CN117286285A - 一种检测小麦条锈病抗性的kasp标记引物及其应用 - Google Patents

一种检测小麦条锈病抗性的kasp标记引物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117286285A
CN117286285A CN202311515238.3A CN202311515238A CN117286285A CN 117286285 A CN117286285 A CN 117286285A CN 202311515238 A CN202311515238 A CN 202311515238A CN 117286285 A CN117286285 A CN 117286285A
Authority
CN
China
Prior art keywords
wheat
detected
primer
rust resistance
stripe rust
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311515238.3A
Other languages
English (en)
Inventor
董艳
陈东升
张维军
亢玲
何进尚
王小亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CROP Research Institute of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Original Assignee
CROP Research Institute of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CROP Research Institute of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences filed Critical CROP Research Institute of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority to CN202311515238.3A priority Critical patent/CN117286285A/zh
Publication of CN117286285A publication Critical patent/CN117286285A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鉴定小麦条锈病抗性的引物及其应用。本发明首先公开了一种鉴定小麦条锈病抗性的引物，所述引物组为由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子和SEQ ID No.3组成的KASP引物组2BC17和/或由SEQ ID No.4所示的单链DNA分子、SEQ ID No.5所示的单链DNA分子和SEQ ID No.6组成的KASP引物组2BA20。本发明进一步公开了上述引物在鉴定小麦条锈病抗性中的应用及方法。本发明开发紧密连锁的分子标记，为抗条锈病基因YrSN69应用于小麦抗条锈病分子标记辅助育种提供了良好工具，在小麦抗条锈病育种中发挥重要作用。

Description

一种检测小麦条锈病抗性的KASP标记引物及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种检测小麦条锈病抗性的高通量KASP标记引物及其应用。
背景技术
小麦是世界范围内重要粮食作物，为全世界人口提供约20％的能量。在我国，小麦是仅次于玉米和水稻的第三大粮食作物，小麦年平均种植面积和平均产量均超过粮食种植总面积和总产量的20％。因此，保障小麦高产稳产是应对人口增长和全球环境变化的必然需求。小麦条锈病为活体寄生型真菌病害，是威胁小麦等禾谷寄主的主要病害。我国被认为是世界上小麦条锈病最大的流行区，每年发病面积在4000万亩，几乎涵盖了所有冬小麦的种植区。建国后出现的条锈病大流行多是由致病小种发生变异引起的，培育抗病品种是防治小麦条锈病最为经济、有效、绿色的途径。
