CN118441091A - 小麦条锈病抗性位点的分子标记及其应用 - Google Patents
小麦条锈病抗性位点的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了小麦条锈病抗性位点的分子标记及其应用，属于分子生物学及作物育种技术领域。本申请要解决的技术问题是：如何筛选具有条锈病抗性的小麦。为此本申请提供鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性的方法，所述方法包括检测小麦基因组中AX‑109906455位点的基因型；AX‑109906455位点是小麦基因组中的一个SNP位点，如SEQ ID No.4的第37位核苷酸，其核苷酸种类为G或C，所述AX‑109906455位点的基因型为CC基因型的待测小麦具有小麦条锈病抗性。本申请提供的方法可用于分子标记辅助选择育种，为小麦条锈病抗性性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学及作物育种技术领域，具体涉及小麦条锈病抗性位点的分子标记及其应用。
背景技术
小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformisWest.f.sp.tritici Eriks.)引发的、传播速度快的气传真菌病害，可侵染小麦的叶片及地上营养器官，如叶鞘、穗、茎秆、颖壳和麦芒等。在我国，除东北春麦区外，其他小麦种植区都可能受到条锈病的影响，尤其是西北、西南和黄淮海等关键种植区，病害发生频繁，影响严重。因此，防控小麦条锈病是一项重要工作。尽管通过喷施杀菌剂、调整种植密度、优化种群结构和施肥等田间管理措施可部分缓解病害，但化学防治手段成本高、且污染环境。培育条锈病抗性品种是一种经济、安全、有效的解决方案。
目前，科学家已经鉴定并命名了约90个抗条锈病基因，这些基因分布在21条染色体中的20条上。然而，由于条锈菌小种变异较快，部分抗性基因容易丧失，且部分已克隆抗性基因与不良性状连锁，导致可用于抗性改良的有效基因数量有限。因此，发掘新的抗病位点(QTL)并开发可用的分子标记，成为抗病育种工作的重点。兰州商学院小麦研究所选育的兰天25具有较好的条锈病抗性水平。
发明内容
本申请要解决的技术问题是：如何筛选具有条锈病抗性的小麦。
为解决上述技术问题，本申请提供鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性的方法，所述方法包括使用检测AX-109906455位点基因型的物质检测待测小麦的基因型，根据待测小麦AX-109906455位点的基因型鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性；
所述AX-109906455位点是小麦基因组中的一个SNP位点，是SEQ ID No.4的第37位核苷酸，其核苷酸种类为G或C。
所述AX-109906455位点的基因型可为CC、GG或GC，所述GG为小麦基因组中所述AX-109906455位点的核苷酸种类为G的纯合型；所述CC基因型表示小麦基因组中所述AX-109906455位点的核苷酸种类为C的纯合型；所述GC基因型表示小麦基因组中所述AX-109906455位点的核苷酸种类为G和C的杂合型。
小麦基因组中AX-109906455位点为CC基因型小麦的条锈病抗性高于或候选高于小麦基因组中AX-109906455位点为GG基因型和/或GC基因型的小麦。
本申请中，所述待测小麦可为纯系或自交系。所述自交系可为重组自交系。
进一步地，所述的方法中，所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质可为如下A1)、A2)或A3)：
A1)含有扩增包括所述AX-109906455位点在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
A2)含有A1)所述引物组合物的PCR试剂；
A3)含有A1)所述引物组合物或A2)所述PCR试剂的试剂盒。
进一步地，所述的方法中，所述引物组合物可由核苷酸序列是SEQ ID No.1的第22-45位的单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.2的第22-45位的单链DNA和核苷酸序列是SEQID No.3的单链DNA组成。
进一步地，所述的方法中，所述引物组合物可由SEQ ID No.1所示的单链DNA、SEQID No.2所示的单链DNA和SEQ ID No.3所示的单链DNA组成。
进一步地，所述的方法中，所述检测待测小麦的上述AX-109906455位点的基因型的方法包括以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用上述的引物组合物进行PCR扩增，得到PCR产物；根据PCR产物的测序结果或荧光信号确定所述AX-109906455位点的基因型。
进一步地，所述方法具体包括下述操作步骤：
S1)提取待测小麦的基因组DNA；
S2)以S1)提取的基因组DNA为模板，以上述引物组合物为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
S3)根据PCR扩增产物的AX-109906455位点的基因型判断或辅助判断待测小麦的条锈病抗性；
进一步地，上述的方法中，S3)步骤中可根据所述PCR产物的测序结果或荧光显色判断AX-109906455位点的基因型。
本申请中，小麦基因组中AX-109906455位点为CC基因型小麦的条锈病抗性高于或候选高于小麦基因组中AX-109906455位点为GG基因型和/或GC基因型的小麦。
进一步地，所述SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA的5'端为特异性荧光标签序列。
进一步地，所述SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA的特异性荧光标签序列不同，结合不同发光类型的荧光探针。
在本发明的一个实施例中，SEQ ID No.1所示的单链DNA第1-21位核苷酸为FAM特异荧光标签序列，SEQ ID No.2所示的单链DNA第1-21位核苷酸为HEX特异荧光标签序列。
