CN112048569B

CN112048569B - 与小麦低多酚氧化酶活性基因QPpo-5D共分离的分子标记

Info

Publication number: CN112048569B
Application number: CN202011155159.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡瑾; 吴纪中; 付必胜; 刘彩云; 张巧凤; 郭炜; 吴小有
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112048569A

Abstract

本发明公开了一个与小麦低多酚氧化酶活性基因QPpo‑5D共分离的分子标记，属于农业生物技术范畴。以一个极低多酚氧化酶活性小麦种质和高PPO活性小麦种质扬麦杂交构建重组自交系RIL群体，通过小麦分子标记技术将该抗性基因定位到染色5DL5‑0.76‑1.00区段中。为了发掘该低PPO活性基因QPpo‑5D新的分子标记，运用SNP标记转换方法开发出了一个KASP标记AX‑110939270。该标记作为低PPO活性基因QPpo‑5D新的分子标记，能够更好地应用于小麦低PPO活性品种的辅助选择上，从而克服常规育种的不足，简化选择方法和提高育种效率，进而加快高白度、高品质品种的育种进程。

Description

与小麦低多酚氧化酶活性基因QPpo-5D共分离的分子标记

技术领域

本发明涉及与小麦低多酚氧化酶活性基因QPpo-5D紧密连锁的分子标记，可应用于分子标记辅助育种，属于农业生物技术领域。

背景技术

我国是世界上最大的小麦生产国和消费国之一，面制食品是我国居民的重要食品。在面粉储存和面制食品加工过程中，颜色褐变的现象非常普遍。褐变不仅降低了面制食品的白度，同时也影响了其营养价值。籽粒多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性是引起面制品褐变的主要原因。在PPO的作用下，酚类底物与氧发生反应产生醌类物质，醌在植物体内能发生自身聚合或与细胞内的氨基酸和蛋白质发生反应，产生黑色或褐色的沉积物，从而导致面团褐变。小麦籽粒中的PPO活性可以解释面团色泽稳定性的50％-70％。因此，通过遗传育种途径降低籽粒PPO活性，对提升小麦面粉的白度、保障面制品食品安全具有重要意义。

随着生物技术的发展，DNA分子标记的类型逐渐丰富。如兴起于70年代基于DNA杂交技术的RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)；兴于90年代的，基于PCR技术的AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA，随机扩增DNA多态性)、SSR(simple sequence repeats，简单重复序列)；基于DNA序列的分子标记，如STS(sequencetagged sites，序列标签位点)、EST(expressed sequence tags，表达序列标签)、SNP(single nucleotide-acid polymorphism，单核苷酸多态性)等。2010年后，随着生物信息学技术的蓬勃发展，各种基于测序的分子标记应运而生，如：GBS(genotyping bysequencing，测序基因分型)、高密度SNP基因型芯片(90K、660K、55K等)、KASPar(KBioscience’competitive allele specific PCR,竞争性等位特异性PCR)。分子标记的发展与使用大大地推动了新位点或新基因的发掘，小麦籽粒低PPO活性基因的发掘也得益于此。

小麦籽粒PPO活性是一个数量性状，表现为多基因家族。通过对多个不同遗传群体及基因表达分析表明，控制籽粒中PPO活性的相关遗传研究发现，控制PPO活性的主效基因位于第二同源群的2AL和2DL染色体上，且2AL染色体上的PPO基因对小麦籽粒PPO活性的影响要大于2DL染色体上的PPO基因。同时在其他染色体如3B、3D、4B和6B上也存在一些微效基因。

