BR112016013111B1 - Métodos de identificação e/ou seleção de planta de milho - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO E/OU SELEÇÃO DE PLANTA DE MILHO, DE INTROGRESSÃO DE ALELOS DE QTL E DE SELEÇÃO DE PLANTAS DE MILHO São fornecidos no presente métodos úteis na identificação e/ou seleção de plantas de milho com resistência à podridão do caule de antracnose. A resistência pode ser recém-conferida ou aprimorada com relação a uma planta controle. Os métodos utilizam marcadores sobre o cromossomo 6 para identificar e selecionar plantas resistentes.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/913.440, depositado em nove de dezembro de 2013, cujo teor integral é incorporado ao presente como referência.

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DEPOSITADA ELETRONICAMENTE

[002] A cópia oficial da listagem de sequências é apresentada eletronicamente por meio de EFS-Web na forma de listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo denominado 20141125_BB1986PCT_SequenceListing_ST25 criado em 25 de novembro de 2014 e que possui tamanho de 14 quilobytes e é depositado simultaneamente com o presente relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII é parte do presente relatório descritivo e é integralmente incorporado ao presente como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] O campo da presente invenção refere-se ao cultivo de plantas e a métodos de identificação e seleção de plantas com resistência à podridão do caule de antracnose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Podridão do caule de antracnose (ASR) causada pelo patógeno fúngico Colletotrichum graminicola (Ces.) Wils (Cg) é uma das principais doenças da podridão das raízes em milho (Zea mays L.). ASR é uma preocupação importante devido à redução significativa da produção, peso e qualidade dos grãos. Ocorrem perdas de produção devido à morte prematura das plantas, o que interrompe o enchimento dos grãos, e à quebra de caules e alojamento que causa perda das espigas no campo. ASR ocorre em todas as áreas de cultivo de milho e pode resultar em perdas de 10 a 20%.

[005] Os agricultores podem combater infecções por fungos tais como antracnose utilizando fungicidas, mas estes apresentam efeitos colaterais ambientais e necessitam de monitoramento dos campos e métodos de diagnóstico para determinar qual fungo está causando a infecção, para que possa ser utilizado o fungicida correto. O uso de linhagens de milho que carregam fontes de resistência genéticas ou transgênicas é mais prático se os genes responsáveis pela resistência puderem ser incorporados a germoplasma de alto rendimento de elite, sem reduzir a produção. Foram descritas fontes genéticas de resistência a Cg (White et al (1979), Annu. Corn Sorghum Res. Conf. Proc. 34: 1-15; Carson, 1981. Sources of inheritance of resistance to anthracnose stalk rot of corn, Tese de PhD, Universidade de Illinois, Urbana- Champaign; Badu-Apraku et al (1987), Phytophathology 77: 957-959; Toman et al, 1993, Phytopathology, 83: 981-986; Cowen, N. et al (1991), Maize Genetics Conference Abstracts 33; Jung et al, 1994, Theoretical and Applied Genetics, 89: 413-418). Mas a introgressão de resistência pode apresentar alta complexidade.

[006] A seleção por meio do uso de marcadores moleculares associados à característica de resistência à podridão dos caules de antracnose permite seleções com base apenas na composição genética da prole. Como resultado, o cultivo de plantas pode ocorrer mais rapidamente, de forma a gerar plantas de milho comercialmente aceitáveis com nível mais alto de podridão do caule de antracnose. É desejável, portanto, fornecer composições e métodos de identificação e seleção de plantas de milho com resistência à podridão do caule de antracnose recém-conferida ou aprimorada. Essas plantas podem ser utilizadas em programas de cultivo para gerar híbridos de alto rendimento que são resistentes à podridão do caule de antracnose.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] São fornecidas no presente composições e métodos úteis na identificação e seleção de plantas de milho com resistência à podridão do caule de antracnose. Os métodos empregam marcadores para identificar e/ou selecionar plantas resistentes ou identificar e/ou contrasselecionar plantas susceptíveis. Também são fornecidas no presente plantas de milho que apresentam resistência à podridão do caule de antracnose recém-conferida ou aprimorada com relação a plantas controle.

[008] Em uma realização, são apresentados métodos de identificação e/ou seleção de plantas de milho que possuem resistência à podridão do caule de antracnose. Nestes métodos, o DNA de uma planta de milho é analisado para determinar a presença de um alelo de QTL associado à resistência à podridão do caule de antracnose, em que o mencionado QTL compreende: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759- 001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1; e uma planta de milho é identificada e/ou selecionada como portadora de resistência à podridão do caule de antracnose se o mencionado alelo de QTL for detectado. A resistência à podridão do caule de antracnose pode ser recém-conferida ou aprimorada com relação a uma planta controle que não possui o alelo de QTL favorável. O alelo de QTL está localizado sobre o cromossomo 6 no cesto 5 e pode ser adicionalmente refinado em um intervalo cromossômico definido por PHM146 e PHM14535, inclusive. A etapa de análise pode ser realizada por meio do isolamento de ácidos nucleicos e detecção de um ou mais alelos marcadores ligados e associados ao alelo de QTL.

[009] Em outra realização, são fornecidos métodos de identificação e/ou seleção de plantas de milho com resistência à podridão do caule de antracnose, em que um ou mais alelos marcadores ligados e associados a qualquer um dentre: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001- K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1 são detectados em uma planta de milho e é selecionada uma planta de milho que possui um ou mais alelos marcadores. Um ou mais alelos marcadores podem ser ligados a qualquer um dos alelos marcadores: “C” em C12305-001- K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1, por 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,9 cM, 0,8 cM, 0,7 cM, 0,6 cM, 0,5 cM, 0,4 cM, 0,3 cM, 0,2 cM, 0,1 cM ou menos.

[010] Em outra realização, são fornecidos métodos de identificação e/ou seleção de plantas de milho com resistência à podridão do caule de antracnose, em que um ou mais alelos marcadores ligados e associados a um haplótipo compreendem: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1 são detectados em uma planta de milho e é selecionada uma planta de milho que possui um ou mais alelos marcadores. Um ou mais alelos marcadores podem ser ligados pelo haplótipo: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1, por 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,9 cM, 0,8 cM, 0,7 cM, 0,6 cM, 0,5 cM, 0,4 cM, 0,3 cM, 0,2 cM, 0,1 cM ou menos.

[011] Em outra realização, são fornecidos métodos de identificação e/ou seleção de plantas de milho com resistência à podridão do caule de antracnose, em que um haplótipo que compreende: “C” em C12305- 001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001- K1 e “A” em C12314-001-K1 é detectado em uma planta de milho e é selecionada uma planta de milho que possui um ou mais alelos marcadores. Um ou mais alelos marcadores podem ser ligados pelo haplótipo: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1, por 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,9 cM, 0,8 cM, 0,7 cM, 0,6 cM, 0,5 cM, 0,4 cM, 0,3 cM, 0,2 cM, 0,1 cM ou menos.

[012] Em outra realização, são apresentados no presente métodos de introgressão de um alelo de QTL associado à resistência à podridão do caule de antracnose. Nesses métodos, é selecionada uma população de plantas de milho com um ou mais marcadores para determinar se qualquer uma das plantas de milho possui alelo de QTL associado à resistência à podridão do caule de antracnose e pelo menos uma planta de milho que possui o alelo de QTL associado à resistência à podridão do caule de antracnose é selecionada a partir da população. O alelo de QTL compreende “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001- K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1. Um ou mais marcadores utilizados para seleção podem estar localizados a 5 cM, 2 cM ou 1 cM (com base em um único mapa genético com base em meiose) de “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314- 001-K1.

[013] Em outra realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas de milho que exibem resistência à podridão do caule de antracnose, em que é obtida uma primeira planta de milho que compreende no seu genoma um haplótipo que compreende: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759- 001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1; a primeira planta de milho é cruzada em uma segunda planta de milho; plantas de prole são avaliadas para determinar o haplótipo ou pelo menos um alelo marcador ligado e associado ao haplótipo; e plantas de prole são selecionadas se possuírem o haplótipo.

[014] Uma planta de milho que é identificada e/ou selecionada como possuindo um ou mais alelos marcadores associados à resistência à podridão do caule de antracnose pode ser nativa do grupo heterótico Sintético de Caule Rígido de Iowa ou pode ser uma planta de prole derivada de outra cultivada no grupo heterótico Sintético de Caule Rígido de Iowa.

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[015] A presente invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir e da Listagem de Sequências que faz parte do presente pedido.

[016] As descrições de sequências e a Listagem de Sequências anexas ao presente atendem às normas que regem descrições de sequências de aminoácidos e/ou nucleotídeos em pedidos de patente conforme estabelecido em 37 C. F. R. §1.821 1.825. A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC UBMB descritos em Nucleic Acids Res. 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical J. 219 (2): 345-373 (1984), que são incorporados ao presente como referência. Os símbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. §1.822.

[017] SEQ ID N° 1 é a sequência de referência para o marcador PHM10315.

[018] SEQ ID N° 2 é a sequência de referência para o marcador PHM13944.

[019] SEQ ID N° 3 é a sequência de referência para o marcador PHM8022.

[020] SEQ ID N° 4 é a sequência de referência para o marcador PHM1204.

[021] SEQ ID N° 5 é a sequência de referência para o marcador PHM146.

[022] SEQ ID N° 6 é a sequência de referência para o marcador PHM8593.

[023] SEQ ID N° 7 é a sequência de referência para o marcador PHM4127.

[024] SEQ ID N° 8 é a sequência de referência para o marcador PHM14535.

[025] SEQ ID N° 9 é a sequência de referência para o marcador C12305-001-K001.

[026] SEQ ID N° 10 é a sequência de referência para o marcador C12307-001-K001.

[027] SEQ ID N° 11 é a sequência de referência para o marcador C16759-001-Q001.

[028] SEQ ID N° 12 é a sequência de referência para o marcador C16760-001-Q001.

[029] SEQ ID N° 13 é a sequência de referência para o marcador C12314-001-K001.

[030] SEQ ID N° 14 é a sequência de referência para o marcador C12315-001-K001.

[031] SEQ ID N° 15 é a sequência de referência para o marcador PHM15290-15-Q2.

[032] SEQ ID N° 16 é a sequência de referência para o marcador C12317-001-K001.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[033] São fornecidos no presente locais marcadores de milho que demonstram cossegregação estatisticamente significativa com a característica de resistência à podridão do caule de antracnose. Pode-se utilizar a detecção desses locais ou locais ligados adicionais na seleção assistida por marcador como parte de um programa de cultivo de milho para produzir plantas de milho que apresentam resistência à podridão do caule de antracnose.

[034] As definições a seguir são fornecidas como auxílio na compreensão da presente invenção.

[035] Deve-se compreender que a presente invenção não se limita a realizações específicas que, naturalmente, podem variar. Deve-se também compreender que a terminologia utilizada no presente destina-se somente a propósitos de descrição de realizações específicas e não se destina a ser limitadora. Da forma utilizada no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, os termos no singular e as formas no singular “um”, “uma” e “o/a”, por exemplo, incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Referência, por exemplo, a “planta”, “a planta” ou “uma planta”, portanto, também inclui uma série de plantas; além disso, dependendo do contexto, o uso do termo “planta” pode também incluir prole geneticamente idêntica ou similar daquela planta; o uso da expressão “ácido nucleico” inclui opcionalmente, de forma prática, várias cópias daquela molécula de ácido nucleico; de forma similar, o termo “sonda" engloba, opcional e tipicamente, muitas moléculas de sonda idênticas ou similares.

[036] A menos que indicado em contrário, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita, em orientação 5’ para 3’. As faixas numéricas indicadas no relatório descritivo incluem os números que definem a faixa e qualquer número inteiro ou fração não inteira dentro da faixa definida. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado comumente compreendido pelos técnicos comuns no assunto a que pertence a presente invenção. Embora possam ser utilizados quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente para teste do objeto indicado no presente relatório descritivo, são descritos no presente os métodos e materiais preferidos. Ao descrever e reivindicar o objeto da presente invenção, será utilizada a terminologia a seguir de acordo com as definições estabelecidas abaixo.

[037] O termo “alelo” designa uma ou mais sequências de nucleotídeos diferentes que ocorrem em um local específico.

[038] “Frequência de alelo” designa a frequência (proporção ou percentual) na qual um alelo está presente em um local dentro de um indivíduo, dentro de uma linhagem ou dentro de uma população de linhagens. Para um alelo “A”, por exemplo, indivíduos diploides do genótipo “AA”, “Aa” ou “aa” possuem frequências de alelo de 1,0, 0,5 ou 0,0, respectivamente. Pode-se estimar a frequência de alelo dentro de uma linhagem por meio de cálculo da média das frequências de alelos de uma amostra de indivíduos daquela linhagem. De forma similar, pode-se calcular a frequência de alelos dentro de uma população de linhagens por meio de cálculo da média das frequências de alelos de linhagens que compõem a população. Para uma população com quantidade finita de indivíduos ou linhagens, uma frequência de alelos pode ser expressa na forma de contagem de indivíduos ou linhagens (ou qualquer outro agrupamento especificado) que contêm o alelo.

