CN105112546A - 基于kasp技术检测小麦功能基因的成套引物及其应用 - Google Patents

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Abstract

本发明公开了一种基于KASP技术检测小麦功能基因的成套引物及其应用。本发明所提供的成套引物是针对小麦的14个功能基因分别设计的共14组KASP引物，其具体的核苷酸序列为序列表中序列1-42。利用本发明所提供的成套KASP引物，可以快速检测不同小麦品种功能基因，其检测方法简便、快捷，检测结果准确可靠。本发明对利用分子标记辅助选择小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。

Description

基于KASP技术检测小麦功能基因的成套引物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于KASP技术检测小麦功能基因的成套引物及其应用。
背景技术
近年来，基于DNA序列多态性的分子标记受到国内外育种家的高度重视。利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行选择，不受环境影响，选择结果可靠，而且在聚合有利性状时，可以在回交渗透过程中通过遗传背景选择，减少连锁累赘，加速育种进程。因此，通过现代分子生物学手段开发控制小麦重要性状的分子标记，对我国小麦育种具有重要意义。
迄今为止，小麦遗传育种中常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、STS、CAPS、DArT、SCAR和SNP。随着小麦基因的克隆，基于小麦功能基因开发的功能标记也逐渐得到应用。在小麦中，几十个重要性状的基因已经克隆，其相应的功能标记为育种家向新品种导入有利基因提供了方便，通过目标选择，并结合感兴趣性状的功能基因的有利等位变异，提高了选择效率，缩短了育种年限。Zhang等(2014)根据控制水稻籽粒大小的基因OsGS3同源克隆了小麦TaGS-D1基因，并据此开发了功能标记GS7D，经连锁分析发现与小麦千粒重有显著的相关性，应用于筛选千粒重较高的品种。Jiang等(2015)克隆了OsGIF(OsCWI2)在小麦中的同源基因TaCWI-4A，开发了caps4A标记，用于选择千粒重较高和穗粒数较多的品种。He等(2009)和Wang等(2009)分别开发了黄色素合成途径中八氢番茄红素合成酶基因Psy-B1的功能标记YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3和Psy1-D1的功能标记YP7D-1、YP7D-2，与小麦籽粒中的黄色素含量显著相关，可以通过检测该酶的等位基因型筛选黄色素含量较高(＝类胡萝卜素含量较高)、营养价值较好的品种，省去了做成品的步骤，方便了育种家选择优质品种。所以，利用功能标记检测不同小麦品种功能基因的等位基因型，给育种家辅助选择品种提供了很大帮助。
尽管这些功能标记在小麦功能基因检测方面已得到部分应用，但操作过程繁琐复杂，需要酶切、电泳，检测效率低。在育种过程中育种家筛选大量后代材料，需要较高成本和较长时间，此方法难以满足生产需要。因此，建立一种快速、高效、便捷检测不同小麦品种功能基因的方法非常必要。
KASP技术(即竞争性等位基因特异性PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之一，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因判断。引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3′端为等位变异碱基，5′端添加通用荧光接头序列，下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。该技术准确率高，灵活性超强，无需昂贵的双色标记探针，最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增，快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测小麦功能基因的成套KASP引物。
本发明提供了一种用于检测小麦功能基因的成套KASP引物，其中所述小麦功能基因为Ppo-D1基因、TaPod-A1基因、TaCKX6-D1基因、TaCW1-4A基因、TaGS-D1基因、TaGASR7-A1基因、1-FEHw3基因、Pinb2-v2基因、Psy-B1基因、Psy1-D1基因、TaZds-A1基因、Talyce-B1基因、TaPds-B1基因、Glu-B1基因，所述成套KASP引物具体由如下(1)-(14)组成：
(1)特异于所述Ppo-D1基因的KASP引物：引物1、引物2和引物3；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列1的第22-41位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列2的第22-41位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA；
(2)特异于所述TaPod-A1基因的KASP引物：引物4、引物5和引物6；所述引物4为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列4的第22-42位的单链DNA；所述引物5为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列5的第22-42位的单链DNA；所述引物6为核苷酸序列如序列表中序列6所示的单链DNA；
(3)特异于所述TaCKX6-D1基因的KASP引物：引物7、引物8和引物9；所述引物7为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列7的第22-44位的单链DNA；所述引物8为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列8的第22-39位的单链DNA；所述引物9为核苷酸序列如序列表中序列9所示的单链DNA；
(4)特异于所述TaCW1-4A基因的KASP引物：引物10、引物11和引物12；所述引物10为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列10的第22-53位的单链DNA；所述引物11为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列11的第22-53位的单链DNA；所述引物12为核苷酸序列如序列表中序列12所示的单链DNA；
(5)特异于所述TaGS-D1基因的KASP引物：引物13、引物14和引物15；所述引物13为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列13的第22-42位的单链DNA；所述引物14为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列14的第22-42位的单链DNA；所述引物15为核苷酸序列如序列表中序列15所示的单链DNA；
(6)特异于所述TaGASR7-A1基因的KASP引物：引物16、引物17和引物18；所述引物16为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列16的第22-41位的单链DNA；所述引物17为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列17的第22-41位的单链DNA；所述引物18为核苷酸序列如序列表中序列18所示的单链DNA；
(7)特异于所述1-FEHw3基因的KASP引物：引物19、引物20和引物21；所述引物19为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列19的第22-41位的单链DNA；所述引物20为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列20的第22-41位的单链DNA；所述引物21为核苷酸序列如序列表中序列21所示的单链DNA；
(8)特异于所述Pinb2-v2基因的KASP引物：引物22、引物23和引物24；所述引物22为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列22的第22-46位的单链DNA；所述引物23为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列23的第22-48位的单链DNA；所述引物24为核苷酸序列如序列表中序列24所示的单链DNA；
