CN116622876B - 与番木瓜果肉维生素c含量相关的单倍型分子标记及应用 - Google Patents
与番木瓜果肉维生素c含量相关的单倍型分子标记及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116622876B CN116622876B CN202310304959.3A CN202310304959A CN116622876B CN 116622876 B CN116622876 B CN 116622876B CN 202310304959 A CN202310304959 A CN 202310304959A CN 116622876 B CN116622876 B CN 116622876B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecular marker
- papaya
- snp2
- vitamin
- content
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 title claims abstract description 170
- 241000219173 Carica Species 0.000 title claims abstract description 126
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 title claims abstract description 120
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 108
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 85
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 title claims abstract description 85
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 title claims abstract description 85
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 101100029173 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) SNP2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 101100094821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SMX2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 101000690100 Homo sapiens U1 small nuclear ribonucleoprotein 70 kDa Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102100024121 U1 small nuclear ribonucleoprotein 70 kDa Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 40
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 2
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001746 carotenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 description 1
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 description 1
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 description 1
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
- Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记及应用，属于生物技术领域，解决了现有与果肉维生素C含量指标相关的番木瓜选育时间长、选育成本高的问题。包括分子标记SNP1和分子标记SNP2；所述分子标记SNP1位于Chr09染色体第2001190位碱基，命名为Cpa09g002680:2846，所述分子标记SNP1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位；所述分子标记SNP2位于Chr09染色体第2001473位碱基，命名为Cpa09g002680:3129，所述分子标记SNP2位于SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的第128位。提高了番木瓜育种选择效率，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记及应用。
背景技术
番木瓜(Carica papaya L.)又称木瓜、乳瓜、万寿果，是一种热带常绿果蔬，其广泛栽培于全世界的热带和亚热带地区。番木瓜果皮光滑美观，果肉厚实细致、香气浓郁、汁水丰多、甜美可口、营养丰富，半个中等大小的木瓜足供成人整天所需的维生素C，有“百益之果”、“水果之皇”、“万寿瓜”之雅称。成熟的番木瓜果肉呈黄色或红色，胡萝卜素、番茄红素含量丰富，具有卓越的保健效果和重要的使用价值以及工业价值。因此，发展番木瓜生产将极大刺激食品加工、医药卫生、美容保健和养殖业等相关产业发展，具有重要的意义。
在传统的番木瓜分子育种中，农民或育种家主要通过选择优良性状的植株个体，通过杂交或回交的方式，将优良性状固定下来。
番木瓜果肉维生素C含量高低为评价番木瓜品质优劣的一个重要指标，因而是育种家在繁育优良番木瓜植株所考虑的重要因素，目前针对这一指标的选育需等待植株开花结果后测定果实的维生素C含量来进行筛选优良植株，选育时间长、选育成本较高。
发明内容
鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记及应用，用以解决现有技术中与果肉维生素C含量指标相关的番木瓜选育时间长、选育成本高的问题。
一方面，本发明实施例提供了一种与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记，包括分子标记SNP1和分子标记SNP2；
所述分子标记SNP1位于Chr09染色体第2001190位碱基，命名为Cpa09g002680:2846，所述分子标记SNP1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位；
所述分子标记SNP2位于Chr09染色体第2001473位碱基，命名为Cpa09g002680:3129，所述分子标记SNP2位于SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第128位。
进一步地，所述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位存在C/T多态性；
所述SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第128位存在A/T多态性。
进一步地，所述分子标记SNP1位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP1位点为C的番木瓜果肉维生素C含量；
