CN111560464B - 分子标记iwb59718及其在检测小麦条锈病抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了分子标记IWB59718及其在检测小麦条锈病抗性中的应用。本发明通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦4B染色体长臂上抗条锈病位点QYr.hbaas‑4BL.3，解释表型变异3.9‑5.8％，其关联SNP IWB59718为二等位多态性SNP位点，为T或C，可用于检测小麦条锈病抗性，并用于抗条锈病分子育种。
Description
技术领域
本发明涉及生物农业领域中，分子标记IWB59718及其在检测小麦条锈病抗性中的应用。
背景技术
小麦条锈病是一种由小麦条锈菌(Puccinia striiformisWestend.f.sp.tritici)引起的、世界范围内广泛发生的真菌病害。条锈病对小麦生产危害巨大，在病害流行年份可造成小麦严重减产甚至绝收。选育并合理运用抗病品种是防治小麦条锈病最经济有效的方法。国内外对条锈病抗性遗传进行了大量研究。迄今，已正式命名的小麦条锈病抗性基因有80多个。由于小麦条锈菌生理小种复杂多变，一些抗病基因已丧失抗性，发掘新的抗病基因并开发其连锁标记对丰富条锈病抗源、更好进行抗病育种意义重大。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性。现阶段，可用电泳、直接测序、DNA芯片、竞争性等位基因特异性PCR(KASP)等对SNP进行检测，电泳方法效率较低，其他方法对设备和技术要求高、成本较高。PARMS(Penta-primer amplification refractory mutationsystem)检测技术，是一种基于扩增受阻突变体系PCR(ARMS PCR)的检测技术，与常规ARMSPCR不同的是，PARMS检测技术增加了两条带有不同荧光的检测引物，可以分别检测两条等位基因正向引物5’端的互补序列，经过与同一条反向引物PCR扩增以后，待检测位点的多态性即可通过不同的荧光信号得以检测出来。PARMS已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测小麦条锈病抗性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了小麦抗病分子标记或检测所述小麦抗病分子标记的物质在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用；所述小麦抗病分子标记其名称为IWB59718，为对应于小麦基因组中序列表中序列4的第51位所示的核苷酸，所述小麦抗病分子标记为T或C。
所述小麦抗病分子标记位于小麦染色体4BL上，物理位置为578.0Mb的位点。
上述应用中，所述检测所述小麦抗病分子标记的物质可为PARMS_IWB59718引物组，所述PARMS_IWB59718引物组由名称分别为PARMS_IWB59718A、PARMS_IWB59718B和PARMS_IWB59718C的单链DNA组成；
所述PARMS_IWB59718A为(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1的第22-42位所示的单链DNA；
(b2)将序列1的第22-42位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的单链DNA；
所述PARMS_IWB59718B为(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列2的第22-42位所示的单链DNA；
(b4)将序列2的第22-42位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的单链DNA；
所述PARMS_IWB59718C为序列表的序列3所示的单链DNA。
上述应用中，(b2)可为序列表中序列1所示的单链DNA；(b4)可为序列表中序列2所示的单链DNA。
本发明还提供了小麦基因型的检测方法，所述基因型为TT基因型、TC基因型和CC基因型，所述方法包括：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸，如所述待测小麦两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测小麦为TT基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测小麦为CC基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测小麦为TC基因型小麦；
g1)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为T；
g2)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为C。
上述方法可采用90K SNP芯片进行分析确定待测小麦基因型。
上述方法中，检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸可采用所述PARMS_IWB59718引物组进行。
上述方法具体可包括：采用所述引物组PARMS_IWB59718进行PARMS反应，得到反应产物，检测所述反应体系的荧光信号，仅有FAM荧光信号的待测小麦为TT基因型小麦(即IWB59718标记为T的纯合型)，仅有HEX荧光信号的待测小麦为CC基因型小麦(即IWB59718标记为C的纯合型)，有FAM与HEX荧光信号的待测小麦为TC基因型小麦(即IWB59718标记为T和C的杂合型)。
