CN117248065A - 小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用 - Google Patents
小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117248065A CN117248065A CN202311249018.0A CN202311249018A CN117248065A CN 117248065 A CN117248065 A CN 117248065A CN 202311249018 A CN202311249018 A CN 202311249018A CN 117248065 A CN117248065 A CN 117248065A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wheat
- total root
- genotype
- nucleotide
- detected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 175
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract 69
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 44
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 46
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 27
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 19
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 120
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 4
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- -1 salt ion Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了小麦总根尖数QNRT.caas‑5D的分子标记及其应用。本发明提供了小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性作为标记物在鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数中的应用；所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。本发明对于培育总根尖数更多(高产、稳产)的小麦品种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的主食作物之一。小麦生产很大程度上受到各种非生物胁迫的限制，因此选育在非生物胁迫下高产稳产品种是小麦育种重要目标。根系不仅对从土壤中获取养分和水分很重要，而且对环境胁迫的耐受性也至关重要。根系结构特征定义了根系的形状，并在植物生长和发育中发挥着重要作用，尤其是在缺水和养分缺乏的条件下(Paez Garcia等，2015)。根系的形态包括根长、根表面积、根尖数、根直径等多种性状(Maccaferri等，2016)。根尖数与养分和水分吸收显著相关(Maccaferri等，2016)。由于难以在田间条件下对根系构成相关性状进行高通量表型评价，传统育种多数侧重于地上部性状，特别是收获指数、抗病性和株高，而忽略了优化根系构成相关性状。小麦根系总根尖数受微效基因控制，受环境条件显著影响。发掘小麦根系总根尖数控制基因，并开发可用KASP标记对于小麦高产、稳产育种具有重要意义。
KASP标记已广泛应用于检测小麦、水稻和玉米等作物的SNP位点，可实现高通量基因分型。利用小麦SNP芯片的基因型数据进行QTL定位和全基因组关联分析，将连锁SNP转化为KASP标记，可直接应用于分子标记辅助选择育种。
发明内容
本发明的目的是提供小麦总根尖数QNRT.caas-5DL的分子标记及其应用。
第一方面，本发明要求保护小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的产品；
(A3)比较待测小麦的总根尖数多少；
(A4)制备用于比较待测小麦的总根尖数多少的产品；
(A5)选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。所述特定SNP位点对应于小麦参考基因组Chinese Spring RefSeq v1.0的物理位置454111247bp(https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/)(下同)。
第二方面，本发明要求保护用于检测小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的产品；
(A3)比较待测小麦的总根尖数多少；
(A4)制备用于比较待测小麦的总根尖数多少的产品；
(A5)选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。
其中，用于检测小麦基因组上所述特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质可为后文第三方面中所述的KASP引物或后文第四方面中所述的试剂或试剂盒。
第三方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的KASP引物。
本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ ID No.1的第22-45位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ ID No.2的第22-45位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。
其中，所述荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，其核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B为荧光标签序列HEX，其核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位。
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
第四方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的试剂或试剂盒。
本发明所要求保护的试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有前文第三方面中所述的KASP引物。
第五方面，本发明要求保护一种特异性DNA分子。
本发明所要求保护的特异性DNA分子如SEQ ID No.4所示。其中，SEQ ID No.4的第38位的Y为T或C。
第六方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的KASP引物或前文第四方面中所述的试剂或试剂盒或前文第五方面中所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的产品；