CC基因型扩增产物结合FAM荧光，显示蓝色荧光；GG基因型扩增产物结合HEX荧光，显示红色荧光，GC基因型扩增产物显示绿色荧光。即扩增产物显示蓝色荧光的待测小麦条锈病抗性高于或候选高于扩增产物显示红色荧光或绿色荧光的待测小麦。
本申请还提供组合物，所述组合物含有上述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质。
本申请还提供上述的检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质在下述C1)-C6)中的应用：
C1)鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性；
C2)制备鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性的产品；
C3)筛选或辅助筛选条锈病抗性小麦品种；
C4)制备筛选或辅助筛选条锈病抗性小麦品种的产品；
C5)小麦育种和/或辅助育种；
C6)制备小麦育种和/或辅助育种的产品。
进一步地，所述的应用中，所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质可为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述AX-109906455位点在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
D2)所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质为含有所述引物组合物的PCR试剂；
D3)含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
进一步地，所述的组合物和/或应用中，所述引物组合物为P1或P2：
P1、所述引物组合物为由核苷酸序列是SEQ ID No.1的第22-45位的单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.2的第22-45位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组合物；
P2、所述引物组合物为由SEQ ID No.1所示的单链DNA、SEQ ID No.2所示的单链DNA和由SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组合物。
本申请还提供DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
本申请还提供小麦育种的方法，所述方法包括选择上述AX-109906455位点的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种，所述CC基因型表示小麦基因组中所述AX-109906455位点的核苷酸种类为C的纯合型。
本申请中，所述育种的育种指标包括小麦条锈病抗性。所述育种的目的包括培育小麦条锈病抗性高(小麦条锈病抗性高于亲本)的小麦。
本申请中，所述产品可为试剂或试剂盒。
本申请中，所述小麦育种的考察指标可包括小麦的条锈病抗性。
本申请中，所述小麦育种的目的包括培育或选育条锈病抗性的小麦。
本申请中，所述引物组合物中的PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
与现有技术相比，本申请取得的有益技术效果如下：
1、本申请首次发现了小麦条锈病抗性基因QTL及其连锁分子标记，该QTL被命名为QYR.gaas-2B，位于2B染色体上，与AX-109906455(697.7Mb)紧密连锁。
2、检测111个小麦自然品种的AX-109906455位点基因型的结果显示：本申请提供的引物组合分型效果良好，该引物能有效鉴定供试植株基于AX-109906455位点的基因型为GG基因型、CC基因型还是GC基因型。
3、小麦自然品种的基因型和条锈病抗性表型的关联分析表明基因型和表型之间具有显著的关联性。由此表明，本申请所提供的分子标记(SNP位点)AX-109906455位点及其所对应的引物将有助于小麦条锈病抗性种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为小麦条锈病抗性性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。
附图说明
图1为Kasp-2B-YR对111份小麦品种基因分型结果。蓝色为兰天25基因型CC，红色为辉县红基因型GG，绿色为杂合GC。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本申请进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本申请，而不是为了限制本申请的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本申请的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所述的111份小麦品种为申请人保存，在文献“Genome-WideAssociation Mapping of Adult-Plant Resistance to Stripe Rust in Common Wheat(Triticum aestivum).Plant Disease.2020Aug；104(8):2174-2180.doi:10.1094/PDIS-10-19-2116-RE.Epub 2020May 26.”中公开，公众可从申请人处获得上述生物材料，所得生物材料仅可用于本申请内容验证，不可用作其他用途。
下述实施例中所述的优势条锈菌混合小种具体为CYR30、CYR31、CYR32、CYR33和CYR34等比例混合的病原菌。在文献“胡朝月,王凤涛,郎晓威,等.小麦抗条锈病基因对中国条锈菌主要流行小种的抗性分析[J].中国农业科学,2022,55(03):491-502.”中公开，公众可从申请人处获得上述生物材料，所得生物材料仅可用于本申请内容验证，不可用作其他用途。
