CN109628628A - 水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与广谱抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T，基于KASP技术开发的该SNP标记的引物组合为Primer X、Primer Y和Primer C。本发明利用KASP技术对与广谱抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP标记进行基因快速分型，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时开发SNP标记表型的选择效率达到100％，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测广谱抗稻瘟基因Pi2；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及溴化乙锭EB(ethidium bromide)等有毒物的使用，可在育种早期进行前景的分子标记辅助选择，减小育种群体的大田种植规模，降低育种成本，加快育种进程。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用

技术领域

本发明涉及分子标记及作物育种领域，具体的，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用。

背景技术

水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，世界上有一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病被称为水稻的癌症，是对水稻生产危害最严重的病害之一。中国大面积推广的杂交稻，由于缺少远源优质抗病资源的导入，亲本遗传多样性不高，抗病改良是一大瓶颈；在水稻主要种植国家，经常有稻瘟病流行和爆发的报道，每年可造成20-100％的产量损失。

实践证明，选育抗病品种是解决上述问题最为经济、安全、环保、高效的方法。但由于稻瘟菌生理小种致病性变异频繁、群体结构复杂，导致单一抗性品种在种植3～5年后即丧失抗性，因此利用广谱抗病基因培育持久、广谱抗病品种是应对稻瘟病危害的重要途径。

至今，水稻中有25个已克隆的稻瘟病抗性基因，其中大多数抗谱很窄。而来自哥伦比亚籼稻品种5173的Pi2，是一个显性广谱抗稻瘟病基因。Chen等以来源于中国中部和南部稻区的792个生理小种接种携带Pi2基因的水稻近等基因系C101A51，发现C101A51对超过92％的生理小种表现抗性；Liu等研究表明，C101A51对来自13个国家的43个稻瘟菌生理小种中的36个表现抗性；刘士平用不同地区来源的75个稻瘟菌菌株接种发现，Pi2抗谱高达85.53％。因此，Pi2在水稻抗稻瘟病育种中具有重要应用价值，自2006年克隆以来，得到了广泛应用。

与传统育种方法相比，分子标记辅助选择提高了选择的可靠性，加快了育种进度，且不受环境和人员经验影响，近年来越来越多的应用到育种实践中。但Pi2所在的基因簇内，至少存在10个抗病基因(Piz,Piz-t,Pi2,Pi2,Pi9,Pi25,Pi26,Pi40,Pi50,Pi2-2)，它们在序列上高度相似，核苷酸水平上的序列一致性达95.6％；在氨基酸水平上，Pi2与Pi9序列一致性高达96％，Pi2与Piz-t只有8个氨基酸的差异。因此，需要开发一种稳定、可靠、分辨率高的分子标记。

目前已开发的分子标记，一般都需要进行琼脂糖凝胶电泳(邓国富等，CN105462971 B；张明永等，CN106636358 A)，甚至需要更复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳(陈庆全等，CN 102312000 A；陈松彪等，CN 104073487 B；纪剑辉等，CN 104450932 B；圣中华等，CN106636395 A)，有的还需要酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(华丽霞等，CN 103320437 B)，操作繁琐，费时耗物，不便于规模化鉴定；金名捺等(CN 107435068A)通过高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting Curve Analysis，HRM)的方法检测SNP(SingleNucleotide Polymorphism)位点，虽然避免了电泳或酶切过程，但随着扩增产物片段增大，检测的准确性和稳定性会逐渐降低。因此，需要开发的标记除了稳定可靠、分辨率高，还要操作简便、高效快速、可直接对碱基进行检测。

发明内容

本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi2的分子标记和应用，所述分子标记是与广谱抗稻瘟病基因Pi2连锁的SNP标记。该标记基于KASP技术开发，能精确的将Pi2与其它紧密连锁或等位的抗稻瘟病基因进行区分，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定性好等优点，且能在低世代群体中准确检测Pi2，提高育种效率，缩短育种年限，对水稻稻瘟病抗性育种具有重要意义。