(9)特异于所述Psy-B1基因的KASP引物：引物25、引物26和引物27；所述引物25为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列25的第22-41位的单链DNA；所述引物26为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列26的第22-41位的单链DNA；所述引物27为核苷酸序列如序列表中序列27所示的单链DNA；
(10)特异于所述Psy1-D1基因的KASP引物：引物28、引物29和引物30；所述引物28为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列28的第22-46位的单链DNA；所述引物29为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列29的第22-47位的单链DNA；所述引物30为核苷酸序列如序列表中序列30所示的单链DNA；
(11)特异于所述TaZds-A1基因的KASP引物：引物31、引物32和引物33；所述引物31为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列31的第22-42位的单链DNA；所述引物32为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列32的第22-42位的单链DNA；所述引物33为核苷酸序列如序列表中序列33所示的单链DNA；
(12)特异于所述Talyce-B1基因的KASP引物：引物34、引物35和引物36；所述引物34为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列34的第22-46位的单链DNA；所述引物35为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列35的第22-46位的单链DNA；所述引物36为核苷酸序列如序列表中序列36所示的单链DNA；
(13)特异于所述TaPds-B1基因的KASP引物：引物37、引物38和引物39；所述引物37为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列37的第22-46位的单链DNA；所述引物38为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列38的第22-46位的单链DNA；所述引物39为核苷酸序列如序列表中序列39所示的单链DNA；
(14)特异于所述Glu-B1基因的KASP引物：引物40、引物41和引物42；所述引物40为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列40的第22-45位的单链DNA；所述引物41为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列41的第22-45位的单链DNA；所述引物42为核苷酸序列如序列表中序列42所示的单链DNA。
进一步，所述标签序列A的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-21位。
更加具体的，所述引物1为核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA；所述引物4为核苷酸序列如序列表中序列4所示的单链DNA；所述引物5为核苷酸序列如序列表中序列5所示的单链DNA；所述引物7为核苷酸序列如序列表中序列7所示的单链DNA；所述引物8为核苷酸序列如序列表中序列8所示的单链DNA；所述引物10为核苷酸序列如序列表中序列10所示的单链DNA；所述引物11为核苷酸序列如序列表中序列11所示的单链DNA；所述引物13为核苷酸序列如序列表中序列13所示的单链DNA；所述引物14为核苷酸序列如序列表中序列14所示的单链DNA；所述引物16为核苷酸序列如序列表中序列16所示的单链DNA；所述引物17为核苷酸序列如序列表中序列17所示的单链DNA；所述引物19为核苷酸序列如序列表中序列19所示的单链DNA；所述引物20为核苷酸序列如序列表中序列20所示的单链DNA；所述引物22为核苷酸序列如序列表中序列22所示的单链DNA；所述引物23为核苷酸序列如序列表中序列23所示的单链DNA；所述引物25为核苷酸序列如序列表中序列25所示的单链DNA；所述引物26为核苷酸序列如序列表中序列26所示的单链DNA；所述引物28为核苷酸序列如序列表中序列28所示的单链DNA；所述引物29为核苷酸序列如序列表中序列29所示的单链DNA；所述引物31为核苷酸序列如序列表中序列31所示的单链DNA；所述引物32为核苷酸序列如序列表中序列32所示的单链DNA；所述引物34为核苷酸序列如序列表中序列34所示的单链DNA；所述引物35为核苷酸序列如序列表中序列35；所述引物37为核苷酸序列如序列表中序列37所示的单链DNA；所述引物38为核苷酸序列如序列表中序列38所示的单链DNA；所述引物40为核苷酸序列如序列表中序列40所示的单链DNA；所述引物41为核苷酸序列如序列表中序列41所示的单链DNA；
上述(1)-(14)共14个KASP引物为分别单独包装。
本发明所提供的用于检测小麦功能基因的成套KASP引物，也可以为下述(a)或(b)：
(a)由来自于上述(1)中的所述KASP引物，以及来自于上述(2)-所述(14)中的任意N个所述KASP引物组成；所述N为1-13的整数；
(b)上述(1)中的所述KASP引物。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测小麦功能基因的试剂盒。
本发明所提供的用于检测小麦功能基因的试剂盒，含有所述成套KASP引物。
所述试剂盒中还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A淬灭探针B；
所述荧光探针A为与所述标签序列A一致的序列，5’末端连接1个荧光基团A；所述淬灭探针A为所述标签序列A的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团；
所述荧光探针B为与所述标签序列B一致的序列，5’末端连接1个荧光基团B；所述淬灭探针B为所述标签序列B的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团。
在本发明中，所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。
在本发明中，所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B是存在于KASP2×MasterMix中的，其中所述KASP2×MasterMix为英国LGC公司产品，其产品目录号为KBS-1016-002。
所述试剂盒中还含有MgCl2和ddH2O，其中所述MgCl2为英国LGC公司产品，其产品目录号为10364672，所述ddH2O为高压灭菌的双蒸水。
本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法。
本发明提供了检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法，其中所述小麦功能基因为Ppo-D1基因和如下中的至少一种：TaPod-A1基因、TaCKX6-D1基因、TaCW1-4A基因、TaGS-D1基因、TaGASR7-A1基因、1-FEHw3基因、Pinb2-v2基因、Psy-B1基因、Psy1-D1基因、TaZds-A1基因、Talyce-B1基因、TaPds-B1基因、Glu-B1基因，所述方法具体为如下(A)或(B)：
(A)由如下(a1)，以及如下(a2)-(a14)这13种中的至少一种组成：
(B)为如下(a1)；
(a1)检测或辅助检测待测小麦的Ppo-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为CG；
(a2)检测或辅助检测待测小麦的TaPod-A1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为AA；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为AG；
(a3)检测或辅助检测待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型为Del；
(a4)检测或辅助检测待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为CT；
(a5)检测或辅助检测待测小麦的TaGS-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为GT；
(a6)检测或辅助检测待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型为Del；
(a7)检测或辅助检测待测小麦的1-FEHw3基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为CT；