但是，除了位于第二同源染色体上控制PPO活性的主效基因，关于其它位点的基因发掘研究却非常少。IDO580等远缘杂种衍生系籽粒PPO活性极低的遗传机制尚未见报道。本实验室从小麦品种IDO580中系统选育出农艺性状较好，籽粒PPO活性更低更稳定的新品系IDO580-21。并用IDO580-21和扬麦158(长江中下游地区大面积推广小麦品种)配制杂交组合，构建了一个F_7-9代重组自交系群体(RIL)，其中亲本IDO580-21活性极低，而扬麦158的PPO活性很高。前期研究运用小麦55K SNP芯片分析法获得的SNP标记构建了高密度遗传图谱，并测定了群体籽粒PPO活性，在5D染色体长臂上定位到了一个效应大且稳定的低PPO活性新位点(QPpo-5D)。目前，小麦5D染色体长臂上尚未有低PPO活性位点的报道，开发新的与该位点紧密连锁的分子标记，将为该基因的分离与有效利用奠定基础。

发明内容

本发明针对上述研究背景，以低PPO活性小麦品种IDO580-21为低PPO活性材料筛选和寻找新的而且稳定存在与低PPO活性基因紧密连锁的分子标记及其方法，用于小麦低PPO活性分子标记辅助选择育种，能够克服常规遗传育种周期长等缺点。

与小麦低多酚氧化酶活性基因QPpo-5D基因共分离的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

与小麦低PPO活性基因QPpo-5D紧密连锁的分子标记引物，该引物是与小麦低PPO活性基因QPpo-5D紧密连锁的KASP标记AX-110939270的引物，引物序列如下：

前引物1：FAM 5’-CTCGTGAATTAGTAAACGACTATTTC-3’；

前引物2：HEX 5’-CTCGTGAATTAGTAAACGACTATTTG-3’；

后引物：5’-TGAAAGCAGATGCATCTGCCTTCTGGCTC-3’。

所述引物是与小麦低多酚氧化酶活性基因QPpo-5D紧密连锁的KASP标记AX-110939270的引物，标记AX-110939270与低多酚氧化酶活性基因紧密连锁，物理距离为144Kb。

本发明还提供上述分子标记在如下任意一项中的应用：

(1)在鉴定或辅助鉴定小麦低多酚氧化酶活性中的应用；

(2)在选育具有低多酚氧化酶活性的小麦中的应用。

一种低多酚氧化酶活性小麦的育种方法，采用上述的引物PCR扩增小麦叶片DNA，选择出现AX-110939270标记的HEX基因型品种。

进一步的，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析得到散点图，当基因型出现在Y轴区域时，表明所述小麦为HEX基因型品种；当基因型出现在X轴区域时，表明所述小麦为FAM基因型品种。

进一步的，PCR扩增的反应体系为：

本发明还提供一种用于鉴定小麦多酚氧化酶活性的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有上述的引物。

所述分子标记引物的应用，其特征在于，用所述与小麦低PPO活性基因QPpo-5D紧密连锁的KASP标记AX-110939270的引物PCR扩增小麦植株DNA，如果出现AX-110939270标记的HEX基因型，则表示该植株中小麦低PPO活性基因存在。所述的应用是以IDO580和扬麦158与其重组自交系为扩增小麦植株DNA对象的。

PCR反应体系5μl：内含2.5μl模板(～20ng/μl)、0.07μl KASP assay mix、LGCGenomics公司的2×KASP master mix 2.5μl；所述KASP assay mix(100μl)包括：每个等位基因特异性前引物各12μl(100μM)，30μl后引物(100μM)与46μl Tris-HCL(10mM，PH 8.3)。

反应循环程序如下：94℃预变性15min，然后按“94℃，20s；65-57℃，60s(每个循环下降0.8℃)”进行10个循环；最后按照“94℃，20s；57℃，60s”进行32个循环扩增；

荧光分析PCR产物运用PHERAstar(LGC Genomics)仪器，最后运用KlusterCaller(LGC Genomics)软件进行分型。

有益效果

多酚氧化酶(PPO)是引起小麦面制品褐变的主要原因，也是影响小麦面粉白度品质与影响价值的主要因素。本发明利用分子标记方法开发出一个新的与低PPO活性基因QPpo-5D紧密连锁的KASP标记，在小麦育种实践研究上都有很重要的价值。其优点具体归纳为以下两点：

