CN111778346A

CN111778346A - 一种用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.1的分子标记及使用方法

Info

Publication number: CN111778346A
Application number: CN202010640130.7A
Authority: CN
Inventors: 王文学; 高春保; 贾梦洁; 李君辉; 刘易科; 佟汉文; 陈泠; 张宇庆; 何伟杰; 邹娟; 朱展望
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-07-06
Also published as: CN111778346B

Abstract

本发明公开了一种用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas‑4BL.1的分子标记及使用方法。本发明通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦4B染色体长臂上抗条锈病位点QYr.hbaas‑4BL.1，解释表型变异3.7‑6.9％，其关联SNP IWB73717可作为小麦抗病分子标记用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas‑4BL.1的基因型，并用于抗条锈病分子育种。

Description

一种用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.1的分子标记及使用方法

技术领域

本发明涉及生物农业领域中，一种用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.1的分子标记及使用方法。

背景技术

遗传研究很大程度上受益于分子标记技术的发展，过去小麦遗传研究以使用简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记为主，近年来单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)芯片技术的发展和成本降低，使之成为基因型鉴定的主要标记。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。理论上SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。随着测序技术的不断发展，可以利用重测序、外显子捕捉测序、RNA-Seq以及SNP芯片技术大规模地、在全基因组水平上鉴定SNP。并可以把目标SNP转化为基于PCR的分子标记进行检测，如竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)、半热不对称反向PCR(semi-thermalasymmetric reverse PCR，STARP)、酶切扩增多态性序列(cleaved amplifiedpolymorphic sequences，CAPS)以及衍生酶切扩增多态性(derived cleaved amplifiedpolymorphic sequences，dCAPS)标记等。PARMS(Penta-primer amplificationrefractory mutation system)检测技术，是一种基于扩增受阻突变体系PCR(ARMS PCR)的检测技术，它含有两条带有不同荧光的检测引物，可以分别检测两条等位基因正向引物5’端的互补序列，经过与同一条反向引物PCR扩增以后，待检测位点的多态性即可通过不同的荧光信号得以检测出来。PARMS技术具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。

小麦条锈病是一种由小麦条锈菌(Puccinia striiformisWestend.f.sp.tritici)引起的真菌病害，在世界范围内广泛发生。条锈病对小麦生产危害巨大，在病害流行年份可造成小麦严重减产甚至绝收。中国小麦条锈病发病面积广、损失严重，主要发生在西北和西南地区，包括陕西、甘肃、四川、湖北、河南南部等地。小麦条锈菌生理小种易发生变异，使之克服当前生产上主要利用的抗病基因，进而使主栽抗病品种丧失抗性，发掘利用新的抗病位点并开发育种标记对于抗病育种意义重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测小麦条锈病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测小麦条锈病抗性的方法，所述方法包括：按照小麦基因型的检测方法检测待测小麦的基因型，所述基因型为TT基因型和CC基因型，CC基因型待测小麦的条锈病抗性高于或候选高于TT基因型小麦；

所述小麦基因型的检测方法包括：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸，如所述待测小麦两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测小麦为TT基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测小麦为CC基因型小麦；

g1)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为T；

g2)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为C。

上述方法中，所述待测小麦可为纯合系小麦。所述待测小麦具体可为TT基因型待测小麦或CC基因型小麦。

上述方法中，检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸可采用PARMS_IWB73717引物组进行；

所述PARMS_IWB73717引物组由名称分别为PARMS_IWB73717A、PARMS_IWB73717B和PARMS_IWB73717C的单链DNA组成；

所述PARMS_IWB73717A为(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1的第22-43位所示的单链DNA；

(b2)将序列1的第22-43位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的单链DNA；

所述PARMS_IWB73717B为(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2的第22-43位所示的单链DNA；

(b4)将序列2的第22-43位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的单链DNA；

所述PARMS_IWB73717C为序列表的序列3所示的单链DNA。

上述方法中，(b2)可为序列表中序列1所示的单链DNA；(b4)可为序列表中序列2所示的单链DNA。

上述小麦基因型的检测方法具体可包括：采用所述引物组PARMS_IWB73717进行PARMS反应，得到反应产物，检测所述反应体系的荧光信号，仅有FAM荧光信号的待测小麦为TT基因型小麦(即IWB73717标记为T的纯合型)，仅有HEX荧光信号的待测小麦为CC基因型小麦(即IWB73717标记为C的纯合型)。

本发明还提供了小麦育种方法，所述方法包括：按照所述小麦基因型的检测方法检测小麦的基因型，选择CC基因型小麦作为亲本进行育种。

上述小麦育种方法还可包括选择后代为CC基因型的小麦作为抗条锈病的目的小麦，实现小麦育种。

所述小麦基因型的检测方法，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了小麦抗病分子标记或检测所述小麦抗病分子标记的物质在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用；所述小麦抗病分子标记为对应于小麦基因组中序列表中序列4的第51位所示的核苷酸，所述小麦抗病分子标记为T或C。

所述小麦抗病分子标记位于小麦染色体4BL上，物理位置为531.3Mb的位点。

上述应用中，所述检测所述小麦抗病分子标记的物质可为所述PARMS_IWB73717引物组。

所述小麦抗病分子标记，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，所述物质包括所述PARMS_IWB73717引物组：

Y1)检测小麦抗病分子标记；

Y2)制备检测小麦抗病分子标记的产品；

Y3)检测或辅助检测小麦条锈病抗性；

Y4)制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品。

所述物质还可包括进行PARMS反应所需的其他试剂，如2×PARMS master mix(武汉市景肽生物科技有限公司产品，货号为E001-2。

所述物质可为试剂盒。所述物质可仅为所述PARMS_IWB73717引物组，还可为由所述PARMS_IWB73717引物组与所述进行PARMS反应所需的其他试剂组成的成套试剂。

本发明还提供了下述任一应用：

H1)所述小麦抗病分子标记在小麦育种中的应用；

H2)检测所述小麦抗病分子标记的物质在小麦育种中的应用；

H3)检测所述小麦抗病分子标记的物质在制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品中的应用；

H4)所述小麦基因型的检测方法在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用。

本发明中所述小麦可为表1中240份小麦中的任一种或多种，但不限于表1中240份小麦。

在本发明的实施例中，所述条锈病由条锈菌生理小种CYR32、CYR33和/或CYR34引发。

本发明通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦4B染色体长臂上抗条锈病位点QYr.hbaas-4BL.1，解释表型变异3.7-6.9％，其关联SNP IWB73717可作为小麦抗病分子标记用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.1的基因型，并用于抗条锈病分子育种。

附图说明

图1为引物组PARMS_IWB73717对待测小麦基因型的检测结果。左上方为IWB73717基因型为CC的小麦，右下方为IWB73717基因型为TT的小麦。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的铭贤169记载在“黄亮,刘太国,肖星芷,等.中国79个小麦品种(系)抗条锈病评价及基因分子检测[J].中国农业科学,2017,50(16):3122–3134.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

条锈菌生理小种CYR32、CYR33和CYR34记载在“张怀志,谢菁忠,陈永兴,刘旭,王勇,闫素红,杨兆生,赵虹,王西成,贾联合,曹廷杰,刘志勇.利用BSR-Seq定位小麦品种郑麦103抗条锈病基因YrZM103[J].作物学报,2017,43(11):1643-1649.”一文中，公众可以从中国农业科学院院植物保护研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、IWB73717标记可以用于检测小麦条锈病

供试材料：国内外小麦品种(系)240份组建的GWAS群体，见表1。

表1、GWAS群体品种(系)及其来源

表1中，^a为引物组PARMS_IWB73717的检测结果；^b为90K SNP芯片分型结果；^c为5个环境下条锈病MDS BLUP值(Best linear unbiased prediction)，“NN”为数据缺失。

表1中材料记载于文献(Zhu Z,Chen L,Zhang W,Yang L,Li J,Liu Y,Tong H,FuL,Liu J,Rasheed A,Xia X,He Z,Hao Y,Gao C,2020.Genome-wide associationanalysis of Fusarium head blight resistance in Chinese elite wheatlines.Frontiers in Plant Science,11:206)中，公众均可以从申请人处获得。其中，14FHBSN6402为文献中CROC_1/AE.SQUARROSA(205)//KAUZ/3/SASIA/4/TROST；14FHBSN6404为文献中MONARCA F2007/KRONSTAD F2004；14FHBSN6405为文献中PBW343*2/KUKUNA//PBW343*2/KUKUNA/3/PBW343；14FHBSN6408为文献中KS82W418/SPN//WBLL1/3/BERKUT；14FHBSN6409为文献中CNDO/R143//ENTE/MEXI75/3/AE.SQ/4/2*FCT/5/KAUZ*2/YACO//KAUZ/6/BERKUT；14FHBSN6411为文献中T.DICOCCON PI94625/AE.SQUARROSA(372)//TUI/CLMS/3/2*PASTOR/4/EXCALIBUR；14FHBSN6418为文献中NG8675/CBRD//MILAN/3/SAUAL/6/CNDO/R143//ENTE/MEXI_2/3/AEGILOPS SQUARROSA(TAUS)/4/WEAVER/5/2*PASTOR。

