JP7176782B2 - カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法、カンキツ植物を製造する方法、及び判定キット - Google Patents

Description

本発明は、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法、カンキツ植物を製造する方法、分子マーカー、及びカンキツ植物に関する。

カンキツ植物は、β－カロテン、β－クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチンをはじめ多種類のカロテノイドを含んでいる。カロテノイドは、プロビタミンとしての作用のほか、抗酸化作用などの機能性を保持する。特にウンシュウミカンに豊富に含まれるβ－クリプトキサンチンは、骨粗鬆症や糖尿病などの生活習慣病の予防に役立つことが明らかになり、β－クリプトキサンチンの機能性を訴求した商品開発が国内外で進展しつつある。β－クリプトキサンチン含有素材を安定的に供給するための生産体制の確立や消費拡大に向けて、β－クリプトキサンチンを高含有化した商品性の高い新品種の育成が急務である。

カロテノイドの含有量の多いカンキツ植物を育種する方法として、交雑の最適な親品種の組み合わせを推定する遺伝統計学的手法が挙げられる。この方法においては、様々な親品種を組み合わせて交雑することにより得られた実生個体を用いて、果肉中に含まれるカロテノイド含有量を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果に基づいて、目的の成分の遺伝率等を算出する。これにより、最適な親品種の組み合わせを推定して、カロテノイドの含有量の多い個体を育成する。

また、ＤＮＡマーカーを用いて交雑により得られた個体を判別することで、カロテノイドの含有量の多いカンキツ植物を選抜する技術がある。非特許文献１には、カンキツ植物のカロテノイド代謝に関与する遺伝子の発現量に関与するＱＴＬを分析したことが記載されている。

Sugiyama et al., 2013. Expression Quantitative Trait Loci Analysis of Carotenoid Metabolism-related Genes in Citrus. J. Japan. Soc. Hort. Sci. Preview. doi: 10.2503/jjshs1.CH-054

しかしながら、果肉中のカロテノイドの含有量は複数の遺伝子が関与する量的形質であり、上位性などカロテノイド代謝遺伝子間の相互反応により本来の遺伝効果が正しく評価できないなどの事例がみられる。このため、遺伝統計学的手法により表現型のみで評価した従来技術では、最適な親品種の組み合わせや遺伝率等の予測精度が質的形質と比較して低い。また、カンキツ植物は、一般に交配から結実までに５～７年程度の期間を要するため、遺伝統計モデルの算出に長い年限を要する。

また、非特許文献１には、フィトエン合成酵素（ＰＳＹ）及びゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）の発現量に作用するＱＴＬが記載されているが、果肉中のカロテノイド含有量の多い個体を判別するためのアレルについては記載されていない。

本発明の一態様は、上記問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、果肉中のカロテノイドの含有量の多いカンキツ植物を容易に判別することが可能な技術を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法は、
カンキツ植物において、下記（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ）Ciclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）の翻訳開始点から２４６９位の塩基；
（ｂ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から４４３６位の塩基；及び
（ｃ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から５０１９位の塩基
を、カンキツ植物において果肉中のカロテノイド含有量に関する分子マーカーとして判定する工程を含む。
本発明の一態様に係る果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を製造する製造方法は、
果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物と、他のカンキツ植物とを交雑する交雑工程と、
前記交雑工程により得られたカンキツ植物又はその後代系統のカンキツ植物から、請求項１から５のいずれか１項に記載された方法によって、果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を判別する判別工程と
を含む。
本発明の一態様に係るカンキツ植物における、果肉中のカロテノイド含有量の調節に関する分子マーカーは、
下記（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ）Ciclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）の翻訳開始点から２４６９位の塩基；
（ｂ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から４４３６位の塩基；及び
（ｃ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から５０１９位の塩基
である。
本発明の一態様に係る果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物は、上述した本発明の一態様に係る製造方法によって得られる。

本発明の一態様によれば、果肉中のカロテノイドの含有量の多いカンキツ植物を容易に判別することが可能な技術を提供することができる。

５の標的遺伝子領域における各アレルの予想される総カロテノイドに対する効果を示す図である。 ５の標的遺伝子領域における各アレルの予想されるβ－クリプトキサンチンに対する効果を示す図である。 ５の標的遺伝子領域における各アレルの予想されるビオラキサンチンに対する効果を示す図である。 正の効果を有するアレル及び負の効果を有するアレルによる総カロテノイド含有量の比較を示す図である。 図４中のＰＳＹアレル型条件における、正の効果を有するＺＥＰアレルによる総カロテノイド含有量の比較を示す図である。 正の効果を有するアレル及び負の効果を有するアレルにおけるβ－クリプトキサンチン含有量の比較を示す図である。 図６中のＰＳＹアレル型条件における、正の効果を有するＺＥＰアレルにおけるβ－クリプトキサンチン含有量の比較を示す図である。 正の効果を有するアレル及び負の効果を有するアレルにおけるビオラキサンチン含有量の比較を示す図である。 図８中のＰＳＹアレル型条件における、正の効果を有するＺＥＰアレルにおけるビオラキサンチン含有量の比較を示す図である。 ＰＳＹ－ＳＮＰ０６を用いたＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ＳＮＰ遺伝子型解析の結果を示す図である。 ＺＥＰ－ＳＮＰ１７を用いたＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ＳＮＰ遺伝子型解析の結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、核酸は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。

本発明の一態様は、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する技術に関する。本発明の一態様は、カンキツ植物において、果肉中のカロテノイド含有量の多い個体を判別するために使用することができる。本発明の一態様は、カンキツ植物のゲノムに存在する、果肉中のカロテノイド含有量の決定に関与する遺伝子の遺伝子型を判定することで、果肉中のカロテノイド含有量に基づいてカンキツ植物個体を判別する。なお、本発明の一態様において、果肉中のカロテノイド含有量の概念には、あるカンキツ植物個体の果肉中に含まれるカロテノイドの量が、他のカンキツ植物個体と比較して相対的に多い又は少ないことを表す含有の程度が含まれる。

カンキツ植物は、ミカン科ミカン亜科のミカン属（Citrus）、キンカン属（Fortunella）、およびカラタチ属（Poncirus）等に属する植物である。カンキツ植物は、例えば、「不知火」、「璃の香」、「みはや」、「あすみ」、「あすき」、「麗紅」、「津之輝」、「西南のひかり」、「津之望」、「はるひ」、「清見」、「せとか」、「はるみ」、「はれひめ」、「甘平」、「天草」、「スイートスプリング」、「たまみ」、「西之香」等の品種に属する植物であり得る。
また、カンキツ植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物であり得る。育種素材の候補植物としては、例えば、交配に用いる親植物、及び、遺伝子組換え技術を利用した分子育種に用いられる植物が含まれる。また、育種のプロセスで得られた植物としては、例えば、カンキツ植物を属内交雑した植物、カンキツ植物の上述したような品種に属する植物を種内交雑した植物、及びこれらの後代系統である。また、カンキツ植物は、ある品種に属するカンキツ植物と他の品種に属するカンキツ植物との交雑植物のように種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。さらに、カンキツ植物は、果肉中のカロテノイド高含有量であることが分かっている品種同士を種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。また、カンキツ植物は、果肉中のカロテノイド高含有であることが分かっている個体同士を種内交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。

