CN118147357A - 分子标记组合在检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记领域，特别涉及分子标记组合在检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度中的应用，解决了如何检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’的种子纯度的技术问题。本发明的一个技术方案为检测瓠瓜基因组中SNP1101的多态性或基因型的组合物1和检测瓠瓜基因组中SNP1102的多态性或基因型的组合物2在检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度中的应用。发明人筛选出了适用于‘苏砧1号’种子纯度鉴定的2个SNP位点及针对其的引物组合，可实现‘苏砧1号’种子的高通量、高效率纯度鉴定，克服田间鉴定费时、费工的缺点，为保障瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’的种子质量提供强有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分子标记领域，特别涉及分子标记组合在检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度中的应用。
背景技术
西瓜是一种重要的园艺作物，不能重茬，受到枯萎病等土传病害的限制，而嫁接是解决西瓜连作障碍最环保有力的方法。‘苏砧1号’是由江苏省农业科学院蔬菜研究所自主选育的瓠瓜类杂种一代西瓜嫁接专用砧木品种(‘苏砧1号’为葫芦属瓠瓜品种，其可作为砧木用于西瓜嫁接)，2023年通过江苏省非主要农作物品种认定(非主要农作物认定证书编号2023-1-011)。种子长方形，种皮灰褐色，种壳坚硬，千粒质量约130g。根系发达，吸肥力强，下胚轴粗壮不易空心，有利于嫁接作业。嫁接亲和力、共生亲和性强，嫁接成活率高。生长势稳健，结果率高，抗西瓜枯萎病，耐低温弱光，耐瘠薄，不影响西瓜的品质，增产效果明显。
高质量种子是实现作物优质高产高效的基本条件。种子纯度是衡定种子质量的重要指标。‘苏砧1号’西瓜砧木在制种过程中易混入母本或其他砧木种子，而传统的田间纯度检测存在观察周期长耗时较长、田间工作量大、耗费成本高、用工量大、受季节和天气的影响等诸多因素。
近年来，随着下一代测序技术的发展，分子标记被用于作物的纯度鉴定。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是基于下一代测序发展起来的第三代分子标记，具有遗传稳定性好、共显性、二等位基因变异、密度高、易实现高通量和自动化检测等优点，被认为是最适宜用于种子纯度检测的标记之一。竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种基于SNP的无凝胶荧光聚合酶链式反应基因分型技术，已广泛应用于农作物的资源鉴定、遗传育种辅助选择、优良性状基因定位和种子质量检测等研究中。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’的种子纯度。
为了解决上述技术问题，本发明提供了检测瓠瓜基因组中SNP1101的多态性或基因型(即等位基因)的组合物1和检测瓠瓜基因组中SNP1102的多态性或基因型(即等位基因)的组合物2在检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度中的应用；
所述SNP1101是瓠瓜基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为C或T，为SEQ IDNo.1第25位核苷酸；所述组合物1包含扩增包括所述SNP1101位点在内的瓠瓜基因组DNA片段的PCR引物1；
所述SNP1102是瓠瓜基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为A或T，为SEQ IDNo.2第26位核苷酸；所述组合物2包含扩增包括所述SNP1102位点在内的瓠瓜基因组DNA片段的PCR引物2。
上述应用中，所述PCR引物1为P1或P2：
P1、所述PCR引物1为由核苷酸序列是SEQ ID No.3的第22-45位单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.4的第22-46位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.5的的单链DNA组成的引物组；
P2、所述PCR引物1为由核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA、核苷酸序列是SEQID No.4的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA组成的引物组。
上述应用中，所述PCR引物2为Q1或Q2：
Q1、所述PCR引物2为由核苷酸序列是SEQ ID No.6的第22-47位单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.7的第22-47位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.8的的单链DNA组成的引物组；
Q2、所述PCR引物2为由核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA、核苷酸序列是SEQID No.7的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.8的单链DNA组成的引物组。
上述应用中，所述组合物1可为通过下述至少一种方法确定SNP1101的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