(1)本发明中与小麦低PPO活性基因紧密连锁的KASP标记，是在对小麦品种IDO580-21中获得的新标记，而且稳定存在，可以用于小麦低PPO活性品种鉴定和小麦低PPO后代的分子标记辅助选择育种，从而克服常规育种的不足，简化选择方法和提高育种效率，进而加快高白度、高品质品种的育种进程。

(2)该标记为稳定的KASP标记，并且与低多酚氧化酶活性基因紧密连锁，物理距离为144Kb。可以直接用于小麦低多酚氧化酶活性分子标记辅助选择育种，加快育种进程。同时为克隆小麦低多酚氧化酶活性基因及其功能研究奠定了良好的基础。

附图说明

通过下面的详细描述并结合附图，将更清楚的理解本发明的目的、特征和其他优点，其中：

图1为5D上AX-110939270标记在亲本及RIL后代中的分离，其中，HEX基因型为表示该植株中小麦低PPO活性等位基因的存在。

图2为低PPO活性基因QPpo-5D的遗传连锁与物理图谱，其中AX-110939270与QPpo-5D紧密连锁。

图3为KASP标记AX-110939270在长江中下游小麦品种(系)中的表现，其中，HEX基因型为表示该植株中小麦低PPO活性等位基因的存在；

图4为长江中下游小麦品种中，FAM和HEX两种基因型品种籽粒多酚氧化酶活性的对比。

具体实施方式

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、与IDO580-21小麦低PPO活性基因连锁的分子标记的获得

1.植物材料

扬麦158(苏种审字179号)作为高PPO活性对照。IDO580-21(‘Cadoux’(PI591905)//‘Maya74’/M2)是由江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所种质资源评价与创新研究室保存并提供，其籽粒PPO活性极低。IDO580-21和扬麦158配制杂交组合，构建重组自交系群体。

2、籽粒PPO活性评价方法

本研究采用多巴(L-DOPA/MOPS)为底物，PPO催化L-DOPA形成醌类物质，进而引起褐变。每份材料分别选取饱满、无破损、无病害的籽粒，称重后分别放入96孔酶标板中，每孔1粒，每份材料设置8个重复和一个空白对照。反应底物为现配10mM L-DOPA(L-3,4-Dihydroxyphenylalanine,Sigma-Aldrich Co.)与50mM MOPS(3-[N-morpholino]propanesulfonic acid,Sigma-Aldrich Co.)缓冲液(pH6.5)。在酶标板中每孔加入上述反应底物150ul。将酶标板固定于摇床上，在37℃条件下以100rpm匀速振荡60min后，在EPOCH微孔板分光光度计(BioTek Instruments,Winooski,VT,USA)475nm处检测其吸光值(OD值)的变化，根据OD值上升的读数变化，根据下式计算PPO活性值。

AU＝Δ(Dn-Dck)/(60min×W)/10-3

式中Dn为样品吸光值(AU)，Dck为空白对照的吸光值(AU)，W表示种子的重量(g)。

数据处理及分析采用Excel和SAS9.2软件进行分析。

3、标记分析

基因组DNA的提取方法参照Maquire等的CTAB提取法，从嫩叶中提取总DNA，–4℃贮存备用。PCR反应在ThermoFisher仪器上进行，反应体系为5μL，内含2.5μl模板(～20ng/μl)、0.07μl KASP assay mix(每个等位基因特异性前引物12μl(100μM)，30μl后引物(100μM)与46μl Tris-HCL(10mM，PH 8.3)混合)、LGC Genomics公司的2×KASP master mix 2.5μl。反应循环程序如下：94℃预变性15min，然后按“94℃，20s；65-57℃，60s(每个循环下降0.8℃)”进行10个循环；最后按照“94℃，20s；57℃，60s”进行32个循环扩增。荧光分析PCR产物运用PHERAstar(LGC Genomics)仪器，最后运用KlusterCaller(LGC Genomics)软件进行分型。