(a8)检测或辅助检测待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型为Del；
(a9)检测或辅助检测待测小麦的Psy-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为CT；
(a10)检测或辅助检测待测小麦的Psy1-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为CT；
(a11)检测或辅助检测待测小麦的TaZds-A1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为CG；
(a12)检测或辅助检测待测小麦的Talyce-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为CG；
(a13)检测或辅助检测待测小麦的TaPds-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为CG；
(a14)检测或辅助检测待测小麦的Glu-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为CG。
其中，Ins表示插入突变；Del表示缺失突变。
所述方法在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)千粒重和/或产量提高；
(b)籽粒长度增加；
(c)籽粒硬度提高；
(d)多酚氧化酶活性降低和/或小麦制品(如馒头、面条)褐变减少；
(e)过氧化物酶活性提高和/或面粉白度提高和/或面团粘性降低；
(f)黄色素含量提高；
(g)面筋强度提高。
本发明的第四个目的是提供一种培育小麦品种的方法。
本发明所提供的培育小麦品种的方法具体可为如下(C)或(D)：
(C)由如下(b1)，以及如下(b2)-(b7)这6种中的至少一种组成：
(D)为如下(b1)；
(b1)培育多酚氧化酶活性降低和/或小麦制品(如馒头、面条)褐变减少的小麦品种的方法，包括采用通过上述检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法检测得到的Ppo-D1基因的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b2)培育过氧化物酶活性提高和/或面粉白度提高和/或面团粘性降低的小麦品种的方法，包括采用通过上述检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法检测得到的TaPod-A1基因的基因型为AA的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b3)培育千粒重和/或产量提高的小麦品种的方法，包括采用通过上述检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法检测得到的TaCKX6-D1基因的基因型为Del，和/或TaCW1-4A基因的基因型为CC，和/或TaGS-D1基因的基因型为GG，和/或1-FEHw3基因的基因型为TT的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b4)培育籽粒长度增加的小麦品种的方法，包括采用通过上述检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法检测得到的TaGASR7-A1基因的基因型为Ins的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b5)培育籽粒硬度指数提高的小麦品种的方法，包括采用通过上述检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法检测得到的Pinb2-v2基因的基因型为Del的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b6)培育黄色素含量提高的小麦品种的方法，包括采用通过上述检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法检测得到的Psy-B1基因的基因型为TT，和/或Psy1-D1基因的基因型为CC，和/或TaZds-A1基因的基因型为GG，和/或Talyce-B1基因的基因型为CC，和/或TaPds-B1基因的基因型为GG的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b7)培育面筋强度提高的小麦品种的方法，包括采用通过上述检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法检测得到的Glu-B1基因的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种的步骤。
本发明基于KASP技术将功能标记转化成KASP标记，PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，实现了高通量、低成本快速检测功能基因的目的，为育种家筛选优异等位基因的小麦品种(材料)提供了方便，加快了育种进程。
附图说明
图1为采用CKX-D1_IND标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图2为采用CWI4A_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图3为采用TaGS-D1标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图4为采用TaGASR7-A1_IND标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图5为采用1-FEHw3_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图6为采用Pinb2_IND标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图7为采用PPOD1_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图8为采用PODA1_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图9为采用PSY_B1c_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图10为采用Psy1Da-g_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图11为采用TaZds-A1_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图12为采用TALYCE-B1_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图13为采用TaPds-B1_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
图14为采用BX7OE_SNP标记检测黄淮麦区部分小麦品种的基因分型图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所有引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
所用小麦品种均由国家小麦改良中心提供，公众可从国家小麦改良中心获取。
实施例1、小麦重要性状功能基因的KASP标记设计及其专用引物序列的开发
本发明涉及的小麦功能基因有Ppo-D1基因、TaPod-A1基因、TaCKX6-D1基因、TaCW1-4A基因、TaGS-D1基因、TaGASR7-A1基因、1-FEHw3基因、Pinb2-v2基因、Psy-B1基因、Psy1-D1基因、TaZds-A1基因、Talyce-B1基因、TaPds-B1基因、Glu-B1基因。
1、小麦功能基因的等位变异序列的获得
在NCBI数据库Nucelotide中输入上述小麦功能基因名称TaGS-D1、TaZds-A1，得到在小麦中该功能基因的两种变异形式，下载序列。从文献中获得Ppo-D1基因、TaPod-A1基因、TaCKX6-D1基因、TaCW1-4A基因、TaGASR7-A1基因、1-FEHw3基因、Pinb2-v2基因、Psy-B1基因、Psy1-D1基因、Talyce-B1基因、TaPds-B1基因、Glu-B1基因的变异序列。
Ppo-D1基因的序列及功能标记在文献“Allelicvariationofpolyphenoloxidase(PPO)geneslocatedonchromosome2Aand2DanddevelopmentoffunctionalmarkersforthePPOgenesincommonwheat.HeXY,HeZH,ZhangLP,SunDJ,MorrisCF,FuerstEP,XiaXCTheorApplGenet(2007)115:47–58”中公开过。