具体的，本发明所述的一种稻瘟病广谱抗性基因Pi2的分子标记的开发流程见图1。根据文献资料将水稻Pi2基因定位于水稻6号染色体的10387509-10390465区间，对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。挑选出的SNP位点，提取其侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。利用候选SNP标记，对含有Pi2基因的供体材料C101A51和其它不含Pi2基因的22个水稻品种进行KASP反应验证，挑选出与Pi2供体材料共分离及扩增效果好的的SNP标记K_060502。利用K_060502标记对190份材料进行检测，证实本发明所检测的Pi2基因位点为高特异性的抗性位点。利用标记K_060502对Pi2供体亲本C101A51和黄华占杂交产生的F2遗传分离群体进行检测，结合抗性鉴定数据，再次验证了本发明的可行性和准确性。

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供与稻瘟病抗性基因Pi2紧密连锁的SNP(single nucleotidepolymorphism)分子标记K_060502及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种与抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pi2共分离的SNP标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T；

一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物组合包括：(1)两条特异性引物：Primer X：5’-GAGCTTCAGCAAGCCATC-3’；Primer Y：5’-TGAGCTTCAGCAAGCCATA--3’；(2)一条通用引物：Primer C：5’-GATATTGTTTCTCTGCCATGC-3’，具体见表1。

表1标记序列表

标记名称

Allele X

Allele Y

Position

Primer Seq Allele X

Primer Seq Allele Y

Primer Seq Common

K_060502

G

T

chr6.10432612

GAGCTTCAGCAAGCCATC

TGAGCTTCAGCAAGCCATA

GATATTGTTTCTCTGCCATGC

一种检测抗稻瘟病基因Pi2的SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合。

所述分子标记、所述的引物组合或所述试剂盒在检测抗稻瘟病基因Pi2、在抗稻瘟病基因Pi2辅助育种以及在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。

进一步的，所述应用包括利用KASP进行Pi2分型或是将Pi2锚定在基因芯片中。

更进一步的，包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；

S3、若只检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基G，判断水稻样品为携带抗稻瘟病基因Pi2的纯和型；若只检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基T，判断水稻样品为不含抗稻瘟病基因Pi2的纯和型；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为抗稻瘟病基因Pi2的杂合型。

进一步的，特异性引物5’段连接FAM或HEX荧光接头序列。

再进一步的，所述分子标记在水稻抗病性辅助育种中的应用，包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；

S3、选择检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。

本发明的有益效果：

(1)本发明开发的SNP标记与Pi2基因紧密连锁，经过分离群体稻瘟病表型鉴定后，验证开发的SNP标记表型选择效率达到100％，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测广谱抗稻瘟基因Pi2。

(2)本发明开发的SNP标记结合KASP基因分型技术，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中，且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，直接对碱基进行检测，准确性不受扩增片段长度影响，而且简便、快速、精确，自动化程度高，大大提高了基因选育效率，降低了成本。

(3)本发明所述的SNP标记可在苗期即可进行前景选择和背景选择，减小育种群体的大田种植规模，缩短育种年限，加快育种进程。

附图说明

图1为本发抗稻瘟病基因Pi2分子标记的开发流程图。

图2为利用分子标记K_060502检测自然群体分型图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

实施例1抗稻瘟病基因Pi2分子标记的制备

1、引物设计

Pi2基因位于水稻6号染色体的10387509-10390465区间，以基因区间为中心向两侧各延伸50kb，根据国际水稻所3000份水稻重测序数据进行SNP位点提取，挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer(http://probes.pw.usda.gov/batch primer3/)对其进行引物设计。该SNP标记有三条引物，见表1，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。

如果样品PCR产物只检测到引物Primer X对应荧光信号，则检测位点为碱基G，判定测试的水稻样品含纯合的Pi2基因；若只检测到引物Primer Y对应荧光信号，则检测位点为碱基T，判定测试的水稻样品不含有纯合的pi2基因；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为G：T，判断待测水稻含有杂合的Pi2基因。

2、DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

3、KASP反应测试

KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。本发明中使用的LGCSNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

表2 KASP检测的反应体系

	终浓度	体积(μL)
			100UM Primer C	0.42μM	0.0125
100UM Primer X	0.17μM	0.0050
			100UM Primer Y	0.17μM	0.0050
2x KASP Master Mix	1x	1.4792
			超纯水		1.4983
总体积		3

