CN116622727A - 一种玉米ZmEXO70F4基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米ZmEXO70F4基因及其应用，ZmExo70F4基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。ZmExo70F4基因的第1390和1437位存在单核苷酸多态性变异，1390位核苷酸为C或T，1437位核苷酸为C或A，该基因的表达水平和群体的单倍型遗传变异分析结果表明，其可能参与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗性。该发明对利用该基因的等位变异开发分子标记，并利用基因工程和分子标记辅助育种技术进行玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗性改良具有一定的价值。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一个玉米ZmEXO70F4基因及其应用。
背景技术
Exocyst复合体是一个进化保守的八亚基蛋白复合体，最早发现于酿酒酵母，从植物到哺乳动物均保守存在。植物中Exocyst复合体参与多种细胞过程，如胞吐、细胞极化、胞质分裂、初级纤毛形成、细胞自噬和抵御病原菌侵染等。例如，拟南芥中EXO70B1和EXO70B2在EXO70蛋白中序列相似性最高，它们都是由多个MAMPs触发的PTI反应所必需的，exo70B1突变体中flg22激活的PTI免疫反应存在缺陷，暗示EXO70B1正调控FLS2信号通路。水稻OsEXO70B1的表达受病原菌相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和稻瘟病菌Magnaporthe oryzae诱导。与野生型相比，敲除OsEXO70B1导致对稻瘟病菌的抗性和防御反应显著降低，相比之下，exo70B1突变体在生长发育方面没有任何缺陷。
另外，病原菌的效应蛋白可以通过与紫丁香假单胞菌的E3连接酶AvrPtoB效应子，与EXO70B1相关。AvrPtoB泛素化EXO70B1并通过宿主的26S蛋白酶体介导EXO70B1的降解。AvrPtoB通过克服EXO70B1介导的抗性增强Pto DC3000的毒力。还有研究报道，小麦中的Exo70FX12可与一个AX21同源的LRR类激酶R基因Pur1形成一个功能模块，在小麦条锈病抗性中发挥重要功能，因此，EXO70基因家族可通过R基因介导作物的免疫反应。玉米中共鉴定出36个ZmEXO70s基因，其中有23个ZmEXO70s基因至少可响应一种非生物胁迫，但目前尚未见到玉米ZmEXO70F4基因在抗病中的报道。EXO70在不同物种中高度保守，且可作为多种病原菌的效应蛋白靶向的组分，在植物免疫和抗病中具有重要的作用。因此，EXO70这一特性为设计广谱抗病的农作物提供了新的策略和选择。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米ZmEXO70F4(Zm00001eb036550)基因及其编码的蛋白质ZmEXO70F4和应用。
本发明的另一目的在于提供一种与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记及其应用。
本发明的目的可以通过如下技术方案实现：
一个玉米ZmEXO70F4基因，该基因的cDNA具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该ZmEXO70F4基因，来自玉米(Zea mays)，其基因组DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述玉米ZmEXO70F4基因编码的ZmEXO70F4蛋白，该蛋白具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序。
上述玉米ZmExo70F4基因的生物材料，该生物材料为重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述的玉米ZmEXO70F4基因、上述的ZmEXO70F4蛋白，或上述的生物材料在调控玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性或禾谷镰孢菌茎腐病高抗病性玉米育种中的应用。
上述的应用中，如SEQ ID NO.2所示的玉米ZmExo70F4基因的第1390和1437位存在单核苷酸多态性变异，1390位核苷酸为C或T，1437位核苷酸为C或A，其中，单倍型1“T、A”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为感病性，单倍型2“C、C”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为抗病性，而单倍型3“C、A”则为杂合型，禾谷镰孢菌茎腐病抗性居于单倍型1和单倍型2之间；所述的ZmEXO70F4基因在第1390位核苷酸和1437位的核苷酸均为“C”的变异赋予玉米对禾谷镰孢菌茎腐病的抗性。
上述的玉米ZmEXO70F4基因、上述的ZmEXO70F4蛋白，或上述的生物材料在提高玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性或诱导植物细胞产生坏死中的应用，在目标植物中上调玉米ZmEXO70F4基因的表达能够诱导植物细胞产生坏死，提高植物的抗病性。