TaPod-A1基因的序列及功能标记在文献“Mappingquantitativetraitlociforperoxidaseactivityanddevelopinggene-specificmarkersforTaPod-A1onwheatchromosome3AL.WeiJ,GengH,ZhangY,LiuJ,WenW,ZhangY,XiaX,ChenX,HeZ.TheorApplGenet.2015July”中公开过。
TaCKX6-D1基因的序列及功能标记在文献“TaCKX6-D1,theorthologofriceOsCKX2,isassociatedwithgrainweightinhexaploidwheat.ZhangL,ZhaoYL,GaoLF,ZhaoGY,ZhouRH,ZhangBS,JiaJZ.NewPhytologist(2012)195:574-584”中公开过。
TaCWI-4A基因的序列及功能标记在文献“Ayield-associatedgeneTaCWI,inwheat:itsfunction,selectionandevolutioninglobalbreedingrevealedbyhaplotypeanalysis.JiangY,JiangQ,HaoC,HouJ,WangL,ZhangH,ZhangS,ChenX,ZhangX.TheorApplGenet(2015)128:131-143”中公开过。
TaGS-D1基因的序列及功能标记在文献“TaGS-D1,anorthologofriceOsGS3,isassociatedwithgrainweightandgrainlengthincommonwheat.ZhangYJ,LiuJD,XiaXC,HeZH.MolecularBreeding(2014)34,1097-1107”中公开过。
TaGASR7-A1基因的序列及功能标记在文献“NaturalvariationofTaGASR7-A1affectsgrainlengthincommonwheatundermultiplecultivationconditions.DongLL,WangFM,LiuT,DongZY,LiAL,JingRL,MaoL,LiYW,LiuX,ZhangKP,WangDW.MolecularBreeding(2014)34,937-947”中公开过。
1-FEHw3基因的序列及功能标记在文献“Awheat1-FEHw3variantunderliesenzyme
activityforstemWSCremobilizationtograinunderdrought.ZhangJingjuan,YunjiXu,WeiChen,BernardDell,RudyVergauwen,BenBiddulph,NusratKhan,HaoLuo,RudiAppelsandWimVandenEndeNewPhytologist(2015)205:293–305.”中公开过。
Pinb2-v2基因的序列及功能标记在文献“PhysicalmappingandanewvariantofPuroindolineb-2genesinwheat.FengChen,BrianS.Beecher,CraigF.MorrisTheorApplGenet.2010,120(4):745-51.”中公开过。
Psy-B1c基因的序列及功能标记在文献“Allelicvariantsofphytoenesynthase1(Psy1)genesinChineseandCIMMYTwheatcultivarsanddevelopmentoffunctionalmarkersforflourcolourX.YHe,Z.H.He,W.Ma,R.AppelsandX.C.XiaMolecularBreeding(2009)23:553-563”中公开过。
Psy1-D1基因的序列及功能标记在文献“Cloningandphylogeneticanalysisofphytoenesynthase1(Psy1)genesincommonwheatandrelatedspecies，JianwuWang,XinyaoHe,ZhonghuHe,HuiWangandXianchunXia，Hereditas(2009)146:208–256”中公开过。
TaZds-A1、Talyce-B1、TaPds-B1基因的序列及功能标记在硕士毕业论文“普通小麦籽粒黄色素含量相关基因的克隆与功能标记开发，董长海，2011”中公开过。
Glu-B1基因的序列及功能标记在文献“EvolutionaryoriginofthesegmentalduplicationencompassingthewheatGLU-B1locusencodingtheoverexpressedBx7(Bx7OE)highmolecularweightgluteninsubunit.RajaRagupathy,HamidA.Naeem,ElsaReimer,OdeanM.Lukow,HarryD.SapirsteinandSylvieCloutierTheoreticalandAppliedGeneticsInternationalJournalofPlantBreedingResearch(2007)116:666”中公开过。
2、使用GeneiousProv4.8.3.软件比对步骤1中的序列，查找非同义突变的SNP或Indel。其中，SNP为单核苷酸多态性位点；Indel为插入或缺失序列。
3、根据等位变异间的差异设计KASP标记
功能基因的等位变异序列如表1所示，中括号示出为非同义突变位点(SNP或Indel)，可以在此处设计KASP标记，且设计该位点位于上游引物的3′端，引物长度为20-30bp，为保证扩增产物在60-120bp，下游引物也应适当选择。
表114个功能基因的等位变异序列
注：表中下划线部分为相应KASP引物的对应位置。
4、KASP标记专用引物的开发
KASP标记的开发需要上游引物2条即引物1和引物2，下游引物1条即引物3。针对SNP位点，上游引物的3′端为等位变异碱基，根据中括号中的序列及其前面或后面的序列进行设计，下游引物1条，根据中括号后面或前面的序列进行设计。针对Indel位点，上游引物在Indel位点附近设计，引物1在Indel前设计，引物2在Ins序列的末端设计，下游引物在Indel的后面设计。下游序列的选择要保证扩增片段长度为60-120bp，上游引物5′端连接荧光标签序列，一条上游引物连接FAM荧光标签序列5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，另一条上游引物连接HEX荧光标签序列5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，本发明基于小麦重要性状的功能基因(上述14种功能基因)开发的KASP标记及其专用引物序列，具体见表2和表3。
表2本发明基于小麦重要性状的功能基因开发的KASP标记
性状 功能基因 等位基因或单倍型 KASP标记名称
多酚氧化酶 Ppo-D1 G/C PPOD1_SNP
过氧化物酶 TaPod-A1 G/A PODA1_SNP
千粒重 TaCKX6-D1 18bp InDel CKX-D1_IND
千粒重 TaCWI-4A C/T CWI4A_SNP
千粒重 TaGS-D1 G/T TaGS-D1_SNP
粒长 TaGASR7-A1 1369bp InDel TaGASR7-A1_IND
抗旱 1-FEH w3 C/T 1-FEH w3_SNP
籽粒硬度 Pinb2-v2 12bp InDel Pinb2_IND
八氢番茄红素合成酶 Psy-B1 T/C PSY_B1c_SNP
八氢番茄红素合成酶 Psy1-D1 C/T Psy1Da-g_SNP
β-胡萝卜素 TaZds-A1 G/C TaZds-A1_SNP
番茄红素 Talyce-B1 G/C TALYCE-B1_SNP
八氢番茄红素脱氢酶 TaPds-B1 C/G TaPds-B1_SNP
高分子量谷蛋白亚基 Glu-B1 G/C BX7OE_SNP
注：针对1-FEHw3基因，表5测量的抗旱指标是产量。
表3本发明开发的KASP标记的专用引物序列(每个标记三条引物)
注：表中加粗部分序列为上游引物中引入的标签序列。
实施例2、KASP标记检测小麦功能基因的体系建立
1、提取基因组DNA
取待测小麦品种的叶片组织，采用CTAB法提取叶片全基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用实施例1开发的用于检测14种功能基因的KASP标记的专用引物分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
KASP标记的引物工作液制备：
各取12μl上游引物(100μM)，30μl下游引物(100μM)，用无菌超纯水补充至100μl，作为KASP标记的引物工作液以备使用。
