CN110512024A

CN110512024A - 桃果实低酸或酸性状相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110512024A
Application number: CN201910836010.1A
Authority: CN
Inventors: 徐摇光; 谢华; 于洋; 官健涛; 任飞
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2039-09-04
Also published as: CN110512024B

Abstract

本发明提供一种通过SNP分子标记检测桃果实酸性状的方法，所述标记位点来自桃长链脂肪醇脱氢酶(PpFAO4A,Prupe.5G013900)基因，其编码核苷酸序列(Coding Sequence,CDS)的第1827位的碱基为A或者G。本发明的方法可用于桃果实低酸风味的早期预测和品种资源的鉴定，还可用于栽培桃遗传背景分析及筛选，以及桃优异单株的选育，具有广阔的应用前景。

Description

桃果实低酸或酸性状相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学，生物信息学和植物分子育种领域，具体涉及与桃果实低酸或酸风味相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

桃(Prunuspercica)，蔷薇科李属，广泛生长于温带和亚热带地区，是世界五大果木类作物之一，具有很高的经济价值。我国是世界最大的桃生产国，但仍然存在着果实品质差、经济效益不高等问题。品质是商品果类的核心，风味是果实重要的内在品质，而有机酸是影响果实风味的主要因素。一般来说，低酸风味的桃口感更佳，与消费者接受度呈正相关，因此培育低酸风味的新品种是现代桃育种的主要目标之一，而开发与低酸风味相关的分子标记就显得尤为重要且迫切。研究表明，桃果实低酸性状主要由位于5号染色体前端的D位点控制(Dirlewanger,E.,et al.,Genetic linkage map of peach[Prunus persica(L.)Batsch]using morphological and molecular markers.Theoretical and AppliedGenetics,1998.97(5-6):p.888-895.)。

近20年来，科学家们利用各类分子标记构建遗传图谱，并开发了一些与低酸性状连锁的分子标记，如：SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记CPPCT040(Eduardo,I.,etal.,Development of diagnostic markers for selection of the subacid trait inpeach.Tree Genetics&Genomes,2014.6(10):p.1695-1709.)，检测效率约为97.5％。随着第三代分子标记SNP(Simple Nucleotide Polymorphisms)技术的迅猛发展，近年来也发表了很多与低酸性状相关的SNP分子标记，分别位于5号染色体上的541,075bp(Wang,Q.,etal.,DNA marker-assisted evaluation of fruit acidity in diverse peach(Prunuspersica)germplasm.Euphytica,2016.210(3):p.413-426.)、764,830bp(Cao,K.,et al.,Genome-wide association study of 12 agronomic traits in peach.NatureCommunications,2016.7:p.13246.)、821,372bp(蒋俊硕士学位论文，桃高密度SNP图谱构建与果实质地和酸度全基因组关联分析，2016)、996,915bp和10,341,037bp(Cao,K.,etal.,Genome-wide association study of 12agronomic traits in peach.NatureCommunications,2016.7:p.13246.)等。与SSR标记相比，这些SNP标记具有数据统计简单、准确、检测方法灵活多样，易实现自动化等优势。随着生物技术手段的迅猛发展，针对不同样本量、不同标记位点数都已开发出相应的检测方案，其中，KASP(Kompetitive AlleleSpecific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)是一种可以对基因组DNA的SNP和InDel的双等位基因进行精准分型的技术，尤为适合少量位点、大群体样本的分子检测。

低酸风味是个复杂的性状，受多种因素影响，因此需要开发更多的分子标记对果实风味进行综合评判可提升对该性状预测的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提升对桃果实低酸性的性状预测和判断的准确性，因而提供一个与桃果实低酸风味相关的SNP分子标记及其在分子育种中的应用。