(A3)比较待测小麦的总根尖数多少；
(A4)制备用于比较待测小麦的总根尖数多少的产品；
(A5)选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
在(A9)中，所述育种的目的是获得总根尖数更多(高产、稳产)的小麦品种。
第七方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的总根尖数多少的方法，包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的总根尖数多少：C:C基因型的所述待测小麦的总根尖数多于或候选多于T:T基因型的所述待测小麦的总根尖数；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型。
方法II：一种选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择C:C基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择C:C基因型的小麦，最终获得总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型。
方法III：一种筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，将T:T基因型的所述待测小麦筛选出来剔除出去；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型。
上述方法中，检测所述待测小麦的基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸可通过直接测序完成，也可按照包括如下步骤的方法进行：利用前文第四方面中所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述特定SNP位点的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为C:C基因型。
在本发明中，所述小麦可选自豆麦和石4185的杂交后代或者表2中165份小麦材料。
本发明利用豆麦和石4185构建了包括262个家系的重组近交系(RIL)群体。本研究利用90K芯片构建的遗传图谱对该RIL群体根尖数进行QTL分析，检测出一个在多环境条件下稳定存在的QTL，位于5DL染色体，侧翼标记为IAAV6218和Kukri_c46526_103，物理区间为449.6-454.1Mb；可解释表型变异的10.16％，暂定名为QNRT.caas-5DL，与其紧密连锁的KASP标记Kasp-Kukri_c46526_103(小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，为T或C)，可用于分子标记辅助育种。统计165份自然品种中TT和CC两种基因型的小麦的平均总根尖数，结果表明CC纯合型(总根尖数226.7)比TT纯合型的小麦品种(总根尖数172.5)的小麦品种的总根尖数显著提高。本发明对于培育总根尖数更多(高产、稳产)的小麦品种具有重要意义。
附图说明
图1为豆麦×石4185RIL群体定位的QNRT.caas-5DL曲线图。
图2为Kasp-Kukri_c46526_103对165份小麦品种基因分型结果(红色为石4185基因型CC，蓝色为豆麦基因型TT，绿色为杂合TC，粉色为检测失败)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
豆麦：记载于“董艳.小麦茎秆水溶性碳水化合物合成基因TaSST的克隆、功能标记开发和关联分析[D].中国农业科学院,2016.”一文，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用，不得他用。
石4185：记载于“董艳.小麦茎秆水溶性碳水化合物合成基因TaSST的克隆、功能标记开发和关联分析[D].中国农业科学院,2016.”一文，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用，不得他用。
实施例1、小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用
一、表型检测
针对豆麦/石4185的RIL群体，挑选饱满且大小一致的小麦种子，置于10％ H2O溶液中浸泡10min，去离子水冲洗3次后，置于湿润滤纸上培养(25℃)。于一叶一心期选取长势一致的幼苗转移到Hoagland培养液中(16h光照/8h黑暗，22-25℃)继续培养，每隔3d更换一次营养液，21d后利用去离子水将根部冲洗干净，将根和地上部在分节处剪断，置于自封袋中，4℃冰箱临时保存。置于装有去离子水的透明根盘中，利用WinRHIZOLA6400XL(爱普生公司)根系专用大幅面透视扫描仪对根系进行扫描，利用WinRHIZOPro软件分析各样品的根系总根尖数。
二、连锁图谱构建
采用CTAB法提取262个家系幼叶基因组DNA，用NanoDrop2000c分光光度计测定DNA浓度，并将DNA样品调至标准浓度50ng/μl，然后用0.8％的琼脂糖凝胶检测DNA质量，质量合格DNA进行SNP分型。利用中国农业科学院作物科学研究所和Affymetrix Axiom公司合作完成的90K SNP芯片进行SNP分析。
90K SNP芯片共包含80547个标记，亲本间有差异的标记为11526个。去除亲本间杂合、缺失率大于10％的标记后剩余10631个。利用IciMapping 4.1bin功能去除冗余标记后剩余9354个。然后根据标记间的遗传距离和染色体位置信息分群，构建连锁群有34个，共包含1507个标记。
三、QTL分析
采用IciMapping 4.1ICIM-ADD方法进行QTL分析，LOD值选取3.0，在5DL染色体定位到1个稳定的QTL，将其命名为QNRT.caas-5DL(图1)。侧翼标记为IAAV6218和Kukri_c46526_103和，物理区间为449.6-454.1Mb。在不同环境条件下，可解释表型变异的10.16％。其侧翼标记Kukri_c46526_103转化为Kasp-Kukri_c46526_103，后续用于检测165份小麦品种的基因型。
四、分子标记Kasp-Kukri_c46526_103的开发
分子标记Kasp-Kukri_c46526_103位于小麦5D染色体上，据其设计并合成适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定小麦总根尖数的引物组。KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R三条引物序列组成，用于扩增包括该位点(SNP位点)的靶序列。
上游引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGGGATGGAGATAGATCAAT-3’(SEQ IDNo.1，下划线部分为特异荧光标签序列FAM)；
上游引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGGGATGGAGATAGATCAAC-3’(SEQ IDNo.2，下划线部分为特异荧光标签序列HEX)；
下游引物R：5’-AGCAGTCTTCTTCTCCCTCG-3’(SEQ ID No.3)。
