CN114182042B - 一种与砂梨褐皮/绿皮相关的snp标记及应用 - Google Patents

一种与砂梨褐皮/绿皮相关的snp标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记及应用。所述SNP标记来源于梨基因组中的含有Ppskin‑Slaf1标记的核心序列，所述核心序列如SEQ ID NO.1所示；所述核心序列共有2个SNP位点，分别为Ppskin‑Slaf1‑SNP1(PSS1‑1)和Ppskin‑Slaf1‑SNP2(PSS1‑2)。本发明通过利用分子标记辅助选择目标性状，可提高选择效率，缩短育种周期，为梨果皮颜色定向育种奠定基础，加快育种进程；且操作便捷。

Description

一种与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记及应用
技术领域
本发明涉及梨遗传育种领域，具体涉及一种与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记及应用。
背景技术
我国南方地区主要种植砂梨。砂梨果实成熟后，果皮颜色一般呈现三种：黄绿色（或绿色）、褐色和红色。红色果皮的砂梨品种目前较少。在绿皮梨中有一些品种（例如‘翠冠’）虽然果面的大部分为黄绿色(或绿色)，但常不规则地分布着褐色锈斑，这种果皮色称为中间色。这些梨果皮锈斑形成少，不能完全覆盖梨果实表面。而褐皮梨果皮锈斑形成多能够完全覆盖果面。中间色的果皮影响梨果的外观，降低了商品价值，所以在砂梨育种过程中培育全绿或全褐色果皮梨尤为重要。梨杂交后代的童期长达5年，小苗期确定果皮颜色非常重要。在育种过程中，利用分子标记辅助选择目标性状，可提高选择效率，缩短育种周期。然而，目前关于梨果皮颜色的SNP标记还很少。
发明内容
本发明的目的之一是一种与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记，本发明的目的之二是与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记在鉴定砂梨品种褐皮/绿皮和在梨分子育种中的应用，本发明的目的之三是应用与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记鉴定砂梨品种褐皮/绿皮的方法，其能够有利于选育褐皮/绿皮砂梨品种，加快育种进程。
本发明采取的技术方案具体如下。
本发明提供的一种与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记，所述SNP标记来源于梨基因组中的含有Ppskin-Slaf1标记的核心序列，所述核心序列如SEQ ID NO.1所示；所述核心序列共有2个SNP位点，分别为Ppskin-Slaf1-SNP1（PSS1-1）和Ppskin-Slaf1-SNP2（PSS1-2）。
可选地， Ppskin-Slaf1-SNP1的正向引物有2个，Ppskin-Slaf1-SNP1的2个正向引物的序列分别为PSS1-1-FAM，SEQ ID NO.2和PSS1-1-HEX，SEQ ID NO.3所示，Ppskin-Slaf1-SNP1的反向引物序列为PSS1-1-R，SEQ ID NO.4所示；
Ppskin-Slaf1-SNP2的正向引物有2个，Ppskin-Slaf1-SNP2的2个正向引物的序列分别为PSS1-2-FAM，SEQ ID NO.5和PSS1-2-HEX，SEQ ID NO.6所示，Ppskin-Slaf1-SNP2的反向引物序列为PSS1-2-R，SEQ ID NO.7。
本发明还提供了与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记在鉴定砂梨品种褐皮/绿皮中的应用。
本发明还提供了与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记在梨分子育种中的应用。
本发明还提供了一种应用上述的与砂梨褐皮/绿皮相关的SNP标记鉴定砂梨品种褐皮/绿皮的方法，包括如下步骤：
1）提取待测砂梨基因组DNA；
2）利用梨基因组DNA中的含有Ppskin-Slaf1标记的核心序列，根据该核心序列中的两个SNP位点分别设计2个竞争性等位基因特异性（KASP）引物组合；
3）以待测砂梨的基因组DNA为模板，利用KASP引物组合进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应；