为实现该目的，本发明提供了一种与桃果实低酸或酸风味相关的SNP分子标记，所述分子标记来自PpFAO4A基因，其编码区如SEQ ID No.1所示核苷酸序列(即CDS)，该基因第1827bp处为突变位点，该位点碱基为G或A(即序列表中的第1827位的碱基Y为G或者A)。当检测到该基因第1827位的碱基表明为纯合GG基因型或杂合GA基因型时，判定果实为低酸性状；当检测到所述位点为纯合AA基因型时，果实为酸性状。

本发明还提供了一种利用上述分子标记以通过SNP分子标记检测桃果实低酸或酸性状的方法。采用PCR扩增和测序列来检测待测桃基因组中PpFAO4A基因编码区第1827位碱基为A或G。需要说明一下，这是基于反义链的检测，也就是说基因型该位点是A，反义链检测的结果就是互补序列T；基因型该位点是G，反义链检测的结果就是互补序列C。

在另一个实施方式中，采用KASP技术来检测待测桃基因组中PpFAO4A基因编码区第1827位碱基为A或G。优选的根据AX-158882016标记的位点信息及其前后50bp序列(SEQID NO：2，其中Y为C或T)来设计KASP引物组合，具体包括上游两条正向引物，分别连接荧光标记Fam的第P1引物和Hex的第P2引物，下游一条反向引物为第P3引物：

P1:AGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATC(SEQ ID NO：3)；

P2:CAGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATT(SEQ ID NO：4)；

P3:TGAATGCACCACCATACTCAATCAGTTAT(SEQ ID NO：5)。

优选地，所述引物用无菌水溶解并稀释至10μM，按照P1：P2：P3＝12：12：30比例混合备用。

进行检测时所用的PCR反应体系如下：

PCR反应体系以3μL计为：DNA样品1μL、2×KASP Master mix 1μL、KASP引物混合物1μL；

所述用PCR反应参数为：94℃15min，然后94℃20sec、61-55℃60sec循环10次，每个循环下降0.6℃，再于94℃20sec、55℃60sec循环27次。

根据所述荧光信号判断各个位点的基因型：若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组5号染色体第1503242位点的基因型为GG；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组5号染色体第1503242位点的基因型为AA；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的5号染色体第1503242位点基因型为GA。

优选地，进一步还包括检测所述桃品种成熟果实的pH。

本发明进一步提供一种将果实为酸的桃品种改良低酸性状的方法，其特征在于，通过杂交的方式或定点突变的方法，其将其基因组中如SEQ ID No.1所示的基因中正义链的第1827位碱基为引入G，使得被培育植株成为纯合GG基因型或杂合GA基因型。

本发明还提供采用KASP技术的检测桃果实低酸或酸性状的方法的试剂盒，其包括KASP引物组合，包括上游两条正向引物，分别连接荧光标记Fam的第P1引物和Hex的第P2引物，下游一条反向引物为第P3引物：

P1:AGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATC(SEQ ID NO：3)；

P2:CAGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATT(SEQ ID NO：4)；

P3:TGAATGCACCACCATACTCAATCAGTTAT(SEQ ID NO：5)。所述试剂盒进一步还包括KASP Master mix。

其中，对于桃果实是酸性状还是低酸性状，可按下述标准判断：将待测桃品种取10个成熟果实进行果实风味评价：分别在每个果实的向阳面和背阳面对称位置取一小块果实样品，10个果实样品进行混和，匀浆，用脱脂棉过滤，收集滤液，用pH计(Sartorius，PB-10)测量，记录pH值。将pH≤4.0的样品判定为“酸”，将pH>4.0的样品判定为“低酸”。

本发明具有以下优点和效果：本发明人对316份不同桃品种进行研究，结合合理的判断标准，最终筛选得到本发明桃果实低酸风味相关的SNP分子标记，即本发明提供的与桃果实低酸风味性状相关的SNP分子标记开发过程以大群体样本为基础，检测效果准确率很高；本发明提供的SNP检测引物，以基因组DNA为模板，不受桃组织样本类型及果实发育时期的限制，具有较高的应用价值。