Kasp-Kukri_c46526_103位点为小麦基因组中SEQ ID No.4自5’末端起第38位的核苷酸(对应两条上游引物的3’末端最后一个碱基)，为T或C(在SEQ ID No.4中用Y表示)，该位点的基因型可为TT纯合型、CC纯合型和TC杂合型。
SEQ ID No.4：
GAAATYCGTAAAGGAGAAGGGATGGAGATAGATCAAT[Y]CTCATTCAGAATCCAGACCCGAGGGAGAAGAAGACT(Y为T/C)。
由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。Kasp-Kukri_c46526_103位点的基因型均为正义DNA的基因型。
上游引物F1用于扩增小麦5D染色体上该SNP位点(正义链)处核苷酸为T的情况，上游引物F2用于扩增小麦5D染色体上该SNP位点(正义链)处核苷酸为C的情况；下游引物R为通用引物。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦5D染色体上该SNP位点(正义链)处核苷酸为T纯合的片段。
上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦5D染色体上该SNP位点(正义链)处核苷酸为C纯合的片段。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增小麦5D染色体上该SNP位点(正义链)处核苷酸为T和C杂合的片段。
五、多态性检测
实验材料为165个小麦品种，具体见表1。
一方面，针对165个小麦品种，采用步骤一中的方法检测各品种小麦的根系总根尖数。
另一方面，利用Kasp-Kukri_c46526_103标记检测所有实验材料。具体操作如下：
采用CTAB法提取165个小麦品种幼嫩叶片的基因组DNA。基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2100(Thermo)检测A260/A280比值介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)，A260/A230比值介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)，270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；待测小麦的基因组DNA的浓度在50-200ng/μL。
以待测小麦的基因组DNA为模板，采用步骤四合成的KASP引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系：2.0μl KASP 2×Master Mix(LGC,货号：13448166)、0.048μl KASP引物(3条引物混合，总浓度为50μM，其中两条上游引物和一条下游引物的摩尔比为2:2:5)、1.952μl模板DNA(50ng/μl)。扩增使用384孔PCR仪(BIO-RAD，S1000TMThermal Cycler)。
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，65℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低1℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃1min，继续扩增41个循环。
PCR扩增产物放在自动聚焦荧光多功能酶标仪(PHERAstarplus SNP,BMGLABTECH)中读取最终荧光数据，然后将数据导入Klustercaller v3.4软件(LGC,Hoddesdon,UK)进行基因分型。FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值。根据荧光信号颜色判断待测小麦基于Kasp-Kukri_c46526_103位点的基因型。具体的判断原则如下：如果待测小麦基于Kasp-Kukri_c46526_103位点显示蓝色荧光信号，则该待测小麦基于Kasp-Kukri_c46526_103位点的基因型TT纯合型，与豆麦一致；如果待测小麦基于Kasp-Kukri_c46526_103位点显示红色荧光信号，则该待测小麦基于Kasp-Kukri_c46526_103位点的基因型为CC纯合型，与石4185一致；如果待测小麦基于Kasp-Kukri_c46526_103位点显示绿色荧光信号，则该待测小麦基于Kasp-Kukri_c46526_103位点的基因型为TC杂合型。
结果见表1、表2和图2。165个小麦品种中。146个品种显示为石4185基因型CC(红色)，总根尖数为226.7；9个品种显示为豆麦基因型TT(蓝色)，总根尖数为172.5；统计测验显示QNRT.caas-5DL的基因效应达到显著差异(P<0.05)。
表1、165份小麦品种的基因型检测结果和根系总根尖数
注：“-”代表表型或基因型数据缺失。
表2、QNRT.caas-5DL 165份自然群体总根尖数效应
注：*表示差异显著。
由此可见，利用Kasp-Kukri_c46526_103位点的基因型可以鉴定小麦的总根尖数，Kasp-Kukri_c46526_103位点的基因型为C:C纯合型的待测小麦的总根尖数显著高于T:T纯合型的待测小麦。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的产品；
(A3)比较待测小麦的总根尖数多少；
(A4)制备用于比较待测小麦的总根尖数多少的产品；
(A5)选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。
2.用于检测小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的产品；
(A3)比较待测小麦的总根尖数多少；
(A4)制备用于比较待测小麦的总根尖数多少的产品；
(A5)选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：用于检测小麦基因组上所述特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质为权利要求4或5中所述的KASP引物或权利要求6或7所述的试剂或试剂盒。
4.用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ ID No.1的第22-45位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ IDNo.2的第22-45位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。
5.根据权利要求4所述的KASP引物，其特征在于：所述荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，其核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B为荧光标签序列HEX，其核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位；
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
6.用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有权利要求4或5中所述的KASP引物。
7.特异性DNA分子，如SEQ ID No.4所示。