3、标记开发

基于55K SNP芯片测序获得的序列：本研究运用IDO580-21和扬麦158配置杂交组合，构建了一个F_7-9代重组自交系(RIL)群体。前期研究运用小麦55K SNP芯片分析法获得的SNP标记构建了一个高密度遗传图谱，并在5D染色体长臂上(5D5-0.76-1.00区段)定位到了一个效应大且稳定的低PPO活性新位点，命名为QPpo-5D，该位点区段中的8个显著的SNP标记被转化为KASP标记。由于SNP芯片测序获得的序列较短，本研究通过该序列搜索对比普通小麦中国春的参考基因组序列(IWGSC RefSeq v1.0)，获得包含该SNP位点的长序列片段。利用软件Primer 3.0将于低PPO活性相关显著的8个SNP标记转化为KASP标记。其中4个在高、低PPO活性亲本间北检测出多态，并能重新定位到QPpo-5D的遗传图谱上(图2；表1)。

新开发的标记信息见表1，用于扩增所述分子标记的引物序列见表2。

表1新开发的标记信息

表2用于扩增所述分子标记的引物序列

实施例2、分子标记AX-110939270在以长江中下游品种(系)中的应用

为了验证AX-110939270标记在长江中下游品种(系)中的等位基因分布，以及是否能够运用于长江中下游品种(系)的育种改良，本研究利用AX-110939270标记对53份长江中下游品种(系)进行筛选，通过读取KASP标记扩增产物的荧光信号，得到荧光扫描结果，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析表明这些品种包含杂合与纯合高低PPO活性基因型。散点图中X轴区域的品种为“FAM”基因型，Y轴区域的品种为“HEX”基因型，介于两个区域之间的为杂合基因型(图1；3)。

KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)，可对SNP进行精准的双等位基因判断。KASP分析需要以下三个要素：1.KASP assay mix是由两条末端碱基为不同等位基因的正向引物与一条反向引物构成的，两条正向引物的5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2.Master Mix带有不同荧光(FAM和HEX)的两条检测引物；3.DNA模板。PCR反应中特异序列对应的检测引物随PCR反应进行而增长，从而产生相应的荧光信号。荧光分析PCR产物的读取运用PHERAstar(LGC Genomics)仪器，最后运用KlusterCaller(LGC Genomics)软件进行分型，得到散点图。

结果显示，标记基因型与小麦籽粒PPO活性呈显著相关(r＝-0.399，P<0.05)。将上述53份品种(系)按照AX-110939270标记基因型分为两组，结果显示含有QPpo-5D基因的品种籽粒多酚氧化酶活性显著低于不含有QPpo-5D基因的品种(图4)。其中，代表低PPO活性的“HEX”基因型品种要明显少于“FAM”基因型，说明长江中下游麦区的品种缺乏QPpo-5D基因。典型的低PPO活性种质宁麦资69、宁麦13、鄂恩1号等含有此基因。此结果表明AX-110939270标记可以应用于长江中下游麦区籽粒低PPO活性品质的分子标记辅助育种。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 与小麦低多酚氧化酶活性基因QPpo-5D共分离的分子标记