小麦对条锈病的抗性大体可分为全生育期抗性(ASR，All stage resistance)和成株抗性(APR，Adult plant resistance)两种类型。全生育期抗性在整个生育期都可以保持较好的抗性，但因其具有小种专化特性，抗性会随着新的毒性小种产生而丧失。成株抗性苗期感病，在植物生长后期表现出抗侵入和抗扩展等不同程度的抗性。至今已经正式命名86个抗条锈病基因Yr1-Yr86，克隆了10个小麦抗条锈病基因，包括7个ASR基因Yr5、Yr7、YrSP、Yr10、Yr15、YrU1和YrAS2388和3个APR基因Pm38/Yr18/Lr34/Sr57/Bdv1/Ltn1、Yr36和Pm46/Yr46/Lr67/Sr55/Ltn3。大面积使用单一抗性基因的品种，对病原菌形成了较高的选择压力，从而进化出毒性更强的生理小种，给小麦生产带来巨大的经济损失。因此发掘新的抗病基因，丰富小麦抗病基因库和种质资源库，对培育具有持久抗性和兼抗型的小麦品种以及完善不同抗性小麦品种合理布局具有重要指导意义和应用价值。
现有的抗病基因连锁标记大多是基于传统PCR(polymerase chain reaction)方法的SSR(Simple Sequence Repeat)标记、EST(Expressed Sequence Tag)标记和STS(sequence-tagged site)标记等。这些方法存在几个技术问题：
1)效率低：传统的PCR方法检测通量低、耗时长、检测步骤繁琐。
2)安全性低：传统的PCR检测方法需要用到一些具有腐蚀性和神经毒性的生化试剂，如溴化已锭、氢氧化钠、丙烯酰胺、硝酸银和甲醛等，长期接触这些生化试剂有致癌的风险。
3)准确性差：PCR方法的准确性受到许多因素的影响，如引物设计、扩增效率等，可重复性差。
SNP(single nucleotide polymorphism)是第三代DNA分子标记，广泛存在于植物基因组中，突变率低，在进化过程中相对稳定，是一种理想的分子标记。KASP(KompetitiveAllele Specific PCR)技术作为一种高通量、低成本SNP分型方法，利用两条特异位点引物和一条通用引物和带有荧光探针与猝灭基团的PCR试剂盒，即可通过扩增产物产生的荧光颜色判断基因型，操作方便，重复性强，安全性高；一个批次可检测样品数从数十个到数万个，标记数从数个到数百个，能够进行高通量的检测，显著提高了检测效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何高效检测或辅助检测小麦抗条锈病基因YrSN69，用于培育抗条锈病的小麦品种。
本发明的第一个目的是提供一种高通量、低成本检测或辅助检测小麦抗条锈病基因YrSN69的KASP标记引物组。本发明包括两组KASP引物，引物组2BC17和/或引物组2BA20。所述引物组2BC17包括引物1、引物2和引物3三条引物。
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子；
上述引物组中，所述引物1、引物2和引物3的摩尔量比为1:1:2.5。
所述引物组2BA20包括引物4、引物5和引物6三条引物；
所述引物4为序列4所示的单链DNA分子；
所述引物5为序列5所示的单链DNA分子；
所述引物6为序列6所示的单链DNA分子；
上述引物组中，所述引物4、引物5和引物6的摩尔量比为1:1:2.5。
序列1Primer-F1(SEQ ID NO.1)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcgagatcaaaggctggtga-3’；其中下划线部分为荧光基团FAM序列；
序列2Primer-F2(SEQ ID NO.2)
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcgagatcaaaggctggtgc-3’；其中下划线部分为荧光基团HEX序列；
序列3Primer-R(SEQ ID NO.3)
5’-aactagtaaacgtgcgtcgc-3’
所述引物组2BA20包括两条上游引物(序列4和序列5)和一条下游引物(序列6)；
序列4Primer-F3(SEQ ID NO.4)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgagccaaccgacaagcca-3’；其中下划线部分为荧光基团FAM序列；
序列5Primer-F4(SEQ ID NO.5)
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgagccaaccgacaagccg-3’；其中下划线部分为荧光基团HEX序列；
序列6Primer-R2(SEQ ID NO.6)
5’-gtcaccgacatcaccgtcc-3’
本发明的第二个目的是提供一种检测或辅助检测抗条锈病基因YrSN69的试剂盒。本发明所述的试剂盒包括上述成套KASP引物，还含有荧光报告基团A、荧光报告基团B、荧光猝灭基团A和荧光猝灭基团B。
在本发明中荧光报告基团A为FAM，荧光报告基团B为HEX，荧光猝灭基团为BHQ。
