CN117144056B - 与番木瓜果实果糖积累相关的单倍型分子标记的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与番木瓜果实果糖积累相关的单倍型分子标记的应用，属于生物技术领域，具体的所述单倍型分子标记为Cpa02g023600:‑302,‑323；所述单倍型位点的基因型为AA/AA。利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用等待番木瓜植株果实成熟的情况下，准确高效的预测其果糖含量的高或低，提高了番木瓜育种材料的选择效率，同时也为高果糖番木瓜分子设计育种或者杂交育种提供优良的目标等位基因型。

Description

与番木瓜果实果糖积累相关的单倍型分子标记的应用

技术领域

本发明涉及一种番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

番木瓜（Carica papaya L.）又称木瓜、乳瓜、万寿果，番木瓜科番木瓜属植物，番木瓜以果实入药，为热带、亚热带常绿软木质大型多年生草本植物，常绿软木质小乔木。番木瓜果皮光滑美观，果肉厚实细致、香气浓郁、汁水丰多、甜美可口、营养丰富，有“百益之果”、“水果之皇”、“万寿瓜”之雅称，是岭南四大名果之一。番木瓜富含17种以上氨基酸及钙、铁等，还含有木瓜蛋白酶、番木瓜碱等。半个中等大小的木瓜足供成人整天所需的维生素C。番木爪的果实不仅可以作水果、蔬菜，还有多种药用价值。未成熟番木瓜的乳汁，可提取番木瓜素，是一种制造化妆品的上乘原料，具有美容增白的功效。番木瓜所含番木瓜碱具有抗肿瘤的作用，还具有抗菌和抗寄生虫的作用、降压等作用；所含木瓜蛋白酶，能帮助蛋白消化，可用于慢性消化不良及胃炎等，木瓜蛋白酶还具有抗凝作用等。

在传统分子育种中，农民或育种家主要通过选择优良性状的植株个体，通过杂交或回交的方式，将优良性状固定下来。随着分子生物学的发展，育种家已经意识到选择优异性状的本质是选择携带优异基因或基因型的个体。由于确定植株携带性状相关基因难度较大，育种家通过检测与目标基因连锁在一起的遗传标记，来检测植株是否携带优异基因或基因型，无需通过播种和田间性状调查即可预测植株表型性状趋势（标记辅助育种/分子标记育种）。第一代分子标记（RALP、AFLP等）由于各种问题和缺陷逐渐被淘汰，目前SSR和SNP分子标记是最常用的分子标记。SNP分子标记具有在个体基因组上分布广泛、数量较多，易于基因分型（SNP的二态性）、适于快速、规模化筛查等优势。随着测序技术的进步测序成本的不断降低，越来越多的作物通过测序技术进行SNP标记开发。

番木瓜果肉果糖含量高低为评价番木瓜品质优劣的一个重要指标，因而是育种家在繁育优良番木瓜植株所考虑的重要因素，目前针对这一指标的选育需等待植株开花结果后测定果实的果糖含量来进行筛选优良植株，选育时间长、选育成本较高。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600：-302,-323及其应用，提早预期所选育番木瓜的果糖含量，缩短育种期限，降低育种成本，提高选育的准确性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323，所述SNP分子标记为Cpa02g023600:-302或Cpa02g023600:-323；其中所述SNP分子标记Cpa02g023600:-302的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第423位碱基为第一个SNP位点，所述第一个SNP位点位于番木瓜基因组的第2号染色体第36650889核苷酸，所述第一个SNP位点的碱基为A或G；所述SNP分子标记Cpa02g023600:-323的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第402位碱基为第二个SNP位点，所述第二个SNP位点位于番木瓜基因组的第2号染色体第36650868核苷酸，所述第二个SNP位点的碱基为A或G。

进一步的，单倍型位点的基因型为AA/AA的番木瓜为高果糖含量，单倍型位点的基因型为GG/GG的番木瓜为低果糖含量。

上述的与番木瓜果糖含量相关的单倍型分子标记(Cpa02g023600:-302,-323)在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用，所述SNP分子标记用于鉴定番木瓜的高果糖含量和低果糖含量。

用于检测与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323的引物对，所述引物对的上游引物是根据番木瓜基因组的第2号染色体第36650868核苷酸上游的序列进行设计，下游引物是根据番木瓜基因组的第2号染色体第36650889核苷酸下游的序列进行设计；所述引物对由两条单链DNA组成，上游引物序列为5’- CGCTCAATCCAGAGTATTCTTGT-3’，如SEQ ID NO.2所示；下游引物序列为5’-GGTTTTGAGTTGTTACGTGGGT-3’，所示，如SEQ ID NO.3所示。

上述的用于检测与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323的引物对在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用，所述引物对用于鉴定番木瓜的高果糖含量和低果糖含量。

用于鉴定番木瓜果肉果糖含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。

本发明的与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323及其应用的有益效果为：

本发明获得了与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的两个分子标记，利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其果糖含量的高或低，大大提高了番木瓜育种的选择效率；

本发明用于检测与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323的引物对，特异性强，能准确扩增得到含有本发明SNP分子标记位点的序列，利用该引物对制备试剂盒，可辅助选择育种，高效鉴定出番木瓜的高果糖含量和低果糖含量；

本发明的与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323及其应用，可高效的辅助番木瓜的育种选择，具有极高的经济价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的两个SNP标记的曼哈顿图；

图2为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的两个SNP标记所在Chr02染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍型块图，其中区间内的箭头指向位点为本发明筛选的分子标记；

图3为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP标记（Cpa02g023600:-302分子标记）不同基因型间的果糖含量差异比较，A等位基因与高果糖含量显著相关；

图4为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP标记（Cpa02g023600:-323分子标记）不同基因型间的果糖含量差异比较，A等位基因与高果糖含量显著相关。

图5为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的单倍型SNP标记（Cpa02g023600:-302，-323分子标记）不同组合基因型间的果糖含量差异比较，A/A等位基因与高果糖含量显著相关。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

(一)、番木瓜全基因组SNP标记开发

对从墨西哥、南非、中国广西、中国海南等地收集到的340份番木瓜，播种于中国热带农业科学院文昌基地，土壤肥力中等、无病虫害，多年多点种植并收集表型性状数据，表型性状数据经Excel2016整理后用于后续分析。

分别从各番木瓜植株上取新鲜幼嫩叶片1~2g，液氮研磨后按照选用天根植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）提取番木瓜材料DNA。利用超微量分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量和浓度，选择电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD260/OD280介于1.8~1.9，浓度大于> 100ng/μL的DNA样品进行建库测序。

采用超声波破碎（或酶切）的方法，将DNA随机打断成约300bp的片段，DNA片段经末端修复、3'端加A、加测序接头偶、纯化、PCR扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过illumina平台进行测序。测序数据下机后需要按一定的标准对原始数据（Raw reads）进行质控，过滤标准如下：（1）去除带接头（adapter）的序列，（2）去除单端序列含氮量>10%的一对序列，（3）去除低质量碱基数超过50%的一对序列。去除低质量序列、接头序列、不准确序列后的Clean reads进行下一步序列比对。参考基因组选择2022年新发布的木瓜sunup基因组（GenBank GCA_021527605.1），使用BWA-mem软件将Clean reads与参考基因组序列比对，使用samtools软件对比对结果排序，GATK4.0软件去除PCR重复序列后进行变异检测，以QD > 2.0，QUAL> 30.0，FS < 60.0，MQ > 40.0的硬标准过滤变异合集，保留具有统计学意义的变异位点数据集。按MAF(次等位基因频率)>= 0.05，miss(缺失率)<=0.2为标准再次过滤变异位点，获得高质量的变异位点合集。

（二）、与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323筛选与应用

全基因组关联分析（Genome wide association studies，GWAS）通过基因组中SNP位点上的基因型信息作为遗传标记，发现影响复杂性状的基因变异的新策略。GWAS最早被应用于人类疾病研究中，其在复杂数量性状的遗传基础解析上有重要的作用，对于挖掘真正的主效基因或关键变异位点有着绝对的优势。2010年至今，二代测序技术的推广和高通量分子标记的大量开发，全基因组关联分析的方法被大规模应用在作物复杂性状的研究中，在水稻、小麦、玉米、油菜和棉花中已经有了完备的使用方法和经验。结合表型性状数据进行全基因组关联分析，在2号染色体上筛选得到与番木瓜果肉果糖含量显著相关的SNP位点Cpa02g023600:-302（-log₁₀(P)>=6 ）和Cpa02g023600:-323（-log₁₀(P)>=6 ）。

本发明中果肉果糖含量的测定方法为：340份番木瓜品种种植后，依据品种表型特性选定代表株（一般是340份番木瓜每份种植若干株，从每份的若干株中依据植株外部形态特征，选择表型性状一致的植株中长势较好的一株作为代表株），在代表株上选择成熟果实，取5-10g果肉样品，液氮冷冻后送至中国热带农业科学院品种测试中心，采用试剂盒检测法测定番木瓜品种果肉中果糖含量，试剂盒具体采用上海茁彩生物科技有限公司生产的货号为：ZC-S0693的试剂盒，试剂盒说明书如下：

Ⅰ试剂盒说明

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

果糖是一种最为常见的己酮糖，是葡萄糖的同分异构体，以游离状态大量存在于水果的浆汁和蜂蜜中，能与葡萄糖结合生成蔗糖。果糖是最甜的单糖，广泛应用于食品、医药、保健品生产中。

果糖（fructose ，FT）含量试剂盒说明书测定原理：

在酸性条件下果糖与间苯二酚反应，生成有色物质，在 480nm 下有特征吸收峰。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100ml×1 瓶，4℃保存；

试剂一：5mg/mL 标准液 1mL×1 支，4℃保存；

试剂二：液体 40ml×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 10ml×1 瓶， 4℃保存；

试剂四：粉剂 0.5g×1 瓶，常温保存。

Ⅱ操作步骤

①果糖提取：

称取 0.1g 样本，常温研碎；加入 1mL 提取液，适当研磨后快速转移到有盖离心管中；置于 80℃水浴锅中 10min（盖紧，以防止水分散失），振荡 3~5 次，冷却后，4000g，常温离心 10min，取上清；加入少量（约 2mg）试剂四，80℃脱色 30min（盖紧，以防止水分散失）；再加入 1mL 提取液，4000g，常温离心 10min，取上清液测定。

②测定操作试剂用量：

1、可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 480nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂）：

试剂（μL） 空白管 标准管 测定管

样本 100

试剂一 100

蒸馏水 100

试剂二 700 700 700

试剂三 200 200 200

混匀，80℃水浴反应 10min（盖紧，以防止水分散失），冷却后测定 480nm 处光吸收值，计为A空白管、A标准管、A测定管，并计算△A测定=A测定管-A空白管、△A标准=A标准管-A空白管。

果糖含量计算：1、按蛋白浓度的计算

果糖含量（mg/mg prot）=C标 × △A测定 ÷ △A标准× V样总÷（Cpr × V样总）=5 ×△A测定÷ △A标准÷Cpr

2、按样本鲜重计算

果糖含量（mg/g 鲜重）= C标 × △A测定÷ △A标准× V样总÷W=10× △A测定÷ △A标准÷W

C标:标准品浓度，5mg/mL；W：样品鲜重，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样总：提取液体积，2mL。

注：如果测定管的OD 值大于0.6，请用提取液稀释样品。

图1为上述两个位点经GWAS分析后得到的曼哈顿图，x轴为SNP标记在染色体上的位置，y轴为-log₁₀(P)值，此值越大SNP位点与性状的相关性越高。此次筛选到的SNP标记位于图中箭头处。

图2为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP标记（Cpa02g023600:-302和Cpa02g023600:-323）所在Chr02染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍型块图，其中区间内的箭头指向位点为本发明筛选的分子标记；

Cpa02g023600:-302分子标记，在340份材料中19份材料在此SNP位点携带G基因型，果糖含量均值低于携带A基因型的235份材料果糖含量均值，图3为340份材料中携带基因型及果糖含量箱型图。

Cpa02g023600:-323分子标记，在340份材料中23份材料在此SNP位点携带G基因型，果糖含量均值低于携带A基因型的226份材料果糖含量均值，图4为340份材料中携带基因型及果糖含量箱型图。

单倍型Cpa02g023600:-302，-323分子标记，在340份材料中19份材料在此单倍型位点携带G基因型，果糖含量均值低于在此单倍型位点携带A基因型的217份材料果糖含量均值，图5为340份材料中携带基因型及果糖含量箱型图。

图3、图4和图5中未示出的剩余样品在上述位点上均为杂合，有一部分是A/G，还有极少数突变为其他碱基，突变为其它碱基的其果糖含量或低于GG，或介于AA和GG之间。

与番木瓜果肉果糖含量显著相关的SNP位点Cpa02g023600:-302和Cpa02g023600:-323均携带两种基因型A/G，其中A基因型与高果糖含量相关。单倍型SNP位点Cpa02g023600:-302,-323携带两种基因型AA/GG，其中AA基因型与高果糖含量相关。

对与番木瓜果肉果糖含量显著相关的SNP位点附近序列设计引物，以番木瓜品种总DNA作为模板，通过普通PCR反应，扩增获得目标片段后测序，检测番木瓜在两个SNP位点携带的基因型。通过检测番木瓜品种在两个SNP位点携带的哪种基因型（AA或者GG），在不用种植等待植株开花结果的情况下，预测其果糖含量高或者低。

单倍型分子标记(Cpa02g023600:-302,-323)，所述引物对的上游引物是根据番木瓜基因组的第2号染色体第36650868上游的序列进行设计，下游引物是根据番木瓜基因组的第2号染色体第36650889核苷酸下游的序列进行设计；所述引物对由两条单链DNA组成，上游引物为5’- CGCTCAATCCAGAGTATTCTTGT-3’，如SEQ ID NO.2所示；下游引物为5’-GGTTTTGAGTTGTTACGTGGGT-3’，所示，如SEQ ID NO.3所示。

PCR扩增的反应体系均为：

2× Rapid Taq Master Mix 12.5μl、10μM 正向引物 1μl、10μM 反向引物 1μl、DNA模板 1μl、ddH2O 9.5μl。（Mix（扩增缓冲液）购于购自诺唯赞生物科技股份有限公司，引物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。）

PCR扩增的反应程序均为95℃ 5min；95℃ 30s、60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。（PCR反应后目标片段测序委托华大基因公司完成。）

所述单倍型分子标记(Cpa02g023600:-302,-323)引物扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第423位碱基为SNP位点，所述SNP位点位于番木瓜基因组的第2号染色体第36650889核苷酸，为分子标记Cpa02g023600:-302，所述SNP位点为A或G；SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第402位碱基为SNP位点，为分子标记Cpa02g023600:-323，所述SNP位点位于番木瓜基因组的第2号染色体第36650868核苷酸，所述SNP位点为A或G。

为验证该SNP分子标记的实用性，在中国热带农业科学院生物技术所文昌基地番木瓜种植区随机挑选若干株番木瓜（不包括用于SNP标记开发的340份番木瓜），经测序后基因分型和番木瓜果肉果糖含量调查；测序所用引物及扩增反应体系等均与上述相同。测序结果如下表1-4所示。

表1. 30株番木瓜在Cpa02g023600:-302不同基因型和果糖含量（mg/g）

表2. 30株番木瓜在Cpa02g023600:-302不同基因型和果糖含量（mg/g）

由表1和表2可知本发明的SNP分子标记对高果糖含量和低果糖含量番木瓜的鉴定准确率较高，AA基因型的番木瓜果肉果糖含量普遍高于GG基因型的番木瓜。

表3. 30株番木瓜在Cpa02g023600:-323不同基因型和果糖含量（mg/g）

表4. 30株番木瓜在Cpa02g023600:-323基因型和果糖含量统计表

表5. 30株番木瓜在单倍型位点Cpa02g023600:-302,-323基因型和果糖含量统计表

表6. 30株番木瓜单倍型Cpa02g023600:-302,-323基因型和果糖含量统计表

表7. 340株番木瓜在Cpa02g023600:-302,Cpa02g023600:-323,单倍型Cpa02g023600:-302,-323基因型、均值和中位数统计表

由表7可知本发明的单倍型SNP分子标记Cpa02g023600:-302,-323基因型AA/AA的果糖含量均值为7.33，高于分子标记Cpa02g023600:-302中高果糖含量基因型AA的果糖含量，中位数为7.28，均高于单个SNP分子标记中高果糖含量基因型的中位数。单倍型SNP分子标记Cpa02g023600:-302,-323基因型GG/GG的果糖含量均值为5.76，中位数为5.66，均低于分子标记Cpa02g023600:-302中低蔗糖含量的基因型GG的平均蔗糖含量和中位数。因此，单倍型SNP分子标记Cpa02g023600:-302,-323对番木瓜的鉴定准确率较高，且均高于单个SNP分子标记，AA/AA基因型的番木瓜果肉果糖含量普遍高于GG/GG基因型的番木瓜。

综上，本发明的单倍型SNP分子标记能够准确对番木瓜果肉果糖含量进行较精确预期，不仅快速有效，而且不用等待植株开花结果在苗期即可进行鉴定，大大缩短了育种的周期，可以在生产中大规模应用。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (4)

1.检测与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323的试剂在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，所述单倍型分子标记为Cpa02g023600:-302,-323；其中单倍型中第一个SNP分子标记Cpa02g023600:-302的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第423位碱基为第一个SNP位点，所述第一个SNP位点的碱基为A或G；单倍型中第二个SNP分子标记Cpa02g023600:-323的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第402位碱基为第二个SNP位点，所述第二个SNP位点的碱基为A或G；

单倍型位点的基因型为AA/AA的番木瓜为高果糖含量，单倍型位点的碱基为GG/GG的番木瓜为低果糖含量。

2.检测与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323的试剂在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，所述单倍型分子标记用于鉴定番木瓜的高果糖含量和低果糖含量；

所述单倍型分子标记为Cpa02g023600:-302,-323；其中单倍型中第一个SNP分子标记Cpa02g023600:-302的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第423位碱基为第一个SNP位点，所述第一个SNP位点的碱基为A或G；单倍型中第二个SNP分子标记Cpa02g023600:-323的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第402位碱基为第二个SNP位点，所述第二个SNP位点的碱基为A或G；

单倍型位点的基因型为AA/AA的番木瓜为高果糖含量，单倍型位点的碱基为GG/GG的番木瓜为低果糖含量。

3.用于检测与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323的引物对在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用，引物对的上游引物序列为5’- CGCTCAATCCAGAGTATTCTTGT-3’，如SEQ ID NO.2所示；引物对的下游引物序列为5’-GGTTTTGAGTTGTTACGTGGGT-3’,如SEQ ID NO.3所示；所述引物对用于鉴定番木瓜的高果糖含量和低果糖含量；

所述单倍型分子标记为Cpa02g023600:-302,-323；其中单倍型中第一个SNP分子标记Cpa02g023600:-302的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第423位碱基为第一个SNP位点，所述第一个SNP位点的碱基为A或G；单倍型中第二个SNP分子标记Cpa02g023600:-323的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第402位碱基为第二个SNP位点，所述第二个SNP位点的碱基为A或G；

单倍型位点的基因型为AA/AA的番木瓜为高果糖含量，单倍型位点的碱基为GG/GG的番木瓜为低果糖含量。

4.用于检测与番木瓜果实果糖积累相关的启动子单倍型分子标记Cpa02g023600:-302,-323的试剂盒在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物对；

所述单倍型分子标记为Cpa02g023600:-302,-323；其中单倍型中第一个SNP分子标记Cpa02g023600:-302的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第423位碱基为第一个SNP位点，所述第一个SNP位点的碱基为A或G；单倍型中第二个SNP分子标记Cpa02g023600:-323的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第402位碱基为第二个SNP位点，所述第二个SNP位点的碱基为A或G；

单倍型位点的基因型为AA/AA的番木瓜为高果糖含量，单倍型位点的碱基为GG/GG的番木瓜为低果糖含量。