PCR扩增的反应体系：模板DNA1.76μl(浓度为30-50ng/μl)，引物工作液0.045μl，50mMMgCl2(LGC公司，LotNo.10364672)，KASP2×MasterMix2μl(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充反应体系至4μl。其中，KASP2×MasterMix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。
PCR扩增的反应程序：95℃预变性15min；95℃变性20s、复性20s(第一次的复性温度为65℃，每个循环降温1℃)共10个循环；95℃变性10s，57℃复性60s，共30个循环；10℃保存。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照，每个PCR板设置1个空白对照。
3、PCR扩增产物的荧光扫描
采用SynergyH1/H1MF酶标仪对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm，HEX激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光ROX激发波长为575，发射波长为610nm。
每个PCR扩增产物样本设置至少3个重复。
4、等位基因分型
采用KlusterCaller软件对酶标仪扫描数据分析(具体操作方法参考KlusterCaller软件说明书，公众可以直接从LGC公司购买，见网址http://www.lgcgroup.com/products/genotyping-software/klustercaller/#.VfoMoNKl-0F)，根据分析结果按照如下确定待测小麦功能基因的具体基因型：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好，扩增产物没有被明确分型，左下角显示黑色的样本为空白对照。
具体而言，如下：
(a1)判定Ppo-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为CG；
(a2)判定TaPod-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为AA；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为AG；
(a3)判定TaCKX6-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型为Del；
(a4)判定TaCW1-4A基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为CT；
(a5)判定TaGS-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为GT；
(a6)判定TaGASR7-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型为Del；
(a7)判定1-FEHw3基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为CT；
(a8)判定Pinb2-v2基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型为Del；
(a9)判定Psy-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示蓝色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示红色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示绿色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为CT；
(a10)判定Psy1-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示蓝色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示红色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示绿色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为CT；
(a11)判定TaZds-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示蓝色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示红色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示绿色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为CG；
(a12)判定Talyce-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示蓝色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示红色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示绿色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为CG；
(a13)判定TaPds-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示蓝色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示红色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示绿色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为CG；
(a14)判定Glu-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示蓝色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示红色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现显示绿色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为CG。
实施例3、KASP标记检测小麦功能基因的方法在育种中的应用
1、采用本发明实施例1开发KASP标记检测种植在河南安阳的黄淮麦区121个小麦品种(见表4)的14个功能基因的基因型，具体操作参见实施例2，获得各品种的功能基因的基因型，具体结果参见表4。
部分小麦样本的基因分型图如图1-图14所示，左下角显示黑色的样本为每个PCR板的空白对照，聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好，扩增产物没有被明确分型。
2、采用常规的功能标记检测种植在河南安阳的黄淮麦区121个小麦品种(见表4)，获得各品种的功能基因的基因型。
常规的功能标记检测方法如下：
(1)Ppo-D1基因的基因型检测：参照文献“Allelicvariationofpolyphenoloxidase(PPO)geneslocatedonchromosome2Aand2DanddevelopmentoffunctionalmarkersforthePPOgenesincommonwheat.HeXY,HeZH,ZhangLP,SunDJ,MorrisCF,FuerstEP,XiaXCTheorApplGenet(2007)115:47–58”中记载方法进行。
(2)TaPod-A1基因的基因型检测：参照文献“Mappingquantitativetraitlociforperoxidaseactivityanddevelopinggene-specificmarkersforTaPod-A1onwheatchromosome3AL.WeiJ,GengH,ZhangY,LiuJ,WenW,ZhangY,XiaX,ChenX,HeZ.TheorApplGenet.2015July”中记载方法进行。
(3)TaCKX6-D1基因的基因型检测：参照文献“TaCKX6-D1,theorthologofriceOsCKX2,isassociatedwithgrainweightinhexaploidwheat.ZhangL,ZhaoYL,GaoLF,ZhaoGY,ZhouRH,ZhangBS,JiaJZ.NewPhytologist(2012)195:574-584”中记载方法进行。