所述分子标记SNP2位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP2位点为A的番木瓜果肉维生素C含量。
第二方面，本发明还提供了上述单倍型分子标记在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
第三方面，本发明还提供了用于上述单倍型分子标记的PCR引物对，包括正向引物和反向引物；
用于所述分子标记SNP1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
用于所述分子标记SNP2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第四方面，本发明还提供了上述PCR引物对在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
第五方面，本发明还提供了用于鉴定番木瓜果肉维生素C含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述用于分子标记SNP1或分子标记SNP2的PCR引物对。
第六方面，一种制备上述单倍型分子标记的方法，所述方法包括：以含有SNP1标记的核苷酸序列为基础序列，利用上述相应的PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP1标记转化为320bp的分子标记；
或者，以含有SNP2标记的核苷酸序列为基础序列，利用上述相应的PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP2标记转化为464bp的分子标记。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。
与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：
1、本发明获得了与番木瓜果肉维生素C含量极显著相关的单倍型分子标记，利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其维生素C含量的高或低，大大提高了番木瓜育种的选择效率。
2、本发明用于检测与番木瓜果肉维生素C含量相关的SNP分子标记的引物对，特异性强，能准确扩增得到含有本发明单倍型分子标记位点的序列，利用该引物对制备试剂盒，可辅助选择育种，高效鉴定出番木瓜的高维生素C含量和低维生素C含量。
3、本发明可高效地辅助番木瓜的育种选择，具有极高的经济价值。
本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。
附图说明
附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。
图1为本发明中与番木瓜果肉维生素C含量极显著相关的SNP标记的曼哈顿图。
图2为本发明中与番木瓜果肉维生素C含量极显著相关的SNP标记所在Chr09染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍快图。
图3为本发明中与番木瓜果肉维生素C含量极显著相关的SNP1标记不同基因型亚群之间的果肉维生素C差异比较，T等位基因与番木瓜果肉高维生素C含量极显著相关。
图4为本发明中与番木瓜果肉维生素C含量极显著相关的SNP2标记不同基因型亚群之间的果肉维生素C差异比较，T等位基因与番木瓜果肉高维生素C含量极显著相关。
图5为本发明中与番木瓜果实维生素C含量极显著相关的单倍型标记不同基因型亚群之间的果实维生素C差异比较，TT等位基因显著性高于CA，TT与果实维生素C显著相关。
具体实施方式
下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例，其中，附图构成本申请一部分，并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。
随着分子生物学的发展，育种家意识到选择优异性状的本质是选择携带优异基因或基因型的个体。由于确定植株携带性状相关基因难度较大，育种家通过检测与目标基因连锁在一起的遗传标记，来检测植株是否携带优异基因或基因型，无需通过播种和田间性状调查即可预测植株表型性状趋势(标记辅助育种/分子标记育种)。第一代分子标记(RALP、AFLP等)由于各种问题和缺陷逐渐被淘汰，目前SSR和SNP分子标记是最常用的分子标记。
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP分子标记具有在个体基因组上分布广泛、数量较多，易于基因分型(SNP的二态性)、适于快速、规模化筛查等优势。
本发明提供了一种与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记，包括分子标记SNP1和分子标记SNP2；
所述分子标记SNP1位于Chr09染色体第2001190位碱基，命名为Cpa09g002680:2846，所述分子标记SNP1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位；
所述分子标记SNP2位于Chr09染色体第2001473位碱基，命名为Cpa09g002680:3129，所述分子标记SNP2位于SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第128位。
与现有技术相比，本发明获得了与番木瓜果肉维生素C含量极显著相关的单倍型分子标记，利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其维生素C含量的高或低，大大提高了番木瓜育种的选择效率。本发明可高效地辅助番木瓜的育种选择，具有极高的经济价值。
具体来说，所述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位存在C/T多态性；所述SEQID NO.4所示核苷酸序列的第128位存在A/T多态性。
进一步地，所述分子标记SNP1位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP1位点为C的番木瓜果肉维生素C含量；所述分子标记SNP2位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP2位点为A的番木瓜果肉维生素C含量。
也就是说，所述分子标记SNP1位点的T等位基因与番木瓜果肉高维生素C含量极显著相关，所述分子标记SNP2位点的T等位基因与番木瓜果肉高维生素C含量极显著相关。当所述分子标记SNP1位点为T等位基因，和/或所述分子标记SNP2位点为T等位基因时，番木瓜果肉具有高维生素C含量。
第二方面，本发明还提供了上述与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，分子标记SNP1位点为T等位基因，和/或所述分子标记SNP2位点为T等位基因时，番木瓜果肉具有高维生素C含量。因此，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其果肉维生素C含量的高或低，大大提高了番木瓜育种的选择效率，可高效地辅助番木瓜的育种选择，具有极高的经济价值。
第三方面，本发明还提供了上述与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记的PCR引物对，包括正向引物和反向引物；
用于所述分子标记SNP1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
用于所述分子标记SNP2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的PCR引物对特异性强，能准确扩增得到含有本发明单倍型分子标记位点的序列。
第四方面，本发明还提供了上述PCR引物对在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
第五方面，本发明还提供了用于鉴定番木瓜果肉维生素C含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述用于分子标记SNP1和/或分子标记SNP2的PCR引物对。利用该引物对制备的试剂盒，可辅助选择育种，高效鉴定出番木瓜的高维生素C含量和低维生素C含量。
需要说明的是，本发明中的“高维生素C含量”和“低维生素C含量”是相对而言的。
第六方面，本发明还提供了一种制备上述与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记的方法，所述方法包括：以含有SNP1标记的核苷酸序列为基础序列，利用上述相应的PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP1标记转化为320bp的分子标记；
或者，以含有SNP2标记的核苷酸序列为基础序列，利用上述相应的PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP2标记转化为464bp的分子标记。
值得注意的是，所述PCR扩增的反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。
具体地，与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记的开发过程包括以下步骤：
1、番木瓜全基因组SNP标记开发
对从墨西哥、南非、中国广西、中国海南等地收集到的340份番木瓜，播种于中国热带农业科学院文昌基地，土壤肥力中等、无病虫害，多年多点种植并收集表型性状数据，表型性状数据经Excel2016整理后用于后续分析。
从番木瓜植株上取新鲜幼嫩叶片1～2g，液氮研磨后按照选用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取番木瓜材料DNA。利用超微量分光光度计及1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量和浓度，选择电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD260/OD280介于1.8～2.0，浓度大于>100ng/μL的DNA样品进行建库测序。
采用超声波破碎(或酶切)的方法，将DNA随机打断成300bp左右的片段，DNA片段经末端修复、3'端加A、加测序接头偶、纯化、PCR扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过illumina平台进行测序。测序数据下机后需要按一定的标准对原始数据(Raw reads)进行质控，过滤标准如下：(1)去除带接头(adapter)的序列，(2)去除单端序列含氮量>10％的一对序列，(3)去除低质量碱基数超过50％的一对序列。去除低质量序列、接头序列、不准确序列后的Clean reads进行下一步序列比对。参考基因组选择发明人番木瓜果用材料“kamiya”基因组，使用BWA-mem软件将Clean reads与参考基因组序列比对，使用samtools软件对比对结果排序，GATK4.0软件去除PCR重复序列后进行变异检测，以QD>2.0，QUAL>30.0，FS<60.0，MQ>40.0的硬标准过滤变异合集，保留具有统计学意义的变异位点数据集。按MAF(次等位基因频率)>＝0.05，miss(缺失率)<＝0.2为标准再次过滤变异位点，获得高质量的变异位点合集。
2、GWAS分析番木瓜果肉维生素C含量相关SNP位点
全基因组关联分析(GWAS)是基于高通量SNP分子标记与性状间关系，挖掘性状相关候选基因的方法，其基本原理是群体中基因间连锁不平衡(LD)现象。
利用基因组DNA区间特征描述文件对变异位点进行注释，分别统计落于基因编码区、非编码区、基因间区、非同义突变等变异位点的数量。通过群体结构分析获得群体亲缘关系矩阵后，结合表型性状数据进行全基因组关联分析，检测到与番木瓜果肉维生素C含量“QTL”位点，如图1和图2，确定了番木瓜果肉维生素C含量相关的候选基因Cpa09g002680。
3、筛选候选标记
基于GWAS分析中关联到的区域内的SNP标记，比较等位基因频率、性状差异、基因表达量差异，结果见图3和图4。在Cpa09g002680基因promoter区域筛选到与番木瓜果肉维生素C含量相关的SNP位点Cpa09g002680:2846(C/T)和Cpa09g002680:3129(A/T)。
4、标记开发和检测
利用引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3通过普通PCR扩增得到320bp的DNA片段，以及利用引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6通过普通PCR扩增得到464bp的DNA片段，扩增体系如下：2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。其中，Mix(扩增缓冲液)购自诺唯赞生物科技股份有限公司，引物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。PCR反应后目标片段测序委托华大基因公司完成。得到DNA片段后，测序，测序结果分别与番木瓜相关基因片段SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4比对、分析，检测该序列在相应标记位点所携带的基因型。由此可以达到检测或预测番木瓜果肉维生素C含量，进而对番木瓜品种果肉维生素C含量进行有效选择，加速番木瓜品种选育的进程。
表1.群体中不同基因型个体数和果肉维生素C含量平均值
下面，通过具体实施例进一步说明本发明的与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记及其应用。
实施例1
在中国热带农业科学院生物技术所文昌基地番木瓜种植区随机挑选20株番木瓜(不包括用于SNP标记开发的340份番木瓜)，经测序后基因分型和番木瓜果肉维生素C含量调查；测序所用引物为序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，扩增体系如下：2×Rapid TaqMaster Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。其中，Mix(扩增缓冲液)购自诺唯赞生物科技股份有限公司，引物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。通过普通PCR扩增得到320bp的DNA片段。
测序结果如表2-3所示。
表2.20株番木瓜在Cpa09g002680:2846不同基因型和果肉维生素C含量(ug/g)
表3. 20株番木瓜在Cpa09g002680:2846不同基因型和果肉维生素C平均含量(ug/g)
| 基因型 | 材料数 | 果肉维生素C含量(ug/g) |
| TT | 12 | 458.881 |
| CC | 8 | 359.241 |
由表2和表3可知本发明的分子标记SNP1位点对高维生素C含量和低维生素C含量番木瓜的鉴定准确率较高，TT基因型的番木瓜果肉维生素C含量高于CC基因型的番木瓜。即Cpa09g002680:2846位点的T等位基因与番木瓜果肉高维生素C含量极显著相关。
实施例2
在中国热带农业科学院生物技术所文昌基地番木瓜种植区随机挑选20株番木瓜(不包括用于SNP标记开发的340份番木瓜)，经测序后基因分型和番木瓜果肉维生素C含量调查；测序所用引物为序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，扩增体系如下：2×Rapid TaqMaster Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。其中，Mix(扩增缓冲液)购自诺唯赞生物科技股份有限公司，引物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。通过普通PCR扩增得到464bp的DNA片段。
测序结果如表4-5所示。
表4. 20株番木瓜在Cpa09g002680:3129不同基因型和果肉维生素C含量(ug/g)
表5. 20株番木瓜在Cpa09g002680:3129不同基因型和果肉维生素C平均含量(ug/g)
| 基因型 | 材料数 | 果肉维生素C含量(ug/g) |
| TT | 12 | 458.881 |
| AA | 8 | 324.38075 |
由表4和表5可知本发明的分子标记SNP2位点对高维生素C含量和低维生素C含量番木瓜的鉴定准确率较高，TT基因型的番木瓜果肉维生素C含量高于AA基因型的番木瓜。即Cpa09g002680:3129位点的T等位基因与番木瓜果肉高维生素C含量极显著相关。
综上，本发明的单倍型分子标记能够准确对番木瓜果肉维生素C含量进行较精确预期，不仅快速有效，而且不用等待植株开花结果在苗期即可进行鉴定，大大缩短了育种的周期，可以在生产中大规模应用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.检测与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记的试剂在辅助选择育种中的应用，其特征在于，
所述分子标记包括分子标记SNP1和分子标记SNP2；
所述分子标记SNP1位于Chr09染色体第2001190位碱基，命名为Cpa09g002680:2846，所述分子标记SNP1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位，该位点具有C/T多态性，所述分子标记SNP1位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP1位点为C的番木瓜果肉维生素C含量；
所述分子标记SNP2位于Chr09染色体第2001473位碱基，命名为Cpa09g002680:3129，所述分子标记SNP2位于SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第128位，该位点具有A/T多态性，所述分子标记SNP2位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP2位点为A的番木瓜果肉维生素C含量。
2.用于检测与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记的PCR引物对在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，所述PCR引物对包括正向引物和反向引物；所述分子标记包括分子标记SNP1和分子标记SNP2；
所述分子标记SNP1位于Chr09染色体第2001190位碱基，命名为Cpa09g002680:2846，所述分子标记SNP1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位，该位点具有C/T多态性，所述分子标记SNP1位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP1位点为C的番木瓜果肉维生素C含量；用于所述分子标记SNP1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述分子标记SNP2位于Chr09染色体第2001473位碱基，命名为Cpa09g002680:3129，所述分子标记SNP2位于SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第128位，该位点具有A/T多态性，所述分子标记SNP2位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP2位点为A的番木瓜果肉维生素C含量；用于所述分子标记SNP2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种检测与番木瓜果肉维生素C含量相关的单倍型分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括：
以含有SNP1标记的核苷酸序列为基础序列，设计PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP1标记转化为320bp的分子标记；所述分子标记SNP1位于Chr09染色体第2001190位碱基，命名为Cpa09g002680:2846，所述分子标记SNP1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第145位，该位点具有C/T多态性，所述分子标记SNP1位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP1位点为C的番木瓜果肉维生素C含量；用于所述分子标记SNP1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
或者，以含有SNP2标记的核苷酸序列为基础序列，设计PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP2标记转化为464bp的分子标记；所述分子标记SNP2位于Chr09染色体第2001473位碱基，命名为Cpa09g002680:3129，所述分子标记SNP2位于SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的第128位，该位点具有A/T多态性；所述分子标记SNP2位点为T的番木瓜果肉维生素C含量高于所述分子标记SNP2位点为A的番木瓜果肉维生素C含量；用于所述分子标记SNP2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×Rapid TaqMaster Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310304959.3A CN116622876B (zh) | 2023-03-27 | 2023-03-27 | 与番木瓜果肉维生素c含量相关的单倍型分子标记及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310304959.3A CN116622876B (zh) | 2023-03-27 | 2023-03-27 | 与番木瓜果肉维生素c含量相关的单倍型分子标记及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116622876A CN116622876A (zh) | 2023-08-22 |