[039] Um “amplicon” é um ácido nucleico amplificado, tal como um ácido nucleico que é produzido por meio da amplificação de um modelo de ácido nucleico por meio de qualquer método de amplificação disponível (tal como PCR, LCR, transcrição ou similares).

[040] O termo “amplificação”, no contexto da amplificação de ácidos nucleicos, é qualquer processo por meio do qual são produzidas cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado (ou uma de suas formas transcritas). Métodos de amplificação típicos incluem diversos métodos de reprodução com base em polimerase, incluindo a reação em cadeia de polimerase (PCR), métodos mediados por ligase tais como métodos de amplificação com base em reação em cadeia de ligase (LCR) e RNA polimerase (tal como por meio de transcrição).

[041] O termo “reunião” aplica-se a BACs e suas propensões a reunir-se para formar estiramentos contíguos de DNA. Um BAC “reúne-se” em um contíguo com base no alinhamento de sequências, caso o BAC seja sequenciado, ou por meio do alinhamento da sua impressão digital de BAC com as impressões digitais de outros BACs. Conjuntos públicos podem ser encontrados utilizando o Navegador de Genoma de Milho, que é disponível ao público na Internet.

[042] Um alelo é “associado” a uma característica quando é parte de um alelo ou sequência de DNA que afeta a expressão da característica, ou ligado a ele(a). A presença do alelo é um indicador de como será expressa a característica.

[043] “BAC”, ou cromossomo artificial bacteriano, é um vetor de clonagem derivado do fator F de ocorrência natural de Escherichia coli, que, por si próprio, é um elemento de DNA que pode existir na forma de plasmídeo circular ou pode ser integrado ao cromossomo bacteriano. BACs podem aceitar grandes insertos de sequência de DNA. Em milho, diversos BACs, cada qual contendo um grande inserto de DNA genômico de milho da linhagem congênita de milho B73, foram reunidos em contíguos (fragmentos genéticos contíguos sobrepostos, ou “DNA contíguo”) e esse conjunto é disponível ao público na Internet.

[044] Impressão digital de BAC é um meio de análise da similaridade entre diversas amostras de DNA com base na presença ou ausência de locais de restrição específicos (em que locais de restrição são sequências de nucleotídeos reconhecidas por enzimas que cortam ou “restringem” o DNA). Duas ou mais amostras de BAC são digeridas com o mesmo conjunto de enzimas de restrição e os tamanhos dos fragmentos formados são comparados, normalmente utilizando separação de gel.

[045] “Retrocruzamento” designa o processo por meio do qual a prole híbrida é repetidamente retrocruzada em um dos seus pais. Em um esquema de retrocruzamento, o pai “doador” designa a planta parental com o(s) gene(s) ou local(is) desejado(s), ou fenótipo específico, a sofrer(em) introgressão. O pai “receptor” (utilizado uma ou mais vezes) ou pai “recorrente” (utilizado duas ou mais vezes) designa a planta parental na qual o gene ou local sofre introgressão. Vide, por exemplo, Ragot, M. et al (1995), Marker-Assisted Backcrossing: a Practical Example, em Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol. 72, págs. 45-56 e Openshaw et al (1994), Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, págs. 41-43. O cruzamento inicial dá origem à geração F1; o termo “BC1” designa o segundo uso do pai recorrente, “BC2” designa o terceiro uso do pai recorrente e assim por diante.

[046] Centimorgan (“cM”) é uma unidade de medida da frequência de recombinação. 1 cM é igual a 1% de chance de que um marcador em um local genético será separado de um marcador em um segundo local devido ao cruzamento em uma única geração.

[047] Da forma utilizada no presente, a expressão “intervalo cromossômico” designa um espaço linear contíguo de DNA genômico que reside na planta sobre um único cromossomo. Os elementos genéticos ou genes localizados sobre um único intervalo cromossômico são fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo cromossômico não é particularmente limitado. Em alguns aspectos, os elementos genéticos localizados dentro de um único intervalo cromossômico são geneticamente ligados, tipicamente com uma distância de recombinação genética, por exemplo, menor ou igual a 20 cM ou, alternativamente, menor ou igual a 10 cM. Isso significa que dois elementos genéticos em um único intervalo cromossômico sofrem recombinação em frequência menor ou igual a 20% ou 10%.

[048] “Cromossomo” é um pedaço isolado de DNA bobinado que contém muitos genes que agem e movem-se em conjunto durante a divisão celular e, portanto, pode-se afirmar que eles são ligados. Ele pode também ser denominado “grupo de ligação”.

[049] A expressão “ligação próxima”, no presente pedido, indica que a recombinação entre dois locais ligados ocorre com frequência menor ou igual a cerca de 10% (ou seja, eles estão separados em um mapa genético em não mais de 10 cM). Em outras palavras, os locais em ligação próxima cossegregam-se em pelo menos 90% do tempo. Locais marcadores são especialmente úteis com relação ao objeto da presente invenção quando demonstram probabilidade significativa de cossegregação (ligação) com uma característica desejada (por exemplo, resistência à podridão do caule de antracnose). Locais em ligação próxima, tais como um local marcador e um segundo local, podem exibir frequência de recombinação entre locais de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 8% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 7% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 6% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 5% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 4% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 3% ou menos e, de preferência ainda maior, cerca de 2% ou menos. Em realizações de alta preferência, os locais relevantes exibem frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, de maior preferência cerca de 0,5% ou menos ou, de preferência ainda maior, cerca de 0,25% ou menos. Também se afirma que dois locais no mesmo cromossomo e em uma distância tal que a recombinação entre os dois locais ocorra em frequência de menos de 10% (tal como cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) estão “próximos” entre si. Em alguns casos, dois marcadores diferentes podem ter as mesmas coordenadas de mapa genético. Neste caso, os dois marcadores encontram-se em tal proximidade entre si que a recombinação entre eles ocorre com tão baixa frequência que não pode ser detectada.

[050] O termo “complemento” designa uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma dada sequência de nucleotídeos, ou seja, as sequências são relacionadas pelas regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick.

[051] A expressão “DNA contíguo” designa uma linha sem interrupções de DNA genômico representada por pedaços parcialmente sobrepostos ou contíguos.

[052] Com referência à relação entre dois elementos genéticos, tais como um elemento genético que contribui com o aumento da resistência à podridão do caule de antracnose e um marcador próximo, ligação de fase de “acoplamento” indica o estado em que o alelo “favorável” no local de resistência à podridão do caule de antracnose é fisicamente associado sobre a mesma fita de cromossomo do alelo “favorável” do local marcador ligado correspondente. Na fase de acoplamento, os dois alelos favoráveis são herdados juntos pela prole que herda aquela fita de cromossomo.

[053] O termo “cruzado” ou “cruzamento” indica cruzamento sexual e envolveu a fusão de dois gametas haploides por meio de polinização para produzir prole diploide (tais como células, sementes ou plantas). O termo engloba a polinização de uma planta por outra e autocruzamento (ou autopolinização, tal como quando o pólen e o óvulo são da mesma planta).

[054] Uma planta denominada no presente como “diploide” contém dois conjuntos (genomas) de cromossomos.

[055] Uma planta denominada no presente “haploide duplo” é desenvolvida dobrando-se o conjunto haploide de cromossomos (ou seja, a metade da quantidade normal de cromossomos). Uma planta haploide dobrada contém dois conjuntos idênticos de cromossomos e todos os locais são considerados homozigóticos.

[056] “Linhagem de elite” é qualquer linhagem que tenha resultado do cultivo e seleção em busca de desempenho agronômico superior.

[057] “Linhagem de milho exótica” ou “germoplasma de milho exótico” é uma linhagem derivada de planta de milho não pertencente a uma linhagem de milho de elite disponível ou linhagem de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas plantas de milho ou linhagens de germoplasma, um germoplasma exótico não apresenta relação próxima de descendente com o germoplasma de elite com o qual é cruzado. Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de nenhuma linhagem de elite de milho conhecida, mas sim é selecionado para introduzir elementos genéticos inovadores (tipicamente alelos inovadores) em um programa de cultivo.

[058] “Alelo favorável” é o alelo em um local específico (marcador, QTL etc.) que confere ou contribui com um fenótipo agronomicamente desejável, tal como resistência à podridão do caule de antracnose, e que permite a identificação de plantas com aquele fenótipo agronomicamente desejável. Alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que se segrega com o fenótipo favorável.

[059] “Fragmento” destina-se a indicar uma parte de uma sequência de nucleotídeos. Os fragmentos podem ser utilizados como sondas de hibridização ou primers de PCR empregando os métodos descritos no presente.

[060] “Mapa genético” é uma descrição de relações de ligação genética entre locais sobre um ou mais cromossomos (ou grupos de ligação) em uma dada espécie, geralmente ilustrados em forma de diagrama ou tabular. Para cada mapa genético, as distâncias entre os locais são medidas pela frequência com que seus alelos aparecem juntos em uma população (suas frequências de recombinação). Os alelos podem ser detectados utilizando marcadores de proteína ou DNA, ou fenótipos observáveis. Um mapa genético é um produto da população de mapeamento, tipos de marcadores utilizados e potencial polimórfico de cada marcador entre populações diferentes. As distâncias genéticas entre os locais podem diferir de um mapa genético para outro. As informações podem ser correlacionadas de um mapa para outro, entretanto, utilizando marcadores comuns. Os técnicos comuns no assunto podem utilizar posições de marcadores comuns para identificar as posições de marcadores e outros locais de interesse em cada mapa genético individual. A ordem dos locais não deverá alterar-se entre os mapas, embora frequentemente existam pequenas alterações da ordem dos marcadores devido, por exemplo, a marcadores que detectam locais duplicados alternados em populações diferentes, diferenças de abordagens estatísticas utilizadas para ordenar os marcadores, mutações inovadoras ou erros de laboratório.

[061] “Local de mapa genético” é um local em um mapa genético relativo a marcadores genéticos vizinhos sobre o mesmo grupo de ligação, em que pode ser encontrado um marcador especificado em uma dada espécie.

[062] “Mapeamento genético” é o processo de definição das relações de ligação de locais por meio do uso de marcadores genéticos, populações que segregam os marcadores e princípios genéticos padrão de frequência de recombinação.

[063] “Marcadores genéticos” são ácidos nucleicos que são polimórficos em uma população e cujos alelos podem ser detectados e diferenciados por um ou mais métodos analíticos, tais como RFLP, AFLP, isozima, SNP, SSR e similares. A expressão também se refere a sequência de ácidos nucleicos complementares às sequências genômicas, tais como ácidos nucleicos utilizados como sondas. Os marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por meio de métodos bem estabelecidos na técnica. Estes incluem, por exemplo, métodos de amplificação específicos de sequências com base em PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozimas, detecção de polimorfismos de nucleotídeos por meio de hibridização específica de alelos (ASH), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma vegetal, detecção de reprodução de sequências autossustentadas, detecção de repetições de sequências simples (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs). Também são conhecidos métodos bem estabelecidos de detecção de marcas de sequências expressas (ESTs) e marcadores SSR derivados de sequências EST e DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD).

[064] “Frequência de recombinação genética” é a frequência de um cruzamento sobre eventos (recombinação) entre dois locais genéticos. A frequência de recombinação pode ser observada seguindo-se a segregação de marcadores e/ou características após a meiose.

[065] “Genoma” designa o DNA total ou todo o conjunto de genes conduzido por um cromossomo ou conjunto de cromossomos.

[066] O termo “genótipo” é a constituição genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais locais genéticos. Genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um ou mais locais conhecidos que o indivíduo herdou dos seus pais. O termo genótipo pode ser utilizado para indicar a constituição genética de um indivíduo em um único local, em diversos locais ou, de forma mais geral, o termo genótipo pode ser utilizado para indicar a composição genética de um indivíduo para todos os genes no seu genoma.

[067] “Germoplasma” designa o material genético de um indivíduo (tal como uma planta), um grupo de indivíduos (tal como uma linhagem, variedade ou família de plantas) ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultivo ou, de forma mais geral, todos os indivíduos de uma espécie ou várias espécies (por exemplo, coleção de germoplasma de milho ou coleção de germoplasma dos Andes). O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula, ou pode ser separado do organismo ou célula. Geralmente, o germoplasma fornece material genético com composição molecular específica que fornece base física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um organismo ou cultivo celular. Da forma utilizada no presente, germoplasma inclui células, sementes ou tecidos dos quais podem ser cultivadas novas plantas ou partes de plantas, tais como folhas, hastes, pólen ou células que podem ser cultivadas em uma planta inteira.

[068] Uma planta denominada “haploide” contém um único conjunto (genoma) de cromossomos.

[069] “Haplótipo” é o genótipo de um indivíduo em uma série de locais genéticos, ou seja, uma combinação de alelos. Tipicamente, os locais genéticos descritos por um haplótipo são ligados física e geneticamente, ou seja, sobre o mesmo segmento de cromosomo.

[070] O termo “heterogeneidade” é utilizado para indicar que indivíduos no grupo diferem de genótipo em um ou mais locais específicos.

[071] A reação heterótica de material, ou “heterose”, pode ser definida como desempenho que excede a média dos pais (ou pai alto) quando cruzados com outros grupos dissimilares ou não relacionados.