在本发明中所述荧光报告基团A、荧光报告基团B、荧光猝灭基团A和荧光猝灭基团B存在于HiGeno 2x Probe Mix B，其中所述HiGeno 2x Probe Mix B是北京嘉程生物科技有限公司产品，产品目录号为AQP-003B。
本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测小麦抗条锈病基因YrSN69的方法。
本发明提供的检测或辅助检测待测小麦抗条锈病基因YrSN69的方法为如下A1)和/或A2)：
A1)以待测小麦基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光基团A为FAM，荧光基团B为HEX，KASP引物组2BC17)进行PCR扩增，在Phestar仪器上读取所扩增产物的荧光值，采用Kluster caller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下判断待测小麦抗条锈病基因YrSN69的等位基因：若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster caller软件分析呈现蓝色，则待测小麦品种基因型为AA，含有YrSN69感病等位基因；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster caller软件分析呈现红色，则待测小麦基因型为CC，含有YrSN69抗病等位基因；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster caller软件分析呈现绿色，则待测小麦基因型为AC，在YrSN69基因位点处为杂合基因型。
A2)以待测小麦基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(所述荧光基团A为FAM，荧光基团B为HEX，KASP引物组2BA20)进行PCR扩增，在Phestar仪器上读取所扩增产物的荧光值，采用Kluster caller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下判断待测小麦抗条锈病基因YrSN69的等位基因：若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster caller软件分析呈现蓝色，则待测小麦品种基因型为AA，含有YrSN69感病等位基因；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster caller软件分析呈现红色，则待测小麦基因型为GG，含有YrSN69抗病等位基因；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster caller软件分析呈现绿色，则待测小麦基因型为AG，在YrSN69基因位点处为杂合基因型。
本发明的第四个目的在于提供一种选育抗条锈病小麦的方法。
本发明提供的选育抗条锈病小麦品种的方法是对含有YrSN69抗病等位基因的小麦材料进行选择和遗传改良。在实际育种应用中，可用农艺性状优良的含YrSN69感病等位基因的小麦品种与含有YrSN69抗病等位基因的小麦品种进行杂交，采用上述KASP引物组、试剂盒和方法，在分离世代中选择含有YrSN69抗病等位基因的单株，直至选育出农艺性状优良，YrSN69抗病等位基因纯合的稳定家系。
上述引物、上述试剂盒、上述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中，抗条锈病小麦为侵染型IT＝0-2的小麦；感条锈病小麦为侵染型IT＝3-4的小麦。
上文中，待测小麦为含有抗条锈病基因YrSN69的小麦或其与其他小麦的杂交后代，如小麦品系“陕农69”、小麦品系“陕农69”和小麦品种“辉县红”的杂交后代(如F1代、F2代、F3代……)、小麦品系“陕农69”的衍生品种或小麦品系“陕农69”与其它小麦品种的杂交后代(如F1代、F2代、F3代……)。
上文中，所述条锈病具体可为条锈菌流行小种条中31(CYR31)引起的条锈病。
本发明获取的显著的技术进步，具体分析如下：
第一，本发明以抗条锈病品系陕农69和感条锈病品种辉县红为亲本构建群体，利用条锈菌小种CYR31对杂交后代F1、F2和F2:3进行苗期抗病性鉴定，利用集群分离分析法结合RNA测序(BSR-Seq)寻找抗感池间的差异SNP，开发紧密连锁的分子标记2BC17和2BA20，为抗条锈病基因YrSN69应用于小麦抗条锈病分子标记辅助育种提供了良好工具，在小麦抗条锈病育种中发挥重要作用。
第二，本发明提供的一种高通量、低成本检测或辅助检测小麦抗条锈病基因YrSN69的KASP标记引物组，具有显著的技术进步：
