CN111235305B - 一组玉米植株铅转运系数相关snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记及其应用。本发明提出一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记,共有3个SNP标记,包括SNP‑8‑175618522(C/T)、SNP‑8‑175621419(C/T)、SNP‑8‑175621684(A/T)。本发明的分子标记可以用于玉米分子标记辅助育种,缩短选育时间,创制培育标记单倍型类型非TCA类型的品种,可以有效降低重金属污染情况下铅离子由根部向地上部分的转运。本发明为创制培育低转运铅的玉米品种提供理论及试验基础。
Description
技术领域
本发明涉及一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记及其应用,属于分子遗传标记技术领域。
背景技术
玉米是全世界重要的粮食作物和能源作物,在世界范围内广泛种植。随着经济的发展,工业生产日益强盛,带来的环境污染也由此进入科学家的视野。与农业生产生产息息相关的土壤污染问题不得不进行重视。中国虽然是全世界玉米第二大生产国,但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和适应性广的优质玉米种质资源。铅、汞、钨、铝等是对植物有害的金属元素。当前土壤受重金属污染日益严重,其中铅污染具有危害大、隐蔽性高等特点。
研究和生产实践表明,玉米植株铅转运相关性状是一个复杂的数量性状。玉米植株铅转运系数为重金属铅胁迫下植株地上部分与根系铅含量的比值。转运系数高的自交系品种在富集一定量的重金属铅后会向地上部分组织如茎干、叶片、果实进行转移。研究发现玉米地上部分组织铅含量与铅转运系数密切相关,在不同玉米自交系间存在显著的基因型差异。在重金属铅胁迫处理下,铅在玉米幼苗根系中的含量随时间推移而逐渐积累并转移到地上部分。玉米铅转运机理复杂,目前研究进度缓慢,对育种实践具有较高利用价值的关键基因挖掘工作仍然很少。
全基因组关联分析(GWAS)是一种在自然群体中基于连锁不平衡(LD)鉴定表型性状与遗传标记之间关系的分析方法,是挖掘优良等位基因的有效途径。目前随着基因测序技术、生物信息学的高速发展,全基因组关联分析成为挖掘和剖析铅胁迫下玉米植株铅转运相关基因及其遗传基础的最有效的方法之一。通过在全基因组水平上挖掘玉米重金属铅转运系数相关基因、开发相应分子标记等可加快玉米抗、耐重金属的研究。为创制低转运,抗重金属铅的玉米新品种提供理论支撑。
数量性状转录本是一种基于基因表达量与表型之间的关系,通过有效的数学模型挖掘与表型相关的表达基因的方法。目前随着二代测序日益普及,高通量数据日益普遍,结合GWAS与表达数量性状一起构成了一个闭环,在检测可靠候选基因的方法中不可或缺。在基因表达水平上为挖掘玉米重金属铅转运系数相关基因提供了一条可靠途径。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足,提供一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记及其应用。本发明提出一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记,可以用于筛选或培育玉米铅低转运品种。
一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记,所述SNP标记包含:第一SNP标记、第二SNP标记、第三SNP标记;
所述的第一SNP标记为SNP-8-175618522,位于玉米基因组8号染色体175618522bp处,变异类型为C/T;
所述第二SNP标记为SNP-8-175621419,位于玉米基因组8号染色体175621419bp处,变异类型为C/T;
所述第三SNP标记为SNP-8-175621684,位于玉米基因组8号染色体175621684bp处,变异类型为A/T。
本发明还保护用于扩增上述SNP分子标记的特异性PCR引物对,序列如下所示:
标记SNP-8-175621419引物对序列为:
上游(F1):5’-AAGCAAGTTGGGTCTGGAGA-3’(SEQ ID NO.1)
下游(R1):5’-GTGGGGAAGAGGAAAGAGCT-3’(SEQ ID NO.2)
分子标记SNP-8-175621419的特征引物对:
上游(F2):5’-ACGTAGGCAGGGAATCACTC-3’(SEQ ID NO.3)
下游(R2):5’-AGTGTCCATGGAAGTGCAGA-3’(SEQ ID NO.4)
分子标记SNP-8-175621684的特征引物对:
上游(F3):5’-CAAAGGACTGCTATTGTGGGG-3’(SEQ ID NO.5)
下游(R3):5’-GCACGTTCATTGGCAGCTAT-3’(SEQ ID NO.6)。
一种检测上述SNP分子标记的试剂盒,包含上述特异性PCR引物对。
上述SNP分子标记、引物对或试剂盒在鉴定玉米植株铅转运系数水平方面的应用。
上述SNP分子标记、引物对或试剂盒在选育或培育玉米耐铅植株方面的应用。
一种鉴定玉米植株铅转运系数水平的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测玉米植株的基因组DNA;
(2)利用上述的引物对将步骤(1)获得的待测玉米植株的基因组DNA进行PCR扩增,以便获得PCR扩增产物;
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序,获得测序结果;