[072] Um “grupo heterótico” compreende um conjunto de genótipos que apresentam bom desempenho quando cruzados com genótipos de um grupo heterótico diferente (Hallauer et al (1998), Corn breeding, págs. 463-564, em G. F. Sprague e J. W. Dudley (ed.), Corn and Corn Improvement). Linhagens congênitas são classificadas em grupos heteróticos e são adicionalmente subdivididas em famílias em um grupo heterótico, com base em diversos critérios, tais como pedigree, associações com base em marcadores moleculares e desempenho em combinações híbridas (Smith et al (1990), Theor. Appl. Gen. 80: 833-840). Os dois grupos heteróticos mais amplamente utilizados nos Estados Unidos são denominados “Sintético de Caule Rígido de Iowa” (também denominado no presente “caule rígido”) e “Lancaster” ou “Safra Segura de Lancaster” (às vezes denominado NSS ou Caule Não Rígido).

[073] Alguns grupos heteróticos possuem as características necessárias para ser mãe e outros, características de pai. Em milho, por exemplo, os resultados de produção de congênitos públicos liberados de uma população denominada BSSS (população Sintética de Caule Rígido de Iowa) tornaram esses congênitos e seus derivados o conjunto de fêmeas do Cinturão do Milho central. Congênitos de BSSS foram cruzados com outros congênitos, tais como SD 105 e Milho Amargo, e esse grupo geral de materiais tornou-se conhecido como Sintéticos de Caule Rígido (SSS), muito embora nem todos os congênitos sejam derivados da população de BSSS original (Mikel e Dudley (2006), Crop Sci. 46: 1193-1205). Como padrão, todos os outros congênitos que se combinam bem com os congênitos de SSS foram atribuídos ao conjunto macho que, por falta de nome melhor, foi denominado NSS, ou seja, Caule Não Rígido. Este grupo inclui vários grupos heteróticos importantes, tais como Lancaster Surecrop, Iodent e Leaming Corn.

[074] Um indivíduo é “heterozigótico” caso mais de um tipo de alelo esteja presente em um dado local (tal como um indivíduo diploide com uma cópia cada de dois alelos diferentes).

[075] O termo “homogeneidade” indica que membros de um grupo possuem o mesmo genótipo em um ou mais locais específicos.

[076] Um indivíduo é “homozigótico” se o indivíduo contiver apenas um tipo de alelo em um dado local (um indivíduo diploide, por exemplo, contém uma cópia do mesmo alelo em um local para cada um dos dois cromossomos homólogos).

[077] O termo “híbrido” designa a prole obtida entre o cruzamento de pelo menos dois pais geneticamente dissimilares.

[078] “Hibridização” ou “hibridização de ácido nucleico” designa o emparelhamento de fitas de RNA e DNA complementares, bem como o emparelhamento de fitas simples de DNA complementar.

[079] O termo “hibridizar” indica formar pares de bases entre regiões complementares de fitas de ácido nucleico.

[080] “Mapa genético IBM” pode designar qualquer um dos mapas a seguir: IBM, IBM2, vizinhos de IBM2, IBM2 FPC0507, vizinhos de IBM2 2004, vizinhos de IBM2 2005, quadro de vizinhos de IBM2 2005, vizinhos de IBM2 2008, quadro de vizinhos de IBM2 2008 ou a última versão do Website maizeGDB. Os mapas genéticos IBM são baseados em uma população B73 x Mo17 na qual a prole do cruzamento inicial foi acasalada aleatoriamente por diversas gerações antes da construção de linhagens congênitas recombinantes para mapeamento. Versões mais novas refletem a adição de locais mapeados por BAC e genéticos bem como refinamento do mapa aprimorado devido à incorporação de informações obtidas de outros mapas genéticos ou mapas físicos, dados limpos ou ao uso de novos algoritmos.

[081] O termo “congênito” indica uma linhagem que foi cultivada por homogeneidade genética.

[082] O termo “indel” designa uma inserção ou exclusão, em que uma linhagem pode ser indicada como contendo um nucleotídeo inserido ou pedaço de DNA com relação a uma segunda linhagem ou a segunda linhagem pode ser indicada como possuindo um nucleotídeo excluído ou pedaço de DNA com relação à primeira linhagem.

[083] O termo “introgressão” designa a transmissão de um alelo desejado de um local genético de um antecedente genético para outro. A introgressão de um alelo desejado em um local especificado pode ser transmitida, por exemplo, para pelo menos uma prole por meio de cruzamento sexual entre dois pais da mesma espécie, em que pelo menos um dos pais contém o alelo desejado no seu genoma. Alternativamente, por exemplo, pode ocorrer transmissão de um alelo por meio de recombinação entre dois genomas doadores, tal como em um protoplasta fundido, em que pelo menos um dos protoplastas doadores contém o alelo desejado no seu genoma. O alelo desejado pode ser detectado, por exemplo, por um marcador que é associado a um fenótipo, em QTL, transgene ou similar. Em qualquer dos casos, prole que compreende o alelo desejado pode ser retrocruzada repetidamente em uma linhagem que possui um antecedente genético desejado e selecionada em busca do alelo desejado, para resultar na fixação do alelo em um antecedente genético selecionado.

[084] O processo de “introgressão” frequentemente é denominado “retrocruzamento” quando o processo for repetido por duas ou mais vezes.

[085] “Linhagem” é um grupo de indivíduos com pais idênticos que são geralmente congênitos até certo grau e geralmente homozigóticos e homogêneos na maior parte dos locais (isogênicos ou quase isogênicos). “Sublinhagem” designa um subconjunto congênito de descendentes que são geneticamente distintos de outros subconjuntos congênitos similares que descendem do mesmo progenitor.

[086] Da forma utilizada no presente, o termo “ligação” é utilizado para descrever o grau com que o local marcador é associado a outro local marcador ou algum outro local. A relação de ligação entre um marcador molecular e um local que afeta um fenótipo é fornecida como “probabilidade” ou “probabilidade ajustada”. A ligação pode ser expressa como uma faixa ou limite desejado. Em algumas realizações, por exemplo, qualquer marcador é ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador quando os marcadores forem separados em menos de 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 unidades de mapa (ou cM) de um único mapa de meiose (mapa genético com base em uma população que passou por uma rodada de meiose, tal como F2; os mapas IBM2 consistem de diversas meioses). Em alguns aspectos, é vantajoso definir uma faixa de ligação limitada, tal como 10 a 20 cM, 10 a 30 cM ou 10 a 40 cM. Quanto mais próximo um marcador for ligado a um segundo local, melhor torna-se o indicador para o segundo local. Desta forma, “locais em ligação próxima” tais como um local marcador e um segundo local exibem frequência de recombinação entre locais de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, de maior preferência cerca de 8% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 7% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 6% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 5% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 4% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 3% ou menos e, de preferência ainda maior, cerca de 2% ou menos. Em realizações de alta preferência, os locais relevantes exibem frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, de maior preferência cerca de 0,5% ou menos ou, de preferência ainda maior, cerca de 0,25% ou menos. Também se afirma que dois locais no mesmo cromossomo e em uma distância tal que a recombinação entre os dois locais ocorre em frequência de menos de 10% (tal como cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) estão “próximos” entre si. Como 1 cM é a distância entre dois marcadores que exibem frequência de recombinação de 1%, qualquer marcador está ligado de forma próxima (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador que se encontre em boa proximidade, tal como a 10 cM de distância ou menos. Dois marcadores com ligação próxima sobre o mesmo cromossomo podem ser posicionados a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos entre si.

[087] A expressão “desequilíbrio de ligação” designa segregação não aleatória de locais ou características genéticas (ou ambos). Em qualquer um dos casos, desequilíbrio de ligação indica que os locais relevantes encontram- se em proximidade física suficiente ao longo de um comprimento de um cromossomo, de tal forma que sejam segregados juntos com frequência maior que a aleatória (ou seja, não aleatória). Os marcadores que exibem desequilíbrio de ligação são considerados ligados. Locais ligados cossegregam-se mais de 50% do tempo, tal como de cerca de 51% a cerca de 100% do tempo. Em outras palavras, dois marcadores que se cossegregam possuem frequência de recombinação de menos de 50% (e, por definição, são separados em menos de 50 cM sobre o mesmo grupo de ligação). Da forma utilizada no presente, a ligação pode ser realizada entre dois marcadores ou, alternativamente, entre um marcador e um local que afeta um fenótipo. Um local marcador pode ser "associado" (ligado) a uma característica. O grau de ligação de um local marcador e um local que afeta uma característica fenotípica é medido, por exemplo, na forma de probabilidade estatística de cossegregação daquele marcador molecular com o fenótipo (por exemplo, estatística F ou avaliação LOD).

[088] O desequilíbrio de ligação é mais comumente determinado utilizando a medida r2, que é calculada utilizando a fórmula descrita por Hill, W. G. e Robertson, A., Theor. Appl. Genet. 38: 226-231 (1968). Quando r2 = 1, existe LD completo entre os dois locais marcadores, o que significa que os marcadores não foram separados por meio de recombinação e possuem a mesma frequência de alelos. O valor de r2 dependerá da população utilizada. Valores de r2 acima de 1/3 indicam LD suficientemente forte para que seja útil para mapeamento (Ardlie et al, Nature Reviews Genetics 3: 299-309 (2002)). Portanto, os alelos encontram-se em desequilíbrio de ligação quando os valores de r2 entre locais marcadores em pares forem maiores ou iguais a 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0.

[089] Da forma utilizada no presente, “equilíbrio de ligação” descreve uma situação na qual dois marcadores segregam-se independentemente, ou seja, classificam-se aleatoriamente entre a prole. Marcadores que exibem equilíbrio de ligação são considerados não ligados (quer dependam eles ou não do mesmo cromossomo).

[090] “Local” é uma posição sobre um cromossomo, por exemplo, na qual está localizado um nucleotídeo, gene, sequência ou marcador.

[091] O “logaritmo de valor de probabilidade (LOD)” ou “avaliação LOD” (Risch, Science 255: 803-804 (1992)) é utilizado em mapeamento de intervalos genéticos para descrever o grau de ligação entre dois locais marcadores. Avaliação LOD de três entre dois marcadores indica que a ligação é mil vezes mais provável que nenhuma ligação, enquanto avaliação LOD de dois indica que a ligação é cem vezes mais provável que nenhuma ligação. Avaliações LOD maiores ou iguais a dois podem ser utilizadas para detectar ligação. Avaliações LOD podem também ser utilizadas para exibir a força de associação entre locais marcadores e características quantitativas em mapeamento de “locais de características quantitativas”. Neste caso, o tamanho da avaliação LOD depende da proximidade entre o local marcador e o local que afeta a característica quantitativa, bem como o tamanho do efeito de característica quantitativa.

[092] “Milho” designa uma planta de Zea mays L. ssp. mays.

[093] A expressão “planta de milho” inclui plantas de milho inteiras, células de plantas de milho, protoplasta de planta de milho, célula de planta de milho ou cultivo de tecido de milho do qual as plantas de milho podem ser regeneradas, calos de plantas de milho, conjuntos de plantas de milho e células de plantas de milho que são intactas em plantas de milho ou partes de plantas de milho, tais como sementes de milho, espigas de milho, flores de milho, cotilédones de milho, folhas de milho, hastes de milho, botões de milho, raízes de milho, extremidades de raízes de milho e similares.

[094] “Marcador” é um meio de encontrar posição sobre um mapa genético ou físico, ou ligações entre marcadores e locais de caraterísticas (locais que afetam características). A posição detectada pelo marcador pode ser conhecida por meio de detecção de alelos polimórficos e seu mapeamento genético, ou por meio de hibridização, coincidência de sequências ou amplificação de sequência que foi mapeada fisicamente. O marcador pode ser marcador de DNA (detecta polimorfismos de DNA), proteína (detecta variação em polipeptídeo codificado) ou simplesmente fenótipo herdado (tal como o fenótipo “ceroso”). Um marcador de DNA pode ser desenvolvido a partir da sequência de nucleotídeos genômicos ou de sequências de nucleotídeos expressas (tal como de um RNA ou cDNA dividido). Dependendo da tecnologia de marcador de DNA, o marcador consistirá de primers complementares que ladeiam o local e/ou sondas complementares que se hibridizam em alelos polimórficos no local. Marcador de DNA ou marcador genético pode também ser utilizado para descrever o gene, sequência de DNA ou nucleotídeo sobre o próprio cromossomo (em vez dos componentes utilizados para detectar a sequência de DNA ou gene) e é frequentemente utilizado quando aquele marcador de DNA é associado a uma característica específica em genética humana (tal como um marcador de câncer de mama). A expressão local marcador é o local (gene, sequência ou nucleotídeo) detectado pelo marcador.