4、标记分型数据

利用标记K_060502对Pi2基因供体材料C101A51与其它22个水稻品种进行KASP初筛反应验证，结果如表3。Pi2基因供体材料C101A51在K_060502测试位点检测结果为碱基G，20份不含Pi2基因水稻品种在测试位点检测出碱基T，Pi50的供体材料二八占也检测出碱基G，可能是Pi50为Pi2的等位基因，基因序列同源性高，在检测位点序列一致。

表3标记K_060502初筛分型数据

材料名称	材料说明	检测结果
			C101A51	Pi2供体	G
75-1-127	Pi9供体	T
			二八占	Pi50供体	G
Fukunishiki	Pi-z供体	T
			谷梅4号	Pigm供体	T
福锦	Pi-z+Pi-sh供体	T
			Asominori	感病材料	T
Cpslo17	感病材料	T
			湘早籼13号	感病材料	T
原丰早	感病材料	T
			丽江新团黑谷	感病材料	T
CO39	感病材料	T
			湘矮早7号	感病材料	T
Kasalath	感病材料	T
			密阳46	感病材料	T
明恢63	感病材料	T
			Ⅱ-23B	感病材料	T
中9B	感病材料	T
			Y58S	感病材料	T
黄华占	感病材料	T
			金23B	感病材料	T
日本晴	感病材料	T

实施例2抗稻瘟病基因Pi2分子标记的群体及标记表型验证

1、自然群体验证

为检测本发明所述SNP标记的实用性，利用187份材料对SNP标记K_060502进行自然群体验证。187份材料中包括已知含纯合Pi2基因的品种、含有其他稻瘟病抗性基因的供体、普感材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料。标记在自然群体分型结果如图2所示，21份材料检测为具有稻瘟病抗性的纯合Pi2基因型，2份杂交稻中检测出杂合Pi2基因型，6份材料无扩增信号，其余含有其他抗稻瘟病基因供体、普感材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料均检测为无稻瘟病抗性纯合Pi2基因型。

可见，Pi2基因已在水稻育种中应用，标记K_060502可便捷高效检测水稻品种中是否含有Pi2基因。

2、标记表型验证

利用标记K_060502对Pi2基因供体C101A51和感病亲本黄华占构建的F2：3家系进行检测。同时，在水稻苗期，对20个F2：3家系及2个亲本接种Pi2基因非亲和稻瘟病菌株CHL1743，调查病情，表型与基因型对应一致，再次验证了本发明的可行性和准确性(见表4)。

表4遗传分离群体表型与基因型鉴定

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华智水稻生物技术有限公司

<120> 水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gagcttcagc aagccatc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

tgagcttcag caagccata 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gatattgttt ctctgccatg c 21

Claims (10)

1.一种与抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pi2共分离的SNP标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T。

2.一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物组合包括：

(1)两条特异性引物：Primer X：5’-GAGCTTCAGCAAGCCATC-3’；Primer Y：5’-TGAGCTTCAGCAAGCCATA-3’；

(2)一条通用引物：Primer C：5’-GATATTGTTTCTCTGCCATGC-3’。

3.权利要求1所述分子标记在检测抗稻瘟病基因Pi2中的应用。

4.权利要求1所述分子标记在抗稻瘟病基因Pi2辅助育种中的应用。

5.权利要求1所述分子标记在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。

6.根据权利要求6所述的选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用，其特征在于，所述应用为利用KASP进行Pi2分型或是将Pi2锚定在基因芯片中。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；

S3、若只检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基G，判断水稻样品为携带抗稻瘟病基因Pi2的纯和型；若只检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基T，判断水稻样品为不含抗稻瘟病基因Pi2的纯和型；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为抗稻瘟病基因Pi2的杂合型。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，引物Primer X、Primer Y的5’段连接FAM或HEX荧光接头序列。

9.权利要求4所述分子标记在水稻抗病性辅助育种中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；

S3、选择检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。

10.一种检测抗稻瘟病基因Pi2的SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求2所述的引物组合。