CN114686614B - 用于检测豌豆叶片构型的kasp分子标记及其应用 - Google Patents

用于检测豌豆叶片构型的kasp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测豌豆叶片构型的KASP分子标记及其应用，其SNP位点位于豌豆2号染色体第422383462位碱基，通过该分子标记中的单碱基差异设计了KASP检测的引物组合，可用于快速精准地鉴定豌豆叶片构型的基因分型，减少时间和人工成本的同时又可以高通量检测多个样品，大大提高检测效率，在豌豆叶片构型品种选育中能够发挥重要作用。

Description

用于检测豌豆叶片构型的KASP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及作物形态构成性状分子标记开发和分子辅助育种技术领域，具体涉及一种用于检测豌豆叶片构型的KASP分子标记及其应用。
背景技术
豌豆为二倍体豆科植物，为世界第四大食用豆类作物。随着农村劳动力资源的短缺，豌豆育种的一个重要趋势就是要培育优质高产、免搭架、适合机械化采收的品种。我们发现，豌豆叶片构型性状是影响豌豆是否需要搭架以及可否机械化采收的一个重要因素。
豌豆的叶片形态类型丰富，最普通的类型是羽状复叶由小叶和卷须组成，此外还有无小叶类型(全部为卷须)，以及无卷须类型(全部为小叶)等。我国市场上的主栽品种包括中豌4号、中豌6号、长寿仁等小叶类型大多数为普通类型，即羽状复叶由小叶和卷须组成(图1左图)。国外包括欧洲等国家的豌豆主栽品种很多羽状复叶的小叶类型为全卷须(图1右图)，这种类型的豌豆品种卷须之间可以相互缠绕，不需要搭架栽培，利于机械化采收，大大节约劳动力成本，适宜轻简化栽培。
前人研究表明叶片构型的基因调控机制非常复杂，of基因被认为是引起豌豆羽状复叶产生须状突变的关键基因，同时mfp、tl、uni、coch等基因也参与豌豆叶片构型过程。此外，生长素和赤霉素两种激素信号也参与豌豆叶片发育过程。
豌豆全基因组测序工作于2019年完成，对豌豆重要性状关键基因的调控机制研究还处于起步阶段。目前主要通过能够形态学鉴定方法来鉴定豌豆叶片构型，存在检测周期长、效率低下等缺点。
因此急需充分挖掘豌豆叶片构型关键调控基因，开发相应基因功能性分子标记，为豌豆适宜轻简化栽培的分子辅助育种提供有力技术支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测豌豆叶片构型的KASP分子标记及应用。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种用于检测豌豆叶片构型的KASP分子标记PsLN，所述分子标记PsLN的SNP位点位于豌豆2号染色体第422383462位碱基，分子标记多态性为G/C。
豌豆全基因组测序工作于2019年完成，对豌豆重要性状关键基因的调控机制研究还处于起步阶段，充分挖掘豌豆叶片构型关键调控基因，开发相应基因功能性分子标记，将为豌豆适宜轻简化栽培的分子辅助育种提供有力技术支撑。
本发明提供的鉴定豌豆叶片构型的相关SNP位点位于豌豆已发表基因组(https://urgi.versailles.inra.fr/jbrowse/gmod_jbrowse/？data＝myData/Pea/Psat_v1a/data)2号染色体422383462bp位置，并以该位点设计的KASP分子标记PsLN。
本发明所获得的分子标记PsLN(leaf number)为豌豆叶片构型的基因标记，能用于羽状复叶有无小叶的辅助选择育种。
另一方面，本发明提供一种用于检测上述的KASP分子标记PsLN的引物组合，包括：
Ⅰ)两条正向引物为Pa型正向引物和Pb型正向引物，其中Pa型正向引物序列如序列表中Seq ID NO.1所示，Pb型正向引物序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
Ⅱ)一条反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示。
进一步地，所述Pa型正向引物的5’端带有HEX荧光信号标签；Pb型正向引物的5’端带有FAM荧光信号标签。
再一方面，本发明提供含有上述的引物组合的试剂或试剂盒。
再一方面，本发明提供采用如上所述的引物组合检测豌豆叶片构型的方法，包括以下步骤：
1)提取待测豌豆品种基因组DNA；
2)以待测豌豆品种基因组DNA为模板，利用权利要求2或3所述的引物组合进行KASP 反应检测；
3)根据KASP产物荧光信号的差异，鉴别出待测豌豆的基因型。
进一步地，步骤2)中KASP反应体系为：5～10ng/μl豌豆基因组DNA 0.8μl，KASPMaster Mix 0.75μl，KASP Assay Mix 0.05μl。
进一步地，步骤2)中KASP反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20S；61℃复性/延伸60s，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；再94℃变性20s，55℃复性/延伸60s，共26个循环。