附图说明

图1KASP技术检测SNP基因分型图(部分结果)。

注：检测的原图为彩色，若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组5号染色体第1503242位点的基因型为GG；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组5号染色体第1503242位点的基因型为AA；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的5号染色体第1503242位点基因型为GA；为了黑白图的情况易于辩认，对其进行了标记。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明与桃果实低酸风味相关的SNP分子标记的筛选过程及其结果，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：桃果实低酸风味性状的评价：

316份不同品种桃果实样品均来自国家果树种质桃资源圃(北京)。测试样品为成熟果实，采摘标准如下：果实形态上不再膨大，底色褪去，表面充分着色，果肉丰满，肉质开始变软，按压有弹性，有芳香，已经基本现出品种特有风味。

每个品种取10个成熟果实进行果实风味评价：分别在每个果实的向阳面和背阳面对称位置取一小块果实样品，10个果实样品进行混和，匀浆，用脱脂棉过滤，收集滤液，用pH计(Sartorius，PB-10)测量，记录pH值。将pH≤4.0的样品判定为“酸”，将pH>4.0的样品判定为“低酸”；试验分别在2016年和2017年进行两年判定，二者不一致的判定为“NA”。

实施例2.AX-158882016的分子标记的开发

1、SNP分型检测

通过对96份栽培桃(包括59份中国地方品种以及37份分别来自欧洲、美州、中国、日本的栽培桃品种)基因组重测序数据与参考基因组(ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v1.0)进行比对，在全基因组范围内广泛挖掘单核苷酸多态性位点(SNP)1,828,513个，经过missing rate≤0.4,sequencingdepth≥2.0,genotype quality≥10,and allele quality≥50等参数过滤，筛选得到SNP1,126,403个；保留至少出现在两个品种中的位点，共有926,790个，其中30,837个标记在设计SNP检测探针上存在序列重复，最终剩余895,953个SNPs用于评估。通过AppliedBiosystems^TMAxiom^TM myDesign pipeline软件对每条探针正反链都进行p-convert计算，根据分值将其分为“recommended”,“neutral”,“not recommended”,and“not possible”四个类别。对于探针设计时涉及到正负链问题，采取方案如下：“recommended on thereverse strand only”、“neutral in reverse strand only(neutral best result)”两个类别的SNP选择在负链设计探针，其它类别的SNP均选择在正链设计探针。优先选择571,705个“recommended”类别的SNP以及48,554个“neutral”类别的位点，制备成桃600K高密度SNP芯片。

选取192份具有地区代表性的种桃质资源，提取基因组DNA，对芯片上每个SNP位点进行评估，每个SNP位点经过Power Tools(v.1.15.0)和R packageSNPolisher(v.1.5.2)软件评估后按检测效果被划分为六大种类：“PolyHighResolution”(PHR),“MonoHighResolution”(MHR),“NoMinorHom”(NMH),“Off-Target Variant”(OTV),“CallRateBelow-Threshold”(CRBT)和“Other”。首先选择分辨率和多态性最好的两个类别——“PHR”和“NMH”的SNP，去除样品检测通过率(Call rate)<97.5％的位点，共筛选出166,416个SNP，备用于芯片制备。整合了市场上现有的桃IPSC peach 9K SNP上的全部8,996个位点，去除已经存在于备选池中的1,487个SNP，最终获得173,925个位点，制备成桃170K高密度SNP基因分型芯片。

为获取实施例1中316份样品的基因型数据，采集取幼嫩植物叶片，利用植物基因组提取试剂盒(Tiangen)提取桃基因组DNA。提取方法参照产品说明书。将提取的基因组总DNA在Affymetrix公司生产的Axiom芯片平台上进行桃170K高密度SNP芯片的基因型判定，芯片信号的分析采用Affymetrix的SNPolisher package及Genotyping Console^TMSoftware(GTC)软件包聚类进行基因分型，根据聚类的效果筛选多态性的位点用于后续的分析。