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctagccta agcatcgtac attgatgtac cctgccaaaa aaacagtaca ttgatgcaat 60

aatgtctgag gcatgatgcc aaagcaataa aagagatgtt tcagctgctc acaacggata 120

aatcatactc cctctgtccc aacgctttta tattatggga cggagggaat acttgccaac 180

tgagcacgcg ttaacacgta ttacaacgac ttacaagcaa gcaaggttag aaccagctac 240

caattaactt aataactatt cctgctacaa gatgacacat gcaggtacca cgagatcaaa 300

tgacgaagca acttccacat cggcagaggt gatctgagaa gaaataacac gtgccacatg 360

ccaggacgtc tgactaactc agcgagcttg acagctgcag ataaaagtac atttttttcc 420

attggcttga cttattctaa cgggcacatg tattggaaat cgacggctgg ccaactataa 480

tttggcgaac tataatttgg cgaggtactt tttctctatt attaaagttt ccatgtttag 540

agaagccatc gatgatcttg tgcaggcatt atatataaat acacaacgca tggtggcagt 600

ctatctcatt gtcacatata catcttcctt gattagtttt gtaaggctta atcagcgatg 660

gagtactcgc cgaagctagc agtagtggtg gtcttagctc tcgcgtccgc catggcggtc 720

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaatccctt ctctgtttga taagttgaat ttttcacaaa gcatttgaca gatccttgaa 60

gcgcatcgtt ttccatcctt aagtgtgtga tggcgttagc atttgacata atcattgagc 120

attccaaatg ccaccacaca gccaagaatg tacgtgatca ttgaccgagg aagcagagat 180

caatattgtg gtggtaaaga agctacaaag gcaggatctg gacaacccat tggccaattg 240

gagacagcac ggacattgaa ttggaaaatg acccacgttg tagcaacaaa atgaagcata 300

aaaaacccat ctgtttgaaa caacaaattg gtcggtgcat cacattcaac ttacattgaa 360

tttcctaggc aaggaatttt acgattcatc cttttgaaag gcgatgtgga ataccaatac 420

tcggaaaaga ttaagattca gagtaagggc caaggtaaat caactgtgca agagcgtgaa 480

tgataaatct ctcacgctgc aaatccaact caacttggaa tgcgatgcac cacttgctct 540

tccacactaa taagagtggg gtttagcaca gtgatgacta aaatgggagg ggcacgacta 600

aaatgaggag gggctctgct agaggagtag gctgtcgaag aagagaaggt ggttgctgct 660

actgaatgtg gcctactttg tcttacaatt gcttgtcttg agatcaacca cggtgccgcc 720

ccatgcacgc agcagcctca ccactgattt ctttaatctc atcgctggtg agaggtggtc 780

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagttcatga cctcttggac cttcaagggt gtgtgcgttc agatgtactt tttcctctcg 60

gaattacacc tgaatgatga gatagcaaat gctctccgtc ttaagcgagg ttttaatttt 120

atgcatgtag ttggtagcta ctgatggtcg gcccaatggc cttcttttgt tttatgcatg 180

tagttggtag ctactgctgt tgacttcgat ttgaagttca cctatgtggt ggtttgctgg 240

gaagggtcaa cacatgatgc taacattctc ggtgacagcc tgagtcatcc tgatggcatc 300

aacatcctcg atggcaagtt ctacctagga gatgctggct atgcatgtcg gtcaggtgtt 360

cttccaccat tcaggaaaac caggtaccat ccgaatgagt tcgctggtag gaactatcct 420

aggactccac aggagttgtt caatctcaga cactcagcct tagagttact attgagaggg 480

cctttggagc tccaaagaac aagtttaaga tcctagatca gaagccattc caccctttcc 540

tcactggggt caagcttgtt cttgttgtat tctgcatagc tggatcctgc aatggggttg 600

tgatgaattg gtgcctgagg aggaagatgt gacgcctgac gatgttgtca gctccggcca 660

tggtgtggag gcatttgaca acgaagcccg aaagaacaaa aagatggagt tgacacaagc 720

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atttggttga tctaaactcg tgaattagta aacgactatt tcttatacat ttctagaaca 60