1)效率提高：通过使用KASP标记引物组，可以在一个反应中同时检测多个样本，大大提高了检测效率。这对于大规模的基因型筛选和育种选择具有重要意义。
2)成本降低：KASP方法较传统的PCR方法更为简单和经济；与Taqman技术相比，它不需要每个SNP位点都去合成特异的荧光引物，它基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了KASP的试剂成本，进而降低了检测成本。(KASP需要的试剂比较贵，但是检测样本数多的情况下，成本会下降，25ml就4000-6000RMB)
3)准确性提高：通过使用两组KASP引物，可以更准确地区分目标基因的等位基因，提高了检测的准确性。
4)应用范围广泛：本发明不仅可用于小麦的抗病性筛选和育种，还可以应用于其他农作物的抗病性研究和育种。
这些显著的技术进步，将有助于推动小麦抗条锈病研究的进展，提高小麦的抗病性，保障粮食安全。
第三，本发明提供的技术进步主要体现在以下几个方面：
1)提高了抗性分子标记的准确性：通过使用特定的引物序列以及荧光基团，可以更精确地确定小麦是否具有抗条锈病的基因YrSN69等位基因。这种方法可以减少假阳性和假阴性的结果，提高了抗性分子标记的准确性。
2)提高了抗性小麦的筛选效率：通过使用这种专门设计的引物和试剂盒，可以快速地对大量的小麦样本进行筛选，大大提高了抗性小麦的筛选效率。这对于抗性小麦的大规模生产和应用具有重要的意义。
3)促进了抗性小麦的育种研究：这种技术提供了一个有效的工具，可以帮助研究人员快速鉴定小麦的条锈病抗性，从而更好地进行抗性小麦的育种研究。
4)控制和防治小麦条锈病：通过选育和种植抗条锈病的小麦，可以有效地控制和防止小麦条锈病的发生和扩散，保护小麦产量，对农业生产有重要的实际意义。
5)促进荧光检测技术的应用：这种技术的应用，推动了荧光检测技术在农业育种中的应用，对于推动相关技术的发展和应用具有重要的推动作用。
因此，本发明的应用带来了显著的技术进步，不仅提高了抗性小麦的筛选效率和准确性，促进了抗性小麦的育种研究，还有助于控制和防止小麦条锈病的发生和扩散。
附图说明
图1为KASP引物组2BC17在抗感亲本和F2群体中的基因分型结果；
图2为KASP引物组2BA20在抗感亲本和F2群体中的基因分型结果；
图3为15个KASP标记与该抗病基因YrSN69的连锁图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下是本发明提供的两个具体的实施例以及实现方案：
应用实施例1：鉴定小麦条锈病抗性
在这个实施例中，使用试剂盒来鉴定或辅助鉴定待测小麦条锈病抗性。
首先，从待测的小麦样本中提取DNA。
使用试剂盒进行PCR扩增，其中包含特定的荧光标记。
使用高分辨率荧光检测设备对PCR产品进行检测，通过检测荧光信号的强弱和波长，分析出待测小麦的条锈病抗性。
应用实施例2：选育抗条锈病小麦
在这个实施例中，使用试剂盒来选育或辅助选育抗条锈病的小麦。
在小麦种质资源中，选取一部分作为待测样本，从中提取DNA。
使用试剂盒进行PCR扩增，其中包含特定的荧光标记。
使用高分辨率荧光检测设备对PCR产品进行检测，通过检测荧光信号的强弱和波长，可以鉴定出具有抗条锈病基因YrSN69等位基因的小麦。
在大田中种植被鉴定为具有抗性的小麦，进行性状观察和病害调查，进一步确认其条锈病抗性。
通过多代选择和繁育，最终获得抗条锈病的小麦新品种。
这些实施例都是根据权利要求中的引物或试剂盒的设计，通过PCR和荧光检测技术，达到鉴定小麦条锈病抗性或选育抗条锈病小麦的目的。
所用引物均在生工生物工程(上海)有限公司合成。
所用小麦品种陕农69、辉县红和铭贤169均由国家小麦改良中心北京分中心提供，公众可从国家小麦改良中心北京分中心获得。
所用条锈菌小种CYR31由西北农林科技大学农学院植物科学系/旱区作物逆境生物学国家重点实验室提供。
本发明下述实施例中接种条锈菌检测抗病性的方法参照(Bariana和McIntosh1993)，侵染型分级标准采用6级标准(即IT＝0，0；，1，2，3，4)，0-2代表抗病，3-4代表感病。
实施例1、抗条锈病基因YrSN69高通量KASP标记2BC17引物组及2BA20引物组的获得
利用条锈菌小种CYR31对小麦材料陕农69(抗病品系)和辉县红(感病品种)及其F1，F2和F2:3代群体进行苗期抗性鉴定。结果如表1所示：亲本陕农69全部抗病，亲本辉县红全部感病，F1全部抗病，F2抗感分离符合3:1(χ2＝0.15，P＝0.70)，F2:3家系符合1:2:1(χ2＝2.79，P＝0.25)，表明陕农69对条锈菌小种CYR31的抗性由一个显性抗病基因控制。在F2:3家系中选择10个抗病家系(侵染型为0；)和10个感病家系(侵染型为4)，分别构建抗病池和感病池，进行BSR-Seq(Bulked segregant RNA-Seq)分析和BSE-Seq(Bulked segregantexome capture sequencing)分析。