[095] Os marcadores que detectam polimorfismos genéticos entre membros de uma população são bem estabelecidos na técnica. Os marcadores podem ser definidos pelo tipo de polimorfismo que detectam e também a tecnologia marcadora utilizada para detectar o polimorfismo. Os tipos de marcadores incluem, mas sem limitações, por exemplo, detecção de polimorfismos com comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozimas, DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), polimorfismos com comprimento de fragmento amplificado (AFLPs), detecção de repetições de sequências simples (SSRs), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma vegetal, detecção de reprodução de sequências autossustentadas ou detecção de polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPs). SNPs podem ser detectados, por exemplo, por meio de sequenciamento de DNA, métodos de amplificação específica de sequências com base em PCR, detecção de polimorfismos de polinucleotídeos por meio de hibridização específica de alelos (ASH), hibridização específica de alelos dinâmicos (DASH), faróis moleculares, hibridização de microconjuntos, testes de ligase de oligonucleotídeos, Flap endonucleases, 5’ endonucleases, extensão de primers, polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP) ou eletroforese de gel de gradiente de temperatura (TGGE). Sequenciamento de DNA, tal como a tecnologia de pirossequenciamento, possui a vantagem de poder detectar uma série de alelos de SNP ligados que constituem um haplótipo. Os haplótipos tendem a ser mais informativos (detectar nível mais alto de polimorfismo) que SNPs.

[096] “Alelo marcador”, alternativamente “alelo de um local marcador”, pode designar uma ou uma série de sequências de nucleotídeos polimórficos encontrada em um local marcador em uma população.

[097] “Seleção assistida por marcadores” (de MAS) é um processo por meio do qual plantas individuais são selecionadas com base em genótipos marcadores.

[098] “Contrasseleção assistida por marcadores” é um processo por meio do qual são utilizados genótipos marcadores para identificar plantas que não serão selecionadas, permitindo a sua remoção de um programa de cultivo ou plantio.

[099] “Haplótipo marcador” designa uma combinação de alelos em um local marcador.

[100] “Local marcador” é um local de cromossomo específico no genoma de uma espécie no qual pode ser encontrado um marcador específico. Um “local marcador” pode ser utilizado para rastrear a presença de um segundo local ligado, tal como um local que afeta a expressão de uma característica fenotípica. Um local marcador pode ser utilizado, por exemplo, para monitorar a segregação de alelos em um local genética ou fisicamente ligado.

[101] “Sonda marcadora” é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula que pode ser utilizada para identificar a presença de um local marcador, tal como uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de local marcador, por meio da hibridização de ácidos nucleicos. Sondas marcadoras que compreendem trinta ou mais nucleotídeos contíguos do local marcador (a sequência de local marcador, “no todo ou em parte”) podem ser utilizadas para hibridização de ácidos nucleicos. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora designa uma sonda de qualquer tipo que seja capaz de diferenciar (ou seja, genotipificar) o alelo específico que se encontra presente em um local marcador.

[102] A expressão “marcador molecular” pode ser utilizada para designar um marcador genético, conforme definido acima, ou seu produto codificado (tal como proteína) utilizado como ponto de referência ao identificar um local ligado. Um marcador pode ser derivado de sequências de nucleotídeos genômicas ou de sequências de nucleotídeos expressas (tal como de um RNA dividido, cDNA etc.) ou de um polipeptídeo codificado. A expressão também designa sequências de ácidos nucleicos complementares ou laterais às sequências de marcadores, tais como ácidos nucleicos utilizados como sondas ou pares de primers capazes de amplificar a sequência de marcadores. “Sonda marcadora molecular” é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula que pode ser utilizada para identificar a presença de um local marcador, tal como uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de local marcador. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora designa uma sonda de qualquer tipo que seja capaz de diferenciar (ou seja, genotipificar) o alelo específico que se encontra presente em um local marcador. Ácidos nucleicos são “complementares” quando se hibridizam especificamente em solução, tal como de acordo com normas de emparelhamento de bases Watson-Crick. Alguns dos marcadores descritos no presente também são denominados marcadores de hibridização quando localizados sobre uma região indel, tal como a região não colinear descrita no presente. Isso ocorre porque a região de inserção é, por definição, um polimorfismo com relação a uma planta sem a inserção. Desta forma, o marcador necessita indicar apenas se a região indel está presente ou ausente. Qualquer tecnologia de detecção de marcadores apropriada pode ser utilizada para identificar esse marcador de hibridização; tecnologia SNP, por exemplo, é utilizada nos exemplos fornecidos no presente.

[103] Um alelo é “negativamente” correlacionado a uma característica quando for ligado a ela e quando a presença do alelo for um indicador de que uma característica ou forma de característica desejada não ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.

[104] “Sequência de nucleotídeos”, “polinucleotídeo”, “sequência de ácidos nucleicos” e “fragmento de ácido nucleico” são utilizados de forma intercambiável e designam um polímero de RNA ou DNA que possui fita simples ou dupla e contém opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. “Nucleotídeo” é uma unidade monomérica a partir da qual são construídos polímeros de DNA ou RNA e consiste de uma base de purina ou pirimidina, pentose e um grupo de ácido fosfórico. Nucleotídeos (normalmente encontrados na sua forma de 5’-monofosfato) são indicados pela sua designação de letra única conforme segue: “A” para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citidilato ou desoxicitidilato, “G” para guanilato ou desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para purinas (A ou G), “Y” para pirimidinas (C ou T), “K” para G ou T, “H” para A, C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.

[105] As expressões “fenótipo”, “característica fenotípica” ou “característica” podem designar a expressão observável de um gene ou de uma série de genes. O fenótipo pode ser observável a olho nu ou por qualquer outro meio de avaliação conhecido na técnica, tal como pesagem, contagem, medição (do comprimento, largura, ângulos etc.), microscopia, análise bioquímica ou teste eletromecânico. Em alguns casos, um fenótipo é diretamente controlado por um único gene ou local genético, ou seja, uma “única característica genética” ou “característica simplesmente herdada”. Na ausência de grandes níveis de variação ambiental, características genéticas isoladas podem segregar-se em uma população para gerar distribuição “discreta” ou "qualitativa", ou seja, o fenótipo enquadra-se em classes discretas. Em outros casos, fenótipo é o resultado de diversos genes e pode ser considerado “característica multigênica” ou “característica complexa”. Características multigênicas segregam-se em uma população para gerar distribuição “quantitativa” ou “contínua”, ou seja, o fenótipo não pode ser separado em classes discretas. Características de genes isolados e multigênicas podem ser afetadas pelo ambiente no qual estão sendo expressas, mas características multigênicas tendem a possuir componente ambiental maior.

[106] “Mapa físico” do genoma é um mapa que exibe a ordem linear de marcas identificáveis (incluindo genes, marcadores etc.) sobre DNA de cromossomo. Ao contrário de mapas genéticos, entretanto, as distâncias entre marcas são absolutas (medidas, por exemplo, em pares de bases ou fragmentos genéticos contíguos sobrepostos e isolados) e não com base em recombinação genética (que pode variar em diferentes populações).

[107] “Planta” pode ser uma planta integral, qualquer uma de suas partes ou um cultivo de células ou tecidos derivado de uma planta. Desta forma, o termo “planta” pode designar qualquer um dentre: plantas inteiras, componentes ou órgãos de plantas (tais como folhas, hastes, raízes etc.), tecidos vegetais, sementes, células de plantas e/ou sua prole. Célula vegetal é uma célula de uma planta, tomada de uma planta ou derivada por meio do cultivo de uma célula tomada de uma planta.

[108] Planta de milho “derivada de congênito na população Sintética de Caule Rígido” pode ser híbrida.

[109] “Polimorfismo” é uma variação do DNA entre dois ou mais indivíduos em uma população. Polimorfismo possui preferencialmente frequência de pelo menos 1% em uma população. Polimorfismo útil pode incluir um polimorfismo de nucleotídeo isolado (SNP), uma repetição de sequências simples (SSR) ou um polimorfismo de inserção e exclusão, também denominado no presente “indel”.

[110] Um alelo correlaciona-se “positivamente” a uma característica quando for ligado a ela e quando a presença do alelo for um indicador de que a característica ou forma de característica desejada ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.

[111] O “valor de probabilidade” ou “valor p” é a probabilidade estatística de que a combinação específica de um fenótipo e a presença ou ausência de um alelo marcador específico seja aleatória. Desta forma, quanto mais baixa a avaliação de probabilidades, maior a propensão à associação entre um local e um fenótipo. A avaliação de probabilidades pode ser afetada pela proximidade do primeiro local (normalmente um local marcador) e do local que afeta o fenótipo, mais a magnitude do efeito fenotípico (a mudança de fenótipo causada por substituição de alelo). Em alguns aspectos, a avaliação de probabilidades é considerada “significativa” ou “não significativa”. Em algumas realizações, avaliação de probabilidades de 0,05 (p = 0,05 ou probabilidade de 5%) de determinação aleatória é considerada indicação significativa de associação. Uma probabilidade aceitável pode ser, entretanto, qualquer probabilidade de menos de 50% (p = 0,5). Probabilidade significativa pode ser, por exemplo, menos de 0,25, menos de 0,20, menos de 0,15, menos de 0,1, menos de 0,05, menos de 0,01 ou menos de 0,001.

[112] “Marcador de produção” ou “marcador SNP de produção” é um marcador que tenha sido desenvolvido para propósitos de alto rendimento. Marcadores de SNP de produção são desenvolvidos para detectar polimorfismos específicos e projetados para uso com uma série de químicas e plataformas. Os nomes de marcadores utilizados no presente começam com prefixo PHM para indicar "Pioneer Hi-Bred Marker", seguido por um número que é específico para a sequência a partir da qual foi projetado, seguido por “.” ou “-“ e, em seguida, um sufixo que é específico para o polimorfismo de DNA. Pode também seguir- se uma versão do marcador (A, B, C etc.) que indica a versão do marcador projetado para aquele polimorfismo específico.

[113] O termo “prole” indica a prole gerada a partir de um cruzamento.

[114] “Planta de prole” é uma planta gerada a partir de um cruzamento entre duas plantas.

[115] A expressão “local de características quantitativas” ou “QTL” indica uma região de DNA que é associada à expressão diferencial de uma característica fenotípica quantitativa em pelo menos um fundo genético, tal como em pelo menos uma população de cultivo. A região do QTL engloba ou apresenta ligação próxima ao(s) gene(s) que afeta(m) a característica em questão.

[116] “Sequência de referência” ou “sequência de consenso” é uma sequência definida utilizada como base de comparação de sequências. A sequência de referência para um marcador de PHM é obtida por meio do sequenciamento de uma série de linhagens no local, alinhamento das sequências de nucleotídeos em um programa de alinhamento de sequências (por exemplo, Sequencher) e obtenção em seguida da sequência de nucleotídeos mais comum do alinhamento. Polimorfismos encontrados entre as sequências individuais são anotados dentro da sequência de consenso. Sequência de referência normalmente não é uma cópia exata de qualquer sequência de DNA individual, mas representa um amálgama de sequências disponíveis e é útil para projetar primers e sondas para polimorfismos na sequência.

[117] Em ligação de fases de “repulsão”, o alelo “favorável” no local de interesse é ligado fisicamente a um alelo “desfavorável” no local marcador próximo e os dois alelos “favoráveis” não são herdados juntos (ou seja, os dois locais estão “fora de fase” entre si).

[118] Da forma utilizada no presente, “resistência à podridão do caule de antracnose” designa aumento da resistência ou tolerância a patógenos fúngicos que causa podridão do caule de antracnose em comparação com plantas controle. Os efeitos podem variar de leve aumento da tolerância aos efeitos do patógeno fúngico (tais como inibição parcial) até a resistência total, de tal forma que a planta não seja afetada pela presença do patógeno fúngico. Nível mais alto de resistência contra um patógeno fúngico específico ou contra um espectro mais amplo de patógenos fúngicos constitui resistência fúngica “ampliada” ou aprimorada. As realizações da presente invenção ampliarão ou aumentarão a resistência ao patógeno fúngico que causa a podridão do caule de antracnose, de tal forma que a resistência da planta a patógeno(s) fúngico(s) será aumentada. O termo “ampliar” indica melhorar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, levantar e similares. As plantas descritas no presente como sendo resistentes à podridão do caule de antracnose podem também ser descritas, portanto, como sendo resistentes a infecções por Colletotrichum graminicola ou como possuindo “resistência aprimorada” a infecções por Colletotrichum graminicola.

[119] “Teste de cruzamento superior” é um teste realizado por meio do cruzamento de cada indivíduo (por exemplo, seleção, linhagem congênita, clone ou indivíduo de prole) com o mesmo pólen parental ou “de teste”, normalmente uma linhagem homozigótica.

[120] A expressão “sob condições estringentes” designa condições sob as quais uma sonda ou polinucleotídeo hibridizar-se-á em uma sequência de ácidos nucleicos específica, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas essencialmente sem outras sequências. Condições rigorosas são dependentes de sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Sequências mais longas hibridizam-se especificamente sob temperaturas mais altas. Geralmente, condições rigorosas são selecionadas como sendo 5-10 °C mais baixas que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica em pH sob resistência iônica definida. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica, pH e concentração de ácido nucleico definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam-se nas sequências alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas são ocupadas no equilíbrio). Condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é de menos de cerca de 1,0 M de íons de sódio, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íons de sódio (ou outros sais) sob pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos). Condições rigorosas podem também ser atingidas com a adição de agentes desestabilizantes, tais como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, sinal positivo é pelo menos duas vezes o fundo, preferencialmente dez vezes a hibridização de fundo. Exemplos de condições de hibridização rigorosas são frequentemente: 50% de formamida, 5x SSC e 1% SDS, incubação a 42 °C ou 5x SSC, 1% SDS, incubação a 65 °C, com lavagem em 0,2x SSC e 0,1% SDS a 65 °C. Para PCR, temperatura de cerca de 36 °C é típica para amplificação pouco rigorosa, embora as temperaturas de combinação possam variar de cerca de 32 °C a 48 °C, dependendo do comprimento do primer. Orientações adicionais para determinar parâmetros de hibridização são fornecidas em numerosas referências.