4）检测PCR扩增产物的荧光值；由Ppskin-Slaf1-SNP1的引物组合扩增的PCR产物中，有FAM荧光值无HEX荧光值则代表褐皮，有HEX荧光值无FAM荧光值则代表绿皮，FAM荧光值和HEX荧光值都有则代表中间色皮和褐皮；由Ppskin-Slaf1-SNP2引物组合扩增的PCR产物中，有FAM荧光值无HEX荧光值则代表褐皮，有HEX荧光值无FAM荧光值则代表绿皮，FAM荧光值和HEX荧光值都有代表中间色皮和褐皮。
可选地，在步骤3）中，PCR扩增体系总体积为10μl，包括1μl的DNA模板（10 ng/μl），5μl的KASP-TF V4.0 2X Master Mix，引物组合2μl，双蒸水2μl。
可选地，2μl引物组合包括2个10 mM正向引物各0.5μl，10 mM反向引物为1μl。
可选地，引物组合有2个， 其中一个引物组合为：Ppskin-Slaf1-SNP1的2个正向引物为PSS1-1-FAM，SEQ ID NO.2和PSS1-1-HEX，SEQ ID NO.3所示，Ppskin-Slaf1-SNP1的反向引物为PSS1-1-R，SEQ ID NO.4；另一个引物组合为：Ppskin-Slaf1-SNP2的2个正向引物为PSS1-2-FAM，SEQ ID NO.5和PSS1-2-HEX，SEQ ID NO.6所示，Ppskin-Slaf1-SNP2的反向引物为PSS1-2-R，SEQ ID NO.7。
可选地，在步骤3）中，PCR扩增程序为两步法降落PCR：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s， 61 ℃延伸60 s，每个循环延伸温度下降0.6 ℃，共10个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃延伸60 s，共26个循环。
可选地，在步骤4）中，使用罗氏480荧光定量仪器对PCR产物中FAM荧光值和HEX荧光值进行检测。
本发明取得的技术效果为：
本发明可快捷地获得与梨褐皮/绿皮相关联的Ppskin-Slaf1位点的基因型。与传统的田间自然观察相比，可以在梨杂交后代小苗期确定果皮的颜色。通过利用分子标记辅助选择目标性状，可提高选择效率，缩短育种周期，为梨果皮颜色定向育种奠定基础，加快育种进程；且操作便捷。通过使用本发明中的褐皮/绿皮分子标记可以为不同果皮颜色的砂梨品种育种提供一个可靠的方法。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为梨Ppskin-Slaf1基因型序列比对；
图2为梨F1代褐皮/绿皮性状分离检测图。
实施方式
为了使本申请的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本申请的一种或几种具体的实施方式，并不对本申请具体请求的保护范围进行严格限定，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明实施例提供了一种与梨褐皮/绿皮相关的SNP标记，属于分子标记辅助育种技术领域，SNP标记来源于梨基因组Ppskin-Slaf1标记。梨基因组Ppskin-Slaf1标记共有2个SNP位点，分别为Ppskin-Slaf1-SNP1（PSS1-1）和Ppskin-Slaf1-SNP2（PSS1-2）。用于检测与梨褐皮/绿皮相关的SNP标记的引物对，Ppskin-Slaf1-SNP1的正向引物有2个，序列分别为PSS1-1-FAM，SEQ ID NO.2和PSS1-1-HEX，SEQ ID NO.3所示，它的反向引物序列为PSS1-1-R，SEQID NO.4所示。Ppskin-Slaf1-SNP2的正向引物有2个，序列分别为PSS1-2-FAM，SEQID NO.5和PSS1-2-HEX，SEQ ID NO.6所示，它的反向引物序列为PSS1-2-R，SEQ ID NO.7。
此外，本发明实施例还提供了一种用SNP标记鉴定砂梨品种褐皮/绿皮的方法，包括如下步骤：首先提取待测梨基因组DNA；利用梨基因组DNA中的含有Ppskin-Slaf1标记的核心序列，根据序列中的两个SNP位点分别设计2个竞争性等位基因特异性（KASP）引物组合；以梨基因组DNA为模板，利用KASP引物进行PCR扩增反应；检测PCR扩增产物的荧光值；根据FAM的荧光值和HEX的荧光值确定每个个体的基因型（褐皮、绿皮和中间色）。使用本方法中的褐皮/绿皮分子标记可以为不同果皮颜色的砂梨品种育种提供一个可靠的方法。
具体地，根据本发明的一种用于鉴定砂梨果皮褐色或绿色的SNP标记的方法，包括如下步骤：
1）提取待测梨基因组DNA；