表1陕农69、辉县红以及后代材料对CYR31的苗期侵染型
BSR-Seq分析结果表明2BL染色体751-770Mb区段内的SNP与表型关联，74个SNP富集在2BL染色体753-766Mb物理区间内。BSE-Seq分析结果表明2BL染色体760-761Mb区段内的SNP与表型关联。根据BSR-Seq结果，设计了15个KASP标记。以陕农69、辉县红及陕农69/辉县红F2群体基因组为模板，利用15个KASP标记进行基因型检测(图1和图2)。
使用Kluster caller对待测PCR扩增产物进行基因型分型，根据产生的颜色判断待测材料的基因型。和陕农69颜色一致的含有YrSN69抗病等位基因；和辉县红颜色一致的含有YrSN69感病等位基因。
用MapMaker3.0进行处理，绘制基因连锁图，如图3所示，15个标记均与抗条锈病基因连锁，抗条锈病基因YrSN69位于2BC17和2BA20之间，与两个标记的距离分别为0.2cM和1.8cM。
本发明基于陕农69/辉县红F2:3家系的BSR-Seq结果开发的KASP标记及其专用引物序列，其中2BC17引物组由序列1、序列2和序列3组成；2BA20引物组由序列4、序列5和序列6组成。序列1和序列4中下划线序列为FAM接头序列；序列2和序列5中下划线序列为HEX接头序列。
实施例2、KASP标记引物组2BC17和2BA20检测小麦抗条锈病基因YrSN69方法的建立
1)提取陕农69/辉县红F2群体单株的基因组DNA，将DNA浓度稀释至50ng/μl；
2)以步骤1提取的基因组DNA为模板，使用KASP引物组2BC17和2BA20进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3)引物组2BC17和2BA20的PCR扩增体系为3μl，包括：50ng/μl的模板2μl(50℃恒温培养箱放置1h，直至呈现干粉状态)，HiGeno 2x Probe Mix B 1.5μl，引物混合液0.0336μl，ddH2O 1.5μl。引物混合液配置：引物组2BC17混合液(100μM的引物1和引物2各12μl，100μM的引物330μl，ddH2O 46μl)；引物组2BA20混合液(100μM的引物4和引物5各12μl，100μM的引物630μl，ddH2O 46μl)；
4)引物组2BC17和2BA20的PCR扩增程序为：94℃ 15min，10个循环(94℃ 20s，65-57℃ 1min)，41个循环(94℃ 20s，57℃ 1min)；
使用Phestar仪器读取荧光值，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；HEX激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm；使用Kluster Caller软件进行基因型分型检测，带有HEX接头引物扩增产物产生红色荧光，带有FAM接头引物扩增产物产生蓝色荧光。
根据步骤2扩增PCR产物的基因分型结果判断检测材料是否含有YrSN69抗病等位基因。对于引物组2BC17，如果PCR产物为蓝光，说明目标SNP基因型为AA，含有YrSN69感病等位基因；如果PCR产物为红光，说明目标SNP基因型为CC，含有YrSN69抗病等位基因。对于引物组2BA20，如果PCR产物为蓝光，说明目标SNP基因型为AA，含有YrSN69感病等位基因；如果PCR产物为红光，说明目标SNP基因型为GG，含有YrSN69抗病等位基因。
实施例3、用2BC17引物组和2BA20引物组筛选抗条锈病小麦
1.待测材料的获得
以陕农69为母本，辉县红为父本，杂交后获得F1代；F1代种下去，自交得到F2代；F2代种下去，自交得到F2代种子，从中随机选取15个F2代后代单株，15个单株分别衍生出15个家系，依次命名为L1株系至L15株系；
2.温室接种条锈病生理小种CYR31鉴定待测材料条锈病抗性；
参照上述条锈病接种方法，对亲本陕农69、辉县红以及15个待鉴定株系进行温室苗期条锈病抗性检测，结果见表2。L1株系、L6株系、L8株系、L9株系、L11株系和L15株系为感病株系，L3株系、L5株系、L12株系和L14株系为抗病株系；L2株系、L4株系、L7株系、L10株系、L13株系为抗感分离株系。
表2陕农69、辉县红以及F2代单株的自交后代对CYR31的苗期抗性表现
3.使用KASP引物组2BC17和2BA20从待测材料中筛选抗条锈病小麦
1)提取株系L1-L15，亲本陕农69和辉县红的基因组DNA，每个株系混取15个单株的叶片。以上述基因组DNA为模板，分别使用KASP引物组2BC17和2BA20进行PCR扩增。PCR反应体系和PCR反应程序同实施例2。