2、全基因组关联分析

对实施例1所得的316份桃低酸性状和实施例2所得的基因型数据，采用genome-wide efficient mixed-model association(GEMMA)统计分析软件的混合线性模型进行统计分析，统计模型为：

y＝Xα+Zβ+Wμ+e

Y为表型性状，X为固定效应的指示矩阵，α为固定效应的估计参数；Z为SNP的指示矩阵，β为SNP的效应；W为随机效应的指示矩阵，μ为估计的随机效应系数，e是随机残差。该模型中，通过在μ中加入亲缘关系矩阵来校正群体分析。

3、分析结果

分析发现芯片上的编号为AX-158882016的分子标记位于5号染色体第1503242位，与桃果实低酸性状呈显著相关(-log₁₀P＝40.0)，并产生非同义突变，使Prupe.5G013900基因编码序列第1827位碱基为G；变异等位碱基为A，导致其编码的氨基酸由丝氨酸突变为亮氨酸。该基因是桃长链脂肪醇脱氢酶基因，其编码核苷酸序列(Coding Sequence,CDS)如SEQ ID No.1所示，第1827位的碱基为G或者A。

根据该位点的序列，AX-158882016分子标记以反义RNA链序列为模板设计探针，正义链上参考等位碱基为G；变异等位碱基为A。芯片上该位点检测探针序列为：

CCTATCTTCAGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCAT[C/T]TCATAACTGATTGAGTATGGTGGTGCATTCACAGT。该位点基因型为CC型或TT型。在316份测试群体中，84.0％口味为“低酸”的果实在该位点基因型为CC或CT；而97.2％口味为“酸”的果实基因型为TT(表1)。

实施例3：基于桃基因组5号染色体第1503242位点的KASP检测体系的建立

根据AX-158882016标记的位点信息及其前后50bp序列(AGTGACTTCTCTAGTCCTATCTTCAGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATYTCATAACTGATTGAGTATGGTGGTGCATTCACAGTTCCTGACCCTTTATC)(SEQ ID NO：2，其中Y为C或T)，利用Kraken^TM software system软件设计KASP引物组合，该组合由3条引物组成，包括上游两条正向引物，分别连接Fam(P1)和Hex(P2)荧光标记，下游一条反向引物(P3)：

P1:AGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATC(SEQ ID NO:3)

P2:CAGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATT(SEQ ID NO:4)

P3:TGAATGCACCACCATACTCAATCAGTTAT(SEQ ID NO:5)

每条引物用无菌水溶解并稀释至10μM，按照P1：P2：P3＝12：12：30比例混合备用。

SNP分型检测方法：

①配置PCR反应体系并进行扩增反应：

配套试剂均由英国LGC公司生产。以基因组DNA为模板，加入1μL KASP Primer mix(引物混合物)和通用的KASP Master mix进行PCR扩增。操作中所使用的检测平台为：

KASP反应在LGC SNPline基因分型平台进行，包括：①K-pette半自动DNA复制工作站；②Meridian微量分液仪；③Kube热封膜仪；④Fusion3激光封膜仪；⑤Hydrocycler水浴PCR热循环仪；⑥Pherastar SNP分型检测仪。

采用荧光检测仪PHERAstar检测PCR扩增产物的荧光信号，fam激发波长为485nm，发射波长为520nm，hex激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光rox激发波长为575nm，发射波长为610nm。

②基因型判读：

利用Kraken^TM软件根据所述荧光信号判断各个位点的基因型：若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组5号染色体第1503242位点的基因型为GG；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组5号染色体第1503242位点的基因型为AA；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken^TM软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的5号染色体第1503242位点基因型为GA；