本明細書において、植物とは、植物体の一部又は全部であってもよい。植物体の一部としては、例えば、繁殖素材（例えば、葉、枝、種子等）等が挙げられる。

カンキツ植物の果肉中に含まれるカロテノイドには、β－カロテン、β－クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン等が含まれる。カロテノイドは、プロビタミンとしての作用のほか、抗酸化作用などの機能性を保持する。特にウンシュウミカンに豊富に含まれるβ－クリプトキサンチンは、骨粗鬆症や糖尿病などの生活習慣病の予防に役立つことが明らかとなっている。このように、β－クリプトキサンチンを含むカロテノイドを果肉中に多く含むカンキツ植物は商品価値が高い。したがって、果肉中のカロテノイド含有量の多いカンキツ植物を容易に育種できれば、非常に有益である。

〔カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量の調節に関する分子マーカー〕
本発明の一態様に係る分子マーカーは、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量の調節に関する分子マーカーである。分子マーカーは、下記（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドである：
（ａ）Ciclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）の翻訳開始点から２４６９位の塩基；
（ｂ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から４４３６位の塩基；及び
（ｃ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から５０１９位の塩基。

Ciclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）はカロテノイド代謝遺伝子である。ＰＳＹ遺伝子は、カンキツ植物におけるカロテノイドの合成に関わる酵素であるフィトエン合成酵素をコードする遺伝子である。ＰＳＹ遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドからなる。なお、ＰＳＹ遺伝子の翻訳開始点は、配列番号１に示す塩基配列の５２７位の塩基である。

Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）は、カロテノイド代謝遺伝子である。ＺＥＰ遺伝子は、カンキツ植物におけるカロテノイドの合成に関わる酵素であるゼアキサンチンエポキシダーゼをコードする遺伝子である。ＺＥＰ遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドからなる。なお、ＺＥＰ遺伝子の翻訳開始点は、配列番号３に示す塩基配列の２６８位の塩基である。

本発明の一態様に係る分子マーカーは、例として、ＳＮＰマーカー、ＡＦＬＰ（分子増幅断片長多型）マーカー、ＲＦＬＰマーカー、マイクロサテライトマーカー、ＳＣＡＲマーカー、ＣＡＰＳマーカーである。

上記（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基自体、又は当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドの組み合わせは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカー又はこれと同一視できるＳＮＰマーカーである。ＳＮＰマーカーは、（ｉ）ＳＮＰに相当する塩基自体の組み合わせ、（ｉｉ）ＳＮＰを含む連続したポリヌクレオチドの組み合わせ、又は、（ｉｉｉ）３つのＳＮＰを含む連続したポリヌクレオチドであり得る。

（ｉ：ＳＮＰマーカー）
本発明の一態様に係る分子マーカーを用いれば、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定することができる。

ここで、ＳＮＰは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に一塩基の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。ＳＮＰマーカーにおいて、ＳＮＰは、クレメンティンのゲノム配列（Clementine genome sequence v1.0）を基準とした一塩基多型である。基準植物であるクレメンティンのゲノム配列は、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅのゲノムデータベース（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）に公表されている。

「（ａ）～（ｃ）の塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーである。「（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーと同一視できるＳＮＰマーカーである。「（ａ）～（ｃ）の塩基」は、ＰＳＹ遺伝子又はＺＥＰ遺伝子上の変異である。ＰＳＹ遺伝子及びＺＥＰ遺伝子は、基準となるカンキツ植物（クレメンティン（Clementine genome sequence v1.0）由来の塩基配列からなる。他のカンキツ植物においては、基準となる塩基配列に対してＳＮＰ以外の部分でも塩基配列が異なる部分が含まれ得る。このＳＮＰマーカーが位置するゲノム上の領域は、多数のカンキツ植物間で保存されているため、ホモロジー検索等の手法によって、このＳＮＰマーカーを特定することができる。

すなわち、他のカンキツ植物において、ＰＳＹ遺伝子又はＺＥＰ遺伝子に対応する遺伝子（すなわち植物間で高度に保存されている遺伝子）が存在する場合、「（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基」とは、ホモロジー検索等の手法によって、（ａ）～（ｃ）の塩基に相当するとされたＰＳＹ遺伝子又はＺＥＰ遺伝子に対応する遺伝子上の塩基を指す。例えば、後述する（ａ２）～（ｃ２）に記載のポリヌクレオチドや、（ａ３）～（ｃ３）に記載のポリヌクレオチドが、ＰＳＹ遺伝子又はＺＥＰ遺伝子に対応する遺伝子の一例である。

本発明の一態様に係る分子マーカーは、上記の（ａ）～（ｃ）ＳＮＰを組み合わせたＳＮＰマーカーである。このＳＮＰマーカーは、本発明者らが新たに同定したＳＮＰマーカーであり、当業者は、このＳＮＰマーカーのそれぞれのＳＮＰを表す塩基配列に基づき、当該ＳＮＰマーカーのゲノム上の位置を特定することができる。後述する実施例に示すように、ＰＳＹ遺伝子のアレルであるＰＳＹ－ａ、及び、ＺＥＰ遺伝子のアレルであるＺＥＰ－ｅが、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド高含有に強い効果を示す。ＳＮＰ（ａ）～（ｃ）の一形態は、実施例に示すＰＳＹ－ＳＮＰ６、ＺＥＰ－ＳＮＰ１７、及びＺＥＰ－ＳＮＰ２１であり、上記２つのアレルを同定するためのＳＮＰの最小セットである。

（ａ）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ａ）ともいう）は、ＰＳＹ遺伝子の翻訳開始点から２４６９位の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。また、（ｂ）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ｂ）ともいう）は、ＺＥＰ遺伝子の翻訳開始点から４４３６位の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。さらに、（ｃ）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ｃ）ともいう）は、ＺＥＰ遺伝子の翻訳開始点から５０１９位の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。

本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）がＡであり、ＳＮＰ（ｂ）がＴであり、かつ、ＳＮＰ（ｃ）がＣであるアレルについてホモ接合性であるとき、当該カンキツ植物はカロテノイド高含有であると判定することができる。すなわち、分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）～（ｃ）をハプロタイプブロックとして解析することにより、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定することができる。

ここで、カンキツ植物がカロテノイド高含有であるとは、カンキツ植物の果肉に含まれるカロテノイドの量が、他のカンキツ植物個体と比較して相対的に多いことが意図される。

（ｉｉ：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド）
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ａ）ともいう）、ＳＮＰ（ｂ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｂ）ともいう）、及び、ＳＮＰ（ｃ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｃ）ともいう）の組み合わせであってもよい。