一种与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记，如SEQ ID NO.2所示的玉米ZmExo70F4基因的第1390和1437位存在单核苷酸多态性变异，1390位核苷酸为C或T，1437位核苷酸为C或A，其中，单倍型1“T、A”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为感病性，单倍型2“C、C”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为抗病性，而单倍型3“C、A”则为杂合型，禾谷镰孢菌茎腐病抗性居于单倍型1和单倍型2之间。
上述的与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记或用于检测如上所述的与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记的生物材料在调控玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性或禾谷镰孢菌茎腐病高抗病性玉米分子标记辅助育种中的应用。上述的应用，单倍型1“T、A”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为感病性，单倍型2“C、C”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为抗病性，而单倍型3“C、A”则为杂合型，禾谷镰孢菌茎腐病抗性居于单倍型1和单倍型2之间；所述的ZmEXO70F4基因在第1390位核苷酸和1437位的核苷酸均为“C”的变异赋予玉米对禾谷镰孢菌茎腐病的抗性。
上述的检测与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记的生物材料为引物、试剂盒中的至少一种。
本发明采用ZmEXO70F4的酵母双杂载体筛选相关信号途径的互作蛋白。本发明所采用的植物器官为生长2周的玉米成株期(盛花期)的茎。
本发明所述的病原菌禾谷镰孢菌Fusarium graminearum，病原菌相关分子模式PAMPsFlg22和几丁质Chitin诱导ZmEXO70F4基因的上调表达。
本发明的ZmEXO70F4基因在不同遗传背景自交系中的第1390和1437位的单核苷酸多态性(SNP)变异、单倍型及其在提高玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明主要研究了以下内容：根据ZmExo70F4序列构建的酵母双杂载体、ZmExo70F4受禾谷镰孢菌接种和几丁质Chitin诱导表达、亚细胞定位、在茎腐病抗性材料和感病材料中的单核苷酸多态性(SNP)变异及其与禾谷镰孢菌茎腐病抗性的关系。研究发现，玉米自交系B73幼苗接种禾谷镰孢菌病原菌接种和外源几丁质处理可显著诱导该基因表达。该基因EMS突变体zmexo70F4在田间接种禾谷镰孢菌后茎腐病抗性显著增强。该基因定位于细胞核和细胞质中。抗病自交系CML120和W438中该基因的第1390和1437位核苷酸的等位变异(C和C)单倍型与禾谷镰孢菌茎腐病抗性相关，自交系R168中该基因的第1390和1437位核苷酸的等位变异(C和A)单倍型；感病自交系335M、Liao6144、CML468和Y331中该基因的第1390和1437位核苷酸的等位变异(T和A)单倍型与禾谷镰孢菌茎腐病感病相关。因此，利用ZmExo70F4的等位变异开发分子标记，并利用基因工程和分子标记辅助育种技术进行玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗性改良具有一定的价值。
本发明的有益效果：
本发明首次从玉米中克隆得到了一个和玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗性相关基因ZmEXO70F4(Zm00001eb036550)及其编码的蛋白质ZmEXO70F4。该基因的表达水平和群体的单倍型遗传变异分析结果表明，其可能参与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗性。该发明对利用该基因的等位变异开发分子标记，并利用基因工程和分子标记辅助育种技术进行玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗性改良具有一定的价值。
附图说明
图1 ZmEXO70F4基因在接种禾谷镰孢菌及不同种类PAMPs处理后B73中的表达水平；
采用实时荧光定量PCR技术研究禾谷镰孢菌及PAMPs处理玉后ZmEXO70F4基因表达水平的影响，ZmTublin基因的表达作为内参。X轴表示处理后的不同时间点。Y轴表示ZmEXO70F4基因相对ZmTublin基因的表达倍数。其中，(A)F.graminearum处理后的ZmEXO70F4基因在不同时间点的表达水平；(B)Flg22处理后的ZmEXO70F4基因在不同时间点的表达水平；(C)Chitin处理后的ZmEXO70F4基因在不同时间点的表达水平。
图2 ZmEXO70F4自然变异赋予玉米对禾谷镰孢菌茎腐病抗性；
其中，(A)禾谷镰孢菌茎腐病抗性自交系CML120、W438和感病自交系R168、335M、Liao5144、CML468、Y331中接种禾谷镰孢菌后的茎腐病表型。(B)不同玉米自交系茎腐病相对病斑面积统计。每个自交系至少包括10株玉米，重复3次，结果相似。显著性分析采用单因素方差分析(One-way Anova)。(C)在禾谷镰孢菌茎腐病抗性自交系CML120、W438、R168和感病自交系335M、Liao5144、CML468、Y331中的ZmEXO70F4基因序列测序比对结果。
图3 Zmexo70F4 EMS突变体(EMS_09f1fc)接种禾谷镰孢菌后表现出明显的茎腐病抗病表型；