[121] “Alelo desfavorável” de um marcador é um alelo marcador que se segrega com o fenótipo vegetal desfavorável, de forma a fornecer o benefício de identificação de plantas que podem ser removidas de um programa de cultivo ou plantio.

[122] O termo “rendimento” designa a produtividade por unidade de área de um produto vegetal com valor comercial específico. O rendimento de milho, por exemplo, é normalmente medido em bushels de sementes por acre ou toneladas de sementes por hectare por estação. O rendimento é afetado por fatores genéticos e ambientais. “Agronomia”, “características agronômicas” e “desempenho agronômico” designam as características (e os elementos genéticos subjacentes) de uma dada variedade de planta que contribuem com o rendimento ao longo da estação de cultivo. Características agronômicas individuais incluem vigor de emergência, vigor vegetal, tolerância à tensão, tolerância ou resistência a doenças, resistência a herbicidas, formação de ramos, floração, definição de sementes, tamanho das sementes, densidade das sementes, resistência, capacidade de debulhar e similares. O rendimento é, portanto, o ápice de todas as características agronômicas.

[123] Alinhamentos de sequências e cálculos do percentual de identidade podem ser determinados utilizando uma série de métodos de comparação projetados para detectar sequências homólogas, incluindo, mas sem limitações, o programa MEGALIGN® da suíte de computação bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison WI). A menos que indicado em contrário, alinhamento múltiplo das sequências fornecidas no presente foi realizado utilizando o método de alinhamento CLUSTAL V (Higgins e Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989)) com os parâmetros padrão (PENALIDADE DO INTERVALO = 10, PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de sequências de proteínas utilizando o método Clustal V são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 2, PENALIDADE DO INTERVALO = 5, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 4 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 4. Após o alinhamento das sequências utilizando o programa CLUSTAL V, é possível obter valores de “percentual de identidade” e “divergência” observando-se a tabela “distâncias de sequências” no mesmo programa; a menos que indicado em contrário, os percentuais de identidade e divergências fornecidos e reivindicados no presente foram calculados desta forma.

[124] Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (a seguir, “Sambrook”).

MAPEAMENTO GENÉTICO

[125] Reconheceu-se por algum tempo que locais genéticos específicos correlacionados a fenótipos específicos, tais como resistência à podridão do caule de antracnose, podem ser mapeados no genoma de um organismo. O cultivador de plantas pode convenientemente utilizar marcadores moleculares para identificar indivíduos desejados por meio da detecção de alelos marcadores que exibem probabilidade estatisticamente significativa de cossegregação com um fenótipo desejado, manifestado na forma de desequilíbrio de ligação. Ao identificar um marcador molecular ou conjuntos de marcadores moleculares que se cossegregam com uma característica de interesse, o cultivador é capaz de selecionar rapidamente um fenótipo desejado por meio de seleção do alelo marcador molecular apropriado (um processo denominado seleção assistida por marcadores, ou MAS).

[126] Diversos métodos bem conhecidos na técnica são disponíveis para detectar marcadores moleculares ou conjuntos de marcadores moleculares que se cossegregam com uma característica de interesse, tal como a característica de resistência à podridão do caule de antracnose. A ideia básica subjacente a esses métodos é a detecção de marcadores, para os quais genótipos alternativos (ou alelos) possuem fenótipos médios significativamente diferentes. Desta forma, realiza-se comparação entre locais marcadores da magnitude de diferença entre genótipos alternativos (ou alelos) ou o nível de significado daquela diferença. Deduz-se que os genes de características encontram-se em local mais próximo do(s) marcador(es) que possui(em) a maior diferença genotípica associada. Dois desses métodos utilizados para detectar locais de características de interesse são: 1) análise de associação com base na população (ou seja, mapeamento de associação) e 2) análise de ligação tradicional.

MAPEAMENTO DE ASSOCIAÇÃO

[127] A compreensão da extensão e dos padrões de desequilíbrio de ligação (LD) no genoma é um requisito prévio do desenvolvimento de abordagens de associação eficientes para identificar e mapear locais de características quantitativas (QTL). Desequilíbrio de ligação (LD) designa a associação não aleatória de alelos em uma coleção de indivíduos. Quando LD é observado entre alelos em locais ligados, ele é medido como redução de LD ao longo de uma região específica de cromossomo. A extensão do LD é uma reflexão do histórico de recombinação daquela região. A taxa média de redução de LD em genoma pode ajudar a prever o número e a densidade de marcadores que são necessários para conduzir um estudo de associação de genoma e fornecer uma estimativa da resolução que pode ser esperada.

[128] A associação ou mapeamento de LD pretende identificar associações significativas entre genótipo e fenótipo. Ela foi explorada como ferramenta poderosa para mapeamento fino no cruzamento de espécies tais como humanos (Corder et al (1994), Protective effect of apolipoprotein-E type-2 allele for late-onset Alzheimer-disease, Nat. Genet. 7: 180-184; Hastbacka et al (1992), Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastrophic dysplasia in Finland, Nat. Genet. 2: 204-211; Kerem et al (1989), Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis, Science 245: 1073- 1080) e milho (Remington et al (2001), Structure of linkage disequilibrium and phenotype associations in the maize genome, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98: 11479-11484; Thornsberry et al (2001), Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time, Nat. Genet. 28: 286-289; analisado por Flint-Garcia et al (2003), Structure of linkage disequilibrium in plants, Annu. Rev. Plant Biol. 54: 357-374), em que a recombinação entre heterozigotos é frequente e resulta em rápida redução de LD. No cultivo de espécies em que a recombinação entre genótipos homozigóticos não é geneticamente detectável, a extensão de LD é maior (ou seja, blocos maiores de marcadores ligados são herdados juntos) e isso aumenta dramaticamente o poder de detecção de mapeamento de associação (Wall e Pritchard (2003), Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human genome, Nat. Rev. Genet. 4: 587-597).

[129] A história de mutação e recombinação de uma população é função do hábito de acasalamento, bem como o tamanho eficaz e a idade de uma população. Tamanhos de população grandes oferecem maiores possibilidades de detecção de recombinação, enquanto populações mais velhas geralmente são associadas a níveis mais altos de polimorfismo, ambos os quais contribuem com taxas notadamente aceleradas de redução de LD. Por outro lado, tamanhos de população eficazes menores, tais como os que experimentaram um recente gargalo genético, tendem a exibir velocidade mais baixa de redução de LD, o que resulta em conservação mais extensa de haplótipos (Flint-Garcia et al (2003), Structure of linkage disequilibrium in plants, Annu. Rev. Plant Biol. 54: 357-374).

[130] Linhagens de cultivo de elite fornecem um ponto de partida valioso para análises de associação. Análises de associação utilizam avaliações fenotípicas quantitativas (por exemplo, a tolerância a doenças avaliada de um a nove para cada linhagem de milho) na análise (ao contrário de observar apenas distribuições de frequência de alelos tolerantes contra resistentes em tipos de análise de distribuição de alelos intergrupos). A disponibilidade de dados de desempenho fenotípico detalhados coletados por programas de cultivo ao longo de diversos anos e ambientes para um grande número de linhagens de elite fornece um conjunto de dados valioso para análises de mapeamento de associação de marcador genético. Isso pavimenta o caminho de integração sem emendas entre a pesquisa e a aplicação e aproveita-se dos conjuntos de dados acumulados historicamente. A compreensão do relacionamento entre polimorfismo e recombinação é útil, entretanto, no desenvolvimento de estratégias apropriadas para extração eficiente de informações máximas desses recursos.

[131] Este tipo de análise de associação não gera nem necessita de nenhum dado de mapa, mas é independente da posição do mapa. Esta análise compara a avaliação fenotípica das plantas com os genótipos nos vários locais. Em seguida, qualquer mapa de milho apropriado (por exemplo, um mapa composto) pode ser opcionalmente utilizado para ajudar a observar a distribuição dos marcadores QTL identificados e/ou a formação de conjuntos marcadores QTL utilizando locais de mapa determinados anteriormente dos marcadores.

ANÁLISE DE LIGAÇÃO TRADICIONAL

[132] Os mesmos princípios servem de base para análise de ligação tradicional; LD, entretanto, é gerado por meio da criação de uma população a partir de um pequeno número de fundadores. Os fundadores são selecionados para maximizar o nível de polimorfismo na população construída e locais polimórficos são determinados com base no seu nível de cossegregação com um dado fenótipo. Diversos métodos estatísticos foram utilizados para identificar associações significativas entre marcadores e características. Um desses métodos é uma abordagem de mapeamento de intervalos (Lander e Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989), na qual cada uma das muitas posições ao longo de um mapa genético (digamos em intervalos de 1 cM) é testada para determinar a probabilidade de localização de um gene controlador de uma característica de interesse naquela posição. Os dados de genótipos e fenótipos são utilizados para calcular uma avaliação de LOD para cada posição de teste (logaritmo da razão de probabilidades). Quando a avaliação de LOD exceder um valor limite, existem evidências significativas de posicionamento de um gene controlador da característica de interesse naquela posição sobre o mapa genético (que cairá entre dois locais marcadores específicos).

[133] São fornecidos no presente locais marcadores de milho que demonstram cossegregação estatisticamente significativa com a característica de resistência à podridão do caule de antracnose, conforme determinado por meio de análise de ligação tradicional e de análise de associação de genoma completo. Pode-se utilizar a detecção desses locais ou locais ligados adicionais em programas de cultivo do milho assistido por marcador para produzir plantas que apresentam resistência à podridão do caule de antracnose.

[134] As atividades em programas de cultivo de milho assistidos por marcador podem incluir, mas sem limitações: seleção entre novas populações de cultivo para identificar qual população possui a frequência mais alta de sequências de ácidos nucleicos favoráveis com base em associações de cultivo agronômico e genótipo históricas, seleção de sequências de ácidos nucleicos favoráveis dentre a prole em populações de cultivo, seleção entre linhagens parentais com base na previsão de desempenho da prole e avanço de linhagens em atividades de aprimoramento de germoplasma com base na presença de sequências de ácidos nucleicos favoráveis. LOCAIS QTL

[135] QTL sobre o cromossomo 6 foi identificado como sendo associado à característica de resistência à podridão de caules de antracnose utilizando análise de mapeamento de associação (Exemplo 1). O QTL está localizado no cesto 5 do cromossomo 6, que é igual a 240,8 a 385,8 cM sobre um mapa genético IBM2, cuja versão mais recente é o mapa IBM2 2008. O QTL foi validado utilizando mapeamento de QTL tradicional em populações de cultivo haploide duplo (Exemplo 2) e por meio de seleção assistida por marcador (Exemplo 3). A região foi adicionalmente delimitada no Exemplo 3 para uma região de cromossomo 6 definida por PHM146 e PHM14535, que é igual a 211,5 a 278,0 sobre um mapa genético IBM2.

INTERVALOS CROMOSSÔMICOS

[136] São fornecidos intervalos cromossômicos que se correlacionam com a característica de resistência à podridão do caule de antracnose. Diversos métodos bem conhecidos na técnica são disponíveis para identificar intervalos cromossômicos. As fronteiras desses intervalos cromossômicos são traçadas para englobar marcadores que serão ligados ao(s) gene(s) que controla(m) a característica de interesse. Em outras palavras, o intervalo cromossômico é delineado de tal forma que qualquer marcador que repouse dentro daquele intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem as fronteiras do intervalo) possa ser utilizado como marcador da resistência à podridão do caule de antracnose. As Tabelas 1 a 3 identificam marcadores na região QTL do cromossomo 6 cuja associação à característica de resistência à podridão do caule de antracnose e ligação a um ou mais genes que controlam a resistência à podridão do caule de antracnose foram demonstradas no presente. As sequências de referência para cada um dos marcadores são representadas por SEQ ID N° 1-16.

[137] Cada intervalo compreende pelo menos um QTL e, adicionalmente, pode compreender, na verdade, mais de um QTL. Boa proximidade de diversos QTL no mesmo intervalo pode ofuscar a correlação de um marcador específico com um QTL específico, pois um marcador pode demonstrar ligação a mais de um QTL. Por outro lado, por exemplo, se dois marcadores em boa proximidade exibirem cossegregação com a característica fenotípica desejada, às vezes é incerto se cada um desses marcadores identifica o mesmo QTL ou dois QTL diferentes. Independentemente, o conhecimento de quantos QTL encontram-se em um intervalo específico não é necessário para realizar ou praticar o que é apresentado na presente invenção.

[138] No cromossomo 6, cesto 5, o intervalo pode englobar qualquer um dos marcadores identificados no presente coimo sendo associados à característica de resistência à podridão do caule de antracnose, incluindo: PHM10315, PHM13944, PHM8022, PHM1204, PHM146, PHM8593, PHM4127, PHM14535, C12305-001-K001, C12307-001-K001, C16759-001-Q001, C16790- 001-Q001, C12314-001-K001, C12315-001-K001, PHM15290-15-Q2 e C12317- 001-K001. O intervalo do cromossomo 6 pode ser definido, por exemplo, pelos marcadores PHM146 e PHM14535 (Exemplo 3), que são separados pela maior distância sobre o mapa físico. Qualquer marcador localizado nesses intervalos pode ser utilizado como marcador para resistência à podridão do caule de antracnose e pode ser empregado no contexto dos métodos apresentados no presente para identificar e/ou selecionar plantas de milho que possuem resistência à podridão do caule de antracnose, seja ela recém-conferida ou aprimorada em comparação com plantas controle.

[139] Intervalos cromossômicos podem também ser definidos por marcadores que são ligados a (exibem desequilíbrio de ligação com) um marcador QTL e r2 é uma medida comum de desequilíbrio de ligação (LD) no contexto de estudos de associação. Caso o valor r2 de LD entre um cromossomo 6, cesto 5, local marcador, por exemplo, e outro local marcador de cromossomo 6 em boa proximidade seja de mais de 1/3 (Ardlie et al, Nature Reviews Genetics 3: 299-309 (2002)), os locais encontram-se em desequilíbrio de ligação entre si.

MARCADORES E RELAÇÕES DE LIGAÇÃO

[140] A medida comum de ligação é a frequência com a qual as características cossegregam-se. Esta pode ser expressa na forma de percentual de cossegregação (frequência de recombinação) ou em centiMorgans (cM). O cM é uma unidade de medição de frequência de recombinação genética. Um cM é igual a 1% de possibilidade de que uma característica em um local genético será separada de uma característica em outro local devido ao cruzamento em uma única geração (o que significa que as características segregam-se juntas por 99% do tempo). Como a distância cromossômica é aproximadamente proporcional à frequência de cruzamento ao longo de eventos entre as características, existe distância física aproximada que se correlaciona à frequência de recombinação.

[141] Os próprios locais marcadores são características e podem ser determinados de acordo com análise de ligação padrão por meio de rastreamento dos locais marcadores durante a segregação. Portanto, 1 cM é igual a 1% de possibilidade de separação de um local marcador de outro local, devido ao cruzamento em uma única geração.

[142] Quanto mais próximo um marcador estiver de um gene que controla uma característica de interesse, mais eficaz e vantajoso aquele marcador será como indicador para a característica desejada. Locais em ligação próxima exibem frequência de cruzamento entre locais de cerca de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 8% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 7% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 6% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 5% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 4% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 3% ou menos e, de preferência ainda maior, cerca de 2% ou menos. Em realizações de alta preferência, os locais relevantes (tais como um local marcador e um local alvo) exibem frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, de maior preferência cerca de 0,5% ou menos ou, de preferência ainda maior, cerca de 0,25% ou menos. Portanto, os locais estão a cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM, 0,25 cM ou menos de distância. Em outras palavras, afirma-se que dois locais posicionados sobre o mesmo cromossomo e em distância tal que a recombinação entre os dois locais ocorra em frequência de menos de 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) são “próximos” entre si.

[143] Embora alelos marcadores específicos possam cossegregar-se com a característica de resistência à podridão do caule de antracnose, é importante observar que o local marcador não é necessariamente responsável pela expressão do fenótipo resistente à podridão do caule de antracnose. Não é necessário, por exemplo, que a sequência de polinucleotídeos marcadores seja parte de um gene que é responsável pelo fenótipo resistente à podridão do caule de antracnose (por exemplo, é parte do quadro de leitura aberta do gene). A associação entre um alelo marcador específico e a característica de resistência à podridão do caule de antracnose deve-se à fase de ligação de “acoplamento” original entre o alelo marcador e o alelo na linhagem de milho ancestral da qual se originou o alelo. Eventualmente, com recombinação repetida, eventos de cruzamento entre o marcador e o local genético podem alterar essa orientação. Por esta razão, o alelo marcador favorável pode alterar-se, dependendo da fase de ligação que existe no pai que possui resistência à podridão do caule de antracnose que é utilizado para criar populações segregantes. Isso não muda o fato de que o marcador pode ser utilizado para monitorar a segregação do fenótipo. Ele somente altera qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população de segregação.

[144] Os métodos apresentados no presente incluem a detecção da presença de um ou mais alelos marcadores associados à resistência à podridão do caule de antracnose em uma planta de milho e identificação e/ou seleção em seguida de plantas de milho que possuem alelos favoráveis nesses locais marcadores. Os marcadores relacionados nas Tabelas 1, 2 e 3 foram identificados no presente como sendo associados à característica de resistência à podridão do caule de antracnose e, portanto, podem ser utilizados para prever a resistência à podridão do caule de antracnose em plantas de milho. Qualquer marcador em até 50 cM, 40 cM, 30 cM, 20 cM, 15 cM, 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM (com base em um mapa genético com base em meiose isolada) de qualquer um dos marcadores das Tabelas 1, 2 e 3 poderá também ser utilizado para prever a resistência à podridão do caule de antracnose em plantas de milho.

SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES

[145] Marcadores moleculares podem ser utilizados em uma série de aplicações de cultivo vegetal (vide, por exemplo, Staub et al (1996), Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983), Plant Molecular Biology Reporter 1: 3-8). Uma das principais áreas de interesse é o aumento da eficiência de retrocruzamento e introgressão de genes utilizando seleção assistida por marcadores (MAS). Um marcador molecular que demonstra ligação com um local que afeta uma característica fenotípica desejada fornece uma ferramenta útil de seleção da característica em uma população vegetal. Isso é particularmente verdadeiro quando o teste do fenótipo é difícil. Como os testes de marcadores de DNA são menos trabalhosos e consomem menos espaço físico que a fenotipificação de campo, populações muito maiores podem ser testadas, aumentando as possibilidades de encontrar um recombinante com o segmento alvo da linhagem doadora movido para a linhagem receptora. Quanto mais próxima a ligação, mais útil o marcador, pois é menos provável a ocorrência de recombinação entre o marcador e o gene que causa a característica, que pode resultar em falsos positivos. Ter marcadores laterais reduz a possibilidade de ocorrência de seleção de falsos positivos, pois seria necessário um evento de recombinação dupla. A situação ideal é ter um marcador no próprio gene, de forma que a recombinação não possa ocorrer entre o marcador e o gene. Esse marcador é denominado “marcador perfeito”.

[146] Quando um gene sofre introgressão por MAS, não apenas o gene é introduzido, mas também as regiões laterais (Gepts (2002), Crop Sci. 42: 1780-1790). Isso é denominado “ligação arrastada”. Caso a planta doadora apresente alta falta de relação com a planta receptora, essas regiões laterais carregam genes adicionais que podem codificar características agronomicamente indesejáveis. Essa “ligação arrastada” pode também resultar em redução do rendimento ou outras características agronômicas negativas mesmo após diversos ciclos de retrocruzamento para a linhagem de milho de elite. Isso às vezes também é denominado “rendimento arrastado”. O tamanho da região lateral pode ser reduzido por meio de retrocruzamento adicional, embora nem sempre isso seja bem sucedido, pois os cultivadores não detêm controle sobre o tamanho da região ou dos pontos de recombinação (Young et al (1998), Genetics 120: 579-585). Em cultivo clássico, normalmente apenas por acaso são selecionadas recombinações que contribuem com redução do tamanho do segmento doador (Tanksley et al (1989), Biotechnology 7: 257-264). Mesmo depois de vinte retrocruzamentos deste tipo, pode-se esperar encontrar um pedaço dimensionável do cromossomo doador ainda ligado ao gene sendo selecionado. Com marcadores, entretanto, é possível selecionar aqueles raros indivíduos que experimentaram recombinação perto do gene de interesse. Em 150 plantas retrocruzadas, existe 95% de possibilidade que pelo menos uma planta tenha experimentado cruzamento em até 1 cM do gene, com base na distância de mapa de meiose isolada. Marcadores permitirão identificação inequívoca desses indivíduos. Com retrocruzamento adicional de trezentas plantas, haveria 95% de possibilidade de cruzamento em distância de até 1 cM do mapa de meiose isolada do outro lado do gene, gerando um segmento em volta do gene alvo de menos de 2 cM com base em distância do mapa de meiose isolada. Isso pode ser conseguido em duas gerações com marcadores, embora fossem necessárias em média cem gerações sem marcadores (vide Tanksley et al, acima). Quando a localização exata de um gene for conhecida, marcadores laterais em volta do gene podem ser utilizados para selecionar recombinações em diferentes tamanhos de população. Em tamanhos de população menores, por exemplo, podem ser esperadas recombinações em locais mais distantes do gene, de forma que mais marcadores laterais distantes seriam necessários para detectar a recombinação.

[147] A disponibilidade de mapas de ligação integrados do genoma de milho que contêm densidades crescentes de marcadores de milho públicos facilitou o mapeamento genético de milho e MAS. Vide, por exemplo, os mapas de vizinhos IBM2, que são disponíveis online no Website MaizeGDB.

[148] Os principais componentes da implementação de MAS são: (i) definição da população na qual será determinada a associação entre marcador e característica, que pode ser uma população em segregação ou uma população aleatória ou estruturada; (ii) monitoramento da segregação ou associação de marcadores polimórficos com relação à característica e determinação da ligação ou associação utilizando métodos estatísticos; (iii) definição de um conjunto de marcadores desejáveis com base nos resultados da análise estatística; e (iv) uso e/ou extrapolação dessa informação para o conjunto atual de germoplasma em cultivo, para permitir a tomada de decisões de seleção com base em marcadores. Os marcadores descritos na presente invenção, bem como outros tipos de marcadores tais como SSRs e FLPs, podem ser utilizados em protocolos de seleção assistidos por marcadores.

[149] SSRs podem ser definidos como conduções relativamente curtas de DNA repetido em conjunto com comprimentos de 6 bp ou menos (Tautz (1989), Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; Wang et al (1994), Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6). Surgem polimorfismos devido à variação do número de unidades de repetição, provavelmente causada por deslizamento durante a reprodução de DNA (Levinson e Gutman (1987), Mol. Biol. Evol. 4: 203-221). A variação do comprimento repetido pode ser detectada por meio do projeto de primers de PCR para as regiões laterais não repetitivas conservadas (Weber e May (1989), Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396). SSRs são altamente apropriados para o mapeamento e MAS, pois eles são multialélicos, codominantes, reproduzíveis e propensos a alta automação de rendimento (Rafalski et al (1996), Generating and Using DNA Markers in Plants em: NonMammalian Genomic Analysis: a Practical Guide, Academic Press, págs. 75135).

[150] Podem ser gerados vários tipos de marcadores de SSR e os perfis de SSR podem ser obtidos por meio de eletroforese de gel dos produtos de amplificação. A avaliação de genótipo marcador baseia-se no tamanho do fragmento amplificado. Um serviço de SSR para milho é disponível ao público em base contratual por meio da DNA Landmarks de Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá.

[151] Podem também ser gerados diversos tipos de marcadores de FLP. Mais comumente, primers de amplificação são utilizados para gerar polimorfismos de comprimento de fragmentos. Esses marcadores de FLP são, de muitas formas, similares a marcadores de SSP, exceto pelo fato de que a região amplificada pelos primers não é tipicamente uma região altamente repetitiva. Além disso, a região amplificada, ou amplicon, possuirá variabilidade suficiente entre o germoplasma, frequentemente devido a inserções ou exclusões, de tal forma que os fragmentos gerados pelos primers de amplificação possam ser diferenciados entre indivíduos polimórficos e esses indels conhecidamente ocorram com frequência em milho (Bhattramakki et al (2002), Plant Mol. Biol. 48, 539-547; Rafalski (2002b), acima).

[152] Os marcadores de SNP detectam substituições de nucleotídeos com par de bases isolado. De todos os tipos de marcadores moleculares, SNPs são os mais abundantes e, por isso, possuem o potencial de fornecimento da mais alta resolução de mapa genético (Bhattramakki et al, 2002, Plant Molecular Biology 48: 539-547). SNPs podem ser testados em nível ainda mais alto de rendimento que SSRs, na chamada forma de “ultra-alto rendimento’, pois eles não necessitam de grandes quantidades de DNA e a automação do teste pode ser direta. SNPs também possuem a promessa de serem sistemas com custo relativamente baixo. Esses três fatores juntos tornam SNPs altamente atraentes para uso em MAS. Diversos métodos são disponíveis para genotipificação de SNP, incluindo, mas sem limitações, hibridização, extensão de primers, ligação de oligonucleotídeos, divisão de nuclease, minissequenciamento e esferas codificadas. Esses métodos foram analisados em: Gut (2001), Hum. Mutat. 17 págs. 475-492; Shi (2001), Clin. Chem. 47, págs. 164-172; Kwok (2000), Pharmacogenomics 1, págs. 95-100; e Bhattramakki e Rafalski (2001), Discovery and Application of Single Nucleotide Polymorphism Markers in Plants, em: R. J. Henry, Ed., Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford. Uma ampla variedade de tecnologias disponíveis comercialmente utiliza estes e outros métodos para interrogar SNPs, incluindo Masscode® (Qiagen), INVADER® (Third Wave Technologies) e Invader PLUS®, SNAPSHOT® (Applied Biosystems), TAQMAN® (Applied Biosystems) e BEADARRAYS® (Illumina).