(4)TaCWI-4A基因的基因型检测：参照文献“Ayield-associatedgeneTaCWI,inwheat:itsfunction,selectionandevolutioninglobalbreedingrevealedbyhaplotypeanalysis.JiangY,JiangQ,HaoC,HouJ,WangL,ZhangH,ZhangS,ChenX,ZhangX.TheorApplGenet(2015)128:131-143”中记载方法进行。
(5)TaGS-D1基因的基因型检测：参照文献“TaGS-D1,anorthologofriceOsGS3,isassociatedwithgrainweightandgrainlengthincommonwheat.ZhangYJ,LiuJD,XiaXC,HeZH.MolecularBreeding(2014)34,1097-1107”中记载方法进行。
(6)TaGASR7-A1基因的基因型检测：参照文献“NaturalvariationofTaGASR7-A1affectsgrainlengthincommonwheatundermultiplecultivationconditions.DongLL,WangFM,LiuT,DongZY,LiAL,JingRL,MaoL,LiYW,LiuX,ZhangKP,WangDW.MolecularBreeding(2014)34,937-947”中记载方法进行。
(7)1-FEHw3基因的基因型检测：参照文献“Awheat1-FEHw3variantunderliesenzymeactivityforstemWSCremobilizationtograinunderdroughtZhangJingjuan,YunjiXu,WeiChen,BernardDell,RudyVergauwen,BenBiddulph,NusratKhan,HaoLuo,RudiAppelsandWimVandenEndeNewPhytologist(2015)205:293–305.”中记载方法进行。
(8)Pinb2-v2基因的基因型检测：参照文献“PhysicalmappingandanewvariantofPuroindolineb-2genesinwheat.FengChen,BrianS.Beecher,CraigF.MorrisTheorApplGenet.2010,120(4):745-51.”中记载方法进行。
(9)Psy-B1c基因的基因型检测：参照文献“Allelicvariantsofphytoenesynthase1(Psy1)genesinChineseandCIMMYTwheatcultivarsanddevelopmentoffunctionalmarkersforflourcolourX.YHe,Z.H.He,W.Ma,R.AppelsandX.C.XiaMolecularBreeding(2009)23:553-563”中记载方法进行。
(10)Psy1-D1基因的基因型检测：参照文献“Cloningandphylogeneticanalysisofphytoenesynthase1(Psy1)genesincommonwheatandrelatedspecies，JianwuWang,XinyaoHe,ZhonghuHe,HuiWangandXianchunXia，Hereditas(2009)146:208–256”中记载方法进行。
(11)TaZds-A1、Talyce-B1、TaPds-B1基因的序列及功能标记在硕士毕业论文“普通小麦籽粒黄色素含量相关基因的克隆与功能标记开发，董长海，2011”中公开过。
(12)Glu-B1基因的序列及功能标记在文献“EvolutionaryoriginofthesegmentalduplicationencompassingthewheatGLU-B1locusencodingtheoverexpressedBx7(Bx7OE)highmolecularweightgluteninsubunitRajaRagupathy,HamidA.Naeem,ElsaReimer,OdeanM.Lukow,HarryD.SapirsteinandSylvieCloutierTheoreticalandAppliedGeneticsInternationalJournalofPlantBreedingResearch(2007)116:666”中公开过。
具体检测结果参见表4。
表4KASP标记和功能标记对黄淮麦区121个小麦品种的基因型的检测结果
注：表中“√”表示本发明KASP标记检测法和功能标记检测法对基因型的检测结果一致。
3、按常规的表型调查方法检测种植在河南安阳的黄淮麦区121个小麦品种(见表4)的表型性状，进行三次重复试验，结果取平均值。
多酚氧化酶活性测定方法参见文献“Animprovedwhole-seedassayforscreeningwheatgermplasmforpolyphenoloxidaseactivity.Anderson,J.V.,andMorris,C.F.2001.CropScience.41:1697-1705”；
过氧化物酶活性测定参见文献“Mappingquantitativetraitlociforperoxidaseactivityanddevelopinggene-specificmarkersforTaPod-A1onwheatchromosome3AL.WeiJ,GengH,ZhangY,LiuJ,WenW,ZhangY,XiaX,ChenX,HeZ.TheorApplGenet.2015July”；
千粒重测定方法为收获后随机抽取每个品种1000粒小麦，称重；
粒长测定方法为将20粒种子摆成一排，用尺子测量；
产量测定方法为每个品种的1个小区(2个1.5米行长)混收后，称重测产；
籽粒硬度采用瑞典PERTEN公司生产的4100型单籽粒硬度仪测定，每个品种的结果为该品种300个籽粒的平均值；
黄色素含量测定方法参考美国谷物化学师协会标准AACCp14-15；
八分钟带宽测定方法参考美国谷物化学师协会标准AACC54-40方法。
4、比较KASP标记和功能标记的检测结果，及其与相应表型性状的相关性，见表5。
表5KASP标记和功能标记对黄淮麦区121个小麦品种的检测结果比较
注：千粒重的单位为g，粒长的单位为cm，产量的单位为g，多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性的单位为U·g-1·min-1，黄色素含量的单位为μg·g-1，八分钟峰值带宽的单位为％。*表型数据后面的字母不同，表明两种基因型品种的表型值之间差异显著(P<0.05)。
结果显示：121个黄淮麦区小麦品种中，使用KASP标记检测为一类基因型的品种，用常规功能标记检测也只有一种等位基因，使用KASP标记检测为另一类基因型的品种，用常规功能标记检测也得出另一种等位基因。通过比较，一类基因型携带一种等位基因，另一类基因型携带另一种等位基因，KASP标记检测与常规功能标记检测的相关系数为1，说明两种标记具有同等的检测效果，即本发明开发的KASP标记检测法与常规功能标记检测法的一致性为100％。
从基因型角度将121个黄淮麦区小麦品种(材料)分成两类，结合小麦重要性状的表型数据，分别计算两类品种的表型平均值，经T测验可知，两种不同基因型的品种间表型性状具有显著性差异(P<0.05)。因此：
培育千粒重高或产量高的品种，采用CKX-D1_IND、CWI4A_SNP、TaGS-D1_SNP、1-FEHw3_SNP检测基因型为Del、CC、GG、TT的品种作为亲本进行育种；培育籽粒长的品种，选用TaGASR7-A1_IND检测基因型为Ins的品种作为亲本进行育种；培育适宜做面包或馒头的硬质麦，选用Pinb2_IND检测基因型为Del的品种作为亲本进行育种；培育多酚氧化酶活性较低、小麦制品馒头和面条褐变减少的品种，选用PPOD1_SNP检测基因型为CC的品种作为亲本进行育种；培育过氧化物酶活性较高、面粉白度提高、面粉粘性降低的品种，选用PODA1_SNP检测基因型为AA的品种作为亲本进行育种；培育黄色素含量高、适宜做面条的品种，选用PSY_B1c_SNP、Psy1Da-g_SNP、TaZds-A1_SNP、TALYCE-B1_SNP、TaPds-B1_SNP检测基因型为TT、CC、GG、CC、GG的品种作为亲本进行育种；培育强筋小麦，采用BX7OE_SNP检测基因型为CC的品种作为亲本进行育种。
综上所述，通过KASP标记检测功能基因的等位基因型辅助筛选含有利等位变异的小麦品种准确可靠、方便快捷，提高了选择效率，加快了育种进程。

Claims (10)

1.用于检测小麦功能基因的成套KASP引物，所述小麦功能基因为Ppo-D1基因、TaPod-A1基因、TaCKX6-D1基因、TaCW1-4A基因、TaGS-D1基因、TaGASR7-A1基因、1-FEHw3基因、Pinb2-v2基因、Psy-B1基因、Psy1-D1基因、TaZds-A1基因、Talyce-B1基因、TaPds-B1基因、Glu-B1基因，其特征在于：所述成套KASP引物由如下(1)-(14)组成：