上述应用中，所述组合物1为如下D1)、D2)或D3)：
D1)含有扩增包括所述SNP1101位点在内的瓠瓜基因组DNA片段的PCR引物1；
D2)含有D1)所述PCR引物1的PCR试剂；
D3)含有D1)所述PCR引物1或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
上述应用中，所述组合物2可为通过下述至少一种方法确定SNP1102的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
上述应用中，所述组合物2为如下E1)、E2)或E3)：
E1)含有扩增包括所述SNP1102位点在内的瓠瓜基因组DNA片段的PCR引物2；
E2)含有E1)所述PCR引物2的PCR试剂；
E3)含有E1)所述PCR引物2或E2)所述PCR试剂的试剂盒。
上述应用中，所述PCR引物1或所述PCR引物2可被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。如所述PCR引物1可为由核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA、核苷酸序列是SEQ IDNo.4的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA组成的引物组，序列表中SEQ IDNo.3由45个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为FAM接头序列(作为标记物)，第22-45位核苷酸为特异序列；序列表中SEQ ID No.4由46个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为VIC接头序列(作为标记物)，第22-46位核苷酸为特异序列；如所述PCR引物2可为由核苷酸序列是SEQ IDNo.6的单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.7的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.8的单链DNA组成的引物组，序列表中SEQ ID No.6由47个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为FAM接头序列(作为标记物)，第22-47位核苷酸为特异序列；序列表中SEQ ID No.7由47个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为VIC接头序列(作为标记物)，第22-47位核苷酸为特异序列。
下述含有所述组合物1和所述组合物2的产品也属于本发明的保护范围，所述产品为检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度的产品。
上述产品中，所述SNP1101是瓠瓜基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为G或A，为SEQ ID No.1第25位核苷酸。所述检测瓠瓜基因组中SNP1101位点的多态性或基因型(即等位基因)具体可为检测SNP1101的核苷酸种类。瓠瓜基因组中SNP1101的基因型可为CC、TT或CT。所述CC是瓠瓜基因组中所述SNP1101为C的纯合型，所述TT是瓠瓜基因组中所述SNP1101为T的纯合型，所述CT是瓠瓜基因组中所述SNP1101为C和T的杂纯合型；
上述产品中，所述SNP1102是瓠瓜基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为A或T，为SEQ ID No.2第26位核苷酸。所述检测瓠瓜基因组中SNP1102位点的多态性或基因型(即等位基因)具体可为检测SNP1102的核苷酸种类。瓠瓜基因组中SNP1102的基因型可为AA、TT或AT。所述AA是瓠瓜基因组中所述SNP1102为A的纯合型，所述TT是瓠瓜基因组中所述SNP1102为T的纯合型，所述AT是瓠瓜基因组中所述SNP1102为A和T的杂纯合型。
上述产品中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物1、PCR引物2、PARMS mastermix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物1、PCR引物2、PARMS mastermix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测瓠瓜基因组中QTL qGL3B.1位点的多态性或基因型的组合物。
本发明基于瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’父、母本简化基因组测序结果，筛选出适用于‘苏砧1号’种子纯度鉴定的2个SNP标记，并设计出用于检测SNP标记的2个引物组合。利用这2个SNP标记，可实现‘苏砧1号’种子的高通量、高效率纯度鉴定，克服田间鉴定费时、费工的缺点，为保障瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’的种子质量提供强有力的技术支撑。
附图说明
图1是本发明实施例2中用于瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度鉴定的SNP1101位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为TT；中间一簇的基因型为CT，右下角一簇的基因型为CC。
图2是本发明实施例2中用于瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度鉴定的SNP1102位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为AA；中间一簇的基因型为TA，右下角一簇的基因型为TT。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’于2023年通过江苏省非主要农作物品种认定，非主要农作物认定证书编号2023-1-011。
实施例1SNP标记及引物的确定
(1)对‘苏砧1号’父本14S-80、母本14S-59进行简化基因组测序，将得到的短序列reads与瓠瓜参考基因组比对，检测父、母本与参考基因组之间的SNP，然后进行群体SNP过滤，过滤参数：测序深度过滤，平均测序深度大于等于5X；MAF(Minor allele frequency)最小等位基因频率大于等于0.05；样品SNP信息完整度为大于等于0.70；SNP质量值Q大于等于30；等位基因数为2。
然后在每条染色体上挑选1个SNP进行一代测序验证并进行KASP分型，最终选出分型结果稳定且物理位置比较远的2个SNP标记，分别编号为SNP1101、SNP1102。
其中，SNP1101对应于瓠瓜参考基因组染色体1第1871367位置，具体为SEQ IDNo.1第25位核苷酸，其核苷酸种类为C或T，以字母Y代表。其第一种等位基因型为CC(即SEQ IDNo.1第25位核苷酸为C的纯合型)；其第二种等位基因型为TT(即SEQ ID No.1第25位核苷酸为T的纯合型)；其第三种等位基因型为CT(即SEQ ID No.1第25位核苷酸为C和T的杂合型)。
SEQ ID No.1
GGACCTAGCAACTCGTTTGAGATCYCCACTTTCCATTGACTCAATGGATGT TCGTATTTTGAACCTCTCAAAGAAGCTGATGAACATGGCAT
SNP1102对应于瓠瓜参考基因组染色体7第21149691位置，具体为SEQ ID No.2第26位核苷酸，其核苷酸种类为A或T，以字母W代表。其第一种等位基因型为AA(即SEQ IDNo.2第26位核苷酸为T的纯合型)；其第二种等位基因型为TT(即SEQ ID No.2第26位核苷酸为C的纯合型)；其第三种等位基因型为AT(即SEQ IDNo.2第26位核苷酸为A和T的杂合型)。
SEQ ID No.2
TGGAACCACCGAGTCTACTATGATTWCCTTTCCATCGTTTGGAATTGCAGTGTAGCAATTTTTCAACAACTTTA
本发明确定的基于KASP技术检测上述SNP位点的引物序列见表1：
表1引物序列
上游引物5'端分别添加了探针序列：上游分型引物F1、F2均添加了FAM探针序列，上游分型引物V1、V2均添加了VIC探针序列。
上述SEQ ID No.3与SEQ ID No.5所示的单链DNA分子扩增SEQ ID No.1第25位核苷酸为C的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；
上述SEQ ID No.4与SEQ ID No.5所示的单链DNA分子扩增SEQ ID No.1第25位核苷酸为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到与VIC序列结合的荧光基团的荧光信号。
上述SEQ ID No.6与SEQ ID No.8所示的单链DNA分子扩增SEQ ID No.2第26位核苷酸为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；
上述SEQ ID No.7与SEQ ID No.8所示的单链DNA分子扩增SEQ ID No.2第26位核苷酸为A的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到与VIC序列结合的荧光基团的荧光信号。
PCR反应完成后对反应产物进行荧光数据读取。FAM荧光激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC荧光激发波长为526nm，发射波长为543nm。
SNP1101的父本样品KASP分型结果为TT；SNP1101的母本样品KASP分型结果为CC；SNP1102的父本样品KASP分型结果为AA；SNP1102的在母本样品的KASP分型结果为TT。具体见表2:
表2‘苏砧1号’及其双亲以2组引物的分型结果
| 样品名称 | SNP1101 | SNP1102 |
| 苏砧1号 | CT | TA |
| 父本 | TT | AA |
| 母本 | CC | TT |
实施例2‘苏砧1号’瓠瓜类型西瓜砧木品种种子纯度的鉴定
本实例具体提供了一种瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度鉴定的方法，包括以下步骤：
1.DNA的提取
随机取‘苏砧1号’西瓜杂交种和父、母本种子，播种于穴盘中育苗，幼苗子叶展平时，取杂交种537株和父、母本各5株的少量叶。使用植物基因组DNA提取试剂盒提取各样品的DNA。
2.利用KASP技术进行基因分型检测
具体步骤：
(1)针对SNP1101的引物组1，用TE(pH 8.0)稀释至10μM，然后按照上游分型引物F1：上游分型引物V1：下游通用引物R1＝1:1:3的比例混合后上机，每5μL反应体系加1.25μL引物混合物。
针对SNP1102的引物组2，用TE(pH 8.0)稀释至10μM，然后按照上游分型引物F2：上游分型引物V2：下游通用引物R2＝1:1:3的比例混合后上机，每5μL反应体系加1.25μL引物混合物。
(2)DNA样本稀释和添加：DNA样本按最低浓度样本稀释至个位数的比例进行整批样品的稀释，每5μL反应体系中含有稀释后的DNA样本1.25μL。
(3)进行PCR扩增。PCR反应体系为，2×KASP master mix 2.5μL；引物混合物(针对SNP1101的引物组1或者针对SNP1102的引物组2)1.25μL；DNA样本1.25μL；总反应体系为5μL。PCR反应板进行封膜，震荡，离心，保证反应体系混合均匀。离心后进行PCR反应，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环的退火温度降低0.6℃；95℃变性20s；55℃退火延伸60s，27个循环；25℃读取结果30s。