2）以待测梨的基因组DNA为模板，利用开发的引物进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应；
3）检测PCR扩增产物的荧光值；由Ppskin-Slaf1-SNP1引物组合扩增的PCR产物中，有FAM荧光值无HEX荧光值代表褐皮，有HEX荧光值无FAM荧光值代表绿皮，FAM荧光值和HEX荧光值都有代表中间色和褐色。同样由Ppskin-Slaf1-SNP2引物组合扩增的PCR产物中，有FAM荧光值无HEX荧光值代表褐皮，有HEX荧光值无FAM荧光值代表绿皮，FAM荧光值和HEX荧光值都有代表中间色和褐色；
其中步骤2）中的PCR扩增体系总体积为10μl，包括1μl的DNA模板（10 ng/μl），5μl的KASP-TF V4.0 2X Master Mix，引物组合2μl（2个10 mM正向引物各0.5μl，10 mM反向引物为1μl），双蒸水2μl；
所述2个引物组合为：Ppskin-Slaf1-SNP1的2个正向引物为PSS1-1-FAM，SEQ IDNO.2和PSS1-1-HEX，SEQID NO.3所示，它的反向引物为PSS1-1-R，SEQID NO.4。Ppskin-Slaf1-SNP2的2个正向引物为PSS1-2-FAM，SEQ ID NO.5和PSS1-2-HEX，SEQID NO.6所示，反向引物为PSS1-2-R，SEQID NO.7。
PCR扩增程序为两步法降落PCR：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s， 61 ℃延伸60 s，每个循环延伸温度下降0.6 ℃，共10个循环；94 ℃变性20 s， 55 ℃延伸60 s，共26个循环；
使用罗氏480荧光定量仪器对PCR产物中FAM荧光值和HEX荧光值进行检测。
本发明属于梨DNA分子遗传标记技术，是梨在Ppskin-Slaf1位点遗传多态性的SNP标记检测方法。梨杂交后代的童期长达5年，小苗期确定果皮颜色非常重要。利用分子标记辅助选择目标性状，可提高选择效率，缩短育种周期。本发明可快捷地获得与梨褐皮/绿皮相关联的Ppskin-Slaf1位点的基因型。与传统的田间自然观察相比，可以在梨杂交后代小苗期确定果皮的颜色。操作便捷，为梨果皮颜色定向育种奠定基础，加快育种进程。
具体实施时，与梨褐皮/绿皮连锁的SNP标记的开发，可以是通过以下方式获得的：
1、构建梨褐皮/绿皮遗传群体
使用褐皮梨‘早生新水’和绿皮梨‘秋水’进行杂交，获得120株F1代单株，定植于基地，5年后开花结果。
2、梨F1代果皮颜色鉴定
对获得的120株F1代单株果实就行绿皮、褐皮和中间色进行分类，全绿为1级，全褐为5级，根据果皮上褐皮程度依次分为2到4级。
3、基于SLAF简化重测序构建遗传图谱并挖掘相关SLAF标记。
使用简化重测序对双亲和后代进行测序，利用SLAF标签对绿皮/褐皮性状进行关联。成功定位到Ppskin-Slaf1标记（如图1所示）与果皮颜色关联。其上含有2个SNP标记，分别为Ppskin-Slaf1-SNP1（PSS1-1，序列第12个碱基为T/A）和Ppskin-Slaf1-SNP2（PSS1-2，序列第39个碱基为C/T）。PSS1-1中TT基因型为绿皮，TA基因型为中间色或者褐皮，AA基因型为褐皮。PSS1-2中CC基因型为绿皮，TC基因型为中间色或者褐皮，TT基因型为褐皮。
4、根据引物设计原则，采用Primer软件设计引物。Ppskin-Slaf1-SNP1的正向引物有2个，序列分别为PSS1-1-FAM，SEQ ID NO.2和PSS1-1-HEX，SEQ ID NO.3所示，它的反向引物序列为PSS1-1-R，SEQ ID NO.4所示。Ppskin-Slaf1-SNP2的正向引物有2个，序列分别为PSS1-2-FAM，SEQ ID NO.5和PSS1-2-HEX，SEQ ID NO.6所示，它的反向引物序列为PSS1-2-R，SEQ ID NO.7。
此外，根据本发明的一种用于鉴定砂梨果皮褐色或绿色的SNP标记的方法，具体可通过如下试验方法进行实施：
1、梨基因组DNA的提取：取梨嫩叶组织500mg，剪碎后放入2mL离心管中，加入研磨珠，液氮速冻后研磨机研磨，加入pH8.0的2% CTAB溶液800μL，加入16μL巯基乙醇，混匀后65℃ 30分钟；加入0.8mL的氯仿/异戊醇（24:1），混匀后12000rpm离心1分钟，取上层水项到新的离心管。加入等体积的异丙醇和1/10体积的醋酸钠（3M），室温静置1小时，离心后取沉淀，使用无水酒精清洗2次后烘干。使用100μL TE溶液进行溶解，即为DNA提取液。
2、采用Primer软件设计引物，根据核心序列Ppskin-Slaf1（图1）上2个多态性位点分别开发2个引物组合。Ppskin-Slaf1-SNP1在核心序列第12个碱基的基因型为T/A，上游设计2个引物PSS1-1-FAM（5’-CCAGATCGAACACCATACTTACGA-3’，5’端添加FAM修饰）和PSS1-1-HEX（5’-CCAGATCGAACACCATACTTACGT-3’，5’端添加HEX修饰），下游1个引物PSS1-1-R（5’-GACAAGGGCAAGACGTCGTTCTT-3’）。Ppskin-Slaf1-SNP2在核心序列第39个碱基的基因型为C/T，上游设计2个引物PSS1-2-FAM（5’-GAACGACGTCTTGCCCTTGTCT-3’，5’端添加FAM修饰）和PSS1-2-HEX（5’-AACGACGTCTTGCCCTTGTCC-3’，5’端添加HEX修饰），下游1个引物PSS1-2-R（5’-GTGGCCTTCCAAGAGTGCACCAA-3’）。
3、PCR扩增：PCR扩增体系总体积为10μl，包括1μl的DNA模板（10 ng/μl），5μl的KASP-TF V4.0 Master Mix，引物组合2μl（2个10 mM正向引物各0.5μl，10 mM反向引物为1μl），双蒸水2μl；PCR扩增程序为两步法降落PCR：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s，61 ℃延伸60 s，每个循环延伸温度下降0.6 ℃，共10个循环；94 ℃变性20 s， 55 ℃延伸60 s，共26个循环。
4、荧光检测，使用罗氏480荧光定量仪器对PCR产物中FAM荧光值和HEX荧光值进行检测（参阅图2）。PSS1-1和PSS1-2引物对均表现为有FAM荧光值无HEX荧光值代表褐皮，此时两个位点的基因型分别为AA和TT，有HEX荧光值无FAM荧光值代表绿皮，此时两个位点的基因型分别为AT和CT，FAM荧光值和HEX荧光值都有代表中间色和褐色，此时两个位点的基因型分别为TT和CC。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本发明中未具体描述和解释说明的结构、装置以及操作方法，如无特别说明和限定，均按照本领域的常规手段进行实施。

Claims (1)

1.一种用于鉴定砂梨果皮褐色或绿色的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）提取待测梨基因组DNA；
2）以待测梨的基因组DNA为模板，利用开发的引物进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应；
3）检测PCR扩增产物的荧光值
由Ppskin-Slaf1-SNP1引物组合扩增的PCR产物中，有FAM荧光值无HEX荧光值代表褐皮，有HEX荧光值无FAM荧光值代表绿皮，FAM荧光值和HEX荧光值都有代表中间色和褐色，
由Ppskin-Slaf1-SNP2引物组合扩增的PCR产物中，有FAM荧光值无HEX荧光值代表褐皮，有HEX荧光值无FAM荧光值代表绿皮，FAM荧光值和HEX荧光值都有代表中间色和褐色，
其中步骤2）中的PCR扩增体系总体积为10μl，包括1μl的DNA模板，5μl的KASP-TF V4.02X Master Mix，引物组合2μl，双蒸水2μl，
两个引物组合为：Ppskin-Slaf1-SNP1的两个正向引物为PSS1-1-FAM，5’-CCAGATCGAACACCATACTTACGA-3’和PSS1-1-HEX，5’-CCAGATCGAACACCATACTTACGT-3’，它的反向引物为PSS1-1-R，5’-GACAAGGGCAAGACGTCGTTCTT-3’；Ppskin-Slaf1-SNP2的两个正向引物为PSS1-2-FAM，5’-GAACGACGTCTTGCCCTTGTCT-3’和PSS1-2-HEX，5’-AACGACGTCTTGCCCTTGTCC-3’，反向引物为PSS1-2-R，5’-GTGGCCTTCCAAGAGTGCACCAA-3’，
PCR扩增程序为两步法降落PCR：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s， 61 ℃延伸60s，每个循环延伸温度下降0.6 ℃，共10个循环；94 ℃变性20 s， 55 ℃延伸60 s，共26个循环。
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