其中，(A)Zmexo70F4突变体不同基因型接种禾谷镰孢菌之后的表型表现。(B)Zmexo70F4突变体不同基因型测序对比图。(C)Zmexo70F4突变体不同基因型接种禾谷镰孢菌之后的统计图。
图4 ZmEXO70F4亚细胞定位；
其中，EV，表示空载。Bright field，表示明场视野。GFP，表示绿色荧光视野。Merge，表示明场和绿色荧光重合视野。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
实施例1玉米ZmEXO70F4基因的筛选克隆
根据玉米基因组数据库中ZmEXO70F4基因的基因组DNA序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物：上游引物ZmEXO70F4-F：5'-ATGGAGCGCATGCCGCAGGAC-3'；下游引物ZmEXO70F4-R：5'-CCACCTGACAAACTTCTGCAC-3'。以玉米自交系B73 cDNA为模板，用Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行扩增。对扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳回收。回收产物与pTOPO-Blunt载体连接转化，并进行测序；测序结果若为单倍型1，则与SEQID NO.2相同，若为单倍型2，则在SEQ ID NO.2的第1390和1437位核苷酸均为“C”。
ZmEXO70F4基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。该基因编码的蛋白质ZmEXO70F4的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2自交系B73接种禾谷镰孢菌及不同种类PAMPs处理后ZmEXO70F4基因的表达水平
选取健康饱满无病虫害的玉米品种B73种子，播种于南京农业大学光照培养室内，于28℃/22℃温度条件下生长至3叶一心期时，在茎秆部位接种禾谷镰孢菌孢子悬浮液(106个/ml)或取2-3cm左右茎秆用于不同的PAMPs处理，在接种或处理后的不同时间点采集茎秆组织，置于液氮速冻后于-80℃保存备用。
应用TRIZOL(Invitrogen)提取总RNA，以玉米组成型表达的Tublin基因为内部参照，以来自玉米茎秆的总RNA为模板，进行RT-PCR分析。用翊圣II两步法RT-PCR/qPCR系列试剂盒(/>qPCR/>Green Master Mix(11201ES03))。应用能特异扩增ZmEXO70F4的特异引物P1(TGCACTTCCTGTCGACTTTC)和P2(CCTCCTCCTCTTCGAGATCAT)，对该基因的表达进行q-PCR分析。PCR反应在q-PCR仪(BIO-RAD，CFX96)上扩增。20μl PCR反应体系中含2μl cDNA,10μl 2×PowerUPTMSYBRTM Green Master Mix(Thermo Fisher)，0.5μl引物P1(10μM)和P2(10μM)。扩增参数为：95℃5min，然后95℃10s、60℃20s，共40个循环。反应结束后，计算相对表达量：根据得到的CT值计算目标基因的相对表达量，即2-ΔΔCT。其中，ΔΔCT＝(CT.Target-CT.Tublin)Time x-(CT.Target-CT.Tublin)Time 0。Time x表示任意时间点，Time 0表示未处理点。结果表明，ZmEXO70F4受Chitin和F.graminearum诱导表达，说明ZmEXO70F4基因参与调控玉米对禾谷镰孢菌的抗性(如图1所示)。
实施例3 ZmEXO70F4自然变异赋予玉米对禾谷镰孢菌茎腐病抗性
选取健康饱满无病虫害的7个不同的玉米自交系种子(CML120、W438、R168、335M、Liao5144、CML468和Y331)，分别于2019年及2020年播种于黑龙江，盛花期7天后，在由下往上第三节茎秆处用锥子扎空，每个伤口注射200ul禾谷镰孢菌孢子悬浮液(106个/ml)，并用石蜡封住伤口，接种2周后剖开茎秆观察表型。由图2A可知，CML120和W438两个自交系病斑较小，而R168、335M、Liao5144、CML468和Y331五个自交系的茎腐病病斑较大。图2B的病斑面积定量结果表明，CML120和W438两个自交系较抗茎腐病，而R168、335M、Liao5144、CML468和Y331四个自交系较感茎腐病，抗病和感病材料之间的病斑面积达显著水平(p<0.05)。
实施例中所涉及的自交系种子CML120、W438、R168、335M、Liao5144、CML468、Y331，均为本领域技术人员公知的被研究者广泛使用的自交系或国内外已公开发表的自交系。
利用CTAB法对不同玉米自交系进行DNA提取，并对ZmEXO70F4进行重测序并进行单倍型遗传变异分析，发现如SEQ ID NO.2所示的玉米ZmExo70F4基因在不同遗传背景自交系中的第1390和1437位存在单核苷酸多态性(SNP)变异。分析结果显示，玉米ZmExo70F4基因在7个不同背景玉米自交系中的单核苷酸变异(SNP)为：玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病自交系CML120、W438的1390位核苷酸为“C”，1437位核苷酸为“C”；R168的1390位核苷酸为“C”，1437位核苷酸为“A”。玉米禾谷镰孢菌茎腐病感病自交系335M、Liao5144、CML468、Y331的1390位核苷酸为“T”，1437位核苷酸为“A”。单倍型1“T、A”与禾谷镰孢菌茎腐病感病有关，单倍型2“C、C”与禾谷镰孢菌茎腐病抗性有关，而单倍型3“C、A”则为杂合型，禾谷镰孢菌茎腐病抗性居于单倍型1和单倍型2之间(如图2C所示)。
结果说明，ZmEXO70F4是一个潜在的玉米抗禾谷镰孢菌茎腐病的基因，该基因在第1390位核苷酸和1437位核苷酸均为“C”的自然变异赋予了玉米对禾谷镰孢菌茎腐病的抗性。
实施例4 Zmexo70F4 EMS突变体幼苗接种禾谷镰孢菌后的茎腐病
选取健康饱满无病虫害的玉米zmexo70F4 EMS突变体(EMS_09f1fc)(购于http://elabcaas.cn/memd/public/index.html#/)和野生型B73种子，播种于南京农业大学白马教学实习基地，接种方式及表型观察时期同实施例2。如图3A所示，因购买的zmexo70F4突变体为杂合型，其不同的分离后代表现出不同的茎腐病病斑面积。对不同单株的该基因序列进行测序后发现，单株#2和#6的第1390位的SNP由“C”变为“T”，且为丝氨酸突变为亮氨酸的非同义突变类型，因此属于纯合突变；单株#3、#10、#12和#15的第1390位的SNP仍然为“C”，因此为野生型；单株#1、#4、#5、#7、#8、#9、#11、#13、#14、#16和#17的第1390位的SNP为“C”和“T”两个碱基峰，因此为杂合型。对这些单株进行接种后的茎腐病面积进行定量分析结果表明：与野生型以及B73种子相比，zmexo70F4在第1390位的SNP由“C”变为“T”造成单个氨基酸的非同义突变体病斑面积显著低于野生型和杂合型，说明ZmEXO70F4基因在该位点的突变对可以提高玉米禾谷镰孢菌抗性。
实施例5 ZmEXO70F4亚细胞定位及调控细胞死亡情况
用限制性内切酶BamHⅠ和SpeⅠ将pCAMBIA1305.1-GFP载体线性化，设计插入片段扩增引物：
上游引物ZmEXO70F4-GFP-F：
5'-CAGCCCAGATCAACTAGTATGGAGCGCATGCCGCAG-3'；
下游引物ZmEXO70F4-GFP-R：
5'-CTTGCTCACCATGGATCCCCACCTGACAAACTTCTGCA-3'。
在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物的5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列，用Max Super-Fidelity DNA Polymerase以玉米B73 cDNA为模板进行扩增，将产物与线性化载体依照Ⅱ快速克隆技术构建好载体，并测序确认。
将构建好的载体转到GV3101农杆菌菌株内，30℃培养箱培养2-3天。按照农杆菌侵染烟草实验方法注射3-5株烟草。暗光培养24h后光照培养24h，激光共聚焦显微镜下观察ZmEXO70F4的定位。暗光培养48h后光照培养72h左右观察ZmEXO70F4调控细胞死亡情况。如图4所示，结果表明：ZmEXO70F4即定位于细胞膜上又定位于细胞核中，且ZmEXO70F4可诱导烟草细胞死亡。
实施例6 ZmEXO70F4基因酵母双杂载体的构建
用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ将pGBKT7和pGADT7载体线性化，设计插入片段扩增引物：
上游引物ZmEXO70F4-PGBKT-F：
5'-ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGAGCGCATGCCGCAG-3'；
下游引物ZmEXO70F4-PGBKT-R：
5'-CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCCACCTGACAAACTTCTGC-3'。
在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物的5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列，用Max Super-Fidelity DNA Polymerase以玉米B73 cDNA为模板进行扩增，将产物与线性化载体依照Ⅱ快速克隆技术构建好载体，并测序确认。
将构建好的pGBKT7载体转到酵母Y2HGold菌株内，pGADT7载体转到Y187菌株内，方法依照Yeastmaker Yeast Transformation System 2试剂盒说明；将转化好的酵母分别涂布到选择培养基SD/–Trp，SD/–Leu上，30℃培养3-5天。筛选出和ZmEXO70F4基因基因编码蛋白的互作蛋白。
SEQ ID NO.1
>Zm00001eb036550_T001 genomic DNA:chromosome:Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0:1:198166440:198171373:1
TATTATGGCGCTGGACTGTCAATGGCGAATACTCTACCCGTAGCGCCTACCAAGCTCAGTTCAATGGAAGCATGTTTAGAATGAAAATTGAAGCAATATGGAAGGCAAAAGCGGAGCCTAAATGCCGTTTTTTCGCGTGGACGCTCCTACATGAAAAGATCCTCACAGCTAACAATTTGCAGAAGAGGGGATGAGATCACAACCCTATTTGTCCTCTTTGTCACATAGATCCGGAAACCCCGAGTCACCTGTGCAAATATTGTAGTTACTCAAAAAGCATTTGGCGGACTTTGTTACATTGGACCAATCTCAACTCTTTAGCAAACCTAAACTATGATGGCCAGTTACATACTTGGTGGAGAAGATGTAGACTCAGAATTGATAAGCCAAGACGAAGGTTATTTGACGGGCTAGTAGTCTATTTTTGGTGGAATATTTGGAAAGAAAGAAATAGGCGAATTTTTCAAAATTCCGGGAATGATCAACTTGTCGTCGCCCATCAAATCAAGGAGGATATCTTACAATACAGTGCGGCTTTCTCTTTCTTTTGATCAGAGAGTTCTCTAGTGGTGGTTTTGTTTTTTCTTAGTGGTGGTTCTTTTTTTTCTCTTCTTTTCGCTCTCTTCTTTTTTCTTGAATTGGCTGTAGTTGGTACCTTGCTGGCCAGTAGTCCCTGTATTTGGTTTTTTCTCCTTCTATTAATATATTCGGCAATCCTCTTGCCGTCCTTTCGAAAAAAGGTACATTCACAAAGTATATTAGAATAGTCCCCTACCCGCAGCTCATCGACACAAGTATTATCTATACCACAATATAATCCGCCAATTTAAATATTGAAAAACTCCCTCAACAAAACCAGCCCATACTCATAATCTTCACTAAATCTATCAAACAAATTGCATCTAAATTTAACACGCTATTAAATCAATGATTCAAATCGTTGGATAATCTTCTTCCTTTTACTTGGTCAAACATAATAGACAATATTATTTGAGTCATCTTTCATCCCTCCATCCCGCGCCGCCGTCGATCCTCATCTCGGGTTGTCACCATCGATTCACCACTCAATGTTGTAGTGTTAGGCTATATACTAGTATTTAAACAGCATTGTATTATACATCTAATTCGGCTGAACCCGTGTAAACTCTATCCCAATAACTACTGCTCTGATTCATATTCATCAGATTACTCGTCATGGTAAAAAACGCATCGACAACGTTTCTACTTTAGTAGAAGGTGAGTAGGTGAGTGTGTATAGGTGGCGTCTAGTTCCCTGTAATTTTTGAGAAATTAGATACTACACAAAATTTAAATAAAGTTCTACTATCAGCTTACGTTGATATTGTGAGATTATGGTACAAAACATAATACAAAATTCAGAAGCTGTTTATTTAATAATGAGATTATAAAAATAAGATTTTAACCAAACAGGACATAAAGTCGACATCCATGAACCATGAAACTTTTTAAGAACTGGTGACGTTTCCCTTAAAAAAAGGGTGACGACGGCCAGGAGGATGGAAAAACTTGGATCTGTCTGTATGTTCCGAAGTCCAAACCCAGTGAAATTGCTGCGAAGTTTTCACGACCACCATGTCCATCCGCTAAAACTTGCGCAGCACCTGCATCTTCTTGCCGAGTCGAACTGCACACGTAGATACTCCAATAGATGCTTGTCGAGGTCGTTGTGCTGCTGCCGTCGACATCTCCACATCGGCAAAACGACTCTCCTCCAATCGAACACGCCGTACGCTACAATTTTCACGGCCTCTCAATCTGACAGAAGGCACTTGAATTCATTCACTTGACACGGTCTAAATTCTGTGGGTCACGAGTAAAGTTTTTTTTTTCTTCTAGAGAGAGGACGCAGAGATGTCAAAGGAAATAAATGATTCTGAAGGAAATAAATGATTCTGATTGTTATATTTAAGAAGGAAAAAAAGGCAACTAGTAGCAGCAGGCAAGTAGTATAAATTATGGCCACGTTATTCGTGGCGTAACAGGCTCTCACCTTTAGAACCGTTCCAGACTCTGCGACGACGACGGCGGCGGTGGGATTGGTGGGAAGGAAGAAAGCTTGCTCCCTGTGTTCCAACGACGACCGAACCGACTGCGTCCATGGAGCGCATGCCGCAGGACGCCGGGCAGGAGAGAGTCATGGCGGCCGCTAAGCAGATCCTGAAGAGCCTTGCCGTGTCCAAGAACGCCGCCGACGACATGATGCACTTCCTGTCGACTTTCGACCCGCGCCTCCACCCGCTGTCCTCCCCGGAGGCGGCCGAGGAGGAGGCGTCCGGGTCCGGCGCTGATGATGATGATCTCGAAGAGGAGGAGGAGATCGCCGCCGCGGAGGAGGTGATCATCCGGTGCGAGTCCTCGTCGATGACGTCCGGCGTGTTCTCTGACTACCTGTACGCCGTGGACGACGCCATCGCCGCGTCCGGCCGCTCGGCCCGCGCCGCCGCCGCCGTGCACGCCGCCATGCCGCGCCTGGAGGAGGAGGCGCGCGCCCTGCTCTCTTCCTCTCCGTCCCTGCGGCGCCTCTCGGTGTCGTCGGATGACCTCGGCGACGCGACGACCACGCCCGACGCGTCCCCGCGCCACGGGAACGGGCACGGCACGCTGTCCCCGACCGCCGCGGCCTCCGTGGGCGCCGTCGCGGCGCGCATGCTGCGCGCCGGGTACGGCCCGGAGCTCGCGCAGGTGTACGTTGCCGCCCGCCGCGATGCGCTGGCGGACTCCGTGGCGCTCCTCGGCGTCGAGGCCGTCGCCATCGAGGAGGTGCTCAGGATGGAGTGGACGGCGCTGGACCAGAGGATGCGGCGGTGGAGCCACGCCGTGCGGGCCGTGGTCAGGACGCTCCTCGCCGCCGAGCGCCAGCTCTGCGACGAGGTGTTCGCGGCGGACGAGGGCCTCGGCCACGAGTGCTTCGCCGACGTCGCCAGGGCCTGCGTCCTGCAGCTGCTAGCCTTCGCGGACGCGGTGGCCGTGTCGCCGCGCGCCACCGAGAAGCTGTACCGCACGCTCGGCATGTACGAGGCGCTCGCCGACGTGCAGCCGGACCTGGAGGCGCTCTTCTCAGACGACGACGGCGCGCGCGAGTTCTTCGCGTCGGAGGCCTCCAGCGCCGTCCAGCAGCTGGGCTCCACCGTGCGCCACACCATCGAGGAGTTCAGCCAAGCCATCCACGGCGAGGCGTCGCGGAGGCCTGTCCACGGCGGGGACATCCACCCCATGGCCCGCTACGTCCTCAACTACTGCGGCCTCCTCGCCGACTGCCGCGGCGCCCTGGACGCGGTCCTCGGCGACGCCGGCGGCCTGGACGACGCGTCCTCCGACGGCCGCGGCGCCGCCTCGACGCCGTCCGCGTGCTGCATCCGCGAGCTGCTCACGCTGCTGCTGCGCAACATCGACGACAAGTCCCGGCTGTACGACGACGCCGGGCTGCGGAACATCTTCCTGATGAACAACCTCTACTACGTGGTGCAGAAGGTGCGGGAGTCCCCGTCGCTGCGCGAGCTCGTCGGCGACGACTGGCTCCGGCGGTACCGCGGACAGATCCGGCAGTACGAGACCGGCTACCTCCGGGCGTCCTGGGCCGCCGTGCTGTCCCAGCTGAGGAGGGACGACGGCGCGGCGGCTAGGCCGCCGGCCGGGCACAGGGCGCCGTCGGGCCCGTCGGCCAAGAGCTTCAACGCGGTGTTCCAGGAGCTGTACCGGACGCAGACGGCGTGGAAGGTGGCGGACGCCCAGCTCCGTGAGGAGCTGCGCATCGCGGTGTCGGAGCGGCTGATCCCGGCGTACCGGGCGTTCCTCGGGCAGGGCACCCGGCACCCGGCGAGACACGTCAAGTGGAGCCTCGACGACCTCGAGTGCTACATGCTGGACTTCTTCGAAGGCGTGCAGAAGTTTGTCAGGTGGTGATCACCGGAGCAGAGGATCATCAATTCACCAATCAGCATCCATGGCGAGTTTGGGACGTGCGTGCATCGTGAACTCGTGGCGTATGCGCTCCAATCTCATGGCACTTACGATGCCGTAGAATCTCGTTTCTCCTCTCTTCTAGGAAATCCTTTTTTTTACACTGAGATAGATGTAGATATGCATCAAATTCAGGAGTGTGTATATACCATACTCTGTTTTTTTGGCTTGTTCATGATTTAGATGTGGTTGTTATTTAGCTTATTAAACAATGAATCATCTTCATCAGGACCTAAGCATGAGCCAACGTATGCTTTGCCTAGTTTGCCAATCAGGCCATGATCAACGAGGTGGCTCACCTGGTGGTCTGCAGGTTTGGTCTGGCCAGCTAGGTTCGGATGCTGCCATGGACAAGAGTCGGGTGCTCTAATCATGTTAGAGTCACGCATGCTGAAGGTGAAGCTGCTTACGACGACATCAGTAACTAGTTAGCTTGCTATTAGCTATTATTCCCTCTATTCTTTTTTATTTATTGCGGTTTAGTTTAAAAAATAAGTTAGTGAGCTACAAATATTCGAGAACGAAGGTAATATCTAACTTAGTATAGCCAGTAAATATAGTTGTCATCTAAAGGTCTACTAAACAATTAGCTAATAGTCCATTGTCTATGTATATTTAGATCCAAAAGAGATAAACATTAACATATAGCTACTATCTATAGGATCGAAACACAACCTAAGGTGAAATTGATCAAAGAAAAACGATATCTGTAATCTGTTGCTGAAATCCCACTACTTGTGCCGTAAGTAAGCAATAAGGCCATGGGAAGAAAGGGGTAAATCCATGTAGAAGAGAGAGAAATAATTATTTTATTACTTACTATATTATCATAACTTATAAAACTAAGTCTGTTGTATGGTACTCTCTCTGTTATAAATTATAAGATATTTTGTCCTTTATATTTTCATAATTTTTGTGGACTCTAGTTAAAACAAAAACTGATCCAATCTAAA
SEQ ID NO.2
>Zm00001eb036550_T001 cdna:_protein_coding
CAGGCTCTCACCTTTAGAACCGTTCCAGACTCTGCGACGACGACGGCGGCGGTGGGATTGGTGGGAAGGAAGAAAGCTTGCTCCCTGTGTTCCAACGACGACCGAACCGACTGCGTCCATGGAGCGCATGCCGCAGGACGCCGGGCAGGAGAGAGTCATGGCGGCCGCTAAGCAGATCCTGAAGAGCCTTGCCGTGTCCAAGAACGCCGCCGACGACATGATGCACTTCCTGTCGACTTTCGACCCGCGCCTCCACCCGCTGTCCTCCCCGGAGGCGGCCGAGGAGGAGGCGTCCGGGTCCGGCGCTGATGATGATGATCTCGAAGAGGAGGAGGAGATCGCCGCCGCGGAGGAGGTGATCATCCGGTGCGAGTCCTCGTCGATGACGTCCGGCGTGTTCTCTGACTACCTGTACGCCGTGGACGACGCCATCGCCGCGTCCGGCCGCTCGGCCCGCGCCGCCGCCGCCGTGCACGCCGCCATGCCGCGCCTGGAGGAGGAGGCGCGCGCCCTGCTCTCTTCCTCTCCGTCCCTGCGGCGCCTCTCGGTGTCGTCGGATGACCTCGGCGACGCGACGACCACGCCCGACGCGTCCCCGCGCCACGGGAACGGGCACGGCACGCTGTCCCCGACCGCCGCGGCCTCCGTGGGCGCCGTCGCGGCGCGCATGCTGCGCGCCGGGTACGGCCCGGAGCTCGCGCAGGTGTACGTTGCCGCCCGCCGCGATGCGCTGGCGGACTCCGTGGCGCTCCTCGGCGTCGAGGCCGTCGCCATCGAGGAGGTGCTCAGGATGGAGTGGACGGCGCTGGACCAGAGGATGCGGCGGTGGAGCCACGCCGTGCGGGCCGTGGTCAGGACGCTCCTCGCCGCCGAGCGCCAGCTCTGCGACGAGGTGTTCGCGGCGGACGAGGGCCTCGGCCACGAGTGCTTCGCCGACGTCGCCAGGGCCTGCGTCCTGCAGCTGCTAGCCTTCGCGGACGCGGTGGCCGTGTCGCCGCGCGCCACCGAGAAGCTGTACCGCACGCTCGGCATGTACGAGGCGCTCGCCGACGTGCAGCCGGACCTGGAGGCGCTCTTCTCAGACGACGACGGCGCGCGCGAGTTCTTCGCGTCGGAGGCCTCCAGCGCCGTCCAGCAGCTGGGCTCCACCGTGCGCCACACCATCGAGGAGTTCAGCCAAGCCATCCACGGCGAGGCGTCGCGGAGGCCTGTCCACGGCGGGGACATCCACCCCATGGCCCGCTACGTCCTCAACTACTGCGGCCTCCTCGCCGACTGCCGCGGCGCCCTGGACGCGGTCCTCGGCGACGCCGGCGGCCTGGACGACGCGTCCTCCGACGGCCGCGGCGCCGCCTCGACGCCGTCCGCGTGCTGCATCCGCGAGCTGCTCACGCTGCTGCTGCGCAACATCGACGACAAGTCCCGGCTGTACGACGACGCCGGGCTGCGGAACATCTTCCTGATGAACAACCTCTACTACGTGGTGCAGAAGGTGCGGGAGTCCCCGTCGCTGCGCGAGCTCGTCGGCGACGACTGGCTCCGGCGGTACCGCGGACAGATCCGGCAGTACGAGACCGGCTACCTCCGGGCGTCCTGGGCCGCCGTGCTGTCCCAGCTGAGGAGGGACGACGGCGCGGCGGCTAGGCCGCCGGCCGGGCACAGGGCGCCGTCGGGCCCGTCGGCCAAGAGCTTCAACGCGGTGTTCCAGGAGCTGTACCGGACGCAGACGGCGTGGAAGGTGGCGGACGCCCAGCTCCGTGAGGAGCTGCGCATCGCGGTGTCGGAGCGGCTGATCCCGGCGTACCGGGCGTTCCTCGGGCAGGGCACCCGGCACCCGGCGAGACACGTCAAGTGGAGCCTCGACGACCTCGAGTGCTACATGCTGGACTTCTTCGAAGGCGTGCAGAAGTTTGTCAGGTGGTGATCACCGGAGCAGAGGATCATCAATTCACCAATCAGCATCCATGGCGAGTTTGGGACGTGCGTGCATCGTGAACTCGTGGCGTATGCGCTCCAATCTCATGGCACTTACGATGCCGTAGAATCTCGTTTCTCCTCTCTTCTAGGAAATCCTTTTTTTTACACTGAGATAGATGTAGATATGCATCAAATTCAGGAGTGTGTATATACCATACTCTGTTTTTTTGGCTTGTTCATGATTTAGATGTGGTTGTTATTTAGCTTATTAAACAATGAATCATCTTCATCAGGACCTAAGCATGAGCCAACGTATGCTTTGCCTAGTTTGCCAATCAGGCCATGATCAACGAGGTGGCTCACCTGGTGGTCTGCAGGTTTGGTCTGGCCAGCTAGGTTCGGATGCTGCCATGGACA
SEQ ID NO.3
>Zm00001eb036550_T001 peptide:Zm00001eb036550_P001 pep:_protein_coding
MERMPQDAGQERVMAAAKQILKSLAVSKNAADDMMHFLSTFDPRLHPLSSPEAAEEEASGSGADDDDLEEEEEIAAAEEVIIRCESSSMTSGVFSDYLYAVDDAIAASGRSARAAAAVHAAMPRLEEEARALLSSSPSLRRLSVSSDDLGDATTTPDASPRHGNGHGTLSPTAAASVGAVAARMLRAGYGPELAQVYVAARRDALADSVALLGVEAVAIEEVLRMEWTALDQRMRRWSHAVRAVVRTLLAAERQLCDEVFAADEGLGHECFADVARACVLQLLAFADAVAVSPRATEKLYRTLGMYEALADVQPDLEALFSDDDGAREFFASEASSAVQQLGSTVRHTIEEFSQAIHGEASRRPVHGGDIHPMARYVLNYCGLLADCRGALDAVLGDAGGLDDASSDGRGAASTPSACCIRELLTLLLRNIDDKSRLYDDAGLRNIFLMNNLYYVVQKVRESPSLRELVGDDWLRRYRGQIRQYETGYLRASWAAVLSQLRRDDGAAARPPAGHRAPSGPSAKSFNAVFQELYRTQTAWKVADAQLREELRIAVSERLIPAYRAFLGQGTRHPARHVKWSLDDLECYMLDFFEGVQKFVRW。