8.权利要求4或5所述的KASP引物或权利要求6所述的试剂或试剂盒或权利要求7所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的总根尖数的产品；
(A3)比较待测小麦的总根尖数多少；
(A4)制备用于比较待测小麦的总根尖数多少的产品；
(A5)选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
9.如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的总根尖数多少的方法，包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的总根尖数多少：C:C基因型的所述待测小麦的总根尖数多于或候选多于T:T基因型的所述待测小麦的总根尖数；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型；
方法II：一种选育总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择C:C基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择C:C基因型的小麦，最终获得总根尖数相对较多的小麦单株或株系或品系或品种；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型；
方法III：一种筛选剔除总根尖数相对较少的小麦单株的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，将T:T基因型的所述待测小麦筛选出来剔除出去；
所述特定SNP位点位于小麦5D染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：检测所述待测小麦的基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸按照包括如下步骤的方法进行：利用权利要求6所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述特定SNP位点的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为C:C基因型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311249018.0A CN117248065A (zh) | 2023-09-26 | 2023-09-26 | 小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311249018.0A CN117248065A (zh) | 2023-09-26 | 2023-09-26 | 小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117248065A true CN117248065A (zh) | 2023-12-19 |
Family
ID=89134569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311249018.0A Pending CN117248065A (zh) | 2023-09-26 | 2023-09-26 | 小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117248065A (zh) |
-
2023
- 2023-09-26 CN CN202311249018.0A patent/CN117248065A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113584216B (zh) | 小麦粒重基因TaCYP78A16的KASP标记开发及其应用 | |
| CN107227373B (zh) | 一种粳稻抗倒伏基因的snp功能分子标记及应用 | |
| CN109295179B (zh) | 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒 | |
| CN111893209B (zh) | 一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用 | |
| CN106755465B (zh) | 与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-2D紧密连锁的分子标记及应用 | |
| CN109811077B (zh) | 与小麦矮秆基因紧密连锁的kasp标记及其应用 | |
| CN116516054A (zh) | 一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN113832251B (zh) | 用于检测番茄花叶病毒病抗性的snp位点组合及其应用 | |
| CN117248065A (zh) | 小麦总根尖数QNRT.caas-5D的分子标记及其应用 | |
| CN111996280A (zh) | 与甘蓝型油菜矮杆紧凑性状共分离的snp标记及应用 | |
| CN111485032A (zh) | 一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的snp引物组合 | |
| CN117106962A (zh) | 小麦总根长QTL QTRL.caas-4AL的分子标记及其应用 | |
| CN117286287B (zh) | 大豆耐荫基因GmYUC2的KASP标记及其应用 | |
| CN118563016A (zh) | 小麦根系干重qtl分子标记及其应用 | |
| CN118166155B (zh) | 与南瓜果肉厚度相关的snp分子标记及其扩增引物组和应用 | |
| CN114686614B (zh) | 用于检测豌豆叶片构型的kasp分子标记及其应用 | |
| CN117248071B (zh) | 与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点s15_36276597及其kasp标记、应用 | |
| CN117925886B (zh) | 与并肩荷性状相关的snp分子标记及应用 | |
| CN117887885B (zh) | 大豆油分含量相关主效单核苷酸多态性位点及其应用 | |
| CN117265167B (zh) | 与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点s08_40145372及其kasp标记、应用 | |
| CN113755637B (zh) | 小麦斑点叶基因Lm5共分离的KASP分子标记及其应用 | |
| CN117363785B (zh) | 一种筛选或辅助筛选不同粒长小麦的方法及其专用的引物组 | |
| CN117535442B (zh) | 一种用于鉴定小麦沉淀值的kasp标记及应用 | |
| CN112593006B (zh) | 一种小麦延绿性状主效qtl位点及紧密连锁的kasp引物和应用 | |
| CN116790794A (zh) | 抗黑胚病QTL QBp.caas-2AL与QBp.caas-5BL的KASP标记 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |