的方法，所述方法包括检测待测高粱中SNP的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重：所述基因型为CC的高粱的地上部分干重高于或候选高于基因型为GG的高粱；所述SNP是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸，其为C或G；所述CC是序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸为C的纯合型，所述GG是序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸为G的纯合型。

2.高粱育种的方法，包括检测待测高粱中权利要求1中所述SNP的多态性或基因型，选择基因型为CC的高粱为亲本进行育种。

3.权利要求1所述的方法在高粱育种中的应用。

4.应用，其特征在于：所述应用为P1或Q1：

所述P1为检测SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定高粱的地上部分干重中的应用，所述SNP是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ ID No.1的第880位核苷酸，其为C或G；

5.应用，其特征在于：所述应用为检测SNP的多态性或基因型的物质在高粱育种或制备高粱育种产品中的应用；所述SNP是高粱基因组的一个SNP，为序列表中SEQ IDNo.1的第880位核苷酸，其为C或G。

6.产品，其特征在于，所述产品含有权利要求4中所述检测高粱基因组SNP的多态性或基因型的物质，且为下述G1)-G3)中的任一种：

G2)鉴定或辅助鉴定高粱地上部分干重的产品；

G3)用于高粱育种的产品。

7.根据权利要求2所述的方法、权利要求3或5中任一所述的应用或权利要求6所述的产品，其特征在于：所述高粱育种为培育高地上部分干重高粱或选育地上部分干重高的高粱。

8.根据权利要求1或2所述的方法、权利要求3-5中任一所述的应用或权利要求6所述的产品，其特征在于：所述检测SNP的多态性或基因型的物质为如下D1)、D2)或D3)：

D2)含有D1)所述PCR引物的体外核酸扩增试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒。

9.根据权利要求8所述的应用或产品或方法，其特征在于：所述体外核酸扩增引物为F1-1、F1-2：

10.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。