(1)特异于所述Ppo-D1基因的KASP引物：引物1、引物2和引物3；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列1的第22-41位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列2的第22-41位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA；
(2)特异于所述TaPod-A1基因的KASP引物：引物4、引物5和引物6；所述引物4为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列4的第22-42位的单链DNA；所述引物5为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列5的第22-42位的单链DNA；所述引物6为核苷酸序列如序列表中序列6所示的单链DNA；
(3)特异于所述TaCKX6-D1基因的KASP引物：引物7、引物8和引物9；所述引物7为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列7的第22-44位的单链DNA；所述引物8为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列8的第22-39位的单链DNA；所述引物9为核苷酸序列如序列表中序列9所示的单链DNA；
(4)特异于所述TaCW1-4A基因的KASP引物：引物10、引物11和引物12；所述引物10为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列10的第22-53位的单链DNA；所述引物11为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列11的第22-53位的单链DNA；所述引物12为核苷酸序列如序列表中序列12所示的单链DNA；
(5)特异于所述TaGS-D1基因的KASP引物：引物13、引物14和引物15；所述引物13为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列13的第22-42位的单链DNA；所述引物14为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列14的第22-42位的单链DNA；所述引物15为核苷酸序列如序列表中序列15所示的单链DNA；
(6)特异于所述TaGASR7-A1基因的KASP引物：引物16、引物17和引物18；所述引物16为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列16的第22-41位的单链DNA；所述引物17为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列17的第22-41位的单链DNA；所述引物18为核苷酸序列如序列表中序列18所示的单链DNA；
(7)特异于所述1-FEHw3基因的KASP引物：引物19、引物20和引物21；所述引物19为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列19的第22-41位的单链DNA；所述引物20为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列20的第22-41位的单链DNA；所述引物21为核苷酸序列如序列表中序列21所示的单链DNA；
(8)特异于所述Pinb2-v2基因的KASP引物：引物22、引物23和引物24；所述引物22为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列22的第22-46位的单链DNA；所述引物23为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列23的第22-48位的单链DNA；所述引物24为核苷酸序列如序列表中序列24所示的单链DNA；
(9)特异于所述Psy-B1基因的KASP引物：引物25、引物26和引物27；所述引物25为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列25的第22-41位的单链DNA；所述引物26为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列26的第22-41位的单链DNA；所述引物27为核苷酸序列如序列表中序列27所示的单链DNA；
(10)特异于所述Psy1-D1基因的KASP引物：引物28、引物29和引物30；所述引物28为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列28的第22-46位的单链DNA；所述引物29为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列29的第22-47位的单链DNA；所述引物30为核苷酸序列如序列表中序列30所示的单链DNA；
(11)特异于所述TaZds-A1基因的KASP引物：引物31、引物32和引物33；所述引物31为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列31的第22-42位的单链DNA；所述引物32为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列32的第22-42位的单链DNA；所述引物33为核苷酸序列如序列表中序列33所示的单链DNA；
(12)特异于所述Talyce-B1基因的KASP引物：引物34、引物35和引物36；所述引物34为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列34的第22-46位的单链DNA；所述引物35为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列35的第22-46位的单链DNA；所述引物36为核苷酸序列如序列表中序列36所示的单链DNA；
(13)特异于所述TaPds-B1基因的KASP引物：引物37、引物38和引物39；所述引物37为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列37的第22-46位的单链DNA；所述引物38为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列38的第22-46位的单链DNA；所述引物39为核苷酸序列如序列表中序列39所示的单链DNA；
(14)特异于所述Glu-B1基因的KASP引物：引物40、引物41和引物42；所述引物40为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列40的第22-45位的单链DNA；所述引物41为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列41的第22-45位的单链DNA；所述引物42为核苷酸序列如序列表中序列42所示的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的成套KASP引物，其特征在于：所述标签序列A的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-21位。
3.根据权利要求1或2所述的成套KASP引物，其特征在于：所述引物1为核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA；所述引物4为核苷酸序列如序列表中序列4所示的单链DNA；所述引物5为核苷酸序列如序列表中序列5所示的单链DNA；所述引物7为核苷酸序列如序列表中序列7所示的单链DNA；所述引物8为核苷酸序列如序列表中序列8所示的单链DNA；所述引物10为核苷酸序列如序列表中序列10所示的单链DNA；所述引物11为核苷酸序列如序列表中序列11所示的单链DNA；所述引物13为核苷酸序列如序列表中序列13所示的单链DNA；所述引物14为核苷酸序列如序列表中序列14所示的单链DNA；所述引物16为核苷酸序列如序列表中序列16所示的单链DNA；所述引物17为核苷酸序列如序列表中序列17所示的单链DNA；所述引物19为核苷酸序列如序列表中序列19所示的单链DNA；所述引物20为核苷酸序列如序列表中序列20所示的单链DNA；所述引物22为核苷酸序列如序列表中序列22所示的单链DNA；所述引物23为核苷酸序列如序列表中序列23所示的单链DNA；所述引物25为核苷酸序列如序列表中序列25所示的单链DNA；所述引物26为核苷酸序列如序列表中序列26所示的单链DNA；所述引物28为核苷酸序列如序列表中序列28所示的单链DNA；所述引物29为核苷酸序列如序列表中序列29所示的单链DNA；所述引物31为核苷酸序列如序列表中序列31所示的单链DNA；所述引物32为核苷酸序列如序列表中序列32所示的单链DNA；所述引物34为核苷酸序列如序列表中序列34所示的单链DNA；所述引物35为核苷酸序列如序列表中序列35；所述引物37为核苷酸序列如序列表中序列37所示的单链DNA；所述引物38为核苷酸序列如序列表中序列38所示的单链DNA；所述引物40为核苷酸序列如序列表中序列40所示的单链DNA；所述引物41为核苷酸序列如序列表中序列41所示的单链DNA。