下述实施例采用GraphPad Prism统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，*(P＜0.05)表示具有显著性差异。
下述实施例中的定量试验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
实施例1、小麦兰天25中一个条锈病抗性基因QTL的发现及其KASP标记的获得
一、表型的获得
利用兰天25和辉县红构建了一个包含235个家系的重组自交系群体。兰天25/辉县红RIL群体于2018-2019和2019-2020种植于四川成都和甘肃天水，采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长2m，行宽0.25m，每行均匀撒播50粒种子。田间管理按当地常规进行。用我国目前的流行条锈病混和菌种对RIL群体进行成株期抗性鉴定，其病害指标最大严重度(Maximum disease severity，MDS)在田间表现为连续性变化，为典型的数量性状遗传。采用改良CTAB法(Murray等，1980)，提取235个家系幼叶基因组DNA，用NanoDrop2000c分光光度计测定DNA浓度，并将DNA样品调至标准浓度50ng/ul，然后用0.8％的琼脂糖凝胶检测DNA质量，质量合格DNA进行SNP分型。利用中国农业科学院作物科学研究所和AffymetrixAxiom公司合作完成的50K SNP芯片进行SNP分析。
二、连锁图谱构建
去除亲本间杂合、缺失率大于10％的标记后，利用Icimapping V4.1去除冗余标记，然后根据标记间的遗传距离和染色体位置信息分群，构建连锁群有21个，与21条染色体契合，共包含5941个标记。
三、QTL分析
采用IciMapping 4.1ICIM-ADD方法进行QTL分析，LOD值选取2.5，在2B染色体定位到1个稳定的QTL，将其命名为QYR.gaas-2B。与AX-109906455紧密连锁(697.7Mb)，在不同环境条件下，可解释11.2-14.4％的表型变异，其侧翼标记AX-109906455转化为Kasp-2B-YR。SNP标记AX-109906455的核苷酸序列是SEQ ID No.4第37位，为C/G多态。
针对AX-109906455位点，基于竞争性等位基因特异性PCR原理，设计引物如下：
上游引物AX-109906455-A(SEQ ID No.1)：5'-GAAGGTGACCAAGTTCAT GCTGGGTAGCATTGATCTAAACTCCTG-3'(其中下划线指示的为FAM荧光标记序列)；
上游引物AX-109906455-B(SEQ ID No.2)：5'-GAAGGTCGGAGTCAACG GATTGGGTAGCATTGATCTAAACTCCTC-3'(其中下划线指示的为HEX荧光标记序列)；
下游引物AX-109906455-C(SEQ ID No.3)：5'-CCACCATTCGACCGACAT GA-3'。
上述SEQ ID No.1与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增SEQ ID No.4中第37位核苷酸为G的片段，用仪器可读取到与FAM荧光标记序列结合的荧光基团的荧光信号；
上述SEQ ID No.2与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增SEQ ID No.4中第37位核苷酸为C的片段，用仪器可读取到与HEX荧光标记序列结合的荧光基团的荧光信号。
上述上游引物最后一位核苷酸C/G对应2B染色体上第109906455位的SNP位点C/G，即序列表序列4中第37位核苷酸。
表1检测条锈病抗性QTL QYR.gaas-2B的KASP引物序列表
实施例2、111份小麦品种的基因型和表型鉴定
1、111份不同来源的小麦品种于2014-2015和2015-2016年度种植于四川郫县和甘肃天水试验点，采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长2m，行宽0.25m，每行均匀撒播50粒种子。田间管理按当地常规进行。用我国目前的流行条锈病混和菌种对RIL群体进行成株期抗性鉴定，记载最大严重度MDS。
在111份小麦成株期接种优势条锈菌混合小种，等对照品种辉县红严重发病时(严重度达到80％)，记载111份测定材料的严重度，每隔一周再记载病害严重度，总共记载三次，取其中最大的一次最为测定材料的最大严重度。
MDS值为病原菌孢子覆盖的叶片面积占叶片总面积的百分比。统计方法可参考文献：兰彩霞.普通小麦条锈病和白粉病成株抗性QTL定位[D].中国农业科学院,2010.。
2、采用改良CTAB法提取111份家系幼叶基因组DNA，利用Kasp-2B-YR标记检测所有基因组DNA。
具体步骤如下：
竞争性等位基因特异性PCR：KASP扩增需要3条引物，两条正向竞争性引物(引物5’端有与荧光集团FAM和HEX互补配对的碱基序列，其它序列仅在3’端的SNP和InDel处有差异)和一条反向共同引物。所用试剂除特殊说明外均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照产品说明书进行。
KASP标记PCR扩增体系(4μL)，具体如下：0.048μL Primer Mix，2.0μL2×KASPMaster Mix，1.952μL Template DNA(50ng/μL)，Primer Mix的配比为：12％HEX引物(即SEQID No.2所示的引物)、12％FAM引物(即SEQ ID No.1所示的引物)、30％的Common引物(即SEQ ID No.3所示的引物，引物委托上海生工合成)。2×KASP master Mix中含有针对上游引物标签序列(FAM和HEX)合成的两个通用荧光探针和两个通用淬灭探针。
扩增使用384孔PCR仪(BIO-RAD,S1000TMThermal Cycler)，程序如下：94℃15min；94℃20s、63-55℃1min(每个循环降1℃)，10个循环；94℃20s、55℃60s，32个循环。PCR扩增产物放在自动聚焦荧光多功能酶标仪(PHERAstarplus SNP,BMG LABTECH)中读取最终荧光数据，然后将数据导入Klustercaller v3.4软件(LGC,Hoddesdon,UK)进行基因分型。
