CN108285928B - 玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的InDel分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的InDel分子标记及应用，位于玉米基因组Chr4:199959398bp，等位基因为5bp插入/缺失，该InDel分子标记与玉米穗行数显著相关，等位基因为5bp的插入/缺失，在供试自交系中有插入/缺失两种纯合基因型，所述5bp的序列如SEQ ID NO.1所示，其位点侧翼序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的分子标记可用于玉米辅助育种，对加快玉米的高产育种进程具有重要意义。

Description

玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的InDel分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及与玉米穗行数性状相关的分子标记，具体涉及玉米第4号染色体上GRMZM2G098557基因的InDel分子标记及应用。

背景技术

玉米是我国目前第一大粮食作物，也是重要的工业原料和能源作物。持续提高玉米产量是确保我国粮食安全、经济快速发展的重要保障。随着我国耕地面积不断减少，通过提高玉米单产从而提升玉米产量是目前生产上最有效的途径。玉米单产量主要由穗行数、行粒数和百粒重决定，因此提高玉米穗行数是提高玉米单产的主要途径之一。

研究和生产实践表明，穗行数是玉米重要的产量构成因素，与玉米产量呈显著正相关。在玉米的驯化和遗传改良过程中，穗行数受到强烈的选择。作为重要的数量性状，穗行数受到微效多基因位点的控制，同时穗行数的发育是玉米花序发育的重要环节，受花序发育相关基因的调控。在玉米产量的三个主要构成因子中，不同品种的行粒数和百粒重受外界环境条件的影响较大，而由于穗行数是在雌穗分化过程中决定的，因此，其遗传力较高且受外界环境条件影响较小，对保证玉米产量具有重要作用。尽管在玉米穗行数基因挖掘方面已取得了一些进展，但整体上仍相对缓慢，且目前已克隆的玉米穗行数相关基因大多来自突变体研究，而利用图位克隆方法获得、对育种实践具有较高利用价值的关键基因挖掘工作仍然很少。

全基因组关联分析(GWAS)是一种在自然群体中基于连锁不平衡(LD)鉴定表型性状与遗传标记之间关系的分析方法，是挖掘优良等位基因的有效途径。目前随着基因测序技术、生物信息学的高速发展，全基因组关联分析成为挖掘和剖析玉米穗行数性状相关基因及其遗传基础的最有效的方法之一。玉米遗传学家在全基因组水平上挖掘玉米穗行数相关基因、开发功能标记、加快高产玉米的定向遗传改良。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供与玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557的InDel分子标记，该InDel标记与玉米穗行数显著相关。

本发明的第二个目的是提供所述InDel分子标记的引物对。

本发明的第三个目的是提供所述InDel分子标记的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：收集了中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系310份，作为本研究的关联群体，结合该关联群体的穗行数表行数据和InDel基因型数据，运用R语言中FarmCPU包来进行全基因组关联分析，结果发现，其位于玉米基因组Chr4:199959398bp(基因组版本为Maize B73RefGen_v3)的InDel分子标记与玉米穗行数显著相关，等位基因为5bp的插入/缺失，在供试自交系中有插入/缺失两种纯合基因型，所述5bp的序列如SEQ ID NO.1所示，其位点侧翼序列如SEQ ID NO.2所示。

该InDel分子标记与玉米穗行数显著相关，等位基因为5bp插入的玉米自交系材料的穗行数均高于等位基因为5bp缺失的玉米自交系材料。

筛选到所述显著关联的InDel后，基于该位点侧翼序列，发明人设计了包含上述InDel位点的检测玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的特征引物对。

上游(F)：5’-CCCATACGCAAGCCTCCTTT-3’(SEQ ID NO.3)

下游(R)：5’-ACCGAAGGTGGATGAGCTTG-3’(SEQ ID NO.4)

本发明还提供了所述InDel分子标记、引物对在鉴定玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557中的应用，在玉米高产改良中的应用。

本发明提供了一种检测玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557的方法，用上述引物对进行PCR扩增待检测玉米基因组DNA，用上述的引物对，PCR扩增待检测玉米材料基因组DNA，如果可以扩增出其位点侧翼序列SEQ ID NO.2所示片段，则说明该待检测玉米材料中存在玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557。

PCR程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。

发明人利用已构建的玉米IBM Syn 10DH(B73×Mo17)群体的240个家系为连锁群体，结合bin marker基因型数据和玉米穗行数的表型数据，进行QTL定位。结果发现上述InDel分子标记位于QTL定位的区段内，进一步验证了上述InDel分子标记与玉米穗行数性状的重要性。

为进一步验证所开发标记的有效性，发明人挑选连锁群体中的16份家系的DNA为模板，利用上述PCR扩增程序及引物对进行扩增并测序，对该位点进行验证，结果显示该InDel分子标记成功在16份玉米自交系进行多态性检测。

本发明利用全基因组关联分析和QTL定位相结合的策略，解释了该基因与玉米穗行数性状之间的内在联系，发觉其中显著地功能InDel位点，并作为遗传标记应用于分子育种，对加快玉米的高产育种进程具有重要意义。

本发明的有益效果在于：结合全基因组关联分析和QTL定位策略，快速精确地检测到与特定性状显著关联的InDel位点。玉米第4号染色体199959398bp位置的一个InDel位点(Maize B73RefGen_v3:Chr4:199959398)与玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557显著相关，该InDel位点可以作为遗传标记，用于分子育种，加速高产玉米育种进程，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为32份玉米自交系材料PCR扩增InDel位点的测序结果。其中方框标识出5bp的插入为穗行数高的玉米自交系材料的位点基因型，而对应穗行数低的玉米自交系的位点基因型为5bp的缺失。

具体实施方式

下面结合具体实验方案和附图对本发明的技术方案及其产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何交换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用试剂如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1.玉米基因GRMZM2G098557与穗行数性状显著相关的InDel分子标记的获得。

获得方法如下：

1)收集310份来自中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系，构建了作图所用的关联群体。该群体有着丰富的遗传多样性。

2)田间试验设计。分别于2016年云南西双版纳州(四川农业大学玉米所实验基地)、四川雅安(四川农业大学玉米所实验基地)和四川洪雅三个环境种植进行。田间实验设计方案采用随机区组实验设计，各设计两个重复，每个家系材料进行两行区种植，行长4米，行距0.8米，单行16株，种植密度约为5万株每公顷，施肥、浇水、除草等田间管理措施均按照当地正常水平进行管理。生理成熟后收获，每个自交系材料收获后的果穗作为表型鉴定样本。

3)关联群体表型鉴定。待晒干后，每个自交系材料挑选长势一致的10个玉米果穗进行表型测定。联合方差分析表明，穗行数在环境、基因型、环境与基因型互作效应间均表现为极显著性差异(表1)。

表1穗行数联合方差分析

4)全基因组关联分析。结合步骤3中玉米穗行数的表型数据和高密度InDel分子标记，运用R语言中FarmCPU包来进行全基因组关联分析，等位基因频率阈值设为0.05，在P＜1/N(N为InDel标记数)水平上，判定InDel标记与性状关联的显著性。结果检测到一个InDel位点与玉米穗行数显著相关，等位基因为5bp的插入/缺失，在供试自交系中有插入/缺失两种纯合基因型，所述5bp的序列如SEQ ID NO.1所示，其位点侧翼序列如SEQ ID NO.2所示。

5)QTL定位验证。试验材料：以B73和Mo17为亲本构建的玉米IBMSyn10DH群体，包含了280个家系，从美国爱荷华州立大学引进。经过前期田间试验调查，选取该群体中适应性较好的250份和2个亲本作为试验材料。

6)田间试验设计：分别于2015年云南西双版纳州(四川农业大学玉米所实验基地)、四川崇州(四川农业大学玉米所实验基地)和河南新乡(河南省农科院实验基地)三个环境下种植。采用随机区组实验设计，各设计两个重复，每个家系材料进行两行区种植，行长4米，行距0.8米，单行16株，种植密度约为5万株每公顷，施肥、浇水、除草等田间管理措施均按照当地正常水平进行管理。

7)表型鉴定：玉米IBMSyn10DH群体中每个家系采取开放性授粉，生理成熟后收获，每个家系收获后的果穗作为表型鉴定样本。待晒干后，每个家系挑选长势一致的10个玉米果穗进行表型测定。

8)QTL分析：利用软件QTL Cartographer Version 1.17f，结合表型数据及6618个bin marker基因型数据，进行QTL定位，其中在第4染色体Chr4：185.8～209.5Mb区段检测到一个QTL，贡献率为5.52％。

步骤4检测到的InDel分子标记落在该QTL区段内，进一步证明了上述InDel标记与玉米穗行数性状的重要性。

实施例2.本发明的InDel标记在玉米穗行数上的应用试验。

在连锁群体中挑选16份表型差异的家系材料，以其基因组DNA为模板，利用InDel分子标记位点侧翼序列设计特异性引物，引物序列如SEQ ID NO.2、3所示，采用KOD FX Neo高保真聚合酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司)进行PCR扩增，程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。将特异性的目的条带用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek)回收纯化，连接平末端克隆载体Peasy-BluntCloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)测序。利用SnapGene2.3.2软件对测序结果进行比对(见图1)。结果显示该InDel位点成功于挑选的30份玉米待鉴定材料进行长度多态性检测，其中8份穗行数高的玉米材料在该InDel位点处的基因型全为5bp的插入，另外8份穗行数低的玉米材料在该位点处的基因型全为5bp的缺失。

本实验进一步证明了全基因组关联分析和QTL定位的准确性。因此，5bp的插入/缺失被视作优异/增效等位基因。本发明进一步证实了该InDel位点能够作为有效的遗传标记应用于分子标记辅助选择，提高玉米的穗行数。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的InDel分子标记及应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 1

cgggc 5

<210> 2

<211> 119

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<220>

<221> Indel分子标记位点侧翼序列

<222> (59)..(59)

<223> n=cgggc/缺失

<400> 2

agcttgcacc agcgaaaaaa aaaaggaaat caaggtttac ttactcctct tatcccccnt 60

gtgattacgt ctaaaacatc tccatcagat gtgccagctc tgctcaagct catccacct 119

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccatacgca agcctccttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accgaaggtg gatgagcttg 20

Claims (8)

1.玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557的InDel分子标记，其特征是，依据基因组版本Maize B73 RefGen_v3，该标记位于玉米第4号染色体199959357bp位置，等位基因序列为SEQ ID NO.1所示；扩增所述InDel分子标记的引物序列如SEQ ID No.3 -4所示。

2.如权利要求1所述的InDel分子标记，其特征是，所述等位基因的侧翼序列如SEQ IDNo.2所示。

3.权利要求1-2任一所述的InDel分子标记的检测试剂在鉴定玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557中的应用。

4.权利要求1-2任一所述的InDel分子标记的检测试剂在鉴定或筛选玉米穗行数高的种质资源中的应用。

5.权利要求1-2任一所述的InDel分子标记的检测试剂在玉米育种中的应用。

6.如权利要求3所述的InDel分子标记的检测试剂在鉴定玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557中的应用，其特征是，所述的InDel分子标记的检测试剂为InDel分子标记的引物，引物序列如SEQ ID No.3 -4所示。

7.如权利要求4所述的InDel分子标记的检测试剂在鉴定或筛选玉米穗行数高的种质资源中的应用，其特征是，所述的InDel分子标记的检测试剂为InDel分子标记的引物，引物序列如SEQ ID No.3 -4所示。

8.如权利要求5所述的InDel分子标记的检测试剂在玉米育种中的应用，其特征是，所述的InDel分子标记的检测试剂为InDel分子标记的引物，引物序列如SEQ ID No.3 -4所示。

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