ポリヌクレオチド（ａ）は、（ａ１）ＰＳＹ遺伝子の塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ａ２）（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ａ３）（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。

ポリヌクレオチド（ｂ）は、（ｂ１）ＺＥＰ遺伝子の塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ２）（ｂ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ｂ３）（ｂ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。

ポリヌクレオチド（ｃ）は、（ｃ１）ＺＥＰ遺伝子の塩基配列において、ＳＮＰ（ｃ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｃ２）（ｃ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｃ）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ｃ３）（ｃ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｃ）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。

（ａ１）～（ｃ１）のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＳＹ遺伝子の塩基配列に基づき、カロテノイド高含有のカンキツ植物（例えば、カロテノイド高含有の津之輝）から得ることができる。

（ａ２）～（ｃ２）のポリヌクレオチドは、（ａ１）～（ｃ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）～（ｃ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に、数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入または付加）を含むものであり得る。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、上述したデータベースに登録されているクレメンティンのゲノム配列を参照することにより、又は、カロテノイド高含有のカンキツ植物のゲノム上におけるＳＮＰの近傍領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。

（ａ３）～（ｃ３）のポリヌクレオチドは、（ａ１）～（ｃ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）～（ｃ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に対して、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するものであり得る。このような塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、２つの塩基配列をアライメントとすることによって決定することができる。

ポリヌクレオチド（ａ）におけるＳＮＰ（ａ）に相当する塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であり、ポリヌクレオチド（ｂ）におけるＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基がＴであるアレルについてホモ接合性であり、かつ、ポリヌクレオチド（ｃ）におけるＳＮＰ（ｃ）に相当する塩基がＣであるアレルについてホモ接合性であるときに、当該カンキツ植物はカロテノイド高含有であると判定することができる。すなわち、分子マーカーは、ポリヌクレオチド（ａ）～（ｃ）をハプロタイプブロックとして解析することにより、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定することができる。

（ｉｉｉ：３つのＳＮＰを含むポリヌクレオチド）
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｄ）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ｄ）は、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）の部位間の領域を、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）の部位と共に含んでいる。ポリヌクレオチド（ｄ）は、例えば、カロテノイド高含有カンキツ植物における対応するＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）の部位間の領域を参照することで得られる。ポリヌクレオチド（ｄ）の塩基配列は、カロテノイド高含有カンキツ植物の塩基配列と少なくとも部分的に一致する。

また、本発明の一態様に係る分子マーカーは、ポリヌクレオチド（ａ）と、ＳＮＰ（ｂ）とＳＮＰ（ｃ）との間の領域の連続したポリヌクレオチドとの組み合わせであってもよい。

本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、カンキツ植物において果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法としては特に限定されず、例えば、ＳＮＰを検出する公知のＳＮＰ分析方法を用いることができる。このような公知のＳＮＰ分析方法には、カンキツ植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中のＳＮＰを検出することによりＳＮＰ分析する方法が含まれる。また、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、カンキツ植物において果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法の一態様は、後述する本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法である。

〔カロテノイド高含有カンキツ植物〕
本発明の一態様に係るカロテノイド高含有カンキツ植物は、後述する製造方法によって得られる植物である。カロテノイド高含有カンキツ植物は、上述した分子マーカーで特定される上述したＳＮＰを有し、果肉中のカロテノイドの含有量の多い植物である。

本発明の一態様に係るカロテノイド高含有カンキツ植物は、後述する製造方法に示すように、カロテノイド高含有カンキツ植物と、他のカンキツ植物とを交雑して得られた植物及びその後代系統から、上述した分子マーカーを用いてカロテノイド高含有カンキツ植物を判別することで得られる。なお、上述したＳＮＰを有するように遺伝子工学的に改変したカロテノイド高含有カンキツ植物についても、本発明の範疇に含まれる。

〔カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法〕
本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法は、カンキツ植物において、下記（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ）Ciclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）の翻訳開始点から２４６９位の塩基；
（ｂ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から４４３６位の塩基；及び
（ｃ）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から５０１９位の塩基
を、カンキツ植物において果肉中のカロテノイド含有量に関する分子マーカーとして判定する工程を含む。

本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法は、上述した本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、カンキツ植物の被検体において、果肉中のカロテノイド含有量を判定する。本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法は、カンキツ植物の被検体のゲノム上において、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）を上述した分子マーカーにより特定することで、被験カンキツ植物が、カロテノイド高含有であるか否かを判定する。

本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法において、被検体であるカンキツ植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物である。被検体であるカンキツ植物は、例えば、カロテノイド高含有カンキツ植物とカロテノイド高含有植物との交雑植物、カロテノイド高含有カンキツ植物とカロテノイド低含有植物との交雑植物、及び、カロテノイド低含有カンキツ植物とカロテノイド低含有植物との交雑植物、並びにこれらの後代系統であり得る。また、被検体であるカンキツ植物は、果肉中のカロテノイド含有量が不明なカンキツ植物同士を交雑した交雑植物及びその後代系統であり得る。

本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法は、（ａ’）Ciclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）の翻訳開始点から２４６９位の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であり、（ｂ’）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から４４３６位の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性であり、かつ、（ｃ’）Ciclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から５０１９位の塩基がＣであるアレルについて、ホモ接合性であるときに、当該カンキツ植物はカロテノイド高含有であると判定する。

本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法において用いる分子マーカーの詳細については、上述した本発明の一態様に係る分子マーカーの説明を援用する。

本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法において、分子マーカーを用いてカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を検査する方法としては特に限定されず、公知のＳＮＰ分析方法を用いることができ、例えば、カンキツ植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中のＳＮＰを検出することによりＳＮＰ分析する方法が挙げられる。本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法は、前記分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、前記カンキツ植物のＤＮＡにおける前記領域を増幅してもよい。このようなプライマーセットは、一例として、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）を含む領域を増幅するプライマーセットである。

カンキツ植物の被検体のＤＮＡにおける前記領域の増幅は、カンキツ植物の被検体から抽出したＤＮＡを鋳型にして、ＳＮＰを含む領域を増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。そして、得られた増幅断片におけるＳＮＰの塩基（遺伝子型）を決定し、決定された塩基（遺伝子型）とカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量との関係を示すデータに基づいて、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する。

ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットは、標的のＳＮＰを含む領域のＤＮＡ断片を増幅することができるものである限り、特に限定されず、増幅断片の長さが短くなるようにプライマーセットを設計してもよい。例えば、プライマー増幅断片の長さが、好ましくは、２００塩基対（ｂｐ）以下、１５０ｂｐ以下、１２０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計する。プライマーセットは、フォワードプライマーである第１のプライマーと、リバースプライマーである第２のプライマーとが含まれる。これらのプライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、または１９ｂｐ以上であってもよく、５０塩基ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、または３０ｂｐ以下であってもよい。

ＳＮＰ（ａ）を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマーと、配列番号６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、カロテノイド高含有カンキツ植物においては配列番号７に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ａ）に相当する塩基を検出することができる。なお、配列番号７に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）に相当する塩基をＲで表している。

ＳＮＰ（ｂ）を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマーと、配列番号９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、カロテノイド高含有カンキツ植物においては配列番号１０に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基を検出することができる。なお、配列番号１０に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基をＹで表している。

ＳＮＰ（ｃ）を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号１１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第５のプライマーと、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第６のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、カロテノイド高含有カンキツ植物においては配列番号１３に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ｃ）に相当する塩基を検出することができる。なお、配列番号１３に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ｃ）に相当する塩基をＹで表している。

ＳＮＰ分析におけるＰＣＲは、単独のプライマーセットを含む反応系でＤＮＡ断片を増幅するシングルプレックスＰＣＲ、または、複数のプライマーセットを含む反応系で遺伝子増幅するマルチプレックスＰＣＲ、のいずれであってもよい。マルチプレックスＰＣＲの場合は、異なる波長を有する蛍光物質（例えば、ＮＥＤ、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＰＥＴ）により標識したプライマーセットを混合してもよい。

ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ装置の種類、増幅断片の長さ等に応じて適宜に設定され得る。サイクル条件としては、変性工程、アニーリング工程および伸長工程の３工程を１サイクルとする３ステップＰＣＲ法、および、変性工程とアニーリングおよび伸長工程との２工程を１サイクルとする２ステップＰＣＲ法を適用することができる。ＰＣＲ反応条件の一例としては、９０～１００℃で４０～６０秒（例えば、９５℃で５０秒）、９０～１００℃（例えば、９５℃）で５秒の３０～６０サイクル（例えば、４０サイクル）、アニーリング１０～２０秒（例えば、１５秒）、及び６５～８０℃で１０～３０秒（例えば、７２℃で２０秒）。アニーリング温度は、６０～７０℃（例えば、６６℃）の初期アニーリング温度から５０～６０℃（例えば、５６℃）の最終アニーリング温度まで、所定サイクル毎に段階的に低下させる条件が挙げられる。鋳型となるＤＮＡの状態に応じて、ＳＮＰを安定的に検出するために、ＰＣＲ反応条件を調整してもよい。

ＳＮＰ分析におけるＰＣＲとして、ＰＣＲによる増幅およびＳＮＰマーカーの特定を行うＴａｑＭａｎ（登録商標）－ＰＣＲ法のようなリアルタイムＰＣＲを用いてもよい。すなわち、プライマーセットを用いて増幅した増幅断片に含まれるＳＮＰを検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをさらに用いてもよい。リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより、高処理能力の判別方法を提供することができる。なお、ＰＣＲにより増幅した増幅断片においてＳＮＰを特定する方法としては、自動ＤＮＡシークエンサー等を用いて増幅断片の塩基配列を決定することにより、解析してもよい。

カンキツ植物の被検体から、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡ抽出方法を用いることができる。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて、ＤＮＡを抽出してもよい。被検体の種類および夾雑物の量等に応じて、ＤＮＡ抽出工程の前に、適宜に前処理を行ってもよい。また、被検体から抽出されたＤＮＡは、ＰＣＲ反応において鋳型として用いるために、必要に応じて洗浄または精製してもよい。さらに、被検体から抽出されたＤＮＡを２種類の制限酵素で消化した制限酵素切断断片をＰＣＲにより増幅してもよい。

また、本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法においては、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）と連鎖不平衡状態にある遺伝子多型を分析し、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｃ）を同定してもよい。上記連鎖不平衡状態は、一例として、連鎖不平衡係数が０．９以上の連鎖不平衡状態である。

本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法によれば、分子マーカーにより、被験カンキツ植物が、カロテノイド高含有であるか否かを判定することができる。したがって、判定結果に基づきカロテノイド高含有カンキツ植物及びその後代系統を選抜することができる。

本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法によれば、幼苗の段階でカロテノイド高含有のカンキツ植物を選抜することが可能であり、育種選抜のための期間を大幅に短縮することができる。また、幼苗の段階で選抜されたカロテノイド高含有の実生のみを栽植して生育することで、圃場の利用効率を向上させることができる。

〔果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を製造する製造方法〕
本発明の一態様に係る製造方法は、果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を製造する方法であって、果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物と、他のカンキツ植物とを交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたカンキツ植物又はその後代系統のカンキツ植物から、本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法によって、果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を判別する判別工程とを含む。

したがって、本発明の一態様に係る分子マーカー、カロテノイド高含有カンキツ植物、及びカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法に関する説明を、果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を製造する方法の説明に援用する。

交雑工程において、親植物として使用する果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物は、本発明の一態様に係るカロテノイド高含有カンキツ植物であり得る。また、交雑工程において用いる果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物は、本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法により選抜された果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物であってもよい。すなわち、本発明の一態様に係る製造方法は、前記交雑工程の前に、本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法により、被験カンキツ植物から果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を判別する判別工程をさらに含み得る。

判別工程は、本発明の一態様に係るカンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法により、交雑工程により得られたカンキツ植物又はその後代系統のカンキツ植物から、果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を判別する。

本発明の一態様に係る製造方法によれば、分子マーカーによりカンキツ植物において果肉中のカロテノイド高含有であるか否かを判定し、判定結果に基づき選抜したカロテノイド高含有のカンキツ植物を製造することができる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

（植物材料）
実験に使用した全ての植物は、農研機構の果樹茶業研究部門の研究場において栽培した。ゲノムＤＮＡは、これらの植物の完全に開いた青葉から抽出した。砂じょう組織を収穫期の完熟した果肉から回収し、液体窒素で即座に冷凍し、カロテノイド含有量の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に用いた。表１は、本実施例で使用した植物材料を示している。

（祖先１３品種におけるカロテノイド代謝遺伝子のＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）
表１の祖先１３品種（founder）のゲノムＤＮＡをＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔに用いた。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ試薬キット(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を用いて、ゲノムＤＮＡサンプルをランダムに断片化し、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔプライマーミックス(Agilent Technologies)を用いて増幅した。アダプターを添加したＤＮＡライブラリーをＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔカスタムライブラリーにハイブリダイズし、捕捉したＤＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１ ｂｅａｄｓ(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)を用いて精製した。

標的カロテノイド代謝遺伝子(ＰＳＹ、ＨＹｂ、ＺＥＰ、ＮＣＥＤ)をインデックスプライマーで濃縮した。各標的遺伝子のインデックスプライマーを、クレメンティンのゲノム配列（Clementine genome sequence v1.0）を参照して設計した。濃縮した断片をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を用いて精製した。精製物を、ＨｉＳｅｑ２５００システム(Illumina, San Diego, CA, USA)における次世代シーケンシング分析の対象とした。前処理したリードをクレメンティンのゲノム配列上にマッピングした。

（ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ及びＦｌｕｉｄｉｇｍアッセイによるＳＮＰ遺伝子型解析）
ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ分析(Illumina)及びＦｌｕｉｄｉｇｍアッセイ(Fluidigm, South San Francisco, CA, USA)を用いて、ＳＮＰ遺伝子型解析を行った。ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイのために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ADT)を用いて、取り扱い説明書にしたがってビーズアレイを設計した。ｉＳｃａｎシステム(Illumina)におけるＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイシステムを用いて、ＳＮＰ遺伝子型解析を行った。Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いてＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ(Illumina)の機能により、スキャンイメージデータを遺伝子型スコアに変換した。

Ｆｌｕｉｄｉｇｍアッセイのために、ＴａｑＭａｎ ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ(ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ)プローブ及びプライマーセットを、Primer Express ver. 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて設計した。ＦＡＭ（5-carboxyl-fluorescein）及びＨＥＸ（hexachloro-fluorescein）をオリゴヌクレオチドの５’末端の標識に用いた。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ ９６．９６ Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙにおいて、ＮＰＴｙｐｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(Fluidigm Corp., South San Francisco, CA, USA)を用いて、遺伝子型解析を行った。熱サイクルは、初期の混合サイクル（７０℃で３０分；２５℃で１０分）の後、ホットスタートＴａｑポリメラーゼ活性化ステップ（９４℃で１５分）及びタッチダウン増幅プロトコルを実行し、さらに、９４℃で２０秒及び６５℃で１分を１０サイクル（１サイクル毎に０．８℃減少）行った後、９４℃で２０秒及び５７℃で１分を２６～４６サイクル行った。２６～４６サイクルの間に、４サイクル毎に２０℃で３０秒保持し、Ｂｉｏｍａｒｋ ｉｍａｇｅｒ (Fluidigm Corp)を用いて、チップの終点蛍光イメージを収集した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、データを分析した。

（親から子に遺伝するＳＮＰのフィルタリング）
コンピュータソフトウェア“ＭＡＲＣＯ”を用いたＳＮＰ遺伝子型の両親から後代への遺伝を評価するために、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ及びＦｌｕｉｄｉｇｍアッセイにより検出したＳＮＰの、親子関係を持つ７８組の組み合わせを用いた。親と子の間の遺伝が確認された信頼性の高いＳＮＰを、トリオＳＮＰと称した。

（育種材料におけるカロテノイド含有量の定量）
８つの代表的なカロテノイド（フィトエン、α－カロテン、ζ－カロテン、ルテイン、β－カロテン、β－クリプトキサンチン、ゼアキサンチン及びビオラキサンチンを定量した。サンプルをホモジナイズし、ヘキサン：アセトン：エタノール＝５０：２５：２５（ｖ／ｖ）の溶液中で抽出した。ヘキサン相に区分された色素が乾燥するまで蒸発させた。これを、０．１％（ｖ／ｖ） ２，６－ジ－ｔｅｒｔブチル－４－メチルフェノールを含むメチルｔｅｒｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中に溶解した。脂肪酸がエステル化したカロテノイドを含む抽出物を、１０％（ｗ／ｖ） ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ＫＯＨで鹸化した。

鹸化後、ＮａＣｌ飽和水を加えて水溶性の抽出物を取り除いた。色素を、２ｍＬのＭＴＢＥ相中に再区分した。逆相ＨＰＬＣシステム(Jasco, Tokyo, Japan)を用いて２０μｌ等分を得た。逆相ＨＰＬＣは、１ｍＬ/ｍｉｎのフローレートにおいて、ＹＭＣカロテノイドに合わせて２５０ｍｍ×４．６ｍｍｉ．ｄ．のＳ－５カラム(Waters, Milford, MA)を用いて行った。溶出液を、フォトダイオードアレイディテクター(MD-910, Jasco, Tochigi, Japan)を用いて監視した。各サンプルを所定の勾配溶離スケジュールにより分析した。９０％ メタノール、５％ ＭＴＢＥ、及び５％ 水の組成を、線形勾配で、９５％ メタノール及び５％ ＭＴＢＥに１２分かけて変更し、８６％ メタノール及び１４％ＭＴＢＥに８分かけて変更し、７５％ メタノール及び２５％ ＭＴＢＥに１０分かけて変更し、５０％ メタノール及び５０％ ＭＴＢＥに２０分かけて変更した。それらの特異的な保持時間と基準試料の吸光スペクトルとを比較して、ピークを同定した。フィトエンは２８６ｎｍ、ζ－カロテンは４００ｎｍ、ｔ－ビオラキサンチン、ｃ－ビオラキサンチン、ルテイン、β－クリプトキサンチン、α－カロテン，及びゼアキサンチンは４５２ｎｍ、β－カロテンは４５３ｎｍにおける吸収係数に基づいて、標準溶液の濃度を推定した。サンプル濃度を標準曲線から推定した。ビオラキサンチン及びカロテンを、異性体の和の濃度とした。各カロテノイド濃度を標準曲線から推定し、１００生重量グラム当たりのミリグラム（ｍｇ／１００ＦＷＧ）として表した。

（１３品種におけるカロテノイド代謝遺伝子のＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ解析）
本発明者らの以前の研究において、ＰＳＹ、ＨＹｂ、ＺＥＰ、及びＮＣＥＤの各遺伝子座、並びに、第８連鎖群におけるＰＤＳ及びＺＤＳの転写レベルを制御するＱＴＬ（ＴＣＬ）が、カロテノイドの含有量及びカロテノイド代謝遺伝子の転写レベルに静的に影響することが示された。この研究において、本発明者らは、果肉中のカロテノイド高含有に関連する最適なアレルを探索した。日本の品種育成素材の１３種の祖先種において、理論上最大で２６種のアレルが存在する。カンキツ品種は、自然交配を繰り返した結果、限られた数の祖先種の複雑なモザイクゲノム構造を有している。それゆえに、ＳＮＰに基づいて、５種の標的遺伝子から、祖先１３品種のいくつかに共通する独立したアレルの数が推定される。

多くの祖先品種のゲノム配列は公開されたデータベースからは得られないので、TCLを除く標的遺伝子の遺伝子領域におけるSNP情報を得るために、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔシステムを用いた。カロテノイド代謝遺伝子はゲノム中にいくつかの異性体を有するので、クレメンティンのゲノム配列中の、ＰＳＹのCiclev10011841m.g、ＨＹｂのCiclev10005481m.g、ＺＥＰのCiclev10025089m.g、及びＮＣＥＤのCiclev10014639m.gの遺伝子領域のゲノム配列を、標的遺伝子の遺伝子領域をカバーするライブラリーを生成するために用いた。

本発明者らの以前の研究において、これらの遺伝子座は、カロテノイド含有量及びカロテノイド代謝遺伝子の転写レベルに影響することが示されている。ＨｉＳｅｑ２５００ ｓｙｓｔｅｍ(Illumina)を用いて, ４つの代謝遺伝子を濃縮したライブラリーを作成し、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ６．５．１(CLC bio, Aarhus, Denmark)を用いて、ＮＧＳデータをクレメンディンゲノム配列の参照配列に揃えて配列化して比較した。

祖先１３品種の４つの標的遺伝子において、多くのＳＮＰ及び塩基の挿入又は欠失が見られた。祖先１３品種のＮＧＳデータをクレメンティンの対応する参照遺伝子と比較したとき、ＰＳＹ、ＨＹｂ、ＺＥＰ及びＮＣＥＤにおける信頼性の高いＳＮＰの数は、それぞれ、１０７、３１、５４及び１９であった。ＰＤＳ及びＺＤＳの転写レベルを制御する原因遺伝子は特定されていない。同じ祖先品種由来の共通のハプロタイプ内にある原因遺伝子は、同じＳＮＰ遺伝子型を表すことから、原因遺伝子の独立したアレルの数を推定するために必要なＴＣＬの候補ＳＮＰを、ミカンゲノムデータベース（https://mikan.dna.affrc.go.jp/）におけるＴＡＳＵＫＥプログラムにより探索した。ＳＮＰ情報に基づいて、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイシステム(Illumina)及びＦｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒ ＨＤアッセイシステム(Fluidigm）を用いて、ＰＳＹの１７個のＳＮＰマーカー、ＨＹｂの１５個のＳＮＰマーカー、ＺＥＰの３１個のＳＮＰマーカー、ＮＣＥＤの８個のＳＮＰマーカー、及びＴＣＬの５個のＳＮＰマーカーを、ＳＮＰ遺伝子型解析のために開発した。

（ＳＮＰマーカーのＳＮＰ遺伝子型情報に基づく祖先１３品種の独立したアレル）
７６個のＳＮＰマーカーの全てを、祖先１３品種及びこれに親子相関のある７８組の子の遺伝子型解析に用いた。祖先１３品種のゲノムの混合及び長い栽培の歴史を考慮すると、共通のハプロタイプに親から子に受け継がれたSNP以外に新規な変位が頻繁に起こっている。これらの変異により共通の祖先種由来の同一のアレルの同定が阻害される。新規の変異のＳＮＰを除くためにトリオ解析を行い、ＳＮＰ遺伝子型が両親から後代に遺伝しているかの判定に基づいて信頼性の高いＳＮＰを得た。親子関係にある７８組み合わせをコンピュータソフトウェア“ＭＡＲＣＯ”で評価し、トリオ解析のフィルタリングを通過した５７個のＳＮＰがトリオＳＮＰとして有効であった。

同一のトリオＳＮＰ遺伝子型を有するアレルを、独立したアレルとして割り当て、１２、１０、２４及び６個のトリオＳＮＰを、それぞれ、ＰＳＹ、ＨＹｂ、ＺＥＰ及びＮＣＥＳの独立したアレルを見つけるために用いた。祖先１３品種における独立したアレルの数は、ＰＳＹは７、ＨＹｂは７、ＺＥＰは１１、ＮＣＥＤは５、ＴＣＬは４であった。

（ベイズ統計分析による５種の標的遺伝子のアレル組成と果肉中のカロテノイド組成との相関）
５種の標的遺伝子のアレル組成とカロテノイド組成との関連を、２６３系統から得たデータを用いて、ベイズ統計分析により評価した。結果を図１～３に示す。図１は、５種の標的遺伝子領域における各アレルの予想される総カロテノイドに対する効果、図２は、β－クリプトキサンチンに対する効果、図３は、ビオラキサンチンに対する効果を示す。５種の標的遺伝子において、測定された８種のカロテノイド含有量及び総カロテノイド含有量とのいくつかの顕著な相関が検出された。ＰＳＹ、ＺＥＰ及びＮＣＥＤは総カロテノイド含有量に顕著に相関し、ＰＳＹ及びＺＥＰはβ－クリプトキサンチン含有量に顕著に相関し、ＰＳＹ、ＨＹｂ、ＺＥＰ、ＮＣＥＤ、及びＴＣＬはビオラキサンチン含有量に顕著に相関した。５種の標的遺伝子の独立したアレルに関して、ＰＳＹ－ａは、果肉中の総カロテノイド含有量の増加に強い正の効果を有していた。一方、ＰＳＹ－ｃ及びＰＳＹ－ｇは、総カロテノイド含有量の減少に中程度の負の効果を有していた。ＺＥＰアレル間で、果肉中の総カロテノイド含有量の増加に強い正の効果を有していた。一方、ＺＥＰ－ａ、ＺＥＰ－ｂ、及びＺＥＰ－ｃは総カロテノイド含有量の増加に中程度又は弱い正の効果を有していた。ＺＥＰ－ｆ、ＺＥＰ－ｇ、ＺＥＰ－ｈ、及びＺＥＰ－ｋの４つのアレルは、果肉中の総カロテノイド含有量の減少に中程度又は弱い負の効果を有していた。さらに、ＮＣＥＤアレル間で、ＮＣＥＤ－ａは果肉中の総カロテノイド含有量の増加に弱い正の効果を有していた。これらの遺伝子とは異なり、ＨＹｂ及びＴＣＬは、果肉中の総カロテノイド含有量における効果は不明確であった。β－クリプトキサンチン含有量に関して、ＰＳＹ－ａは中低の正の効果を有している一方で、ＰＳＹ－ｃ及びＰＳＹ－ｇは弱い負の効果を有していた。一方、ＺＥＰ－ａは弱い正の効果を有していた。他のアレルは、β－クリプトキサンチン含有量における効果は不明確であった。ビオラキサンチン含有量に関して、ＰＳＹ－ａは弱い正の効果を有していた一方で、ＺＥＰ－ｃ及びＺＥＰ－ｅもまた、弱い正の効果を有していた。他のアレルは、果肉中のビオラキサンチン含有量に対する効果は不明確であった。

他のカロテノイドに関して、ＰＳＹ、ＨＹｂ及びＺＥＰにおけるいくつかのアレルがこれらの含有量の増加に弱い効果を有していた。とりわけ、ＰＳＹ－ａは、ルテインを除く複数のカロテノイドにおいて、広範な効果を有していた。

ＰＳＹ－ａは、グレープフルーツ、キシュウミカン、ハッサク、スイートオレンジ、クネンボ、地中海マンダリン、キングマンダリン、及びマーコットのいずれかのアレル由来である。ＺＥＰ－ｅは、キングマンダリン及びマーコットのいずれかのアレル由来である。

従来の交雑育種法によるＢＣＲ高含有品種の育成の過程において育種選抜した品種及び育種系統において、ＰＳＹ－ａ及びＺＥＰ－ｅ（又はＺＥＰ－ａ）のアレルが集積していた。ＰＳＹ－ａ及びＺＥＰ－ｅは、果肉中の総カロテノイド含有量の増加において、統計的に強い正の効果を有することが示された。これらのアレルは、β－クリプトキサンチン及びビオラキサンチン含有量の増加を調節し得るが、総カロテノイド含有量に対する効果と比較するとその効果は小さい。カロテノイド含有量に負の効果を有する多くのアレルは、育種世代の進行中に失われた。

（果肉における増加したカロテノイド含有量に対するＰＳＹ及びZEPの最適なアレルの効果の検証）
果肉中の総カロテノイド含有量に対するＰＳＹ及びＺＥＰの最適なアレルの効果を検証するために、Ｂｏｘ ｐｌｏｔ解析を行った。図４及び５は、果肉中の総カロテノイドの増加に関して、最適なＰＳＹ及びＺＥＰアレルの効果を検証するためのＢｏｘ ｐｌｏｔ解析の結果を示す。図４は、正の効果を有するアレル（ＰＳＹ－ａ）及び負の効果を有するアレル（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）による総カロテノイド含有量の比較を示す。Ｃｏｎｄ．１（条件１）は、ＰＳＹ－ａ＝０、（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）＝２である。Ｃｏｎｄ．２（条件２）は、ＰＳＹ－ａ＝０、（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）＝１である。Ｃｏｎｄ．３（条件３）は、ＰＳＹ－ａ＝０、（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）＝０である。Ｃｏｎｄ．４（条件４）は、ＰＳＹ－ａ＝１、（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）＝１である。Ｃｏｎｄ．５（条件５）は、ＰＳＹ－ａ＝１、（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）＝０である。Ｃｏｎｄ．６（条件６）は、ＰＳＹ－ａ＝２、（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）＝０である。図５は、図４中のＰＳＹアレル型条件における、正の効果を有するＺＥＰアレル（ＺＥＰ－ａ、ＺＥＰ－ｂ、ＺＥＰ－ｃ、又はＺＥＰ－ｅ）による総カロテノイド含有量の比較を示す。

図４は、ＰＳＹアレルの６つの組み合わせにおける総カロテノイド含有量の分布を明らかにした。６つの組み合わせは以下の通りである。条件１：負のアレル（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）のペア、条件２：最適アレル（ＰＳＹ－ａ）を除く負のアレル単独、条件３：最適アレル（ＰＳＹ－ａ）及び負のアレル（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）の両方を含まない、条件４：最適アレル（ＰＳＹ－ａ）単独及び負のアレル（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）単独、条件５：いずれの負のアレル（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）も含まない最適アレル（ＰＳＹ－ａ）単独、及び条件６：２つの最適アレル（ＰＳＹ－ａ）。条件１及び２の平均値と条件３の値を比較したとき、ＰＳＹ－ｃ及びＰＳＹ－ｇがカロテノイド含有量の減少に負の効果を有することが明らかになった。一方、２つのＰＳＹ－ａアレルを有する条件６の平均値は、条件３、４及び５よりも高かった。

加えて、上記の６つの条件に対して、総カロテノイド含有量への正の効果を発揮する４つのＺＥＰアレル（ＺＥＰ－ａ、ＺＥＰ－ｂ、ＺＥＰ－ｃ、及びＺＥＰ－ｅ）の可能性を調べた（図５）。ＰＳＹ－ａを含まない条件３において、総カロテノイド含有量の平均値は、ＺＥＰアレルの数に比例して増加した。条件１及び２において、ＰＳＹアレルとＺＥＰアレルとの間の上位相互作用を示す、ＺＥＰアレルの数に応じた増加に関する一貫した効果は観察されなかった。この結果から、ＰＳＹはＺＥＰよりもカロテノイド代謝経路の上流に位置することが理解できる。その結果、負の効果を持つＰＳＹアレルは、正の効果を有するＺＥＰアレルの効果を打ち消し得る。条件５において、総カロテノイド含有量の平均値は、最適ＺＥＰアレルの数に比例して増加した。条件６において、ＺＥＰアレルを有する場合の総カロテノイド含有量の平均値は、有さない場合よりも高かった。それゆえに、これらの結果から、ＰＳＹ及びＺＥＰの最適アレルは、果肉中の総カロテノイド含有量を増加する能力を有することが確認された。

Ｂｏｘ ｐｌｏｔ解析はまた、β－クリプトキサンチン及びビオラキサンチン含有量についても行った（図６～９）。図６は、正の効果を有するアレル（ＰＳＹ－ａ）及び負の効果を有するアレル（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）におけるβ－クリプトキサンチン含有量の比較を示す。図７は、図６中のＰＳＹアレル型条件における、正の効果を有するＺＥＰアレル（ＺＥＰ－ａ、ＺＥＰ－ｂ、ＺＥＰ－ｃ、又はＺＥＰ－ｅ）におけるβ－クリプトキサンチン含有量の比較を示す。図８は、正の効果を有するアレル（ＰＳＹ－ａ）及び負の効果を有するアレル（ＰＳＹ－ｃ又はＰＳＹ－ｇ）におけるビオラキサンチン含有量の比較を示す。図９は、図８中のＰＳＹアレル型条件における、正の効果を有するＺＥＰアレル（ＺＥＰ－ａ、ＺＥＰ－ｂ、ＺＥＰ－ｃ、又はＺＥＰ－ｅ）におけるビオラキサンチン含有量の比較を示す。

ＢＣＲに関して、平均値の増加にＰＳＹ－ａのわずかな効果が観察された一方で、正の効果を有するＺＥＰアレルは、β－クリプトキサンチン含有量の増加を導く効果が観察された。さらに、ビオラキサンチンに関して、正の効果を有するＺＥＰアレルの数値の増加は、条件５を除いてビオラキサンチン含有量に相関がなかった。これらの評価試験から、ＰＳＹ－ａの最適アレルは、カロテノイド代謝経路の流れを強くする能力有することが強調され、β－クリプトキサンチン及びビオラキサンチンの増加に伴い、総カロテノイド含有量を増加させることが示された。

正の効果を有するＺＥＰアレルはまた、総カロテノイド含有量を増加させることが確認され、その効果は、ビオラキサンチン含有量よりもβ－クリプトキサンチン含有量の増加に優先的に影響した。正のアレルを有するＺＥＰアレルは、それ自体ではβ－クリプトキサンチン含有量の増加に強力な影響は有さないが、カロテノイド代謝経路における上流遺伝子と下流遺伝子との間のサンドイッチ効果によって、ＰＳＹ－ａとのシナジー効果によりβ－クリプトキサンチン含有量を増加させると考えられる。

（マーカー支援選抜のためのＰＳＹ－ａ及びＺＥＰ－ｅの最適アレルを同定するためのトリオＳＮＰの最小セット）
ＰＳＹ－ａ及びＺＥＰ－ｅの最適アレルのシナジー効果は、果肉中のカロテノイド（特にβ－クリプトキサンチン）の含有量増加において有望である。ＤＮＡマーカー選抜による分子育種を効率的に促進するために、ＭｉｎｉｍａｌＭａｒｋｅｒソフトウェアを用いて、トリオＳＮＰの最小セットを評価し、最適なＰＳＹアレル及びＺＥＰアレルを決定した。評価したトリオＳＮＰを表２に示す。