进一步地，步骤3)为根据KASP产物荧光信号的差异，利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，进而鉴别出每个待测豌豆材料的基因型，即鉴定出属于纯合aa型基因型(羽状复叶由小叶和卷须组成)，纯合bb型基因型(羽状复叶无小叶，只有卷须)，杂合ab基因型(羽状复叶由小叶和卷须组成)。
在一些实施方式中，步骤3)中KASP产物荧光信号的差异，主要根据颜色分类，得到基因分型效果图，从而进行豌豆基因型的鉴别。
由于Pa型正向引物的5’端带有HEX荧光信号标签，Pb型正向引物的5’端带有FAM荧光信号标签，如果检测到的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个引物扩增(例如，纯合aa型只能与F-HEX发生反应)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是 aa型还是bb型，如果检测的材料是杂合ab型的，扩增时2个引物都会被用到，产生的荧光不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合的基因型。
在一些方式中，步骤3)若在SNP位点检测到碱基G，为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，荧光信号显示为蓝色，则判定待测豌豆叶片构型为纯合基因型aa(羽状复叶由小叶和卷须组成)；若检测到碱基C，为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，荧光信号显示为红色，则判定待测豌豆叶片构型为纯合基因型bb(羽状复叶无小叶，只有卷须)；若同时检测到碱基G和C，为同时连接FAM荧光标签序列和HEX荧光标签序列的中间型，荧光信号显示为紫色，则判定待测豌豆叶片构型为杂合基因型ab(羽状复叶由小叶和卷须组成)。
再一方面，本发明提供一种用于检测豌豆叶片构型的SNP位点的定位方法，包括以下步骤：
a)以羽状复叶由小叶和卷须组成的普通豌豆(Pa型)与羽状复叶无小叶仅有卷须的突变类型豌豆(Pb型)为亲本进行杂交和自交，从而获得作为后代的有小叶和无小叶分离的单株；
b)用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取豌豆亲本幼苗和杂交后代F2群体幼苗基因组DNA；
c)采用BSA(分离群体分析，Bulked Segregant Analysis)构建有小叶/无小叶基因混池，基因Illumina高通量测序平台对有/无小叶基因池及父母本进行覆盖度30倍重测序；
d)采用关联分析鉴定与叶片构型相关的基因位点；
e)定位与豌豆叶片构型相关的基因位点。本发明定位到一个与豌豆叶片构型相关的基因位点位于2号染色体422383462bp位置。
本发明经过大量的基因测序、关联分析和比对工作，在初定位区间2号染色体400Mb-420Mb基础上，进一步设计引物利用198个F2单株进行精细定位，终于定位到一个与豌豆叶片构型相关的基因位点，然后再进行大量的豌豆叶片构型的相关鉴定工作来验证上述位点的有效性。
再一方面，本发明提供一种豌豆叶片构型辅助选择育种的方法，包括以下步骤：根据定位叶片构型相关位点上下游核苷酸序列，设计开发分子标记PsLN，用于检测不同叶片构型豌豆基因型的多态性，从而获得叶片构型符合育种目标的株系。
在一些实施方式中，具体包括以下步骤：
以羽状复叶由小叶和卷须组成的普通豌豆(Pa)与羽状复叶无小叶仅有卷须的突变类型豌豆(Pb)为亲本进行杂交和自交获得F2群体，对F2群体种子直接提取DNA，利用检测KASP分子标记PsLN的引物组合进行基因分型鉴定，获得叶片构型符合育种目标的株系。
在一些实施方式中，所述检测KASP分子标记PsLN的引物组合的设计步骤为：根据定位叶片构型相关位点上下游核苷酸序列，设计开发检测KASP分子标记PsLN的引物组合，用于检测不同叶片构型豌豆基因型的多态性。
在一些实施方式中，定位叶片构型相关位点上下游核苷酸序列是指分子标记PsLN的 SNP位点前后共50bp的序列，其序列如序列表中Seq ID NO.4所示。
本发明根据分子标记PsLN的SNP位点前后共100bp的序列，设计的引物组合有很多种，经过大量试验，选出了最佳引物组合用于豌豆叶片构型的鉴定。
在一些实施方式中，所述基因分型鉴定，主要通过在IntelliQube基因分型检测平台检测荧光信号并分析基因分型。
在一些实施方式中，通过上述引物组合进行KASP反应检测，其中KASP反应体系为：5～10ng/μl豌豆基因组DNA 0.8μl，KASP Master Mix 0.75μl，KASP Assay Mix 0.05μl。
在一些实施方式中，KASP反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20S；61℃复性/延伸60s，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；再94℃变性20s，55℃复性/延伸60s，共26个循环。
在一些实施方式中，检测到的荧光信号主要根据颜色分类，得到基因分型效果图，从而进行豌豆基因型的鉴别。
将不同豌豆叶片构型的表型数据与分子标记PsLN的基因分型数据关联分析，结果表明，所有纯合aa基因型的材料均为羽状复叶由小叶和卷须组成的普通类型，所有纯合bb基因型的材料均为羽状复叶无小叶只有卷须的类型，杂合基因型ab的羽状复叶由小叶和卷须组成。