Claims (10)
1.一个玉米ZmEXO70F4基因，该基因的cDNA具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述玉米ZmEXO70F4基因编码的ZmEXO70F4蛋白，该蛋白具有如SEQ IDNO.3所示氨基酸序。
3.含有权利要求1所述玉米ZmExo70F4基因的生物材料，其特征在于，该生物材料为重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
4.权利要求1中所述的玉米ZmEXO70F4基因、权利要求2中所述的ZmEXO70F4蛋白，或权利要求3中所述的生物材料在调控玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性或禾谷镰孢菌茎腐病高抗病性玉米育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，如SEQ ID NO.2所示的玉米ZmExo70F4基因的第1390和1437位存在单核苷酸多态性变异，1390位核苷酸为C或T，1437位核苷酸为C或A，其中，单倍型1“T、A”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为感病性，单倍型2“C、C”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为抗病性，而单倍型3“C、A”则为杂合型，禾谷镰孢菌茎腐病抗性居于单倍型1和单倍型2之间；所述的ZmEXO70F4基因在第1390位核苷酸和1437位的核苷酸均为“C”的变异赋予玉米对禾谷镰孢菌茎腐病的抗性。
6.权利要求1中所述的玉米ZmEXO70F4基因、权利要求2中所述的ZmEXO70F4蛋白，或权利要求3中所述的生物材料在提高玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性或诱导植物细胞产生坏死中的应用，其特征在于，在目标植物中上调玉米ZmEXO70F4基因表达能够诱导植物细胞产生坏死，提高植物的抗病性。
7.一种与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记，其特征在于，如SEQ IDNO.2所示的玉米ZmExo70F4基因的第1390和1437位存在单核苷酸多态性变异，1390位核苷酸为C或T，1437位核苷酸为C或A，其中，单倍型1“T、A”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为感病性，单倍型2“C、C”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为抗病性，而单倍型3“C、A”则为杂合型，禾谷镰孢菌茎腐病抗性居于单倍型1和单倍型2之间。
8.权利要求7所述的与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记或用于检测如权利要求7所述的与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记的生物材料在调控玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性或禾谷镰孢菌茎腐病高抗病性玉米分子标记辅助育种中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，单倍型1“T、A”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为感病性，单倍型2“C、C”对禾谷镰孢菌茎腐病表现为抗病性，而单倍型3“C、A”则为杂合型，禾谷镰孢菌茎腐病抗性居于单倍型1和单倍型2之间；所述的ZmEXO70F4基因在第1390位核苷酸和1437位的核苷酸均为“C”的变异赋予玉米对禾谷镰孢菌茎腐病的抗性。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的检测与玉米禾谷镰孢菌茎腐病抗病性相关的SNP分子标记的生物材料为引物、试剂盒中的至少一种。
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| CN105218651A (zh) * | 2015-09-01 | 2016-01-06 | 中国农业大学 | 玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆及功能分析 |
| CN108893550A (zh) * | 2018-07-10 | 2018-11-27 | 北京市农林科学院 | 玉米茎腐病抗性相关snp分子标记开发及其应用 |
| CN109234431A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-01-18 | 北京大北农生物技术有限公司 | 玉米抗茎腐病qtl的分子标记及其应用 |
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2023
- 2023-05-19 CN CN202310568263.1A patent/CN116622727A/zh active Pending
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