一、IWB73717标记的发现

1、条锈病抗性鉴定

2015-2016年度在四川郫县和四川新都，2013-2014年度、2016-2017年度和2018-2019年度在湖北武汉对GWAS群体条锈病抗性进行田间接种鉴定。试验采用完全随机区组设计，两次重复。每小区2行，行长1m，行间距25cm。小区周围种植条锈病高感品种铭贤169作为诱发行，2013-2014年度用条锈菌生理小种CYR32和CYR33混合接种铭贤169，其余年份用CYR32和CYR34混合小种接种。当铭贤169的条锈病严重程度达到最高时，调查各小区条锈病最大严重度(MDS)，即发病最严重时叶片上条锈病孢子堆面积占总叶片面积的百分数，然后用R程序包lme4计算5个环境下表型BLUP值作为平均值，结果见表1。

2、基因型分析

GWAS群体用90K SNP芯片进行基因型分析，选择其中22922个分型结果好的SNP用于后续分析，去掉缺失率超过20％、最小等位基因频率小于5％的标记，共剩余14577个SNP用于GWAS。

3、GWAS分析

采用Tassel v5.2.53和GAPIT软件kinship(K)+PCA方法的混合线性模型进行关联分析。当P≤0.001时，认为该标记与性状显著关联。

4、QYr.hbaas-4BL.1及其连锁SNP标记

关联分析发现位于4BL上的抗条锈病位点，在新都2015-2016环境下的BLUP值与条锈病抗性显著相关，解释表型变异3.7-6.9％，代表性关联标记为IWB73717，IWB73717标记为二等位多态性SNP位点，为T或C，其侧翼序列为：5′-GGGTCGTCAAAAGATAAGACCAGCTTCCGTTTGTCGGGTTTTATTGCCTT[T/C]GCATTCCCTCCTAATAGGTAACACCTGTGTCCCATCAAAAAGTGAGGGAA-3′(序列4，SNP位点在括号内，序列表的序列4中y表示t或c)。在小麦品种中国春参考基因组序列(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)上物理位置为531.3Mb(表2)。

^a代表性SNP标记，^b下划线所示为抗病等位基因，^c中国春参考基因组物理位置(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)，^d解释表型变异。

二、利用检测IWB73717标记专用引物检测小麦IWB73717标记与条锈病

1、基因组特异引物设计

用PolyMarker(www.polymarker.tgac.ac.uk)设计IWB73717标记的染色体特异引物PARMS_IWB73717(序列1、序列2和序列3)，由生工生物工程股份有限公司合成。

鉴定SNP位点IWB73717的PARMS引物为PARMS_IWB73717引物组，具体如下：

PARMS_IWB73717A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTGTCGGGTTTTATTGCCTTT-3’(序列1)；

PARMS_IWB73717B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTGTCGGGTTTTATTGCCTTC-3’(序列2)；

PARMS_IWB73717C：5’-ATGGGACACAGGTGTTACCTA-3’(序列3)。

PARMS_IWB73717A中下划线序列为FAM结合序列；PARMS_IWB73717B中下划线序列为HEX结合序列。

上述序列1与序列3所示的单链DNA分子可以扩增包括SNP位点IWB73717的DNA片段，所得PCR产物中SNP位点IWB73717处的核苷酸为T，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到PARMS master mix中与FAM结合序列结合的荧光基团FAM的荧光信号；

上述序列2与序列3所示的单链DNA分子可以扩增包括SNP位点IWB73717的DNA片段，所得PCR产物中SNP位点IWB73717处的核苷酸为C，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到PARMS master mix中与HEX结合序列结合的荧光基团HEX的荧光信号。

2、检测基因型

提取待测小麦的基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板，采用引物组PARMS_IWB73717进行PARMS反应，检测SNP位点IWB73717的核苷酸。

上述PARMS反应体系如表3所示；

表3、引物组PARMS_IWB73717的PARMS反应体系

其中，2×PARMS master mix为武汉市景肽生物科技有限公司产品，货号为E001-2。

PARMS反应程序如表4所示：

表4、引物组PARMS_IWB73717的PARMS反应程序

PARMS反应结束后将所得产物用利用酶标仪或荧光定量PCR仪对PARMS反应产物进行荧光数据读取，用在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)进行荧光信号处理，并确定待测小麦SNP位点IWB73717的基因型：仅有FAM荧光信号的待测小麦为TT基因型小麦(即IWB73717标记为T的纯合型)，仅有HEX荧光信号的待测小麦为CC基因型小麦(即IWB73717标记为C的纯合型)，有FAM与HEX荧光信号的待测小麦为TC基因型小麦(即IWB73717标记为T和C的杂合型)。

待测小麦的基因型检测结果如表1和图1所示，表明利用上述方法可以用于检测小麦的检测IWB73717标记。

3、基因型与表型分析

进一步，根据步骤2的基因型分型结果，计算各基因型条锈病MDS的BLUP平均值，见表5。

表5、不同基因型小麦条锈病MDS的BLUP平均值

PARMS_IWB73717基因型	品种个数	条锈病MDS BLUP(％)
			TT	76	60.27
CC	161	44.87

从表5的结果可以看出，SNP位点IWB73717为CC基因型待测小麦条锈病MDS的BLUP平均值显著低于SNP位点IWB73717为TT基因型的待测小麦，说明SNP位点IWB73717为CC基因型待测小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB73717为TT基因型的待测小麦，SNP位点IWB73717携带C的小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB73717携带T的小麦。

因此，SNP位点IWB73717可用于辅助检测待测小麦是否抗条锈病，并用于抗条锈病分子育种。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 一种用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.1的分子标记及使用方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc ttttgtcggg ttttattgcc ttt 43

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat ttttgtcggg ttttattgcc ttc 43

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

atgggacaca ggtgttacct a 21

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 4

gggtcgtcaa aagataagac cagcttccgt ttgtcgggtt ttattgcctt ygcattccct 60

cctaataggt aacacctgtg tcccatcaaa aagtgaggga a 101

Claims

1.检测小麦条锈病抗性的方法，包括：按照小麦基因型的检测方法检测待测小麦的基因型，所述基因型为TT基因型和CC基因型，CC基因型待测小麦的条锈病抗性高于或候选高于TT基因型小麦；

g1)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为T；

g2)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为C。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸采用PARMS_IWB73717引物组进行；

所述PARMS_IWB73717A为(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1的第22-43位所示的单链DNA；

所述PARMS_IWB73717B为(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2的第22-43位所示的单链DNA；

所述PARMS_IWB73717C为序列表的序列3所示的单链DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：(b2)为序列表中序列1所示的单链DNA；(b4)为序列表中序列2所示的单链DNA。

4.小麦育种方法，包括：按照权利要求1-3中所述小麦基因型的检测方法检测小麦的基因型，选择CC基因型小麦作为亲本进行育种。

5.权利要求1-3中所述小麦基因型的检测方法。

6.小麦抗病分子标记或检测所述小麦抗病分子标记的物质在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用；所述小麦抗病分子标记为对应于小麦基因组中序列表中序列4的第51位所示的核苷酸，所述小麦抗病分子标记为T或C。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述检测所述小麦抗病分子标记的物质为权利要求2或3中所述PARMS_IWB73717引物组。

8.权利要求6中所述小麦抗病分子标记。

9.具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，包括权利要求2或3中所述PARMS_IWB73717引物组：

Y1)检测小麦抗病分子标记；

Y2)制备检测小麦抗病分子标记的产品；

Y3)检测或辅助检测小麦条锈病抗性；

Y4)制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品。

10.下述任一应用：

H1)权利要求6中所述小麦抗病分子标记在小麦育种中的应用；

H2)检测权利要求6中所述小麦抗病分子标记的物质在小麦育种中的应用；

H3)检测权利要求6中所述小麦抗病分子标记的物质在制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品中的应用；

H4)权利要求5所述的方法在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用。