③KASP鉴定准确性分析

随机选取23个表1中样品DNA，根据上述方法进行基因分型。结果如表2所示，所有样品与芯片检测结果均一致。

实施例4：基于桃基因组5号染色体第1502996位点的KASP检测技术在鉴定桃果实低酸风味中的的应用

采集146个栽培桃叶片样本，提取植物基因组DNA，SNP基因分型方法及成熟果实的pH测量方法如前所示。

基因分型结果及pH等检测结果如图1(部分结果)、表3所示：65个样品基因型为T/T，果实口味预测为“酸”，其中59个样品pH≤4.0，预测准确率为90.8％；3个样品基因型为“C/C”，表型预测为“低酸”，均pH>4.0，预测准确率为100％；78个样品基因型为“T/C”，果实口味预测为“低酸”，其中74个样品pH>4.0，结果预测准确率94.9％；总体表型预测准确率为93.2％(表3)。

由于桃品种丰富，类型多样，低酸风味的形成机制也不尽相同，这可能也是单一的分子标记很难对所有栽培桃进行百分之百准确预测的原因之一。但本发明预测准确率达93％以上，应该来说达到了非常高的水平，具有较强的应用价值。

表1：316份栽培桃品种AX-159367659基因型与表型

表2：KASP引物组合验证SNP分子标记AX-159367659准确性检测

表3：表型预测准确性鉴定

注：√表示预测准确，×表示预测错误的样品。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>桃果实低酸或酸性状相关的SNP分子标记及其应用

<160> 5

<170> PatentIn Version 2.1

<210> 1

<211> 2259

<212> DNA

<213> 桃

<220>

<223> y =c或t

<221> CDS

<400> 1

atggagtcac tcactgccct ctgtgacacc ttcttgcctt ccatcgacgt ctccgacacc 60

accacaaatg catcgctggt cgccttttac cggacttcgg cttccatggc aggaacacca 120

caacgagtag gaggactgat aagtgagaga atgaagcacc caaagctatg gttgatgcga 180

ttggcgttgt ggtttttgtc cacatggata gggagcttca tattgtgtgg aagagccagc 240

ctttcaagcc aatttcccta ctttcagagc tttcctcaga tgtctcagca gaaacgggaa 300

gaaatattat tgtcatggtc tcttagttac ttttatctcc ttaggatgtt gttcaagagc 360

atgaagcttc tcactctcct tgtcttcttc actcaggtga atgagaagaa tgagaaccta 420

tcctggaaag caattgacta caccgggcct gatccagagt tcatcaccaa aaccaagaaa 480

ttcaaagcat caacaacaat tggaagccaa agacccaaca atgaagaaca aaatgcatgc 540

cctcacaaag aagagctgtt tggaccactt aacagaggca ttatcaatct ggataaacca 600

aaggatttag ttgttgatgc tctaagtaca tttggaattc cagcatctgt tcttcactct 660

gaaaaaaccg taaactgctc gtcgaatcct tctttaacca tccgatgcga tgcagtagtg 720

atcggttcgg ggtcaggagg tggtgttgtt gcaggtgttt tagcaacggc gggttacaaa 780

gtggttgtta tagagaaagg aaactatcat gccaggaaga atcttacact ccttgaagga 840

cccgcaatgg accaaatgta cctatcaggt ggcttaattg caactgatga catgggagtt 900

tttgttcttg ctggctctac tgttggggga ggctccgcca tcaactggtc cgcttcgatt 960

cgaaccccac agcacgtaat caaggaatgg tgcaatgacc atgagctaga gctgtttgac 1020

agtaaattat accaagaagc tctggatgtt gtctgtgaaa aaatgggagt tcaatctcaa 1080

atacaagaag aagggtttaa taatgcaatt ttaagaaaag ggtgccaaga attggggtat 1140

cctgtgaata atattcctcg aaactcgcca ccgaatcatt attgtggttg gtgttgtttt 1200

ggttgcaagg atggaaggaa gggaggtacc acggagacgt ggcttgtgga tttggtgaat 1260

tctggtaatg gtgctatttt gactggatgt gaggctataa aagtgctgca caagagaaag 1320

aaaggaagaa gagatcgaaa cacagctacc ggggtggcct tcgaatttga gcatggaggg 1380

ggtaaagaaa taggttttgt ggagtctaag gtaactattg ttgcttgcgg agctctttgt 1440

actccgaaac tgttgaagcg aagcggattg aagaacgtaa atattgggga aaacttgcat 1500

ttgcatccgg tggcaatggc atggggctac tttccagact cacaagtgtt tgatggaagg 1560

cctgagagag agaagaagag ctacgaagga gggataatga cagcaatgtc tactgtagtg 1620

gcagagttca acaagtctgg atatggagcg gtgatacaaa caccggcgtt gcacccaggt 1680

atgttctcgg ttgtgatgcc ttgggtttca ggcaaagaca taaaacatag aatgagcagg 1740

ttctctagga ctgcccatgt atttgcattg gcaagagata aagggtcagg aactgtgaat 1800

gcaccaccat actcaatcag ttatgayatg gaagctcttg atgaaaacaa tctgaagata 1860

ggactagaga agtcactgag aatattggcc gcggccggag ctgaagacat tggaacccat 1920

cactttaaag ggaagggttt acatgtgaag aagtcgaatt tggatgagtt tgagaggttt 1980

gtgaaagagg agagttcaag gccactaaga gagctttctt ccgcaatatg ttcagcacat 2040

cagatgggga gctgcaggat gggtgtcgat tcgaagcagt ctgtgttgaa ccagatggga 2100

gagacatggg aggtggaggg actttttgta gcagacacaa gtgtcttccc aacggcttta 2160

ggggtaaatc caatggtcac tgttcaggct attgcttact gcacttccca atccattctc 2220

caagtactta ggagaaagaa ggtagaatat aaaaactga 2259

<210> 2

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> y =c或t

<400> 2

agtgacttct ctagtcctat cttcagattg ttttcatcaa gagcttccat ytcataactg 60

attgagtatg gtggtgcatt cacagttcct gaccctttat c 101

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 3

agattgtttt catcaagagc ttccatc 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 4

cagattgttt tcatcaagag cttccatt 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 5

tgaatgcacc accatactca atcagttat 29

Claims

1.一种桃果实低酸或酸性状SNP分子标记，其特征在于：所述分子SNP标记来自PpFAO4A基因，其编码区的第1827位的碱基为A或者G。

2.一种通过SNP分子标记检测桃果实低酸或酸性状的方法，其特征在于：所述分子SNP标记来自PpFAO4A基因，其如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第1827位的碱基为A或者G，当检测到该基因第1827位的碱基表明为纯合GG基因型或杂合GA基因型时，判定果实为低酸性状；当检测到所述位点为纯合AA基因型时，果实为酸性状。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述方法用于桃果实低酸风味的早期预测，或者品种资源的鉴定，或用于栽培桃遗传背景分析或筛选，或者用于桃优异单株的选育。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用PCR扩增和测序列来检测待测桃基因组中PpFAO4A基因编码区第1827位碱基为A或G。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用KASP检测待测桃基因组中PpFAO4A基因编码区第1827位碱基为A或G。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，KASP引物组合，包括上游两条正向引物：连接荧光标记Fam的P1引物和连接荧光标记Hex的P2引物，以及下游一条反向引物为P3引物，其中各引物序列如下：

P1:AGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATC；

P2:CAGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATT；

P3:TGAATGCACCACCATACTCAATCAGTTAT。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物用无菌水溶解并稀释至10μM，按照P1：P2：P3＝12：12：30比例混合备用。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所用的PCR反应体系如下：

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步还包括检测所述桃品种成熟果实的pH。

10.一种用于KASP检测桃果实低酸或酸性状的试剂盒，其特征在于，其KASP引物组合，包括上游两条正向引物：连接荧光标记Fam的P1引物和连接荧光标记Hex的P2引物，以及下游一条反向引物为P3引物，其中各引物序列如下：

P1:AGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATC；

P2:CAGATTGTTTTCATCAAGAGCTTCCATT；

P3:TGAATGCACCACCATACTCAATCAGTTAT；

任选地，进一步包括KASP Master mix。