[153] Diversos SNPs juntos em uma sequência ou ao longo de sequências ligadas podem ser utilizados para descrever um haplótipo para qualquer genótipo específico (Ching et al (2002), BMC Genet. 3: 19, Gupta et al, 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162: 329-333). Os haplótipos podem ser mais informativos que SNPs isolados e podem ser mais descritivos de qualquer genótipo específico. Um único SNP pode ser, por exemplo, alelo “T” para uma linhagem ou variedade específica com resistência à podridão do caule de antracnose, mas o alelo “T” poderá também ocorrer na população de cultivo de milho que é utilizada para pais recorrentes. Neste caso, um haplótipo, tal como uma combinação de alelos em marcadores SNP ligados, pode ser mais informativo. Após a atribuição de um haplótipo exclusivo a uma região cromossômica doadora, aquele haplótipo pode ser utilizado naquela população ou qualquer de seus subconjuntos para determinar se um indivíduo possui um gene específico. Vide, por exemplo, WO 2003054229. O uso de plataformas de detecção de marcadores de alto rendimento automatizadas conhecidas dos técnicos comuns no assunto torna este processo altamente eficiente e eficaz.

[154] Muitos dos marcadores de PHM aqui apresentados podem ser facilmente utilizados como marcadores de FLP para selecionar os locais genéticos sobre o cromossomo 6, devido à presença de inserções/polimorfismos de exclusão. Os primers para os marcadores de PHM podem também ser utilizados para converter esses marcadores em SNP ou outros marcadores estruturalmente similares ou funcionalmente equivalentes (SSRs, CAPs, indels etc.) nas mesmas regiões. Uma abordagem muito produtiva da conversão de SNP é descrita por Rafalski (2002a), Current Opinion in Plant Biology 5 (2): 94100 e também Rafalski (2002b), Plant Science 162: 329-333. Utilizando PCR, os primers são utilizados para amplificar segmentos de DNA de indivíduos (preferencialmente congênitos) que representam a diversidade na população de interesse. Os produtos de PCR são sequenciados diretamente em uma ou em ambas as direções. As sequências resultantes são alinhadas e os polimorfismos são identificados. Os polimorfismos não se limitam a polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPs), mas também incluem indels, CAPS, SSRs e VNTRs (número variável de repetições conjuntas). Especificamente com relação às informações de mapas finos descritas no presente, pode-se utilizar facilmente as informações fornecidas no presente para obter SNPs polimórficos adicionais (e outros marcadores) dentro da região amplificada pelos primers relacionados no presente relatório descritivo. Marcadores na região de mapa descrita podem ser hibridizados em BACs ou outras bibliotecas genômicas ou alinhados eletronicamente com sequências genômicas, para encontrar novas sequências no mesmo local aproximado dos marcadores descritos.

[155] Além de SSRs, FLPs e SNPs, conforme descrito acima, outros tipos de marcadores moleculares também são amplamente utilizados, incluindo, mas sem limitações, marcas de sequência expressas (ESTs), marcadores SSR derivados de sequências de EST, DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) e outros marcadores com base em ácido nucleico.

[156] Os perfis de isozimas e características morfológicas ligadas podem, em alguns casos, também ser utilizados indiretamente como marcadores. Muito embora eles não detectem diretamente as diferenças de DNA, frequentemente são influenciados por diferenças genéticas específicas. Os marcadores que detectam variações de DNA são, entretanto, muito mais numerosos e polimórficos que isozima ou marcadores morfológicos (Tanksley (1983), Plant Molecular Biology Reporter 1: 3-8).

[157] Alinhamentos de sequências ou contíguos podem também ser utilizados para encontrar sequências acima ou abaixo no fluxo dos marcadores específicos relacionados no presente. Essas novas sequências, próximas dos marcadores descritos no presente, são utilizadas em seguida para descobrir e desenvolver marcadores funcionalmente equivalentes. Diferentes mapas físicos e/ou genéticos são alinhados, por exemplo, para localizar marcadores equivalentes não descritos no presente relatório descritivo, mas que se encontram em regiões similares. Esses mapas podem estar nas espécies de milho ou mesmo ao longo de outras espécies que tenham sido genética ou fisicamente alinhadas com milho, tais como arroz, trigo, cevada ou sorgo.

[158] De forma geral, MAS utiliza marcadores polimórficos que foram identificados como possuindo probabilidade significativa de cossegregação com uma característica tal como a característica de resistência à podridão do caule de antracnose. Presume-se que esses marcadores mapeiem perto de um ou mais genes que fornecem à planta o seu fenótipo de resistência à podridão do caule de antracnose e são considerados indicadores da característica desejada ou marcadores. As plantas são testadas para determinar a presença de um alelo desejado no marcador e espera-se que as plantas que contêm um genótipo desejado em um ou mais locais transfiram o genótipo desejado, em conjunto com um fenótipo desejado, para a sua prole. Desta forma, plantas com resistência à podridão do caule de antracnose podem ser selecionadas por meio de detecção de um ou mais alelos marcadores e, além disso, plantas de prole derivadas dessas plantas podem também ser selecionadas. Uma planta que contém um genótipo desejado em uma dada região cromossômica (ou seja, um genótipo associado à resistência à podridão do caule de antracnose) é obtida e cruzada em seguida em outra planta. A prole desse cruzamento seria avaliada genotipicamente em seguida utilizando um ou mais marcadores e as plantas de prole com o mesmo genótipo em uma dada região cromossômica seriam então selecionadas como possuindo resistência à podridão do caule de antracnose.

[159] Os marcadores foram identificados a partir de mapeamento de ligações e análise de associação como sendo associados à característica de resistência à podridão do caule de antracnose. As sequências de referência para os marcadores são representadas por SEQ ID N° 1-16. As posições de SNP são identificadas nas sequências de marcadores.

[160] Os SNPs puderam ser utilizados isoladamente ou em combinação (ou seja, haplótipo de SNP) para selecionar alelos de QTL favoráveis associados à resistência à podridão do caule de antracnose. Haplótipo de SNP no cromossomo 6 QTL descrito no presente pode compreender, por exemplo: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 ou “A” em C12314-001-K1 ou qualquer de suas combinações.

[161] Os técnicos no assunto esperariam que pudesse haver locais polimórficos adicionais nos locais marcadores em e em volta dos marcadores de cromossomo 6 identificados no presente, em que um ou mais locais polimórficos encontram-se em desequilíbrio de ligação (LD) com um alelo em um ou mais dos locais polimórficos do haplótipo e, portanto, poderiam ser utilizados em um programa de seleção assistido por marcador para introgressão de um alelo de QTL de interesse. Afirma-se que dois alelos específicos em diferentes locais polimórficos encontram-se em LD se a presença do alelo em um dos locais tender a prever a presença do alelo no outro local sobre o mesmo cromossomo (Stevens, Mol. Diag. 4: 309-17 (1999)). Os locais marcadores podem encontrar-se em até 5 cM, 2 cM ou 1 cM (em um mapa genético com base em meiose isolada) da característica de resistência à podridão do caule de antracnose QTL.

[162] Os técnicos no assunto compreenderão que a frequência alélica (e, portanto, a frequência de haplótipos) pode diferir de um conjunto de geromplasmas para outro. Conjuntos de germoplasmas variam devido a diferenças de maturidade, agrupamentos heteróticos, distribuição geográfica etc. Como resultado, SNPs e outros polimorfismos podem não ser informativos em alguns conjuntos de germoplasmas.

COMPOSIÇÕES DE PLANTAS

[163] Plantas de milho identificadas e/ou selecionadas por meio de qualquer um dos métodos descritos acima também são de interesse. Isso inclui qualquer planta da espécie Zea mays que possui no seu genoma um haplótipo sobre o cromossomo 6 que compreende: “C” em C12305-001-K1, “C” em C12307-001-K1, “A” em C16759-001-K1, “G” em C16760-001-K1 e “A” em C12314-001-K1; e exibe resistência à podridão do caule de antracnose (a resistência pode ser recém-conferida ou aprimorada) em comparação com uma planta de milho que não contém o haplótipo no seu genoma.

TRANSGÊNICOS

[164] Haplótipos preferidos e QTL identificados pela presente invenção podem ser adiantados como possíveis genes para inclusão em construções de expressão, ou seja, transgenes. Ácidos nucleicos subjacentes a haplótipos ou QTL de interesse podem ser expressos em células vegetais por meio da sua ligação operativa a um promotor funcional em plantas. Ácidos nucleicos subjacentes a alótipos ou QTL de interesse podem ter sua expressão modificada por meio de supressão genética mediada por RNA de fita dupla, também conhecida como interferência de RNA (“RNAi”), que inclui supressão mediada por RNAs interferentes pequenos (“siRNA”), RNAs interferentes pequenos com ação trans (“ta-siRNA”) ou microRNAs (“miRNA”).

[165] São conhecidos na técnica métodos de montagem e introdução de construções em uma célula, de tal forma que a molécula de ácido nucleico para uma característica seja transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é traduzida e expressa como produto de proteína.

TRATAMENTO DE SEMENTES

[166] Para proteger e aprimorar as tecnologias de características e produção de rendimento, opções de tratamento de sementes podem fornecer flexibilidade de planejamento de safra adicional e controle econômico de insetos, ervas e doenças, de forma a aprimorar ainda mais o objeto descrito no presente. O material de sementes pode ser tratado, tipicamente tratado na superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, agentes de segurança de herbicidas, inseticidas, fungicidas, inibidores e amplificadores da germinação, nutrientes, ativadores e reguladores do crescimento vegetal, bactericidas, nematicidas, avicidas e/ou molusquicidas. Esses compostos são tipicamente formulados em conjunto com veículos, tensoativos ou adjuvantes promotores de aplicação adicionais costumeiramente empregados na técnica de formulação. Os revestimentos podem ser aplicados por meio da impregnação de material de propagação com uma formulação líquida ou por meio de revestimento com formulação seca ou úmida combinada. Exemplos dos diversos tipos de compostos que podem ser utilizados como tratamentos de semente são fornecidos em The Pesticide Manual: A World Compendium, C. D. S. Tomlin, Ed., publicado pelo British Crop Production Council, que é incorporado ao presente como referência.

[167] Alguns tratamentos de sementes que podem ser utilizados sobre sementes de safra incluem, mas sem limitações, um ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metil, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirilum, azadiractina, azoxistrobina, Bacillus spp (incluindo um ou mais dentre cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis e/ou thuringiensis), Bradyrhizobium spp (incluindo um ou mais dentre betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi e/ou yuanmingense), captano, carboxin, chitosan, clotianidin, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazol, fipronil, fludioxonil, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteína grampo de cabelo, imazalil, imidacloprid, ipconazol, isoflavenoides, lipochito-oligossacarídeo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, PCNB, penflufen, penicillium, pentiopirad, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxano, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, tiram, tolclofós-metil, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triticonazol e/ou zinco. Revestimento de semente de PCNB refere-se ao registro no EPA n° 00293500419, contendo quintozene e terrazol. TCMTB designa 2-(tiocianometiltio)benzotiazol.

[168] Sementes que produzem plantas com características específicas (tais como resistência à podridão do caule de antracnose) podem ser testadas para determinar quais opções de tratamento de sementes e taxas de aplicação podem complementar essas plantas a fim de aumentar o rendimento. Plantas com bom potencial de rendimento mas susceptibilidade a carvão do pendão, por exemplo, podem beneficiar-se do uso de um tratamento de sementes que fornece proteção contra carvão do pendão, plantas com bom potencial de rendimento mas susceptibilidade a nematoides do cisto podem beneficiar-se do uso de um tratamento de sementes que fornece proteção contra nematoides do cisto e assim por diante. Além disso, o estabelecimento de boas raízes e a emergência precoce que resulta do uso adequado de tratamento de sementes podem resultar em uso mais eficiente de nitrogênio, melhor capacidade de suportar seca e aumento geral do potencial de rendimento de uma ou mais plantas que contêm uma certa característica em combinação com tratamento de sementes.

EXEMPLOS

[169] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a presente invenção. Compreende-se que os exemplos e realizações descritos no presente destinam-se apenas a fins ilustrativos e que os técnicos no assunto reconhecerão diversos reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem abandonar o espírito da presente invenção ou o escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1 ANÁLISE DE MAPEAMENTO DE ASSOCIAÇÃO:

[170] Linhagens de milho foram avaliadas fenotipicamente com base no seu grau de resistência a infecções por antracnose. As linhagens vegetais utilizadas na análise foram de diversas fontes, incluindo germoplasma de elite. O grau de resistência das plantas a infecções por antracnose variou amplamente, conforme medido utilizando características ANTINODE e ANTGR75. ANTINODE é uma contagem do número de internódulos, incluindo o internódulo inoculado, no qual surgem sintomas de podridão do caule de antracnose. ANTGR75 é o número de internódulos que possuem mais de 75% de sintomas de podridão do caule de antracnose.

[171] A coleção de linhagens de milho foi analisada utilizando genotipificação ILLUMINA® SNP (teste 1536-plex). Utilizou-se variação de SNP para gerar haplótipos específicos ao longo de congênitos em cada local. Estes dados foram utilizados para identificar associações entre alelos e resistência à antracnose em nível de genoma.

[172] Avaliações de resistência e informações genotípicas foram incorporadas em uma análise de mapeamento de associação. Foi conduzida uma análise de associação com base em estrutura, utilizando métodos de mapeamento de associação padrão em que a estrutura da população é controlada utilizando dados de marcadores. O software de análise de conjunto com base em modelo, Structure, desenvolvido por Pritchard et al (J. K. Pritchard, M. Stephens e P. J. Donnelly (2000), Inference of Population Structure Using Multilocus Genotype Data, Genetics 155: 945-959) foi utilizado para reduzir a ocorrência de falsos positivos que podem surgir devido ao efeito de estrutura da população sobre estatísticas de mapeamento de associação. Estatística de Kuiper para testar se duas distribuições são idênticas foi utilizada para testar um dado marcador em busca de associação entre haplótipo e fenótipo em uma dada subpopulação (W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, B. P. Flannery, 2002; Numerical Recipes in C, segunda edição, Cambridge University Press, Nova Iorque).

[173] Um pico de marcadores associados foi identificado sobre o cromossomo 6, cesto 5 (que é igual a 240,8 a 385,8 em um mapa genético IBM2) em um grupo que consiste de congênitos sintéticos com caule rígido do Iowa, incluindo a linhagem congênita PH14J (que possui o fenótipo favorável). A Tabela 1 fornece marcadores de milho que demonstraram desequilíbrio de ligação com o fenótipo da podridão do caule de antracnose utilizando o método de mapeamento de associação. TABELA 1

[174] Marcadores de milho com associação significativa à resistência à podridão do caule de antracnose:

[175] As probabilidades estatísticas de que o alelo marcador e o fenótipo segregam-se independentemente são refletidas nos valores de probabilidade ajustados a mapeamento de associação da Tabela 1, que é uma probabilidade (P) derivada da análise de associação entre genótipo e fenótipo. Quanto mais baixo o valor da probabilidade, mais significativa é a associação entre o genótipo marcador naquele local e o nível de resistência à podridão do caule de antracnose. A linhagem PH14J possui o haplótipo favorável (ou seja, aumento da resistência à podridão do caule de antracnose).

EXEMPLO 2 MAPEAMENTO DE QTL UTILIZANDO POPULAÇÕES DE CULTIVO DE HAPLOIDE DOBRADO:

[176] Conduziu-se análise de mapeamento de intervalo de QTL para identificar intervalos de cromossomos e marcadores associados à resistência à podridão do caule de antracnose utilizando populações de cultivo de haploide dobrado geradas a partir de diferentes cruzamentos de congênitos. A avaliação fenotípica de cada uma das populações haploides dobradas foi baseada em conjuntos de dados fenotípicos coletados do campo em uma estação de safra. Prole de haploide dobrado de milho dos diferentes cruzamentos foi genotipificada utilizando um conjunto de 756 SNPs distribuídos no genoma de milho.

[177] Foi identificado um pico significativo sobre o cromossomo 6, cesto 5, o que indica que a região abriga um ou mais QTL associados à resistência à podridão do caule de antracnose. A região detectada valida o QTL identificado no Exemplo 1.

EXEMPLO 3 VALIDAÇÃO DE QTL POR MEIO DE SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR:

[178] Foram geradas populações de BC2F1 por meio de seleção assistida por marcadores a partir do cruzamento PH9PHx PH14J. Avaliação fenotípica de cada um dos indivíduos BC2F1 e pais foi baseada em dados coletados do campo em uma estação de safra. A prole de BC2F1 foi genotipificada utilizando SNPs polimórficos na região QTL identificada nos Exemplos 1 e 2.

[179] Cartógrafo Windows QTL (versão atualizada de acordo com a data de mapeamento de QTL) foi utilizado para análise de regressão de marcador e mapeamento de intervalo de QTL. Avaliações de LOD (logaritmo da razão de probabilidades) foram estimadas ao longo do genoma de acordo com os procedimentos de mapeamento de QTL padrão. O limite de LOD foi de 2,5 e o intervalo de confiança foi estimado para cada QTL. O estudo de mapeamento exibiu pico de LOD significativo sobre o cromossomo 6, cesto 5. Além disso, em diversos marcadores no cromossomo 6, cesto 5, a região exibiu associação ao fenótipo de resistência a antracnose em nível de confiança de P = 0,05 ou melhor (Tabela 2). TABELA 2

[180] Marcadores associados à podridão do caule de antracnose em população de PH9PH x PH14J:

EXEMPLO 4 MAPEAMENTO GENÉTICO DE ALTA RESOLUÇÃO E LINHAGENS PRÓXIMAS DA ISOGÊNICA - HÍBRIDOS QUASE ISOGÊNICOS:

[181] Mapeamento genético de alta resolução por meio de teste de prole de plantas recombinantes homozigóticas foi realizado para refinar ainda mais o QTL de resistência à podridão do caule de antracnose. Foi criada uma população de mapeamento a partir do cruzamento de congênitos PHY7K1 e PH14J, ambos os quais são congênitos sintéticos de caule rígido do Iowa. A população de PHY7K1 x PH14J consistiu de 120 famílias BC4F3 geradas por meio de isolamento e fixação de plantas BC4 recombinantes selecionadas a partir de um total de cerca de 3000 plantas BC5 que abrigam um fragmento heterozigótico na região de 211,5 a 342,7 cM sobre o cromossomo 6 (as posições do mapa são baseadas no mapa genético IBM2). Esta estratégia permitiu a cobertura com recombinantes de toda a região de QTL. Outra população para mapeamento fino foi criada de forma similar a partir do cruzamento de congênitos PHY7M2 e PH14J (95 famílias).

[182] Linhagens quase isogênicas BC4F3 (NIL) que abrigam variação alélica na região dos marcadores preferidos foram geradas por meio de seleção assistida por marcador para os dois cruzamentos, bem como para cruzamentos de PHKEW x PH14J, ambos os quais são sintéticos de caule rígido do Iowa e PH9PH x PH14J, em que PH9PH é um congênito não de caule rígido. Os NILs foram gerados por meio da introgressão da região QTL de PH14J em pais recorrentes, limpando os antecedentes genéticos e selecionando recombinantes específicos na região dos marcadores preferidos. Por meio do isolamento de plantas BC4F2/BC5F2 que abrigam um fragmento heterozigótico na região dos marcadores preferidos, foram derivadas linhagens quase isogênicas negativas e positivas e o QTL foi tratado como fator mendeliano isolado.

AVALIAÇÃO FENOTÍPICA

[183] Avaliação fenotípica de cada uma das diferentes famílias do cruzamento PHY7K1 x PH14J e do cruzamento PHY7M2 x PH14J, os pais dos cruzamentos e os NILs gerados foi baseada em conjuntos de dados fenotípicos coletados do campo (experimentos de campo sob infecção artificial; três locais) obtidos em duas estações de safra.

GENOTIPIFICAÇÃO DE MILHO

[184] Prole BC4F3 de milho do cruzamento PHY7K1 x PH14J e do cruzamento de PHY7M2 e PH14J, bem como os pais e NILs, foram genotipificados utilizando SNPs polimórficos na região QTL sobre o cromossomo 6. Cartógrafo Windows QTL foi utilizado para análise de regressão de marcador e mapeamento de intervalo de QTL. Avaliações de LOD (logaritmo da razão de probabilidades) foram estimadas ao longo das regiões alvo de acordo com os procedimentos de mapeamento de QTL padrão.

[185] Avaliações médias foram utilizadas em mapeamento de intervalos de QTL. O limite de LOD foi de 2,5. Estimou-se intervalo de confiança para cada QTL. Como essa população foi gerada por meio de seleção assistida por marcador (não eventos aleatórios de recombinação), a análise da regressão de marcador foi considerada poderosa como análise de mapeamento de intervalos.

RESULTADOS

[186] O presente estudo identificou um intervalo cromossômico isolado que abriga QTL associado à resistência à infecção por podridão do caule de antracnose. Utilizando regressão de marcador isolado, houve uma série de marcadores que exibem associação ao fenótipo a p < 0,05, conforme exibido na Tabela 3. Os marcadores identificados na análise de regressão de marcadores delineiam uma posição genética de alta resolução para o QTL alvo, coincidente com a posição dos marcadores preferidos. TABELA 3

[187] Marcadores associados à resistência à podridão do caule de antracnose em nível de confiança de P = 0,05 ou melhor (fundo de PHY7M2) na Argentina e nos Estados Unidos:

LINHAGENS QUASE ISOGÊNICAS E HÍBRIDOS QUASE ISOGÊNICOS:

[188] As linhagens quase isogênicas que abrigam variação alélica na região de marcadores preferidos exibiram diferença significativa da sua reação à doença na Argentina e nos Estados Unidos; diversos marcadores foram significativos a p < 0,05 nos dois locais (Tabela 3). IDENTIFICAÇÃO DE HAPLÓTIPOS

[189] O haplótipo associado à resistência foi identificado conforme exibido na Tabela 4.

[190] A Tabela 4 exibe o genótipo de SNPs (ou seja, haplótipo) na região de interesse de QTL.

Claims (5)

1. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E/OU SELEÇÃO DE PLANTA DE MILHO, com resistência à podridão do caule de antracnose, caracterizado por compreender: (a) análise do DNA de uma planta de milho para determinar a presença de um alelo de QTL associado à resistência à podridão do caule de antracnose, em que o mencionado alelo de QTL compreende: (i) um “C” na posição 201 na SEQ ID NO:9; (ii) um “C” na posição 201 na SED ID NO:10; (iii) um “A” na posição 201 na SEQ ID NO:11; (iv) um “G” na posição 201 na SEQ ID NO:12; e (v) um “A” na posição 201 in SEQ ID NO:13; e (b) seleção da mencionada planta de milho como possuindo resistência à podridão do caule de antracnose caso seja detectado o mencionado alelo de QTL.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mencionada análise compreender o isolamento de ácidos nucleicos e detecção de um ou mais alelos marcadores ligados e associados ao mencionado alelo de QTL, em que o mencionado um ou mais alelos marcadores está localizado no intervalo cromossômico definido por e incluíndo o marcador PHM146 com uma sequência de referência descrita em SEQ ID NO: 5 e um marcador PHM14535 com uma sequência de referência descrita em SEQ ID NO: 8.

3. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E/OU SELEÇÃO DE PLANTA DE MILHO, com resistência à podridão do caule de antracnose, caracterizado por compreender: (a) detecção em planta de milho de pelo menos um alelo marcador que é ligado e associado a um ou mais alelos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: (i) um “C” na posição 201 na SEQ ID NO:9; (ii) um “C” na posição 201 na SED ID NO:10; (iii) um “A” na posição 201 na SEQ ID NO:11; (iv) um “G” na posição 201 na SEQ ID NO:12; e (v) um “A” na posição 201 in SEQ ID NO:13; e (b) seleção da mencionada planta de milho que possui o pelo menos um alelo marcador que é ligado e associado a um ou mais alelos marcadores descritos em (i) a (v) na etapa (a), em que o mencionado pelo menos um alelo marcador está localizado no intervalo cromossômico definido por e incluíndo o marcador PHM146 com uma sequência de referência descrita em SEQ ID NO: 5 e um marcador PHM14535 com uma sequência de referência descrita em SEQ ID NO: 8.

4. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E/OU SELEÇÃO DE PLANTA DE MILHO, com resistência à podridão do caule de antracnose, caracterizado por compreender: (a) detecção em plantas de milho de pelo menos um alelo marcador que é ligado e associado a um haplótipo que compreende: (i) um “C” na posição 201 na SEQ ID NO:9; (ii) um “C” na posição 201 na SED ID NO:10; (iii) um “A” na posição 201 na SEQ ID NO:11; (iv) um “G” na posição 201 na SEQ ID NO:12; e (v) um “A” na posição 201 in SEQ ID NO:13; e (b) seleção da mencionada planta de milho que possui o pelo menos um alelo marcador que é ligado e associado ao haplótipo, em que o mencionado pelo menos um alelo marcador está localizado no intervalo cromossômico definido por e incluindo o marcador PHM146 com uma sequência de referência descrita em SEQ ID NO: 5 e um marcador PHM14535 com uma sequência de referência descrita em SEQ ID NO: 8.

5. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E/OU SELEÇÃO DE PLANTA DE MILHO, com resistência à podridão do caule de antracnose, caracterizado por compreender: (a) detecção na planta de milho de um haplótipo que compreende: (i) um “C” na posição 201 na SEQ ID NO:9; (ii) um “C” na posição 201 na SED ID NO:10; (iii) um “A” na posição 201 na SEQ ID NO:11; (iv) um “G” na posição 201 na SEQ ID NO:12; e (v) um “A” na posição 201 in SEQ ID NO:13; e (b) seleção da mencionada planta de milho que contém o mencionado haplótipo.