4.用于检测小麦功能基因的成套KASP引物，为下述(a)或(b)：
(a)由来自于权利要求1-3任一中的所述(1)中的所述KASP引物，以及来自于权利要求1-3任一中的所述(2)-所述(14)中的任意N个所述KASP引物组成；所述N为1-13的整数；
(b)权利要求1-3任一中的所述(1)中的所述KASP引物。
5.用于检测小麦功能基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-4中任一所述的成套KASP引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A为与所述标签序列A一致的序列，5’末端连接1个荧光基团A；所述淬灭探针A为所述标签序列A的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团；
所述荧光探针B为与所述标签序列B一致的序列，5’末端连接1个荧光基团B；所述淬灭探针B为所述标签序列B的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团A为FAM；所述荧光报告基团B为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。
8.一种检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法，所述小麦功能基因为Ppo-D1基因和如下中的至少一种：TaPod-A1基因、TaCKX6-D1基因、TaCW1-4A基因、TaGS-D1基因、TaGASR7-A1基因、1-FEHw3基因、Pinb2-v2基因、Psy-B1基因、Psy1-D1基因、TaZds-A1基因、Talyce-B1基因、TaPds-B1基因、Glu-B1基因，其特征在于：所述方法为如下(A)或(B)：
(A)由如下(a1)，以及如下(a2)-(a14)这13种中的至少一种组成：
(B)为如下(a1)；
(a1)检测或辅助检测待测小麦的Ppo-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Ppo-D1基因的基因型为CG；
(a2)检测或辅助检测待测小麦的TaPod-A1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为AA；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaPod-A1基因的基因型为AG；
(a3)检测或辅助检测待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaCKX6-D1基因的基因型为Del；
(a4)检测或辅助检测待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaCW1-4A基因的基因型为CT；
(a5)检测或辅助检测待测小麦的TaGS-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaGS-D1基因的基因型为GT；
(a6)检测或辅助检测待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaGASR7-A1基因的基因型为Del；
(a7)检测或辅助检测待测小麦的1-FEHw3基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的1-FEHw3基因的基因型为CT；
(a8)检测或辅助检测待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型为Ins；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Pinb2-v2基因的基因型为Del；
(a9)检测或辅助检测待测小麦的Psy-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光显示绿色，则所述待测小麦的Psy-B1基因的基因型为CT；
(a10)检测或辅助检测待测小麦的Psy1-D1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Psy1-D1基因的基因型为CT；
(a11)检测或辅助检测待测小麦的TaZds-A1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaZds-A1基因的基因型为CG；
(a12)检测或辅助检测待测小麦的Talyce-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Talyce-B1基因的基因型为CG；
(a13)检测或辅助检测待测小麦的TaPds-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的TaPds-B1基因的基因型为CG；
(a14)检测或辅助检测待测小麦的Glu-B1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用KlusterCaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为GG；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的Glu-B1基因的基因型为CG。
9.权利要求8所述方法在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用:
(a)千粒重和/或产量提高；
(b)籽粒长度增加；
(c)籽粒硬度指数提高；
(d)多酚氧化酶活性降低和/或小麦制品褐变减少；
(e)过氧化物酶活性提高和/或面粉白度提高和/或面团粘性降低；
(f)黄色素含量提高；
(g)面筋强度提高。
10.一种培育小麦品种的方法，为如下(C)或(D)：
(C)由如下(b1)，以及如下(b2)-(b7)这6种中的至少一种组成：
(D)为如下(b1)；
(b1)培育多酚氧化酶活性降低和/或小麦制品褐变减少的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求8所述的方法检测得到的Ppo-D1基因的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b2)培育过氧化物酶活性提高和/或面粉白度提高和/或面团粘性降低的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求8所述的方法检测得到的TaPod-A1基因的基因型为AA的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b3)培育千粒重和/或产量提高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求8所述的方法检测得到的TaCKX6-D1基因的基因型为Del，和/或TaCW1-4A基因的基因型为CC，和/或TaGS-D1基因的基因型为GG，和/或1-FEHw3基因的基因型为TT的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b4)培育籽粒长度增加的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求8所述的方法检测得到的TaGASR7-A1基因的基因型为Ins的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b5)培育籽粒硬度指数提高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求8所述的方法检测得到的Pinb2-v2基因的基因型为Del的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b6)培育黄色素含量较高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求8所述的方法检测得到的Psy-B1基因的基因型为TT，和/或Psy1-D1基因的基因型为CC，和/或TaZds-A1基因的基因型为GG，和/或Talyce-B1基因的基因型为CC，和/或TaPds-B1基因的基因型为GG的小麦作为亲本进行育种的步骤；
(b7)培育面筋强度提高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求8所述的方法检测得到的Glu-B1基因的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种的步骤。
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