本发明还提供了检测小麦条锈病抗性的方法，所述方法包括：按照所述小麦基因型的检测方法检测待测小麦的基因型，TT基因型待测小麦的条锈病抗性高于或候选高于CC基因型小麦。
上述方法中，所述待测小麦可为纯合系小麦。所述待测小麦具体可为TT基因型小麦或CC基因型小麦。
本发明还提供了小麦育种方法，所述方法包括：按照所述小麦基因型的检测方法检测小麦的基因型，选择TT基因型或TC基因型小麦作为亲本进行育种。
上述小麦育种方法还可包括选择后代为TT基因型或TC基因型的小麦作为抗条锈病的目的小麦，实现小麦育种。
所述小麦抗病分子标记，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，所述物质包括所述PARMS_IWB59718引物组：
Y1)检测小麦抗病分子标记；
Y2)制备检测小麦抗病分子标记的产品；
Y3)检测或辅助检测小麦条锈病抗性；
Y4)制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品。
所述物质还可包括进行PARMS反应所需的其他试剂，如2×PARMS master mix(武汉市景肽生物科技有限公司产品，货号为E001-2。
所述物质可为试剂盒。所述物质可仅为所述PARMS_IWB59718引物组，还可为由所述PARMS_IWB59718引物组与所述进行PARMS反应所需的其他试剂组成的成套试剂。
本发明还提供了下述任一应用：
H1)所述小麦抗病分子标记在小麦育种中的应用；
H2)检测所述小麦抗病分子标记的物质在小麦育种中的应用；
H3)检测所述小麦抗病分子标记的物质在制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品中的应用；
H4)所述小麦基因型的检测方法在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用。
本发明中所述小麦可为表1中240份小麦中的任一种或多种，但不限于表1中240份小麦。
在本发明的实施例中，所述条锈病由条锈菌生理小种CYR32、CYR33和/或CYR34引发。
本发明通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦4B染色体长臂上抗条锈病位点QYr.hbaas-4BL.3，解释表型变异3.9-5.8％，其关联SNP IWB59718可用于检测小麦条锈病抗性，并用于抗条锈病分子育种。
附图说明
图1为引物组PARMS_IWB59718对待测小麦基因型的检测结果。左上方为IWB59718基因型为CC的小麦，右下方为IWB59718基因型为TT的小麦。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的铭贤169记载在“黄亮,刘太国,肖星芷,等.中国79个小麦品种(系)抗条锈病评价及基因分子检测[J].中国农业科学,2017,50(16):3122–3134.”一文中，，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
条锈菌生理小种CYR32、CYR33和CYR34记载在“张怀志,谢菁忠,陈永兴,刘旭,王勇,闫素红,杨兆生,赵虹,王西成,贾联合,曹廷杰,刘志勇.利用BSR-Seq定位小麦品种郑麦103抗条锈病基因YrZM103[J].作物学报,2017,43(11):1643-1649.”一文中，公众可以从中国农业科学院院植物保护研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、IWB59718标记可以用于检测小麦条锈病
供试材料：国内外小麦品种(系)240份组建的GWAS群体，见表1。所用材料记载于文献(Zhu Z,Chen L,Zhang W,Yang L,Li J,Liu Y,Tong H,Fu L,Liu J,Rasheed A,Xia X,He Z,Hao Y,Gao C,2020.Genome-wide association analysis of Fusarium headblight resistance in Chinese elite wheat lines.Frontiers in Plant Science,11:206)中，公众均可以从申请人处获得。其中，14FHBSN6402为文献中CROC_1/AE.SQUARROSA(205)//KAUZ/3/SASIA/4/TROST；14FHBSN6404为文献中MONARCA F2007/KRONSTAD F2004；14FHBSN6405为文献中PBW343*2/KUKUNA//PBW343*2/KUKUNA/3/PBW343；14FHBSN6408为文献中KS82W418/SPN//WBLL1/3/BERKUT；14FHBSN6409为文献中CNDO/R143//ENTE/MEXI75/3/AE.SQ/4/2*FCT/5/KAUZ*2/YACO//KAUZ/6/BERKUT；14FHBSN6411为文献中T.DICOCCONPI94625/AE.SQUARROSA(372)//TUI/CLMS/3/2*PASTOR/4/EXCALIBUR；14FHBSN6418为文献中NG8675/CBRD//MILAN/3/SAUAL/6/CNDO/R143//ENTE/MEXI_2/3/AEGILOPS SQUARROSA(TAUS)/4/WEAVER/5/2*PASTOR。
表1、GWAS群体品种(系)及其来源
表1中，a为引物组PARMS_IWB59718的检测结果；b为90K SNP芯片分型结果；c为5个环境下条锈病MDS BLUP值(Best linear unbiased prediction)，“NN”为数据缺失。
一、IWB59718标记的发现
1、条锈病抗性鉴定