本发明提供的分子标记PsLN能用于豌豆叶片构型的分子辅助选择，该标记具有可靠性和可用性。
大量实验证明，本发明所获得的分子标记PsLN能用于豌豆叶片构型的分子辅助育种。
再一方面，本发明提供一种如上所述的KASP分子标记PsLN或检测上述的KASP分子标记PsLN的引物组合或包含所述引物组合的试剂或试剂盒在鉴定豌豆叶片构型辅助育种方面的用途。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于检测豌豆叶片构型的KASP分子标记PsLN，其SNP位点位于豌豆2号染色体第422383462位碱基，通过该分子标记中的单碱基差异设计了KASP检测的引物组合，可用于快速精准地鉴定豌豆叶片构型的基因分型，减少时间和人工成本的同时又可以高通量检测多个样品，大大提高检测效率，将在豌豆叶片构型品种选育中发挥重要作用。
附图说明
图1为豌豆叶片构型示意图，其中左图为普通叶片构型，羽状复叶由小叶和卷须组成，右图为突变叶片构型，羽状复叶没有小叶只有卷须组成。
图2为实施例3中的使用KASP分子标记PsLN后的基因分型结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。实施例中未注明具体条件者按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。
实施例1豌豆叶片构型相关的分子标记的开发
本实施例通过对以浙江省农业科学院自主选育的豌豆品种‘浙豌1号’为母本[羽状复叶由小叶和卷须组成的普通豌豆(Pa型)]与从西班牙引进的豌豆品种为父本[状复叶无小叶仅有卷须的突变类型豌豆(Pb型)]，进行杂交，F1代收获12粒种子，12粒种子第二年全部播种进行自交，收获198个F2代种子，F2代中有小叶的单株有151株，无小叶的单株有47株。对亲本及F2单株个体嫩叶取样，用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethylammonium Bromide)法提取豌豆亲本幼苗和杂交后代F2群体幼苗基因组DNA；采用BSA (分离群体分析，Bulked Segregant Analysis)构建有小叶/无小叶基因混池，基因Illumina高通量测序平台对有/无小叶基因池及父母本进行覆盖度30倍重测序；采用关联分析鉴定与叶片构型相关的基因位点，初步定为区间为2号染色体400Mb-420Mb内；进一步在区间内选择在基因外显子上非同义突变的SNP位点设计引物进行精细定位，终于定位到与豌豆叶片构型相关的基因位点。本实施例定位到一个与豌豆叶片构型相关的基因位点位于2号染色体422383462bp位置。
实施例2用于KASP检测分子标记PsLN的引物组合的设计
本实施例根据实施例1获得的SNP位点，根据定位叶片构型相关位点上下游核苷酸序列，设计开发检测KASP分子标记PsLN的引物组合，用于检测不同叶片构型豌豆基因型的多态性。其中的引物组合设计委托杭州擎科生物有限公司合成，具体步骤如下：
通过分子标记PsLN的SNP位点前后共100bp的序列，其序列如序列表中Seq IDNO.4 所示，设计的引物组合可以有非常多种，本实施例通过大量的实验进行筛选，最终选出了最佳引物组合用于豌豆叶片构型的鉴定，具体引物组合如表1所示，其中Pa型正向引物的5’端带有HEX荧光信号标签，Pb型正向引物的5’端带有FAM荧光信号标签。该引物组合序列可和豌豆基因的相应序列特异性结合。
表1筛选获得的最佳引物组合序列
实施例3豌豆叶片构型的KASP分子标记PsLN检测
(1)提取待测豌豆基因组DNA
以羽状复叶由小叶和卷须组成的普通豌豆(Pa)与羽状复叶无小叶仅有卷须的突变类型豌豆(Pb)为亲本进行杂交和自交获得F2群体。待测F2群体豌豆样品共184份，提取基因组DNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳对所提取的豌豆基因组DNA的质量及浓度进行检测，确保基因组DNA条带完整无拖尾。
(2)KASP特异性PCR反应
对待测F2群体豌豆材料基因组DNA进行KASP反应，KASP反应在IntelliQube基因分型平台上进行。
KASP检测的PCR反应体系为：5～10ng/μl豌豆基因组DNA 0.8μl，KASP Master Mix0.75μl，KASP Assay Mix 0.05μl。
KASP反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20S；61℃复性/延伸60s，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；再94℃变性20s，55℃复性/延伸60s，共26个循环。
反应完成后利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，读取结果会转化成基因分型图。
(3)检测结果分析
184份豌豆样品和1份纯水阴性对照品使用分子标记PsLN后的基因分型结果如图2所示，该基因型是通过检测KASP产物中两种荧光强度判断的，图中每个圆点代表一份待测材料，检测结果原图为彩色图，考虑到专利申请时只能提交黑白图，因此申请人对图中的各小圆圈所代表的基因型进行了标注。其中蓝色圆点表示是纯合基因型aa(羽状复叶由小叶和卷须组成)，红色圆点表示是纯合基因型bb(羽状复叶无小叶，只有卷须)，紫色圆点表示是杂合基因型ab(羽状复叶由小叶和卷须组成)。