2)使用Phestar仪器读取步骤1中PCR扩增产物的荧光值，使用Kluster Caller软件进行基因型分型检测，根据PCR扩增产物颜色确定待测材料是否含有YrSN69抗病等位基因。
3)对于引物组2BC17，如果PCR扩增产物产生蓝光，表明目标基因型为AA，含有YrSN69感病等位基因；如果PCR产物为红色，表明目标基因型为CC，含有YrSN69抗病等位基因。对于引物组2BA20，如果PCR产物为蓝色，表明目标基因型为AA，含有YrSN69感病等位基因；如果PCR产物为红色，表明目标基因型为GG，含有YrSN69抗病等位基因，检测结果见表3。结果表明L1株系、L6株系、L8株系、L9株系、L11株系和L15株系均与感病亲本辉县红基因分型结果一致，因此将L1株系、L6株系、L8株系、L9株系、L11株系和L15株系鉴定为感病株系。L3株系、L5株系、L12株系、L14株系均与抗病亲本陕农69基因分型结果一致，因此将L3株系、L5株系、L12株系和L14株系鉴定为抗病株系。L2株系、L4株系、L7株系、L10株系和L13株系基因分型结果均为杂合基因型，因此将L2株系、L4株系、L7株系、L10株系和L13株系鉴定为抗感分离家系。
15个株系温室苗期表型鉴定结果与引物组2BC17和2BA20基因型检测结果一致，以上结果表明，利用引物组2BC17和2BA20可应用辅助鉴定和筛选具有抗条锈病的小麦。
表3KASP引物组2BC17和2BA20检测陕农69、辉县红以及F2代单株自交后代
实施例4：高通量筛选抗条锈病小麦种质
在小麦种质的筛选过程中，可以使用本发明的KASP标记引物组，快速、准确地检测抗条锈病基因YrSN69的存在。具体步骤如下：
1.从待测小麦中提取DNA样本。
2.使用本发明的KASP标记引物组(如引物组2BC17或引物组2BA20)，在PCR反应中扩增DNA样本。
3.使用荧光检测设备，根据KASP标记引物组在PCR反应中产生的荧光信号，判断抗条锈病基因YrSN69的存在。
实施例5：繁育抗条锈病小麦新品种，在小麦育种过程中，可以使用本发明的KASP标记引物组，追踪抗条锈病基因YrSN69的遗传。具体步骤如下：
1.从亲本小麦中提取DNA样本。
2.使用本发明的KASP标记引物组，检测亲本小麦中抗条锈病基因YrSN69的存在。
3.选择含有抗条锈病基因YrSN69的亲本进行杂交，获取杂交种子。
4.从杂交种子自交后代的幼苗中提取DNA样本，使用本发明的KASP标记引物组，检测后代材料中抗条锈病基因YrSN69的存在。
5.选择含有抗条锈病基因YrSN69的后代材料，继续自交结合农艺性状的考察，最终获得抗条锈病的小麦新品种。
以上实施例4和实施例5均使用了本发明的KASP标记引物组，实现了对抗条锈病基因YrSN69的高通量、低成本检测，提高了小麦种质筛选和育种的效率和准确性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种引物，其特征在于，所述引物包括引物组2BC17和/或引物组2BA20；
所述引物组2BC17包括两条上游引物序列1和序列2和一条下游引物(序列3)；
序列1Primer-F1(SEQ ID NO.1)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcgagatcaaaggctggtga-3’；其中下划线部分为荧光基团FAM序列；
序列2Primer-F2(SEQ ID NO.2)
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcgagatcaaaggctggtgc-3’；其中下划线部分为荧光基团HEX序列；
序列3Primer-R(SEQ ID NO.3)
5’-aactagtaaacgtgcgtcgc-3’
所述引物组2BA20包括两条上游引物(序列4和序列5)和一条下游引物(序列6)；
序列4Primer-F3(SEQ ID NO.4)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgagccaaccgacaagcca-3’；其中下划线部分为荧光基团FAM序列；
序列5Primer-F4(SEQ ID NO.5)
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgagccaaccgacaagccg-3’；其中下划线部分为荧光基团HEX序列；
序列6Primer-R2(SEQ ID NO.6)
5’-gtcaccgacatcaccgtcc-3’。