2015-2016年度在四川郫县和四川新都，2013-2014年度、2016-2017年度和2018-2019年度在湖北武汉对GWAS群体条锈病抗性进行田间接种鉴定。试验采用完全随机区组设计，两次重复。每小区2行，行长1m，行间距25cm。小区周围种植条锈病高感品种铭贤169作为诱发行，2013-2014年度用条锈菌生理小种CYR32和CYR33混合接种铭贤169，其余年份用CYR32和CYR34混合小种接种。当铭贤169的条锈病严重程度达到最高时，调查各小区条锈病最大严重度(MDS)，即发病最严重时叶片上条锈病孢子堆面积占总叶片面积的百分数，然后用R程序包lme4计算5个环境下表型BLUP值作为平均值，结果见表1。
2、基因型分析
GWAS群体用90K SNP芯片进行基因型分析，选择其中22922个分型结果好的SNP用于后续分析，去掉缺失率超过20％、最小等位基因频率小于5％的标记，共剩余14577个SNP用于GWAS。
3、GWAS分析
采用Tassel v5.2.53和GAPIT软件kinship(K)+PCA方法的混合线性模型进行关联分析。当P≤0.001时，认为该标记与性状显著关联。
4、QYr.hbaas-4BL.3及其连锁SNP标记
关联分析发现位于4BL上的抗条锈病位点，在武汉2013-2014、新都2015-2016以及五个环境下的BLUP值与条锈病抗性显著相关，解释表型变异3.9-5.8％，代表性关联标记为IWB59718，IWB59718标记为二等位多态性SNP位点，为T或C，其侧翼序列为：5′-AAGGAGCAGAGCACACCGTCGCCATGGGAGGAGCACCAGACCATCATTCT[T/C]GGGATAGCTCCATCTAGAAAGGGTGGCCTCTCCTCCTACGTCCTCGTCGG-3′(序列4，SNP位点在括号内，序列表中序列4的y表示t或c)。在小麦品种中国春参考基因组序列(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)上物理位置为578.0Mb(表2)。
a代表性SNP标记，b下划线所示为抗病等位基因，c中国春参考基因组物理位置(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)，d解释表型变异。
二、利用检测IWB59718标记专用引物检测小麦IWB59718标记与条锈病
1、基因组特异引物设计
用PolyMarker(www.polymarker.tgac.ac.uk)设计IWB59718标记的染色体特异引物PARMS_IWB59718(序列1、序列2和序列3)，由生工生物工程股份有限公司合成。
鉴定SNP位点IWB59718的PARMS引物为PARMS_IWB59718引物组，具体如下：
PARMS_IWB59718A:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCACCAGACCATCATTCTT-3’(序列1)；
PARMS_IWB59718B:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCACCAGACCATCATTCTC-3’(序列2)；
PARMS_IWB59718C:5’-AGGAGAGGCCACCCTTTCTA-3’(序列3)。
PARMS_IWB59718A中下划线序列为FAM结合序列；PARMS_IWB59718B中下划线序列为HEX结合序列。
上述序列1与序列3所示的单链DNA分子可以扩增包括SNP位点IWB59718的DNA片段，所得PCR产物中SNP位点IWB59718处的核苷酸为T，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到PARMS master mix中与FAM结合序列结合的荧光基团FAM的荧光信号；
上述序列2与序列3所示的单链DNA分子可以扩增包括SNP位点IWB59718的DNA片段，所得PCR产物中SNP位点IWB59718处的核苷酸为C，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到PARMS master mix中与HEX结合序列结合的荧光基团HEX的荧光信号。
2、检测基因型
提取待测小麦的基因组DNA，加ddH2O溶解作为模板，采用引物组PARMS_IWB59718进行PARMS反应，检测SNP位点IWB59718的核苷酸。
上述PARMS反应体系如表3所示；
表3、引物组PARMS_IWB59718的PARMS反应体系
其中，2×PARMS master mix为武汉市景肽生物科技有限公司产品，货号为E001-2。
PARMS反应程序如表4所示：
表4、引物组PARMS_IWB59718的PARMS反应程序
PARMS反应结束后将所得产物用利用酶标仪或荧光定量PCR仪对PARMS反应产物进行荧光数据读取，用在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)进行荧光信号处理，并确定待测小麦SNP位点IWB59718的基因型：仅有FAM荧光信号的待测小麦为TT基因型小麦(即IWB59718标记为T的纯合型)，仅有HEX荧光信号的待测小麦为CC基因型小麦(即IWB59718标记为C的纯合型)，有FAM与HEX荧光信号的待测小麦为TC基因型小麦(即IWB59718标记为T和C的杂合型)。
待测小麦的基因型检测结果如表1和图1所示，表明利用上述方法可以用于检测小麦的检测IWB59718标记。
3、基因型与表型分析
进一步，根据步骤2的基因型分型结果，计算各基因型条锈病MDS的BLUP平均值，见表5。
表5、不同基因型小麦条锈病MDS的BLUP平均值
| PARMS_IWB59718基因型 | 品种个数 | 条锈病MDS BLUP(％) |