3.结果分析
通过CFX Connect荧光定量PCR检测系统，获得各样品的基因分型结果，见图1和图2：
5株父本在SNP1101标记的基因型结果为TT、在SNP1102标记的基因型结果为AA；5株母本在SNP1101标记的基因型结果为CC、在SNP1102标记的基因型结果为TT。537株‘苏砧1号’杂交种中，534株在SNP1101标记的基因型结果为CT且在SNP1102标记的基因型结果为TA，说明真杂种株数为534株；3株在SNP1101标记的基因型结果为CC且在SNP1102标记的基因型结果为TT，说明该3株的种子为母本自交种子。该批‘苏砧1号’西瓜砧木杂交种的种子纯度为99.44％。
实施例3特异性标记SNP1101、SNP1102在其他西瓜砧木父母本及杂交种上的鉴定
选取西瓜砧木苏砧3号、苏砧4号父母本种子(苏砧3号父本为18S-57、苏砧3号母本为18S-55、苏砧4号父本为19S-68、苏砧4号母本为19S-84)各5粒与苏砧3号、苏砧4号杂交种种子各20粒，同时取苏砧1号父母本种子各5粒与苏砧1号杂交种种子各20粒，按照实施例2中的方法育苗，提取DNA，同时利用本发明涉及的2个SNP标记进行基因分型检测。PCR反应体系和反应条件如实施例2。
表3苏砧3号、苏砧4号与苏砧1号及其父母本在2个SNP位点上的分型结果
结果分析：获得苏砧3号、苏砧4号及其父母本在2个SNP位点上的分型结果，苏砧3号、苏砧4号父母本在2个SNP位点没有差异，表明通过标记SNP1101、SNP1102不能够将苏砧3号、苏砧4号父母本与其杂交种区分开来。而标记SNP1101、SNP1102对西瓜砧木苏砧1号及其父母本具有特异性。且苏砧1号与其它品种的SNP位点均存在差异，表明通过标记SNP1101、SNP1102能够将苏砧1号与其它瓠瓜类型西瓜砧木品种区分开来。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (6)
1.检测瓠瓜基因组中SNP1101的多态性或基因型的组合物1和检测瓠瓜基因组中SNP1102的多态性或基因型的组合物2在检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度中的应用；
所述SNP1101是瓠瓜基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为C或T，为SEQ ID No.1第25位核苷酸；所述组合物1包含扩增包括所述SNP1101位点在内的瓠瓜基因组DNA片段的PCR引物1；
所述SNP1102是瓠瓜基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为A或T，为SEQ ID No.2第26位核苷酸；所述组合物2包含扩增包括所述SNP1102位点在内的瓠瓜基因组DNA片段的PCR引物2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PCR引物1为P1或P2：
P1、所述PCR引物1为由核苷酸序列是SEQ ID No.3的第22-45位单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.4的第22-46位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.5的的单链DNA组成的引物组；
P2、所述PCR引物1为由核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA、核苷酸序列是SEQ IDNo.4的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA组成的引物组。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PCR引物2为Q1或Q2：
Q1、所述PCR引物2为由核苷酸序列是SEQ ID No.6的第22-47位单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.7的第22-47位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.8的的单链DNA组成的引物组；
Q2、所述PCR引物2为由核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA、核苷酸序列是SEQ IDNo.7的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.8的单链DNA组成的引物组。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述组合物1为如下D1)、D2)或D3)：
D1)含有所述PCR引物1；
D2)含有D1)所述PCR引物1的PCR试剂；
D3)含有D1)所述PCR引物1或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
5.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述组合物2为如下E1)、E2)或E3)：
E1)含有所述PCR引物2；
E2)含有E1)所述PCR引物2的PCR试剂；
E3)含有E1)所述PCR引物2或E2)所述PCR试剂的试剂盒。
6.含有权利要求1-5任一所述组合物1和含有权利要求1-5任一所述组合物2的产品，所述产品为检测瓠瓜类型西瓜砧木品种‘苏砧1号’种子纯度的产品。
Priority Applications (1)
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