2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物，还含有荧光基团A、荧光基团B、荧光猝灭基团A和荧光猝灭基团B，所述荧光基团A为FAM，所述荧光基团B为HEX，所述荧光猝灭基团为BHQ，所述荧光基团A、荧光基团B、荧光猝灭基团A、荧光猝灭基团A和荧光猝灭基团B存在于HiGeno 2xProbe Mix B。
3.权利要求1所述的引物或权利要求2任一所述的试剂盒在如下任一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测小麦条锈病抗性；
2)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦抗条锈病性状的产品；
3)检测或辅助检测待测小麦抗条锈病基因YrSN69等位基因；
4)制备检测或辅助检测待测小麦抗条锈病基因YrSN69等位基因的产品。
4.权利要求1所述的引物或权利要求2任一所述的试剂盒在如下任一种中的应用：
1)选育或辅助选育抗条锈病小麦；
2)制备选育或辅助选育抗条锈病小麦的产品。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦条锈病抗性的方法，其特征在于，所述方法为如下A1)和/或A2)：
A1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述的KASP引物组2BC17进行PCR扩增，得到扩增产物，使用Phestar收集荧光信号，使用Kluster caller软件进行基因型分型，根据PCR产物分型结果判断待测小麦的条锈病抗性：
若待测小麦扩增产物为蓝光，说明待测小麦目标基因型为AA，具有或候选具有感条锈病性状；若待测小麦的扩增产物为红光，说明待测小麦目标基因型为CC，具有或候选具有抗条锈病性状；若待测小麦的扩增产物为绿光，说明待测小麦目标基因型为杂合AC；
A2)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述的引物对2BA20进行PCR扩增，得到扩增产物，使用Phestar收集荧光信号，使用Kluster caller软件进行基因型分型，根据PCR产物分型结果判断待测小麦的条锈病抗性：
若待测小麦扩增产物为蓝光，说明待测小麦目标基因型为AA，具有或候选具有感条锈病性状；若待测小麦的扩增产物为红光，说明待测小麦目标基因型为GG，具有或候选具有抗条锈病性状；若待测小麦的扩增产物为绿光，说明待测小麦目标基因型为杂合AG，具有或候选具有抗条锈病性状。
6.一种检测或辅助检测待测抗条锈病基因YrSN69等位基因的方法，其特征在于，所述方法为如下B1)和/或B2)：
B1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述引物组2BC17进行PCR扩增，得到扩增产物，使用Phestar收集荧光信号，使用Kluster caller软件进行基因型分型；根据所述PCR产物分型结果判断待测小麦抗条锈病基因YrSN69等位基因：
若待测小麦扩增产物为蓝光，说明待测小麦目标基因型为AA，具有或候选具有YrSN69感病等位基因；若待测小麦的扩增产物为红光，说明待测小麦目标基因型为CC，具有或候选具有YrSN69抗病等位基因；若待测小麦的扩增产物为绿光，说明待测小麦目标基因型为杂合AC，在YrSN69基因位点是杂合状态；
B2)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述引物组2BA20进行PCR扩增，得到扩增产物，使用Phestar收集荧光信号，使用Kluster caller软件进行基因型分型；根据所述PCR产物分型结果判断待测小麦抗条锈病基因YrSN69等位基因：
若待测小麦扩增产物为蓝光，说明待测小麦目标基因型为AA，具有或候选具有YrSN69感病等位基因；若待测小麦的扩增产物为红光，说明待测小麦目标基因型为GG，具有或候选具有YrSN69抗病等位基因；若待测小麦的扩增产物为绿光，说明待测小麦目标基因型为杂合AG，在YrSN69基因位点是杂合状态。
7.一种选育抗条锈病小麦的方法，其特征在于，所述方法为C1)和/或C2)：
C1)按照权利要求5所述的方法，选育出具有抗条锈病性状的小麦；
C2)按照权利要求6所述的方法，选育出含有抗条锈病基因YrSN69抗病等位基因的小麦。
8.根据权利要求3或4所述的应用，或，权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述待测小麦为含有抗条锈病基因YrSN69的小麦或其与其他小麦的杂交后代。