结果见表2、表3和图1。111份小麦品种中，77个品种显示为兰天25基因型CC(荧光显色为蓝色)，条锈病MDS均值为39.1；31个品种显示为辉县红基因型GG(荧光显色为红色)，条锈病MDS均值为43.9；2个品种显示为杂合基因型GC(荧光显色为绿色)，条锈病MDS均值为42.1；统计测验显示QYR.caas-2B的基因效应达到显著差异(P<0.05)。
GG基因型表示小麦基因组中AX-109906455位点的核苷酸种类为G的纯合型；CC基因型表示小麦基因组中AX-109906455位点的核苷酸种类为C的纯合型；GC基因型表示小麦基因组中AX-109906455位点的核苷酸种类为G和C的杂合型。
GG基因型扩增产物结合HEX荧光基团，显示红色荧光；CC基因型扩增产物结合FAM荧光基团，显示蓝色荧光，GC基因型扩增产物显示绿色荧光。
结果显示分型效果良好，该引物能有效鉴定供试植株基于AX-109906455位点的基因型为GG基因型、CC基因型还是GC基因型。
小麦基因组中AX-109906455位点为CC基因型小麦的条锈病抗性高于或候选高于小麦基因组中AX-109906455位点为GG基因型和/或GC基因型的小麦。即扩增产物显示蓝色荧光的待测小麦条锈病抗性高于或候选高于扩增产物显示红色荧光或绿色荧光的待测小麦。
表2 111份小麦品种的基因型检测结果和条锈病抗性
CC为兰天25基因型；GG为辉县红基因型；GC为杂合。
表3QYR.caas-2B 111份自然品种条锈病抗性效应
以上对本申请进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本申请的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本申请。虽然本申请给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本申请作进一步的改进。总之，按本申请的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本申请的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括使用检测AX-109906455位点基因型的物质检测待测小麦的基因型，根据待测小麦AX-109906455位点的基因型鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性；
所述AX-109906455位点是小麦基因组中的一个SNP位点，是SEQ ID No.4的第37位核苷酸，其核苷酸种类为G或C。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)含有扩增包括所述AX-109906455位点在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
A2)含有A1)所述引物组合物的PCR试剂；
A3)含有A1)所述引物组合物或A2)所述PCR试剂的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物组合物由核苷酸序列是SEQ IDNo.1的第22-45位的单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.2的第22-45位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA组成。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述引物组合物由SEQ IDNo.1所示的单链DNA、SEQ ID No.2所示的单链DNA和SEQ ID No.3所示的单链DNA组成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测待测小麦的AX-109906455位点的基因型的方法包括以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用权利要求3或4中所述的引物组合物进行PCR扩增，得到PCR产物；根据PCR产物的测序结果或荧光信号确定所述AX-109906455位点的基因型。
6.组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1-5中任一项所述的检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质。
7.权利要求1-5中任一项所述的检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质在下述C1)-C6)中的应用：
C1)鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性；
C2)制备鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性的产品；
C3)筛选或辅助筛选条锈病抗性小麦品种；
C4)制备筛选或辅助筛选条锈病抗性小麦品种的产品；
C5)小麦育种和/或辅助育种；
C6)制备小麦育种和/或辅助育种的产品。
8.根据权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述AX-109906455位点在内的小麦基因组DNA片段的引物组合物；
D2)所述检测AX-109906455位点的多态性或基因型的物质为含有所述引物组合物的PCR试剂；
D3)含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
9.DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
10.小麦育种的方法，其特征在于，所述方法包括选择权利要求1中所述AX-109906455位点的基因型为CC的小麦作为亲本进行育种，所述CC基因型表示小麦基因组中所述AX-109906455位点的核苷酸种类为C的纯合型。
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