cgtgcctttg agccagaagg cagatgcatc tgctttcaac tcaatgaacc cctcatatgc 120

ccatgaagca aagtttattt tttcctgttt tgaacttttt ctgattttgc tgccggtttg 180

attccacttt ggaggttcga cataggttcg gcagtgatga atttgatgtt catgtttagc 240

aatacaaaac tttgtggggt tgtataactt taatggcttt tgtatcatca accagtggta 300

caaattttat ttgacaagtg actgtttccc agttatctga gctctcattc gggttgctga 360

ccagctgcag agtgacttta ccggcgcagg ttctgtcggt gcggaagttg atcttctacg 420

gagcgtgttc tggtcaactg cgaagtagat ttgtcggatt tatcccctgg taaaataaaa 480

agatttgtac tacctccaat ccataaaaag tgtcgcagtt ttgaactaaa cccagttcaa 540

aaccgcgaca cttattttgg atcagaggga gtagggttta tctgtccagt ttggtaccct 600

<210> 5

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcttcttgt ccgacaatgg catgcccagg taggtacagg ggaactcatg gatcgggcag 60

tcaaagccgt gcaccagctc ttgaagatca atccctgtcg gtgtcaaaac cggtggatct 120

agggtagggg gtcccaaact gtgcgtctaa ggtcgatggt aacaagagac aggggacacg 180

atgtttaccc aggttcggac cctctctatg gaggtaatac cctacttcct tcttgactga 240

tcttgatgaa tacgagtatt acaagagttg atctaccacg agatcgtaat ggctaaaagc 300

ttaaaaccct agaagtctag cctgtatgat tatgattgtc cctatggact aaaccctccg 360

gtttatatag acaccggagg ggactagggt tgcacaaagt cggttataga gaaaggaatc 420

ttcatatctg ggcgccaagc ttgccttcca cgccaaggag agtcccatcc ggacacgggt 480

gagagtcttc attcttgtat cttcacagcc catcagtccg gcccatgtgc aacaggtcgg 540

acgcccgagg accccttagt ccaggactcc ctcagtagca cctgaaccag gcttcaatgt 600

cgaggtgtcc agcgcgcaga ttatcttcgg cattgcaaga cgggttcctc ctccgaatac 660

tccaaaacag cctttgaaca caaagaacgt gtccggctct gcaaaacaag taccacactc 720

aaccgcagag agtataatat ttcacgagtc caatctactg acaacttttt gtagtgtgat 780

<210> 6

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacggtgga gcaagagcac gggcagtcgg cactgtctcc gtcttacgcg aggacgcaga 60

gtgcccaaga gcacgccact acctgtcgcc aaggccaggg acgcccaaca agggaacgtg 120

gaatgcggaa tcaagtacgt gtcacacaac cagcaaacaa ggcaaggatg acaagccaga 180

ttagcgggaa acgaagagtg taagggaggt acaaggaagc gatgaaaaca ctatcaggac 240

agcacacccg ccatcctcta ccatttattc gcttgaactt gcaaagagct gccctgagtt 300

cagttgctcg ccccagtttt cccctcatgg tattttataa gacctggcac tttccttccc 360

cctggcgcca agggagcgtc cttggccgac acacggttgt ctgcaatcac tccgtttgca 420

ttgacattgc atgtaccggt atttccattt tcagggtgaa aataatcttt ctccttatac 480

atcgggtcga gtcatgccca acttaccctc cacgaccacc ttggcctcta ctgcccagcc 540

acctcttcca caagtagtgc taccacgagg ttgagcaatg aactcatttc taggttggaa 600

ccatcataaa atcgctaaat tgaaacttct ttggatcatg aaccccatcc ctgcattgtt 660

<210> 7

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgtctctt gtgctatagg tgtggtgtcc aaatttggtg tcactattgg aaagatggat 60