CN202311515238.3A 2023-11-15 2023-11-15 一种检测小麦条锈病抗性的kasp标记引物及其应用 Pending CN117286285A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311515238.3A CN117286285A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种检测小麦条锈病抗性的kasp标记引物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311515238.3A CN117286285A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种检测小麦条锈病抗性的kasp标记引物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117286285A true CN117286285A (zh) 2023-12-26

Family

ID=89257408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311515238.3A Pending CN117286285A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种检测小麦条锈病抗性的kasp标记引物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117286285A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106868131B (zh) 陆地棉6号染色体与纤维强度相关的snp分子标记
CN109735652B (zh) 小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用
CN108998562B (zh) 基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用
CN112481275B (zh) 一种小麦抗条锈病基因yrZ15-1370及其分子标记和应用
CN113584216B (zh) 小麦粒重基因TaCYP78A16的KASP标记开发及其应用
CN112080582A (zh) 一种与小麦穗长主效qtl位点紧密连锁的kasp分子标记及其应用
CN109295179B (zh) 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒
CN114427007A (zh) 一种与苦瓜全雌性相关的kasp分子标记及其应用
CN109609687B (zh) 用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用
CN110872633A (zh) 一种基于snp标记鉴定京科968玉米杂交种纯度的方法
CN116287387A (zh) 一种辣椒PMMoV抗性基因L3紧密连锁的SNP位点、KASP分子标记及应用
CN114606335A (zh) 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用
CN117286285A (zh) 一种检测小麦条锈病抗性的kasp标记引物及其应用
CN108060247B (zh) 一种与陆地棉8号染色体纤维强度相关的单体型
CN111607664A (zh) 一种与小麦条锈病相关的1ds染色体上的snp分子标记的应用
CN116200528B (zh) 与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁的SNP分子标记及应用
CN116024379B (zh) 小麦抗条锈病基因YrAK58功能性分子标记及其应用
CN115772579B (zh) 一种茄子抗青枯病性状紧密连锁的snp分子标记及其应用
CN114908183B (zh) 一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法及snp专用引物组和应用
CN117286287B (zh) 大豆耐荫基因GmYUC2的KASP标记及其应用
CN108060246B (zh) 一种与陆地棉7号染色体纤维强度相关的单体型
CN114686614B (zh) 用于检测豌豆叶片构型的kasp分子标记及其应用
CN117487947A (zh) 水稻光温敏雄性核不育kasp分子标记、试剂盒和应用
CN115896339A (zh) 与小麦抗条锈病基因Yr81相关的特异SNP分子标记及应用
CN117802265A (zh) 谷子抗锈病基因高通量检测kasp标记、引物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination