CN117144055B - 调控番木瓜果实长度相关的单倍型分子标记的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供调控番木瓜果实长度相关的单倍型分子标记的应用，属于生物技术领域，具体的所述单倍型分子标记为Cpa03g018770:‑236分子标记或Cpa03g018770:‑767分子标记，其中Cpa03g018770:‑236分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第556bp处位点的多态性为T/C；Cpa03g018770:‑767分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第25bp处位点的多态性为C/A。利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其果实的相对长度，大大提高了番木瓜育种的选择效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767试剂盒开发及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
番木瓜（Carica papaya L.）又称木瓜、乳瓜、万寿果，番木瓜科番木瓜属植物番木瓜，以果实入药，为热带、亚热带常绿软木质大型多年生草本植物，常绿软木质小乔木。番木瓜富含17种以上氨基酸及钙、铁等，还含有木瓜蛋白酶、番木瓜碱等。
在传统分子育种中，农民或育种家主要通过选择优良性状的植株个体，通过杂交或回交的方式，将优良性状固定下来。随着分子生物学的发展，育种家已经意识到选择优异性状的本质是选择携带优异基因或基因型的个体。由于确定植株携带性状相关基因难度较大，育种家通过检测与目标基因连锁在一起的遗传标记，来检测植株是否携带优异基因或基因型，无需通过播种和田间性状调查即可预测植株表型性状趋势（标记辅助育种/分子标记育种）。第一代分子标记（RALP、AFLP等）由于各种问题和缺陷逐渐被淘汰，目前SSR和SNP分子标记是最常用的分子标记。SNP分子标记具有在个体基因组上分布广泛、数量较多，易于基因分型（SNP的二态性）、适于快速、规模化筛查等优势。随着测序技术的进步测序成本的不断降低，越来越多的作物通过测序技术进行SNP标记开发。目前还未有番木瓜果实长度相关的SNP分子标记被开发或报道出来。
果实长度为番木瓜果实品质优劣的一个鉴定指标，同时果用番木瓜（水果用）是番木瓜重要销售途径和育种方向，在果用番木瓜市场上消费者更偏爱果实大小可供一人食用（400-500g）的木瓜。因此在果用番木瓜育种中控制果实长度具有重要意义。而有关番木瓜果实长度方面的分子标记目前并未被开发或公开出来。
发明内容
针对上述问题，本发明提供调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767试剂盒开发及其应用，提早预期所选育番木瓜的果实长度，缩短育种期限，降低育种成本。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767，所述单倍型（SNP）分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记或Cpa03g018770:-767分子标记，其中Cpa03g018770:-236分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第556bp处位点的多态性为T/C；Cpa03g018770:-767分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第25bp处位点的多态性为C/A。
上述的SNP分子标记在鉴定番木瓜果实长度表型中的应用，当利用Cpa03g018770:-236分子标记进行鉴定时，若SNP分子标记的基因型为TT时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若SNP分子标记的基因型为CC，则待鉴定番木瓜果实长度为短；当利用Cpa03g018770:-767分子标记进行鉴定时，若SNP分子标记的基因型为CC时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若SNP分子标记的基因型为AA时，则待鉴定番木瓜果实长度为短。
上述SNP分子标记在番木瓜种质资源改良中的应用，所述种质资源改良的性状为果实长度。
上述的SNP分子标记在番木瓜果实长度早期预测中的应用。
上述的SNP分子标记在筛选长果实长度番木瓜中的应用。
引物对或含有所述引物对的试剂盒在鉴定长果实长度番木瓜中的应用，当SNP分子标记为单倍型分子标记(Cpa03g018770:-236,-767) 时，所述引物对的上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
进一步的，当SNP分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记时，扩增产物的第556位碱基，若基因型为TT时，则待鉴定番木瓜为长果实长度番木瓜；当SNP分子标记为Cpa03g018770:-767分子标记时，扩增产物的第25位碱基，若基因型为CC时，则待鉴定番木瓜为长果实长度番木瓜。
本发明的调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767试剂盒开发及其应用的有益效果为：
本发明首次开发获得了与番木瓜果实长度极显著相关的分子标记，利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其果实长度的长或短，大大提高了番木瓜育种的选择效率；本发明的SNP位点位置明确，不受环境影响，目的性更强，实际检测工作量小，效率更高，成本更低。
本发明用于检测与番木瓜果实长度相关的两个SNP分子标记的引物对，特异性强，能准确扩增得到含有本发明SNP分子标记位点的序列，利用该引物对制备试剂盒，可辅助选择育种，高效鉴定出番木瓜的果实长度的长或短；
本发明的调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767试剂盒开发及其应用，可高效的辅助番木瓜的育种选择，具有极高的经济价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明中与番木瓜果实长度极显著相关的两个SNP标记的曼哈顿图；
图2为本发明中与番木瓜果实长度极显著相关的两个SNP标记所在Chr03染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍型块图，其中区间内的箭头指向位点为本发明筛选的分子标记；
图3为本发明中与番木瓜果实长度极显著相关的SNP标记（Cpa03g018770:-236分子标记）不同基因型间的果实长度差异比较，T等位基因与长果实长度显著相关；
图4为本发明中与番木瓜果实长度极显著相关的SNP标记（Cpa03g018770:-767分子标记）不同基因型间的果实长度差异比较，C等位基因与长果实长度显著相关；
图5为本发明中与番木瓜果实长度极显著相关的单倍型分子标记（Cpa03g018770:-236,-767分子标记）不同基因型间的果实长度差异比较，T/C等位基因与长果实长度显著相关。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
(一)、番木瓜全基因组SNP标记开发
对从墨西哥、南非、中国广西、中国海南等地收集到的340份番木瓜，播种于中国热带农业科学院文昌基地，土壤肥力中等、无病虫害，多年多点种植并收集表型性状数据，表型性状数据经Excel2016整理后用于后续分析。
分别从各番木瓜植株上取新鲜幼嫩叶片1~2g，液氮研磨后按照选用天根植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）提取番木瓜材料DNA。利用超微量分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量和浓度，选择电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD260/OD280介于1.8~1.9，浓度大于> 100ng/μL的DNA样品进行建库测序。
采用超声波破碎（或酶切）的方法，将DNA随机打断成约300bp的片段，DNA片段经末端修复、3'端加A、加测序接头偶、纯化、PCR扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过illumina平台进行测序。测序数据下机后需要按一定的标准对原始数据（Raw reads）进行质控，过滤标准如下：（1）去除带接头（adapter）的序列，（2）去除单端序列含氮量>10%的一对序列，（3）去除低质量碱基数超过50%的一对序列。去除低质量序列、接头序列、不准确序列后的Clean reads进行下一步序列比对。参考基因组选择2022年新发布的木瓜sunup基因组（GenBank GCA_021527605.1）使用BWA-mem软件将Clean reads与参考基因组序列比对，使用samtools软件对比对结果排序，GATK4.0软件去除PCR重复序列后进行变异检测，以QD > 2.0，QUAL> 30.0，FS < 60.0，MQ > 40.0的硬标准过滤变异合集，保留具有统计学意义的变异位点数据集。按MAF(次等位基因频率)>= 0.05，miss(缺失率)<=0.2为标准再次过滤变异位点，获得高质量的变异位点合集。
（二）、调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记(Cpa03g018770:-236,-767)筛选与应用
全基因组关联分析（Genome wide association studies，GWAS）通过基因组中SNP位点上的基因型信息作为遗传标记，发现影响复杂性状的基因变异的新策略。GWAS最早被应用于人类疾病研究中，其在复杂数量性状的遗传基础解析上有重要的作用，对于挖掘真正的主效基因或关键变异位点有着绝对的优势。2010年至今，二代测序技术的推广和高通量分子标记的大量开发，全基因组关联分析的方法被大规模应用在作物复杂性状的研究中，在水稻、小麦、玉米、油菜和棉花中已经有了完备的使用方法和经验。结合表型性状数据进行全基因组关联分析，在3号染色体上筛选得到与番木瓜果实长度显著相关的SNP位点Cpa03g018770:-236（-log10(P)>=6 ）和Cpa03g018770:-767（-log10(P)>=6 ）。
本发明中番木瓜果实长度的测定方法具体为：340份木瓜种植后先依据品种表型特性选定代表株（具体的340份番木瓜中，每份种植若干株，然后从每份的若干株中主要是依据植株外部形态特征，挑选表型性状一致的植株中长势较好的一株作为代表株），在代表株上选择成熟果实，直接用游标卡尺测量果实宽度、果实长度。
图1为Cpa03g018770:-236分子标记和Cpa03g018770:-767分子标记经GWAS分析后得到的曼哈顿图，x轴为SNP标记在染色体上的位置，y轴为-log10(P)值，此值越大SNP位点与性状的相关性越高。此次筛选到的两个SNP标记位于图中箭头处。
当SNP分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记时，在340份材料中210份材料在此SNP位点携带T基因型，果实长度均值高于携带C基因型的25份材料果实长度均值，图3为340份材料中携带基因型及果实长度箱型图，其余的图中未示出的105株为杂合基因型，性状表现较差，不在分析范围内。SNP分子标记为Cpa03g018770:-767分子标记时，在340份材料中217份材料在此SNP位点携带C基因型，果实长度均值高于携带A基因型的23份材料果实长度均值，图4为340份材料中携带基因型及果实长度箱型图，其余的图中未示出的100株为杂合基因型，性状表现较差，不在分析范围内。单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767，在340份材料中210份材料在此单倍型位点携带T/C基因型，果实长度均值高于携带C/A基因型的20份材料果实长度均值，图5为340份材料中携带基因型及果实长度箱型图，其余的图中未示出的110株为杂合基因型，性状表现较差，不在分析范围内。
图2为本发明中与番木瓜果实长度极显著相关的两个SNP标记所在Chr03染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍型块图，其中区间内的箭头指向位点为本发明筛选的两个分子标记。
与番木瓜果实长度显著相关的SNP位点Cpa03g018770:-236携带两种基因型CC、TT，其中TT基因型与长果实长度相关；与番木瓜果实长度显著相关的SNP位点Cpa03g018770:-767携带两种基因型AA、CC，其中CC基因型与长果实长度相关。
对与番木瓜果实长度显著相关的SNP位点附近序列设计引物，以番木瓜品种总DNA作为模板，通过普通PCR反应，扩增获得目标片段后测序，检测番木瓜在该SNP位点携带的基因型。通过检测番木瓜品种在该SNP位点携带的哪种基因型，在不用种植等待植株开花结果的情况下，预测其果实长度长或短。
单倍型分子标记为(Cpa03g018770:-236,-767)，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
PCR扩增的反应体系均为：
2× Rapid Taq Master Mix 12.5μl、10μM 正向引物 1μl、10μM 反向引物 1μl、DNA模板 1μl、ddH2O 9.5μl。（Mix（扩增缓冲液）购于购自诺唯赞生物科技股份有限公司，引物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。）
PCR扩增的反应程序为95℃ 5min；95℃ 30s、60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃5min。（PCR反应后目标片段测序委托华大基因公司完成。）
当SNP分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记时，扩增产物的第556位碱基，若基因型为TT时，则待鉴定番木瓜为长果实长度番木瓜；当SNP分子标记为Cpa03g018770:-767分子标记时，扩增产物的第25位碱基，若基因型为CC时，则待鉴定番木瓜为长果实长度番木瓜。
为验证该SNP分子标记的实用性，在中国热带农业科学院生物技术所文昌基地番木瓜种植区随机挑选若干株番木瓜（不包括用于SNP标记开发的340份番木瓜），经测序后基因分型和番木瓜果实长度调查；测序所用引物及扩增反应体系等均与上述相同。测序结果如下表1-4所示。
表1、30株番木瓜在Cpa03g018770:-236不同基因型和果实长度（mm）
表2、30株番木瓜在Cpa03g018770:-236不同基因型和果实长度统计
由表1和表2可知本发明的SNP分子标记对果实长度的鉴定准确率较高，基因型鉴定为TT的果实实际长度一般比基因型为CC的果实长度长。
表3、30株番木瓜在Cpa03g018770:-767不同基因型和果实长度（mm）
表4、30株番木瓜在Cpa03g018770:-767不同基因型和果实长度统计
由表3和表4可知本发明的SNP分子标记对果实长度的鉴定准确率较高，基因型鉴定为CC的果实实际长度一般比基因型为AA的果实长度长。
表5、30株番木瓜在Cpa03g018770:-236,-767不同基因型和果实长度（mm）
表6、30株番木瓜在Cpa03g018770:-236,-767不同基因型和果实长度统计
表7、340株番木瓜在Cpa03g018770:-236，Cpa03g018770:-767， Cpa03g018770:-236,-767基因型、均值和中位数统计表
由表1-7可知本发明的单倍型SNP分子标记Cpa03g018770:-236,-767基因型TT/CC的平均果实长度为147.73cm，中位数为145.95，均分别高于单个SNP分子标记中长果基因型的平均果实长度与中位数。单倍型SNP分子标记Cpa03g018770:-236,-767中CC/AA基因型的平均果实长度为114.36cm，中位数为111.07，均低于单个SNP分子标记中短果基因型的平均果实长度与中位数。因此，单倍型SNP分子标记Cpa03g018770:-236,-767对番木瓜的果实长度鉴定准确率较高，且均高于单个SNP分子标记，TT/CC基因型的番木瓜果实长度普遍高于CC/AA基因型的番木瓜。
综上，本发明的单倍型SNP分子标记能够较准确对番木瓜果实长度进行预测，不仅快速有效，而且不用等待植株开花结果在苗期即可进行鉴定，大大缩短了育种的周期，对育种生产具有较大的指导意义，可以在生产中大规模应用。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (5)
1.检测调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767的试剂在鉴定番木瓜果实长度表型中的应用，其特征在于，单倍型分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记或Cpa03g018770:-767分子标记，其中Cpa03g018770:-236分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第556bp处位点的多态性为T/C；Cpa03g018770:-767分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第25bp处位点的多态性为C/A；
当利用Cpa03g018770:-236分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为TT时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为CC，则待鉴定番木瓜果实长度为短；当利用Cpa03g018770:-767分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为CC时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为AA时，则待鉴定番木瓜果实长度为短。
2.检测调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767的试剂在番木瓜种质资源改良中的应用，所述种质资源改良的性状为果实长度，所述种质资源改良是利用检测Cpa03g018770:-236分子标记的试剂进行鉴定，筛选番木瓜果实长度为长的番木瓜植株作为种质资源改良的基础进行育种；
所述单倍型分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记或Cpa03g018770:-767分子标记，其中Cpa03g018770:-236分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第556bp处位点的多态性为T/C；Cpa03g018770:-767分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第25bp处位点的多态性为C/A；
当利用Cpa03g018770:-236分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为TT时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为CC，则待鉴定番木瓜果实长度为短；当利用Cpa03g018770:-767分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为CC时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为AA时，则待鉴定番木瓜果实长度为短。
3.检测调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767的试剂在番木瓜果实长度早期预测中的应用，单倍型分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记或Cpa03g018770:-767分子标记，其中Cpa03g018770:-236分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第556bp处位点的多态性为T/C；Cpa03g018770:-767分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第25bp处位点的多态性为C/A；
当利用Cpa03g018770:-236分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为TT时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为CC，则待鉴定番木瓜果实长度为短；当利用Cpa03g018770:-767分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为CC时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为AA时，则待鉴定番木瓜果实长度为短。
4.检测调控番木瓜果实长度相关的基因启动子区单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767的试剂在筛选长果实长度番木瓜中的应用；单倍型分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记或Cpa03g018770:-767分子标记，其中Cpa03g018770:-236分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第556bp处位点的多态性为T/C；Cpa03g018770:-767分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列第25bp处位点的多态性为C/A；
当利用Cpa03g018770:-236分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为TT时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为CC，则待鉴定番木瓜果实长度为短；当利用Cpa03g018770:-767分子标记进行鉴定时，若单倍型分子标记的基因型为CC时，则待鉴定番木瓜果实长度为长，若单倍型分子标记的基因型为AA时，则待鉴定番木瓜果实长度为短。
5.引物对或含有所述引物对的试剂盒在鉴定长果实长度番木瓜中的应用，其特征在于，当单倍型分子标记为单倍型分子标记Cpa03g018770:-236,-767时，所述引物对的上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；当单倍型分子标记为Cpa03g018770:-236分子标记时，扩增产物的第556位碱基，若基因型为TT时，则待鉴定番木瓜为长果实长度番木瓜；当单倍型分子标记为Cpa03g018770:-767分子标记时，扩增产物的第25位碱基，若基因型为CC时，则待鉴定番木瓜为长果实长度番木瓜。
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