ＰＳＹについて、４５の最小セットを見出した。これらは、６個のトリオＳＮＰの異なる組み合わせを含み、７個のＰＳＹアレルの何れの組み合わせも区別した。例えば、ＰＳＹ－ＳＮＰ－０５、ＰＳＹ－ＳＮＰ０６、ＰＳＹ－０７、ＰＳＹ－ＳＮＰ０８、ＰＳＹ－ＳＮＰ０９，及びＰＳＹ－ＳＮＰ１０は、最小セットの１つであった（表３）。最適なＰＳＹ－ａアレルは、ＰＳＹ－ＳＮＰ０６のみにより他のアレルから区別可能であった。

ＺＥＰについて、１の最小セットを見出した。これは、７個のトリオＳＮＰ（ＺＥＰ－ＳＮＰ０１、ＺＥＰ－ＳＮＰ０３、ＺＥＰ－ＳＮＰ０５、ＺＥＰ－ＳＮＰ１４、ＺＥＰ－ＳＮＰ１７、ＺＥＰ－ＳＮＰ２０、及びＺＥＰ－ＳＮＰ２１）を含んでいた（表４）。最適なＺＥＰ－ｅアレルは、ＺＥＰ－ＳＮＰ１７及びＺＥＰ－ＳＮＰ２１の２つのトリオＳＮＰにより区別可能であった。

交配に使用する親品種のＰＳＹ及びＺＥＰアレルのアレル遺伝子型の組み合わせにより、交雑実生のマーカー選抜に必要なＳＮＰの数は、算出した上記最小セットよりも少なくなり得る。例えば、種子親ＺＥＰ－ｃ及びＺＥＰ－ｅと花粉親ＺＥＰ－ｅ及びＺＥＰ－ｅとの交配から得た種子の遺伝子型は、ＺＥＰ－ｅのホモ接合型であるか、又はＺＥＰ－ｃ及びＺＥＰ－ｅのヘテロ接合型である。この場合、ＺＥＰ－ＳＮＰ１７又はＺＥＰ－ＳＮＰ２０のただ１つのトリオＳＮＰがＺＥＰ－ｅのホモ接合型を有する種子を判別するに十分である（図１０）。

他のトリオＳＮＰは、上記最小セットには含まれておらず、それらが親のアレル遺伝子型を区別するときに、マーカー支援選抜に適用することも可能である。近年、ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ＳＮＰ遺伝子型解析、ＫＡＳＰ遺伝子型解析等のような様々なＳＮＰ検出システムが開発されている。これらのシステムに互換性のあるＳＮＰマーカーは、表２に列挙したトリオＳＮＰの配列情報に基づいて構築することができる。

（マーカー支援選抜のためのＰＳＹ－ＳＮＰ０６及びＺＥＰ－ＳＮＰ１７を用いたＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ＳＮＰ遺伝子型解析）
マーカー支援選抜のためのＰＳＹ－ＳＮＰ０６及びＺＥＰ－ＳＮＰ１７を用いたＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ＳＮＰ遺伝子型解析の結果を図１０及び図１１に示す。図１０は、ＰＳＹ－ＳＮＰ０６を用いたＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ＳＮＰ遺伝子型解析の結果を示し、図１１は、ＺＥＰ－ＳＮＰ１７を用いたＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ＳＮＰ遺伝子型解析の結果を示している。図１０及び図１１において、ＦＡＭ蛍光シグナル値をＸ軸にプロットし、ＨＥＸ蛍光シグナル値をＹ軸にプロットした。ＮＴＣはコントロールを表す。

図１０及び図１１に示すように、親のアレル遺伝子型が有効な場合は、ホモ接合型ＰＳＹ－ａ及びホモ接合型ＺＥＰ－ｅを有する苗を、単一のＤＮＡマーカーによるマーカー支援選抜において、カロテノイド高含有として選択することができる。

上述した実験により、ＰＳＹ遺伝子及びＺＥＰ遺伝子が、成熟した果肉中におけるカロテノイドの流れの制御において重要な役割を果たすことが示された。結果として、ＰＳＹ－ａ及びＺＥＰ－ｅの２つのアレルの連携によりカロテノイド高含有が達成されることが示された。これらの重要なアレルは、ＴａｑＭＡＮ－ＭＧＢ ＳＮＰマーカーを用いたマーカー支援選抜により遺伝子型が特定された。これらの結果に基づけば、ＤＮＡマーカーを用いることにより、果肉中の栄養価を向上させるためのカロテノイド代謝の設計が容易になり得る。

本発明は、農業分野、植物育種分野等に利用することができる。

Claims (7)

1. カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法であって、
   カンキツ植物において、下記の（ａ）～（ｃ）を満たすとき：
   （ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるCiclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）の翻訳開始点から２４６９位の塩基又はこれに相当する塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である；
   （ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるCiclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から４４３６位の塩基又はこれに相当する塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である；かつ
   （ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるCiclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から５０１９位の塩基又はこれに相当する塩基がＣであるアレルについて、ホモ接合性である、
   当該カンキツ植物は、上記（ａ）～（ｃ）を満たさない他のカンキツ植物個体と比較して、果肉中のカロテノイド含有量が相対的に多いカロテノイド高含有であると判定する工程を含む、方法。
2. 上記カンキツ植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物である、請求項１に記載の方法。
3. 前記判定する工程において、前記（ａ）～（ｃ）に示された塩基又はこれに相当する塩基を含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、前記カンキツ植物のＤＮＡにおける前記領域を増幅する、請求項１又は２に記載の方法。
4. カンキツ植物同士を交雑した交雑植物又はその後代系統から、請求項１から３のいずれか１項に記載された方法によって、上記（ａ）～（ｃ）を満たさない他のカンキツ植物個体と比較して、果肉中のカロテノイド含有量が相対的に多いカロテノイド高含有のカンキツ植物を判別する判別工程
   を含む、果肉中のカロテノイド高含有のカンキツ植物を製造する製造方法。
5. 前記判別工程において判別したカンキツ植物又はその後代系統と、他のカンキツ植物とを交雑する交雑工程をさらに包含する、
   請求項４に記載の製造方法。
6. 前記交雑工程において交雑により得られたカンキツ植物又はその後代系統から、請求項１から３のいずれか１項に記載された方法によって、上記（ａ）～（ｃ）を満たさない他のカンキツ植物個体と比較して、果肉中のカロテノイド含有量が相対的に多いカロテノイド高含有のカンキツ植物を判別する判別工程をさらに包含する、請求項５に記載の製造方法。
7. カンキツ植物における、果肉中のカロテノイド含有量の調節に関する分子マーカーであって、
   下記（ａ）～（ｃ）の塩基に相当する塩基自体か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
   （ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるCiclev10011841m.g遺伝子（ＰＳＹ遺伝子）の翻訳開始点から２４６９位の塩基；
   （ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるCiclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から４４３６位の塩基；及び
   （ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるCiclev10025089m.g遺伝子（ＺＥＰ遺伝子）の翻訳開始点から５０１９位の塩基である分子マーカーの、少なくとも１つを含む領域を増幅するプライマーセットを備えた、カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する判定キット。
   

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