(4)根据步骤(3)获得的测序结果,确定待测玉米植株的所述一组SNP标记中的第一SNP标记的基因型、第二SNP标记的基因型、第三SNP标记的基因型,鉴定出所测玉米植株的铅转运系数水平。
进一步的,上述步骤(2)中所述的PCR扩增的程序为:94℃预变性2min;98℃变性10s;59℃退火30s;68℃延伸6s;共35个循环;68℃再延伸10min。
进一步的,上述步骤(4)当所述的第一SNP标记的基因型为T,第二SNP标记的基因型为C,且第三SNP标记的基因型为A时,玉米植株铅转运系数显著高于其他类型的自交系材料。
有益效果:
(1)本发明提供了重金属铅胁迫下,玉米植株铅转运系数相关基因Zm00001d012509的分子标记开发及其应用。该基因及其启动子区域内共有3个SNP标记,包括SNP-8-175618522(C/T)、SNP-8-175621419(C/T)、SNP-8-175621684(A/T),它们与植株铅转运系数显著相关。
(2)单倍型为CTT的玉米自交系铅转运系数显著低于单倍型为TCA的玉米自交系。本发明的分子标记可以用于玉米分子标记辅助育种,缩短选育时间,创制培育标记单倍型类型为CTT类型的品种,可以有效降低重金属污染情况下铅离子由根部向地上部分的转运。本发明为创制培育低转运铅的玉米品种提供理论及试验基础。
附图说明
图1:不同单倍型玉米自交系植株铅转运系数。
图2:10份玉米自交系材料PCR扩增SNP位点的测序结果。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面结合实施例对本发明作进一步说明,所描述的实施例仅是本申请一部分实施例,而不是全部,本发明不受下述实施例的限制。
实施例1:与铅积累性状相关基因Zm00001d012509分子标记的获得。
获得方法如下:
1)关联群体表型鉴定:本发明收集了中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系305份,在水培条件下一定浓度铅离子胁迫处理幼苗之后,使用电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)测定植株根系及地上部分铅含量,并计算铅转运系数(TC),设置3次生物学重复。联合方差分析表明不同材料间基因型差异显著,表1。
表1:表型联合方差分析
2)关联群体基因型的获取:使用二代高通量测序获得该群体的基因型。
3)基因型与表型关联分析:运用R语言中Gapit包来进行全基因组关联分析,使用MLM模型考虑群体结构及亲缘关系进行关联分析,最小等位基因频率设置为0.05,在P<1e-5的阈值水平下,判定分子标记与表型关联的显著性。结果检测到分子标记SNP-8-175618522与重金属铅胁迫下玉米植株铅转运系数显著相关。其位置位于玉米8号染色体,物理位置为175618522bp处,其等位基因突变类型为C/T,显著P<4.0e-6,位于候选基因Zm00001d012509上游的349bp处。
4)基于该标记的连锁不平衡区域分析,在LD区段内存在一个与铅转运相关的候选基因Zm00001d012509。
5)候选基因分析:在铅转运相关的候选基因Zm00001d012509区域及其启动子区域内,基于候选基因关联分析,使用Tassel软件GLM模型,在0.05阈值的检测水平下,共筛选到了3个与植株铅转运系数相关的分子标记,分别为SNP-8-175618522、SNP-8-175621419、SNP-8-175621684。分子标记信息如表2:
表2:三个与植株铅转运系数相关的分子标记信息
筛选到的分子标记相应的侧翼序列为:
分子标记SNP-8-175618522的侧翼序列为:
TGTGTGCAATGATTC[C/T]CTCAGCTTATGGCGC
分子标记SNP-8-175621419的侧翼序列为:
CTCTTACAGTTTCTT[C/T]TCCAGTCTTGGATTG
分子标记SNP-8-175621684的侧翼序列为:
GTCTAATATCAAAGG[A/T]CTGCTATTGTGGGGG
筛选到所述显著关联的分子标记后,基于该位点侧翼序列,本发明人设计了包含上述变异位点的特征引物对,序列如下:
分子标记SNP-8-175618522的特征引物对:
上游(F1):5’-AAGCAAGTTGGGTCTGGAGA-3’(SEQ ID NO.1)
下游(R1):5’-GTGGGGAAGAGGAAAGAGCT-3’(SEQ ID NO.2)
分子标记SNP-8-175621419的特征引物对:
上游(F2):5’-ACGTAGGCAGGGAATCACTC-3’(SEQ ID NO.3)
下游(R2):5’-AGTGTCCATGGAAGTGCAGA-3’(SEQ ID NO.4)
分子标记SNP-8-175621684的特征引物对:
上游(F3):5’-CAAAGGACTGCTATTGTGGGG-3’(SEQ ID NO.5)
下游(R3):5’-GCACGTTCATTGGCAGCTAT-3’(SEQ ID NO.6)
实施例2:基因表达量与表型关联分析
1)基因表达量的获取:使用开源软件Kallisto对群体材料的基因及转录本进行表达定量。
2)基因表达量与表型关联分析:运用R语言,线性回归模型,鉴定基因表达量与表型关联程度。在p<0.05水平下,Zm00001d012509基因的表达量与胁迫下玉米地上部分铅含量显著相关,显著P值为0.023。结果进一步证实了该基因的表达与玉米植株铅转运系数相关。
实施例3:基于标记类型的方差分析
1)表型分组:基于该组标记在不同自交系中的基因型,将试验材料分为五组,表型铅转运系数统计如表3。
表3:不同单倍型材料铅转运系数统计
2)方差分析:使用SPSS25软件对不同单倍型材料分组进行了方差分析,结果显示单倍型为TCA的自交系显著高于其他四组,表4,表5。
表4:不同基因型材料方差分析
表5:不同单倍型之间差异比较
实施例4:本发明的分子标记在鉴定玉米铅转运系数中的应用
(1)序列扩增:在自然群体中挑选了5份铅高转运系数材料及5份铅转运系数材料,以其基因组DNA为模板,利用SNP分子标记位点侧翼序列设计特异性引物,引物序列如SEQID NO.1-6所示,采用KOD FX Neo高保真聚合酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司)进行PCR扩增,程序为:94℃预变性2min;98℃变性10s;59℃退火30s;68℃延伸6s;共35个循环;68℃再延伸10min。
(2)序列鉴定:将特异性的目的条带用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek)回收纯化,连接平末端克隆载体Peasy-Blunt Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)测序。
(3)序列分析:利用SnapGene3.2.1软件对测序结果进行比对(见图2)。结果显示该SNP位点成功于挑选的10份玉米待鉴定材料进行基因分型,其中5份铅离子转运系数高的的玉米材料中有4份自交系单倍型为TCA,既在第一SNP位点处的基因型为T,在第二SNP位点处的基因型为C,在第三SNP位点处的基因型为A。另外5份铅离子转运系数较低的材料中,有3份自交系材料的单倍型为CTT,既在第一SNP位点处的基因型为C,在第二SNP位点处的基因型为T,在第三SNP位点处的基因型为T,表6,图2。
表6:植株铅转运系数
SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> 一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记及其应用
<130> 2020
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagcaagttg ggtctggaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtggggaaga ggaaagagct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgtaggcag ggaatcactc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agtgtccatg gaagtgcaga 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaaggactg ctattgtggg g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcacgttcat tggcagctat 20
Claims (7)
1.一组玉米植株铅转运系数相关SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记包含:第一SNP标记、第二SNP标记、第三SNP标记;
所述的第一SNP标记为SNP-8-175618522,位于玉米基因组8号染色体175618522bp处,变异类型为C/T;
所述第二SNP标记为SNP-8-175621419,位于玉米基因组8号染色体175621419bp处,变异类型为C/T;
所述第三SNP标记为SNP-8-175621684,位于玉米基因组8号染色体175621684bp处,变异类型为A/T。
2.一组用于扩增如权利要求1所述的SNP分子标记的特异性PCR引物对,其特征在于,序列如下所示:
标记SNP-8-175618522引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示;
标记SNP-8-175621419引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示;
标记SNP-8-175621684引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。
3.一种检测如权利要求1-2任一项所述的SNP分子标记的试剂盒,包含如权利要求2所述的特异性PCR引物对。
4.如权利要求1所述的SNP分子标记、如权利要求2所述的引物对或如权利要求3所述的试剂盒在鉴定玉米植株铅转运系数水平方面的应用。
5.如权利要求1所述的SNP分子标记、如权利要求2所述的引物对或如权利要求3所述的试剂盒在选育或培育玉米耐铅植株方面的应用。
6.一种鉴定玉米植株铅转运系数水平的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取待测玉米植株的基因组DNA;
(2)利用如权利要求2所述的引物对将步骤(1)获得的待测玉米植株的基因组DNA进行PCR扩增,以便获得PCR扩增产物;
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序,获得测序结果;
(4)根据步骤(3)获得的测序结果,确定待测玉米植株的第一SNP标记的基因型、第二SNP标记的基因型、第三SNP标记的基因型,鉴定出所测玉米植株的铅转运系数水平。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的PCR扩增的程序为:94℃预变性2min;98℃变性10s;59℃退火30s;68℃延伸6s;共35个循环;68℃再延伸10min。
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