| TT | 170 | 46.3 |
| CC | 66 | 57.8 |
从表5的结果可以看出，SNP位点IWB59718为TT基因型待测小麦条锈病MDS的BLUP平均值显著低于SNP位点IWB59718为CC基因型的待测小麦，说明SNP位点IWB59718为TT基因型待测小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB59718为CC基因型的待测小麦，SNP位点IWB59718携带T的小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB59718携带C的小麦。
因此，SNP位点IWB59718可用于辅助检测待测小麦是否抗条锈病，并用于抗条锈病分子育种。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 分子标记IWB59718及其在检测小麦条锈病抗性中的应用
<120> 湖北省农业科学院植保土肥研究所
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgagcaccag accatcattc tt 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tgagcaccag accatcattc tc 42
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
aggagaggcc accctttcta 20
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> 小麦（Triticum aestivum L.）
<400> 4
aaggagcaga gcacaccgtc gccatgggag gagcaccaga ccatcattct ygggatagct 60
ccatctagaa agggtggcct ctcctcctac gtcctcgtcg g 101
Claims (7)
1.小麦抗病分子标记或检测所述小麦抗病分子标记的物质在辅助检测小麦条锈病抗性中的应用；所述小麦抗病分子标记为小麦基因组中序列表中序列4所示的核苷酸片段，其中第51位为T或C。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测所述小麦抗病分子标记的物质为PARMS_IWB59718引物组，所述PARMS_IWB59718引物组由名称分别为PARMS_IWB59718A、PARMS_IWB59718B和PARMS_IWB59718C的单链DNA组成；
所述PARMS_IWB59718A为序列表中序列1所示的单链DNA；
所述PARMS_IWB59718B为序列表中序列2所示的单链DNA；所述PARMS_IWB59718C为序列表的序列3所示的单链DNA。
3.检测小麦条锈病抗性的方法，包括：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸，如所述待测小麦两条染色体均为下述g1）的染色体，所述待测小麦为TT基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体均为下述g2）的染色体，所述待测小麦为CC基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体中一条为下述g1）的染色体，另一条为下述g2）的染色体，所述待测小麦为TC基因型小麦；其中，所述TT基因型待测小麦的条锈病抗性高于或候选高于所述CC基因型小麦；
g1）对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为T；
g2）对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为C。
4.抗条锈病小麦育种方法，包括：检测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸，如所述待测小麦两条染色体均为下述g1）的染色体，所述待测小麦为TT基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体均为下述g2）的染色体，所述待测小麦为CC基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体中一条为下述g1）的染色体，另一条为下述g2）的染色体，所述待测小麦为TC基因型小麦；选择所述TT基因型或所述TC基因型小麦作为亲本进行育种；
g1）对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为T；
g2）对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为C。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸采用权利要求2中所述PARMS_IWB59718引物组进行。
6.具有如下Y1）- Y4）中任一用途的物质，包括权利要求2所述PARMS_IWB59718引物组：
Y1）检测小麦抗病分子标记；
Y2）制备检测小麦抗病分子标记的产品；
Y3）辅助检测小麦条锈病抗性；
Y4）制备辅助检测小麦条锈病抗性产品。
7.下述任一应用：
H1）权利要求1中所述小麦抗病分子标记在抗条锈病小麦育种中的应用；
H2）检测权利要求1中所述小麦抗病分子标记的物质在抗条锈病小麦育种中的应用；
H3）检测权利要求1中所述小麦抗病分子标记的物质在制备辅助检测小麦条锈病抗性产品中的应用。
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