| CN116622876B true CN116622876B (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=87640592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310304959.3A Active CN116622876B (zh) | 2023-03-27 | 2023-03-27 | 与番木瓜果肉维生素c含量相关的单倍型分子标记及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116622876B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117144055B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-03-22 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 调控番木瓜果实长度相关的单倍型分子标记的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114672586A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-06-28 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种与番木瓜果实宽度性状相关的snp分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用 |
| CN114672587A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-06-28 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种与番木瓜果实果糖含量相关的snp分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI721708B (zh) * | 2019-12-12 | 2021-03-11 | 國立屏東科技大學 | 一種與番木瓜結果性相關之分子標記 |
-
2023
- 2023-03-27 CN CN202310304959.3A patent/CN116622876B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114672586A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-06-28 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种与番木瓜果实宽度性状相关的snp分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用 |
| CN114672587A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-06-28 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种与番木瓜果实果糖含量相关的snp分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Accession NO: XM_022031234.1 PREDICTED: Carica papaya E3 ubiquitin-protein ligase RHF2A-like（LOC110806396）, mRNA.GenBank Database.2017,Features and Origin. * |
| Sequence information on single nucleotide polymorphism(SNP) through genome sequencing analysis of carica papaya variety Eksotika and Sekaki;Z.A.Rabiatual Adawiah等;J. Trop. Fd. Sci.;第44卷(第2期);219-228 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116622876A (zh) | 2023-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114672587B (zh) | 一种与番木瓜果实果糖含量相关的snp分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用 | |
| CN116426678B (zh) | 与番木瓜果肉果糖含量相关的snp分子标记及应用 | |
| CN103555717B (zh) | 一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记及应用 | |
| CN114672586B (zh) | 一种与番木瓜果实宽度性状相关的snp分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用 | |
| CN114672588B (zh) | 一种SNP分子标记Cpa03g017250：8及其扩增引物、检测试剂盒和应用 | |
| CN114622034B (zh) | 与番木瓜果实腔室直径相关的snp分子标记及应用 | |
| CN114574629B (zh) | 与番木瓜果实重量相关的snp分子标记及应用 | |
| CN116622876B (zh) | 与番木瓜果肉维生素c含量相关的单倍型分子标记及应用 | |
| KR20180077873A (ko) | 수박 분자마커이용여교잡 선발용 snp 마커 | |
| CN117144055B (zh) | 调控番木瓜果实长度相关的单倍型分子标记的应用 | |
| CN111719012A (zh) | 鉴定玉米籽粒脱水速率基因型的dCAPS分子标记引物对及应用 | |
| CN113046467B (zh) | 一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点及其在遗传育种中的应用 | |
| CN113528703A (zh) | 水稻稻瘟病抗性基因Pid3-A4的KASP分子标记开发及其应用 | |
| CN114592086B (zh) | 与环斑病病毒prsv抗性相关的snp分子标记及应用 | |
| CN114703316A (zh) | 番茄ps-2基因的KASP标记开发及应用 | |
| Bello et al. | Genetic Diversity Analysis of Selected Sugarcane (Saccharum spp. Hybrids) Varieties Using DArT-Seq Technology. | |
| CN117512203B (zh) | 一种与番木瓜果实宽度相关的分子标记、方法及应用 | |
| JP7176782B2 (ja) | カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法、カンキツ植物を製造する方法、及び判定キット | |
| CN117512202B (zh) | 一种与番木瓜果实腔室直径显著相关的snp分子标记、方法及应用 | |
| CN116334269B (zh) | 一种软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记及其特异性引物对m3 | |
| CN117144056B (zh) | 与番木瓜果实果糖积累相关的单倍型分子标记的应用 | |
| CN115838790B (zh) | 一种软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记及特异性引物对m4的应用 | |
| CN117604155A (zh) | 一种筛选高愈伤诱导率油棕种质资源的snp分子标记及应用 | |
| CN112980993B (zh) | 与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记及其应用 | |
| CN117165718B (zh) | 与番木瓜果肉果糖含量相关的snp分子标记的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |