CN109234431B

CN109234431B - 玉米抗茎腐病qtl的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109234431B
Application number: CN201811134182.6A
Authority: CN
Inventors: 孙志考; 赵攀锋; 熊冠军; 邸萌亮; 周毅; 丁德荣; 鲍晓明
Original assignee: Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2038-09-27
Also published as: CN109234431A

Abstract

本发明涉及一种玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用，玉米抗茎腐病QTL的SNP分子标记包括MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C。本发明首次对玉米茎腐病抗性遗传主效位点QTL‑9.04进行了定位并获得与其连锁的SNP分子标记；本发明SNP分子标记在玉米茎腐病抗性改良育种中具有重要价值。

Description

玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用，特别是涉及一种玉米抗茎腐病主效位点QTL-9.04的SNP分子标记及其应用。

背景技术

玉米茎腐病，又称青枯病，属于世界玉米产区普遍发生的土传病害。多数研究者认为玉米茎腐病主要是肿囊腐霉菌(Pythium inflatum)和禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)复合侵染的结果，属玉米成株期病害，一般情况下于灌浆期开始显症，发病症状分为青枯型和黄枯型。据报道，在美国茎腐病严重时可导致产量损失20-30％。在中国，茎腐病是影响黄淮海玉米产区的主要病害。一般年份，田间植株发病率在10-20％之间，严重时可达到80％，重病田甚至绝收。近几年随着国家对秸秆还田、保护性耕作制度的倡导，病原菌在田间连年不断累积，东北和华北玉米产区的茎腐病也愈演愈烈；同时，伴随主推品种抗性单一化，种质资源抗性低等原因，玉米茎腐病已成为制约中国各大玉米产区的主要病害。因此，选育和种植抗茎腐病品种已成为预防和控制茎腐病暴发流行的有效途径。

由于玉米茎腐病是由肿囊腐霉菌和禾谷镰孢菌复合侵染的结果，其抗性机制较为复杂。多数研究者认为玉米茎腐病抗性是由多基因控制的数量性状，并且基因效应是以加性效应为主。Pe等(1993)利用高抗茎腐病自交系B89和高感茎腐病自交系33-16构建了112份F2:3家系，接种禾谷镰孢菌后对抗性进行鉴定和分析，定位了6个抗禾谷镰孢菌茎腐病的QTL位点，分别位于第1、2、3、4、5、10号染色体上。Yang等(2005)利用抗病自交系1145和感病自交系Y331构建的群体对茎腐病抗性进行了研究，结果在4号染色体上定位一个抗肿囊腐霉菌茎腐病QTL-Rpi1，在6号染色体上定位到一个抗镰胞茎腐病QTL-Rfg1。Yang等(2010)利用1145和Y331杂交获得的回交群体人工接种禾谷镰孢菌后进行抗病QTL定位，最终定位到两个抗病QTL，分别为主效QTL qRfg1和微效QTL qRfg2。通过连续精细定位方法，将主效QTLqRfg1定位到10号染色体500kb的区间中，可以将茎腐病抗病率稳定提高32-43％。此后Zhang等(2011)将微效QTL qRfg2定位到l号染色体上约300kb的区间中，可以将茎腐病抗病率提高12％。Song等(2015)利用抗病自交系齐319和感病自交系掖107杂交获得的673株F2群体和662个F2:3家系接种肿囊腐霉菌，并进行抗性遗传分析，发现茎腐病的抗性受两个独立显性基因(RpiQI319-1和RpiQI319-2)控制，并最终将其定位在玉米染色体bin 1.03和bin 10.02上。在国外，杜邦先锋利用抗病自交系MP305和感病自交系DE811杂交获得的回交群体进行精细定位，接种的病原菌为禾生炭疽菌，最终在玉米染色体bin 4.06-4.08之间发现了一个主效QTL位点，通过图位克隆方法确定抗病基因为Rcg1。杜邦先锋之后利用关联分析和连锁分析方法，在bin 6.05上定位到一个抗茎腐病的主效QTL。孟山都公司利用192个DH群体通过炭疽菌接种后进行表型鉴定，将主效QTL定位在bin1.04-1.05上。2015年孟山都公司发现了两个抗拟轮枝镰孢茎腐病QTL，分别为FSR-3.01和FSR-8.01。

尽管国内外在茎腐病抗性遗传研究方面开展了大量研究，定位了很多QTL位点，但是由于生产中病原菌的复杂性及环境条件的影响，能够稳定提供茎腐病抗性的位点较少，在国内玉米育种上很难得到大规模应用。同时，鉴于目前茎腐病发病面积连年扩大，危害愈发严重，选育抗病品种已迫在眉睫。因此，挖掘和利用在多环境下表现抗性稳定的抗病位点对于选育抗病品种非常重要。

本发明提供的抗茎腐病主效位点QTL-9.04位于玉米9号染色体bin 9.04上，能够显著提高茎腐病的抗病率，且在多年多环境下表现稳定。主效位点QTL-9.04可有效补充现有抗病位点的不足，能够显著提高品种的抗病性和稳定性。与主效位点QTL-9.04连锁的分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A都是基于道格拉斯高通量SNP分子标记检测平台(Douglas

Array Tape^TM)开发的，能够快速、低成本的对育种群体进行选择，极大提高了育种效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用，首次发现了玉米抗茎腐病主效位点QTL-9.04的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)分子标记，其可以实现茎腐病抗性的精准改良，减少连锁累赘对农艺性状的负面影响。

为实现上述目的，本发明提供了一种玉米抗茎腐病QTL的SNP分子标记，包括MC0215X0591A和MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C。

进一步地，所述MC0215X0591A包含以玉米基因组为模板、由SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3为引物进行PCR反应所获得的扩增产物；所述MC0215X0608A包含以玉米基因组为模板、由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行PCR反应所获得的扩增产物。

更进一步地，对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0591A的侧翼序列包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0608A的侧翼序列包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于检测玉米抗茎腐病QTL的SNP分子标记的探针或引物对，所述SNP分子标记包括物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体bin 9.04的MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0591A的侧翼序列包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0608A的侧翼序列包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列自5’端起第103位碱基为C或T，SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列自5’端起第101位碱基为C或G。

优选地，用于检测所述MC0215X0591A的引物对为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，探针为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；用于检测所述MC0215X0608A的引物对为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，探针为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

为实现上述目的，本发明还提供了一种试剂盒，包含所述的用于检测玉米抗茎腐病QTL的SNP分子标记的探针或引物对。

为实现上述目的，本发明还提供了一种选择具有增强的茎腐病抗性的玉米植物的方法，包括：

检测玉米植物的基因型；

选择具有抗病主效位点QTL-9.04的玉米植株；

所述抗病主效位点QTL-9.04包括分子标记MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C。

为实现上述目的，本发明还提供了一种鉴定玉米植物具有增强的茎腐病抗性的方法，包括：检测玉米植物中分子标记MC0215X0591A和/或MC0215X0608A的等位基因型，所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C。

为实现上述目的，本发明还提供了一种获得具有增强的茎腐病抗性的玉米植物的方法，包括：

获得基因组中含有增强的茎腐病抗性的分子标记位点的第一玉米植物；

所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；

对子代植物中相应的分子标记位点进行评估；

选择具有所述增强的茎腐病抗性的分子标记位点的子代植物；

所述增强的茎腐病抗性的分子标记包括MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C。

为实现上述目的，本发明还提供了一种预测具有增强的茎腐病抗性的玉米植物的方法，包括：

检测玉米植物的基因型；

所述玉米植物的基因组中含有增强的茎腐病抗性的分子标记位点；

所述增强的茎腐病抗性的分子标记位点包括MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C。

为实现上述目的，本发明还提供了一种所述的玉米抗茎腐病QTL的SNP分子标记、所述的用于检测玉米抗茎腐病QTL的SNP分子标记的探针或引物对、或所述的试剂盒在筛选或鉴定玉米茎腐病抗性或玉米育种中的应用。

在上述技术方案中，“对应玉米品种B73基因组”是指以玉米品种B73基因组为例进行记载的，在非玉米品种B73基因组中具体信息可能与玉米品种B73基因组中具体信息不同，如分子标记的物理位置、侧翼序列等，但其相对的对应关系是不变的，本领域技术人员可依据对应关系，获知非玉米品种B73基因组的相应信息。

本文所用术语“等位基因”指在特定基因座处发生的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。

本文所用术语“等位基因频率”指等位基因存在于个体、品系、或一组品系中的基因座上的频率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5或0.0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样品的等位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。同样地，人们能够通过平均化构成种群的品系的等位基因频率来计算该种群品系中的等位基因频率。就一组限定数目的个体或品系而言，可将所有等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其他指定组)的计数。

“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)通过扩增模板核酸制备的核酸。

在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。

本文所用术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。QTL能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。

本文所用术语“QTL定位”指采用类似单基因定位的方法将QTL定位在遗传图谱上，确定QTL与遗传标记间的距离(以重组率表示)。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如QTL复合区间作图(CIM)多区间作图(MIM)、多QTL作图、多性状作图(MTM)等。

本文所用术语“分子标记”指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

本文所用术语“主效基因”或“主效位点”指由单个基因决定某一性状的基因，本文所述术语“微效基因”指对于同一性状的表型来讲，几个非等位基因中的每一个都只有部分的影响，这样的几个基因称为累加基因或多基因。在累加基因中每一个基因只有较小的一部分表型效应，所以又称为微效基因。

本文所用术语“SNP”、“Single Nucleotide Polymorphisms”指单核苷酸多态性，具体是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。

本文所用术语“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，繁殖的植物品种。

本文所用术语“植物”或“植株”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

本文所用术语“自交系”指在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系。本文所用术语“回交”指子一代和两个亲本的任一个进行杂交的方法。

本文所用术语“杂交”或“杂交的”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。

本文所用术语“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。初始杂交产生F1代；然后，术语“BC1”指轮回亲本的第二次使用，“BC2”指轮回亲本的第三次使用等。

本文所用术语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低、优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。1cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。

“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的玉米茎腐病抗性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的“有利”等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。

“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。

“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们间的重组频率进行测量，并且基因座之间的重组可使用多种标记进行检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的基因座。

“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。

“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。

“遗传标记”是种群中的多态核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区分出它们的等位基因，例如RFLP、AFLP、同工酶、SNP、SSR等。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，如用作探针的核酸。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ASH)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。

“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座上基因型不同。

术语“杂合子”指其中不同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。

术语“同质”指一组成员在一个或多个特定基因座上具有相同基因型。

术语“纯合子”指其中相同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。

术语“杂交体”指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。

术语“近交”指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。

术语“渗入”指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可为例如标记的选择等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并选择期望的等位基因以产生固定在选择遗传背景中的等位基因。

当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。

“基因座”是基因或标记位于染色体上的位点。

“标记”是用作参考点得核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异或多态性。对于分子标记，这意味着DNA水平的差异是由于多核苷酸序列差异(例如SSR、RFLP、FLP和SNP)。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如EST)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于PCR的方法扩增序列片段。

对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ASH)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。

如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或两侧为标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如SNP技术。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将不发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“负”相关。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它们由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基组成。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)可以用它们的单字母名称指代如下：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞甘酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟甘酸或脱氧鸟甘酸，“U”表示尿甘酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。

术语“表型”或“表型性状”或“性状”指生物的一个或多个性状。表型可用肉眼或者本领域已知的任何其他评估手段观察到，例如显微镜法、生物化学分析、或电装置检测分析法。在某些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。

“多态性”是DNA中的变型，它过于常见而不仅仅由突变产生。多态性在种群中必须具有至少1％的频率。多态性可以是单核苷酸多态性或SNP、或插入/缺失多态性。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本发明实施方案的多肽既可从本文所公开的核酸产生，也可通过使用标准的分子生物学技术而产生。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“正”相关。

术语“子代”指杂交产生的后代。

“子代植株”从两个植株间的杂交生成。

术语“产量”指具有商业价值的特定植株产品每单位面积的产量。产量受遗传和环境因素的影响。“农学”、“农学特性”和“农学性能”指给定植株品种的性状(以及产生性状的遗传因子)，所述性状有助于经过生长期的产量。单个农学特征包括出苗活力、营养势、胁迫耐受性、病害抗性或耐受性、除草剂抗性、发生分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、抗倒伏性、脱粒率等等。因此产量是所有农学特性的最终结果。

与玉米茎腐病抗性关联的分子标记和分子标记的等位基因的鉴定允许抗性的正选择仅基于子代的遗传组成。本文提供了通过基因组成评估(如使用分子标记及其等位基因评估)来鉴定和选择具有增强的玉米茎腐病抗性的玉米植株的方法。

分子标记可用于多种植株育种应用。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植株种群中选择性状的有用工具。当表型难以测定(例如很多病害抗性性状)，或表型发生在植株发育的晚期(例如籽粒特征)时，尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的种群，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，两侧标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。

当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了两侧区域，这成为“连锁累赘”。在供体植株与受体植株极不相关的情况下，这些两侧区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。即便与优良玉米品系回交多个周期后，该“连锁累赘”也可导致产量减少或其他负面农学特性，这有时也称为“产量累赘”。两侧区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小。在传统育种中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植株中，至少一株植株经历交换有95％的概率，所述交换在基于单次减数分裂图距的1cM基因内进行。标记使得能够明确鉴定这些个体。对于300株植株的一次附加回交，在基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的交换概率，从而产生在基于单次减数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代。当基因的确切位置已知时，围绕基因的两侧标记可用于在不同的种群大小中对重组进行正选择。例如，在更小的种群中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的两侧标记来检测重组。

具体实施MAS的关键是：(1)限定标记-性状的关联在其中将被测定的群体，其能够是分离群体、或随机的或结构化的群体；(2)监测多态性标记相对于性状的分离或关联，并使用统计学方法确定连锁或关联；(3)基于统计学分析的结果限定一组所期望的标记，和(4)运用和/或外推该信息至当前的育种种质，以使得能够作出基于标记的选择决定。

简单重复序列(SSR)能够被定义为相对少量的6bp或更短的DNA的串联重复。多态性由于重复单元数量的变化而增加，这种变化很可能是由DNA复制过程中的滑移导致的。重复长度的变化可通过在保守的非重复两侧区域设计PCR引物来检测。SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的，并且适合高通量自动化。

也可生成各种类型的FLP标记。最常见地，扩增引物用于生成片段长度多态性。此类FLP标记在很多方面类似于SSR标记，不同的是由引物扩增的区域通常不是高度重复区域。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间还具有足够的可变性，使得由扩增引物产生的片段能够在多态性个体中区分开，并且已知此类插入缺失常常发生于玉米中。

SNP分子标记是指DNA序列上单个核苷酸的变异形成的DNA序列多态性。在所有分子标记类型当中，SNP是最丰富的，因此具有提供最高基因图谱分辨率的能力。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上进行检测，即以所谓的“超高通量”模式进行检测，因为它们不需要大量DNA，并且可直接进行自动化检测。SNP也具有成为相对低成本系统的前景。这三个因素一起使得SNP在MAS中的应用具有高度吸引力。若干种方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶酶解和微测序。

除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其他类型的分子标记也广泛使用，包括但不限于表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA(RAPD)以及其他基于核酸的标记。

一般来讲，MAS使用的多态性标记是经鉴定具有与玉米茎腐病抗性共分离的显著概率的那些。推测此类标记在图谱上接近赋予植株玉米茎腐病抗性表型的一个或多个基因，并且认为此类标记是期望性状的指示或标记。测试植株是否在标记中存在期望的等位基因，并且期望在一个或多个基因座上包含期望基因型的植株将期望基因型与期望表型一起转移到它们的子代。

在一个PCR方法中，能设计寡核苷酸引物用于PCR反应以从提取自任何受关注生物的cDNA或基因组DNA中扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域已知的。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单个特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，将已知多核苷酸的全部或部分用作探针，探针选择性地杂交到来自所选择生物的存在于一组克隆基因组DNA片段或cDNA片段的其他对应多核苷酸上(即基因组或cDNA文库)。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测的基团如³²P或任何其他可检测标记物标记。

序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”或“严格杂交条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10至50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％至1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程估算：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约1℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。

本文中术语全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)是应用基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism，SNP)为分子遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较筛选出影响复杂性状的基因变异。

本文中术语混合线性模型(mixed linear model，MLM)是一种方差分量模型，在方差分量模型中，把既含有固定效应，又含有随机效应的模型，称为混合线性模型。

本文中术语“MAF”是最小等位基因频率，通常是指在给定群体中的不常见的等位基因发生频率。

本文中术语“Missing rate”是缺失率，通常是指在给定群体中的单个SNP位点的缺失数量占给定群体数量的比率。

本文中术语“bin”是染色体上的一个区间或片段。玉米基因组的遗传图谱被核心标记划分为100个片段，每个片段被称为一个“bin”。Bin的命名方式为染色体序号加上两位小数(如1.00、1.01、1.02等)。

本发明提供了玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用，具有以下优点：

1、本发明首次对玉米茎腐病抗性遗传主效位点QTL-9.04进行了定位并获得与其连锁的SNP分子标记。

2、本发明提供的SNP分子标记可以在玉米茎腐病抗性改良育种中进行抗病单株的有效选择，只保留抗病单株进入后期育种程序，至少可节省50％以上的育种种植成本。

3、本发明利用分子标记辅助选择技术可实现茎腐病抗性的精准改良，减少连锁累赘对农艺性状的负面影响，如利用道格拉斯高通量SNP分子标记检测平台，可以提高3倍以上检测效率，有效降低检测成本。

4、本发明利用分子标记辅助选择的玉米抗茎腐病品种，能够在茎腐病发病严重年份相对增产10％。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用的玉米茎腐病抗性全基因组关联分析Manhattan图；

图2为本发明玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用的感病亲本、抗病亲本和F1在第一试验地的抗病性分析图；

图3为本发明玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用的BC1F1群体中主效位点QTL-9.04在第一试验地的效应分析图；

图4为本发明玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用的感病亲本、抗病亲本和F1在第二试验地的抗病性分析图；

图5为本发明玉米抗茎腐病QTL的分子标记及其应用的BC2F1群体中主效位点QTL-9.04在第二试验地的效应分析图。

具体实施方式

第一实施例、玉米抗茎腐病主效QTL及与其连锁的分子标记的发现

对83个玉米自交系进行连续两年的茎腐病抗性调查，并设置抗病对照材料DBN049和感病对照材料DBN073(来自中国农业大学合作项目，申请人可以提供)以评估茎腐病发病的有效性。当感病对照材料DBN073病情级别达到9级时视为发病有效。玉米茎腐病抗性评价标准如表1所示。

表1、玉米茎腐病抗性评价标准

发病率	0-5％	5.1-10％	10.1-30％	30.1-40％	40.1-100％
						抗病水平	高抗(HR)	抗病(R)	中抗(MR)	感病(S)	高感(HS)
病情级别	1	3	5	7	9

乳熟末期，当感病对照材料DBN073病情级别达到表1中的9级时，利用表1的评价标准对83个玉米自交系进行茎腐病抗性第一次调查，每隔一周调查一次，共调查三次。鉴定方法具体为以手指按捏玉米植株地表上方第二茎节，茎秆变空、变软或茎节明显变褐即为发病株，计算发病率的公式为：发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％。调查结果如表2所示，以两个试验地调查记录的最高级别为准，在83个玉米自交系中，抗病材料主要来源于PB和瑞德种质，感病材料主要是四平头、兰卡斯特以及部分瑞德种质。

表2、83个玉米自交系茎腐病抗性调查结果

利用2188个玉米SNP探针对83个玉米自交系进行指纹图谱检测，从中选取1929个高质量的分子标记(MAF>0.05；Missing Rate<10％)用于全基因组关联分析(GWAS)。采用Anderson-Darling方法对83个玉米自交系茎腐病抗性数据进行全基因组关联分析，共发现27个分子标记与茎腐病抗性显著相关(P<2.59E-05)，如表3所示，玉米茎腐病抗性全基因组关联分析Manhattan图如图1所示。利用回交群体对抗病位点功能进行评估，发现抗病位点9.04及其分子标记MC0215X0591A(P＝1.62E-06)和MC0215X0608A(P＝1.64E-06)为茎腐病抗性提供较大抗性效应，茎腐病抗性可提高40.3％。

表3、27个高质量的分子标记的相关信息

注：表3中SNP分子标记的物理位置是基于玉米基因组版本：B73RefGen_v3

第二实施例、玉米抗茎腐病主效位点QTL-9.04的功能验证

为了研究抗茎腐病主效位点QTL-9.04的功能，从83个玉米自交系中筛选出在抗茎腐病主效位点QTL-9.04上表现为抗病等位基因型的高抗自交系DBN022(供体亲本，来自中国农业大学合作项目)和在抗茎腐病主效位点QTL-9.04上表现为感病等位基因型的高感自交系DBN021(受体亲本，来自中国农业大学合作项目)作为亲本，进行杂交组配获得F1，再以感病亲本DBN021为轮回亲本进行第一次回交获得BC1F1群体。抗茎腐病主效位点QTL-9.04的分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A的信息如表4所示。

表4、分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A的基本信息

在第一试验地种植上述获得的252株BC1F1群体，第一试验地为沙壤粘土，肥力中等，设置抗病亲本DBN022、感病亲本DBN021和F1(DBN021/DBN022)作为对照，同时为了避免试验结果受到不同地块因素干扰，将感病亲本DBN021种植在回交群体周围及行间(每隔2行种植1行)，以有效缩小环境误差。

于玉米三叶期时，分别取252株BC1F1群体植株的叶片作为样品，用SDS法提取其基因组DNA，利用表4中的分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A在道格拉斯高通量SNP检测平台进行基因型检测，同时以抗病亲本DBN022、感病亲本DBN021和F1(DBN021/DBN022)作为对照，按照上述方法进行检测分析。具体方法如下：

步骤11、使用直径约为5mm叶片打孔器对252株BC1F1群体植株的叶片打孔取样，每个植株打出小圆形叶片3片，用镊子将叶片放于对应的96孔板中(已放入钢珠)，取样完成后立即放入-80℃冰箱冷冻；

步骤12、将冷冻后的样品从-80℃冰箱拿出，使用SPEX GENO 2010

高通量组织研磨机研磨冷冻样品；

步骤13、采用SDS法提取上述样品的基因组DNA；

步骤14、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific^TM)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤15、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤16、在道格拉斯高通量SNP检测平台上进行PCR反应，具体为：在Nexar工作站将上述样品的基因组DNA、PCR mix、所述分子标记MC0215X0591A或MC0215X0608A的引物/探针混合物、和ddH₂O加入Array Tape中，然后在Soellex水浴中完成PCR反应。PCR反应体系和反应条件如下所示：

PCR反应体系为1μl：

PCR反应条件为：

利用所述分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A在道格拉斯高通量SNP检测平台对DNA进行分子标记基因型检测；

步骤17、PCR反应完成后在Araya荧光阅读仪上读取荧光信号，基因型数据的读取和分析使用IntelliScore^TM数据分析软件(道格拉斯配置)进行。

基因型分型标准为：X代表来自感病亲本DBN021的等位基因型，Y代表来自抗病亲本DBN022的等位基因型。基因型为X/X，表示被测样品在检测SNP分子标记位点具有感病亲本DBN021的纯合基因型；基因型为Y/Y，表示被测样品在检测SNP分子标记位点具有抗病亲本DBN022的纯合基因型；基因型为X/Y：表示被测样品在检测SNP分子标记位点具有DBN021和DBN022的杂合基因型。

乳熟末期，感病对照材料DBN021病情级别达到9级，而抗病对照材料DBN022病情级别为1级，证明田间自然发病有效。对252株BC1F1群体进行单株茎腐病抗性调查，每隔1周调查1次，共调查3次。汇总3次调查数据，决定单株的最终抗性级别，调查标准如下表5和表6所示。

表5、玉米茎腐病单株调查分级标准(适用于鉴定分离群体)

表6、玉米茎腐病单株多次调查分级标准(适用于鉴定分离群体)

在252株BC1F1群体中，抗病株数(抗病级别包括HR、R、MR)为83株，感病株数为(抗病级别包括MS、S、HS)169株，BC1F1群体抗病率为32.9％(抗病率(％)＝抗病株数/调查总株数×100％)，BC1F1群体单株详细调查结果如表7所示。

表7、252株BC1F1群体的单株茎腐病抗性调查结果

如图2所示，按照表1的标准，第一试验地中感病亲本DBN021茎腐病抗病水平为高感(9级)，抗病率为11.7％；抗病亲本DBN022茎腐病抗病水平为高抗(1级)，抗病率为100％；F1(DBN021/DBN022)为中抗(5级)，抗病率为74.8％。通过亲本的抗病性分析说明，感病亲本DBN021的抗病水平达到需要改良的程度，抗病亲本DBN022的抗病水平符合供体亲本的要求，F1达到中抗水平说明茎腐病改良有效。

在回交群体中参照下述两个标准评估茎腐病抗病位点的效应：(1)杂合基因型的抗病率比纯合感病基因型的抗病率高5％以上；(2)杂合基因型的抗病率比整个回交群体的抗病率高5％以上。主效位点QTL-9.04的效应分析如表8和图3所示，含有抗病位点9.04的杂合基因型群体抗病率为39.8％，比纯合感病基因型群体的抗病率(26.9％)高13.0％，且两者之间达到显著差异水平；同时，含有抗病位点9.04的杂合基因型群体抗病率比整个BC1F1群体的抗病率(32.9％)高6.9％。因此，抗茎腐病主效位点QTL-9.04可以显著提高茎腐病抗性水平。

表8、抗茎腐病主效位点QTL-9.04在BC1F1群体中的效应分析

注：*代表α＝0.05水平，**代表α＝0.01水平

在BC1F1群体中筛选含有抗茎腐病主效位点QTL-9.04且抗病水平为高抗或抗病的单株与感病亲本DBN021进行第二次回交，获得BC2F1群体，用于下一步功能验证。

在第二试验地种植20个所述BC2F1群体的果穗(共846个单株)，第二试验地为沙壤粘土，肥力较高，种植方式与上述种植BC1F1群体相同，并采取自然发病的方式，设置抗病亲本DBN022、感病亲本DBN021和F1(DBN021/DBN022)作为对照。乳熟末期，感病对照材料DBN021病情级别为9级，抗病对照材料DBN022病情级别为1级，证明田间自然发病有效。在846株BC2F1群体中，抗病株数(抗病级别包括HR、R、MR)为460株，感病株数(抗病级别包括MS、S、HS)为386株，BC2F1群体抗病率为54.4％(抗病率(％)＝抗病株数/调查总株数×100％)，BC2F1群体单株详细调查结果如表9所示。

表9、846株BC2F1群体的单株茎腐病抗性调查结果

如图4所示，按照表1的标准，第二试验地中感病亲本DBN021茎腐病抗病水平为高感(9级)，抗病率为3％；抗病亲本DBN022茎腐病抗病水平为高抗(1级)，抗病率为100％；F1(DBN021/DBN022)为中抗(5级)，抗病率为87.5％。通过亲本的抗病性分析说明，感病亲本DBN021、抗病亲本DBN022和F1的抗病性在上述两个试验地保持稳定。

参照上述基因型检测方法和表4的分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A对BC2F1群体进行基因型检测，同时以抗病亲本DBN022、感病亲本DBN021和F1(DBN021/DBN022)作为对照，并参照上述两个标准评估茎腐病抗病位点的效应：在BC2F1群体中，主效位点QTL-9.04的效应分析如表10和图5所示，含有抗病位点9.04的杂合基因型群体抗病率达到75.7％，已较为接近F1(DBN021/DBN022)的抗病率(87.5％)，而纯合感病基因型群体的抗病率仅为35.3％，含有抗病位点9.04的杂合基因型比纯合感病基因型群体的茎腐病抗病率高40.4％，且达到了极显著差异水平；同时，含有抗病位点9.04的杂合基因型群体抗病率比整个BC2F1群体的抗病率(54.4％)高21.3％。因此，通过上述试验进一步验证了主效位点QTL-9.04可以显著提高感病亲本的茎腐病抗性水平。

表10、抗茎腐病主效位点QTL-9.04在BC2F1群体中的效应分析

注：*代表α＝0.05水平，**代表α＝0.01水平

通过上述试验，获得并确定了抗茎腐病主效位点QTL-9.04的功能，以及与主效位点QTL-9.04紧密连锁的分子标记为MC0215X0591A和MC0215X0608A，抗病等位基因型都为C，感病等位基因型分别为T和G。所述抗茎腐病主效位点QTL-9.04及其分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A可以大幅提升自交系和杂交种的茎腐病抗性，对玉米品种的茎腐病抗性改良具有重要的应用价值。

综上所述，本发明首次对玉米茎腐病抗性遗传主效位点QTL-9.04进行了定位并获得与其连锁的SNP分子标记MC0215X0591A和MC0215X0608A；本发明SNP分子标记可以在玉米茎腐病抗性改良育种中进行抗病单株的有效选择，只保留抗病单株进入后期育种程序，至少可节省50％以上的育种种植成本；同时利用分子标记辅助选择技术可实现茎腐病抗性的精准改良，减少连锁累赘对农艺性状的负面影响，筛选出抗茎腐病的玉米新品种，从而在茎腐病重发年份相对增产5-10％。

最后所应说明的是、以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制、尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明、本领域的普通技术人员应当理解、可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换、而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 北京大北农生物技术有限公司

<120> 玉米抗茎腐病主效QTL的分子标记及其应用

<130> DBNBC129

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 178

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<220>

<221> allele

<222> (103)..(103)

<223> SNP分子标记位点侧翼序列，n=t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (103)..(103)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

gatcagattt atactcgggg accacaacaa ccgggcgagt agacctgcat gtcctgtggc 60

ggagcgcgga aatctgttgc gcgattccgg cgcagctgcc gtngtcgaga aggggaaagg 120

agcccctgac gaaacggtcc caccggtaga tgacccatgc gcggttgtgt gcgataga 178

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> MC0215X0591A上游引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcgagtaga cctgcatgt 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> MC0215X0591A下游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgcgcatgg gtcatcta 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> MC0215X0591A-VIC探针(Artificial Sequence)

<400> 4

cttctcgaca acggcag 17

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> MC0215X0591A-FAM探针(Artificial Sequence)

<400> 5

ttctcgacga cggcag 16

<210> 6

<211> 251

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<220>

<221> allele

<222> (101)..(101)

<223> SNP分子标记位点侧翼序列，n=g or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 6

gaaaaaagca taatcagccc gacgatccag agaaggtagg ccacgagcac ccaggcgccc 60

ggcggcggct ccgcgacggc gtcagcgagt agaaggtaca nggccgccgc gaccatcgcc 120

acgagagcta cgaccgcgcg gcggccacgc ggccagactt tcctcctctg cccgcgacgg 180

tgcccaccgc cgttctcctc ctcacggctc ggcggaggcg gcggcggggc cggcgccttc 240

cccttgccac g 251

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> MC0215X0608A上游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

cccgacgatc cagagaaggt a 21

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> MC0215X0608A下游引物(Artificial Sequence)

<400> 8

gctctcgtgg cgatggt 17

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> MC0215X0608A-VIC探针(Artificial Sequence)

<400> 9

tagaaggtac agggccgc 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> MC0215X0608A-FAM探针(Artificial Sequence)

<400> 10

tagaaggtac acggccgc 18

Claims

1.一种玉米抗茎腐病QTL的核酸分子，其特征在于，包括核酸分子1和/或核酸分子2；所述核酸分子1包含以玉米基因组为模板、由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3为引物进行PCR反应所获得的扩增产物1，所述扩增产物1包含SNP分子标记MC0215X0591A，所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；

所述核酸分子2包含以玉米基因组为模板、由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行PCR反应所获得的扩增产物2，所述扩增产物2包含SNP分子标记MC0215X0608A，所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C；

其中，所述玉米品种B73基因组是B73 RefGen_v3。

2.根据权利要求1所述的玉米抗茎腐病QTL的核酸分子，其特征在于，对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0591A的侧翼序列包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0608A的侧翼序列包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

3.一种用于检测玉米抗茎腐病QTL的核酸分子中SNP分子标记的探针和引物对的组合物，其特征在于，所述SNP分子标记包括物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体bin 9.04的MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0591A的侧翼序列包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，对应且源自玉米品种B73基因组的所述MC0215X0608A的侧翼序列包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列自5’端起第103位碱基为C或T，SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列自5’端起第101位碱基为C或G；其中，用于检测所述MC0215X0591A的引物对为SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3，探针为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；用于检测所述MC0215X0608A的引物对为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8，探针为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

其中，所述玉米品种B73基因组是B73 RefGen_v3。

4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的用于检测玉米抗茎腐病QTL的核酸分子中SNP分子标记的探针和引物对。

5.一种选择具有增强的茎腐病抗性的玉米植物的方法，其特征在于，包括：

检测玉米植物的基因型；

选择具有抗病主效位点QTL-9.04的玉米植株；

所述抗病主效位点QTL-9.04包括分子标记MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C；

其中，所述玉米品种B73基因组是B73 RefGen_v3。

6.一种鉴定玉米植物具有增强的茎腐病抗性的方法，其特征在于，包括：检测玉米植物中分子标记MC0215X0591A和/或MC0215X0608A的等位基因型，所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C；

其中，所述玉米品种B73基因组是B73 RefGen_v3。

7.一种获得具有增强的茎腐病抗性的玉米植物的方法，其特征在于，包括：

所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；

对子代植物中相应的分子标记位点进行评估；

所述增强的茎腐病抗性的分子标记包括MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C；

其中，所述玉米品种B73基因组是B73 RefGen_v3。

8.一种预测具有增强的茎腐病抗性的玉米植物的方法，其特征在于，包括：

检测玉米植物的基因型；

所述增强的茎腐病抗性的分子标记位点包括MC0215X0591A和/或MC0215X0608A；所述MC0215X0591A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的103148105bp，其抗病等位基因位点为C；所述MC0215X0608A的物理位置位于对应玉米品种B73基因组9号染色体的111500329bp，其抗病等位基因位点为C；

其中，所述玉米品种B73基因组是B73 RefGen_v3。

9.一种权利要求1或2所述的玉米抗茎腐病QTL的核酸分子、权利要求3所述的用于检测玉米抗茎腐病QTL的核酸分子中SNP分子标记的探针和引物对的组合物、或权利要求4所述的试剂盒在筛选或鉴定玉米茎腐病抗性或玉米茎腐病抗性育种中的应用。