经过统计，该批待测F2群体豌豆样品中的纯合基因型aa样品53份，纯合基因型bb样品42份，杂合基因型ab样品89份。分型结果图形分区界限明显，说明KASP分子标记PsLN分型可靠。
同时统计这批待测F2群体豌豆材料的叶片构型表型，并与KASP分子标记PsLN基因分型结果进行比对，结果如表2所示。
表2不同叶片构型F2群体的单株叶片表型和基因型统计结果
表2结果表明，纯合基因型aa叶片表型为羽状复叶由小叶和卷须组成，纯合基因型bb叶片表型为羽状复叶没有小叶只有卷须，杂合基因型ab叶片表型与aa表型一样，为羽状复叶由小叶和卷须组成。可见经KASP分子标记PsLN基因分型结果与其叶片构型表型结果一致。
通过KASP分子标记PsLN基因分型结果，育种科研人员可以从中挑选出需要的纯合基因型的样品，可以快速预测豌豆的叶片构型，大大加快豌豆叶片构型材料的选择进度。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 用于检测豌豆叶片构型的KASP分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtcgga gtcaacggat tgagaatggg aattttacta gc 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tgagaatggg aattttacta gg 42
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgacataa cccgtaagat tc 22
<210> 4
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtgaatat gaagtttccc gagttaattg ttgatgagaa tgggaatttt actaggcgat 60
gtttattcag ggacgttgaa tcttacgggt tatgtcaaat tcagtgggat tg 112

Claims (7)

1.采用引物组合检测豌豆叶片构型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测豌豆品种基因组DNA；
2)以待测豌豆品种基因组DNA为模板，利用引物组合进行KASP反应检测；
3)根据KASP产物荧光信号的差异，鉴别出待测豌豆的基因型；
所述引物组合包括：
Ⅰ)两条正向引物为Pa型正向引物和Pb型正向引物，其中Pa型正向引物序列如序列表中Seq ID NO.1所示，Pb型正向引物序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
Ⅱ)一条反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Pa型正向引物的5’端带有HEX荧光信号标签；Pb型正向引物的5’端带有FAM荧光信号标签。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中KASP反应体系为：5～10ng/μl豌豆基因组DNA 0.8μl，KASP Master Mix 0.75μl，KASP Assay Mix 0.05μl。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中KASP反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20S；61℃复性/延伸60s，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；再94℃变性20s，55℃复性/延伸60s，共26个循环。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)为根据KASP产物荧光信号的差异，利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，鉴别出待测豌豆的基因型。
6.一种KASP分子标记PsLN或引物组合或含有引物组合的试剂或试剂盒在鉴定豌豆叶片构型辅助育种方面的用途，其特征在于，所述KASP分子标记PsLN的SNP位点位于豌豆2号染色体第422383462位碱基，分子标记多态性为G/C，所述KASP分子标记PsLN可由引物组合检测得到；所述引物组合包括：
Ⅰ)两条正向引物为Pa型正向引物和Pb型正向引物，其中Pa型正向引物序列如序列表中Seq ID NO.1所示，Pb型正向引物序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
Ⅱ)一条反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述Pa型正向引物的5’端带有HEX荧光信号标签；Pb型正向引物的5’端带有FAM荧光信号标签。
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