tggcttcaag ataggagctc atggtcgttg gctagcttgg atggcaaaga tcttggcagt 120

tttgattttg ttgtagcaac agataagaac atagcatcac aaaaagtttc tgggttgact 180

ggaaagccac cacctcttgg tttgttcgat tccattctct tcataatatg ctctacttac 240

tatcacatga caagatttct gtttttagtt ttctttttta agaacatgct tctaatcttc 300

cgacaagttc tacaaatcag gatggttatc actactccct ccgttcactt tttaaagatg 360

ttttagatat tttagacagc acctaaaaca gttcaatttc agctgtctta aatgacttac 420

aaaagtgaac agagggagta cttttaatta gagaaattat cctttcttac cctaagtgaa 480

ttgcttttcg tttctttgat ttatggctag catttatttt ccgatggagt aatggagtgc 540

tgctgtacac atgctgaaca gtcaaaatgt aagtaaataa gctatatgcg ctataaagcc 600

<210> 8

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attgcgcagt acttctgtac tatatgtgca aaatctgcaa attgcagaac gcgacgacga 60

ttgagggcat taaggattcc ctcgtccgta cagttgttgc gaaatactga aattgcgtcg 120

tcgtcgcaac agtcctttat cttgttttta acaaggagga atctagccca aaagtgctgg 180

actgtctccc gaggctgctg gtgcacatac attaggtcgc atatgtctgg agggccggag 240

ttgcttgggg aatattgctt gtggtgggtg ggtgggctcg aattcgcacc ctgacccact 300

gtggaatccg aagtttgaag aattttcgag gttaccaacc ccgactccgg agtgtccggc 360

gaattctcag gcttaacgtc cgatacggtg tttgggggac ggggagtgtc ctctcaagga 420

tgggtatccg gctttccggg ttcggaaatc cgaacgtagt ttgttctcag cgtaggataa 480

gatttattgt cagcttgttc ctccacaacc gctacttgat gggtgatcgg tggagattta 540

atttctctct gctcgggttt aggcccgatc cgatcatagt cagtggagac ccctagggcg 600

gcgatgcaat ctagcacctc gttcaaagac gatagacctg ccggatccat cttatcggag 660

Claims

1.AX-110939270标记的KASP引物在如下任意一项中的应用：

（1）在鉴定或辅助鉴定小麦低多酚氧化酶活性中的应用；

（2）在选育具有低多酚氧化酶活性的小麦中的应用；

所述KASP引物的序列如下：

前引物1：FAM 5’- CTCGTGAATTAGTAAACGACTATTTC -3’；

前引物2：HEX 5’- CTCGTGAATTAGTAAACGACTATTTG -3’；

后引物：5’- TGAAAGCAGATGCATCTGCCTTCTGGCTC -3’；

选择AX-110939270标记的荧光信号为HEX的品种；所述小麦为长江中下游麦区小麦。

2.一种低多酚氧化酶活性小麦的育种方法，其特征在于，采用权利要求1所述的KASP引物PCR扩增小麦叶片DNA，选择AX-110939270标记的荧光信号为HEX的品种；所述小麦为长江中下游麦区小麦。

3.根据权利要求2所述低多酚氧化酶活性小麦的育种方法，其特征在于，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析得到散点图，散点图中，X轴区域对应的荧光信号为FAM，Y轴区域对应的荧光信号为HEX，若扩增产物的荧光信号为FAM，表明所述小麦为CC基因型品种；若扩增产物的荧光信号为HEX，表明所述小麦为GG基因型品种。

4.根据权利要求3所述低多酚氧化酶活性小麦的育种方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：

20ng/µl 的2.5 µl模板、0.07 µl KASP assay mix、2×KASP master mix 2.5 µl；所述KASP assay mix包括：每个等位基因特异性前引物各12 µl 100 µM，30 µl后引物100 µM与46 µl Tris-HCl 10 mM，pH 8.3。

5.根据权利要求2所述低多酚氧化酶活性小麦的育种方法，其特征在于，PCR反应循环程序如下：94℃预变性15 min，然后按“94℃，20s；65-57℃，60s；每个循环下降0.8℃”进行10个循环；最后按照“94℃，20s；57℃，60s”进行32个循环扩增。