CN110229223B

CN110229223B - 小麦抗白粉病相关bfr蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN110229223B
Application number: CN201910514331.XA
Authority: CN
Inventors: 张相岐; 刘亚培; 范仁春; 席海秀; 卫波
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: CN110229223A

Abstract

本发明涉及小麦抗病领域，具体的涉及小麦抗白粉病相关蛋白BFR及其编码基因与应用，所述蛋白为如序列7所示的氨基酸序列，或序列7所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换后的序列。通过病毒诱导的基因沉默和CRISPR/Cas9基因编辑技术，降低所述蛋白在小麦叶片中的表达，使抗白粉病的小麦品种小白冬麦对无毒菌系E18的侵染，反应型由0‑1级变为3‑4级。通过基因枪转化，在小麦叶片中过表达BFR基因，使毒性菌系E18病原菌孢子在感病小麦品种科农199叶片上的萌发显著被抑制。

Description

小麦抗白粉病相关BFR蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与小麦抗白粉病相关的BFR蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

小麦白粉病是由小麦白粉病菌侵染引起的世界性病害。小麦白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)属于子囊菌纲，布氏白粉菌属，禾本科布氏白粉菌小麦专化型，是一类专性活体寄生真菌(Wicker et al.,2013)。

小麦白粉菌的侵染，主要影响叶片正常的光合作用和新陈代谢，导致分蘖减少、结实率下降、千粒重降低等不良后果(Wiersma et al.,2017)。如在苗期感染白粉病，甚至会导致植株的死亡(Singh et al.,2016)。在我国，小麦白粉病的常年发病面积都在600万公顷以上(中国农业年鉴主编委员会,2006)。小麦白粉病大流行年份可造成30％-40％的产量损失(Mehta,2014)，同时也会导致小麦品质的显著降低，严重威胁着我国小麦生产和粮食安全。尽管化学药剂可以有效控制小麦病害造成的经济损失，但出于对环境安全和人类健康的考虑，培育并推广抗病品种依然被认为是最根本、最经济和最安全的途径(Line andChen,1995；Xu et al.,2013)。抗病基因的克隆与功能研究对于小麦抗病分子机制的研究和进行分子抗病育种具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦白粉病抗性相关的蛋白及其编码基因和应用。

本发明涉及一种名为BFR的蛋白质，所述BFR为如序列7所示的氨基酸序列，或序列7所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换后的序列。

其中，所述替换后的氨基酸序列具有如序列8或者序列9所述的氨基酸序列。

一种编码上述的蛋白质的基因，名为BFR基因，所述BFR基因为如序列1或序列2或序列3所示的核苷酸序列。

一种培育白粉病抗性降低的转基因植物的方法，包括抑制受体植物中权利要求2所述的蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的白粉病抗性低于所述受体植物。

其中，通过将抑制所述的蛋白质表达的物质导入受体植物中来抑制受体植物中权利要求2所述的蛋白质的含量和/或活性，所述抑制蛋白质表达的物质为：A)BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和和γ-TXR,所述γ-TXR为γ-TXR-1或γ-TXR-2，所述γ-TXR-1为将序列表中的序列2自5’末端起第109-314位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ链的其它序列不变的得到的TXR基因沉默载体,所述γ-TXR-1为将序列表中的序列2自5’末端起第1623-1795位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ链的其它序列不变的得到的TXR基因沉默载体。

其中，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统实现抑制受体植物中所述的抑制TXR基因转录，从而实现抑制受体植物中所述TXR蛋白质的含量和/或活性。

一种用于抑制受体植物中所述的蛋白质的含量和/或活性的沉默片段，所述沉默片段具有如序列2中109-314的核苷酸序列或者序列2中1623到1795的核苷酸序列。

一种培育白粉病抗性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的白粉病抗性高于所述受体植物。

其中，所述转基因植物的白粉病抗性高于所述受体植物体现在如下a)或b)：a)转基因植物的白粉病菌的吸器指数低于受体植物；b)转基因植物的白粉病菌的分生孢子数低于受体植物。

其中，所述受体植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。

本发明所提供的小麦白粉病抗性相关的基因，命名为BFR，来源于普通小麦(Triticum aestivumL.)品种小白冬麦，其核苷酸序列与氨基酸序列示于序列表中序列1-3和序列7-9。该基因位于小麦的第三部分同源群染色体上，并分别将来自3A、3B和3D染色体上的BFR基因序列暂命名为BFR-3A-xiaobaidongmai、BFR-3B-xiaobaidongmai和BFR-3D-xiaobaidongmai。通过病毒诱导的基因沉默和CRISPR/Cas9基因编辑技术，降低BFR基因在小麦叶片中的表达，使抗白粉病的小麦品种小白冬麦对无毒菌系E18的侵染，反应型由0-1级变为3-4级。通过基因枪转化，在小麦叶片中过表达BFR基因，使毒性菌系E18病原菌孢子在感病小麦品种科农199叶片上的萌发显著被抑制。由此证明小麦的BFR基因参与小麦对白粉病的抗性调控。

附图说明

图1为从小麦品种小白冬麦基因组中克隆获得到的3个BFR基因拷贝的KASP标记分型对3个基因拷贝的染色体定位分析。(A)、(B)和(C)分别代表162、643和1245bp位置处的KASP标记分型结果。BFR1、BFR2和BFR3分别代表以小白冬麦基因组DNA为模板，扩增得到的BFR基因的三个拷贝序列，CS为中国春。红色的三角形表示VIC荧光基团，位于X轴，蓝色的圆形表示FAM荧光基团，位于Y轴，绿色的正方形表示杂合型。×表示分型不明确。

图2为小白冬麦BSMV-VIGS植株中BFR基因的相对表达量检测。图示沉默片段BFR-1和BFR-2均可极显著下调BFR基因的表达(“**”代表P≤0.01)。Mock：模拟接种的空白对照植株；BSMV:GFP：转GFP基因的负对照植株；BSMV:BFR-1和BSMV:BFR-2分别代表利用沉默片段BFR-1和沉默片段BFR-2下调BFR基因表达的植株。

图3为下调BFR基因表达的小白冬麦植株失去对白粉菌系E18的抗性，沦为高感(反应型为3～4)。Mock：模拟接种的空白对照植株；BSMV:GFP：转GFP基因的负对照植株；BSMV:BFR-1和BSMV:BFR-2分别代表利用沉默片段BFR-1和沉默片段BFR-2下调BFR基因表达的植株。

图4为BSMV-VIGS下调BFR表达后小白冬麦叶片产生H₂O₂的细胞数目减少A：白粉菌菌系E18侵染的小白冬麦叶片，箭头示积累大量活性氧的叶片表皮细胞。B：BSMV-VIGS降低BFR在小白冬麦中的表达后，E18侵染时积累活性氧的叶片表皮细胞数量和面积显著减少。C：BSMV-VIGS降低BFR在小白冬麦中的表达后，E18侵染时产生的活性氧表皮细胞数量统计结果，与对照Mock和BSMV:GFP相比显著减少。

图5为瞬时过表达BFR基因的感白粉病普通小麦品种科农199和Chancellor叶片表皮细胞接种白粉菌菌系E18后的抗病细胞(A)、感病细胞(B)及吸器指数变化(C)。A：有白粉菌孢子附着，但没有吸器形成的抗病细胞，箭头指示附着在细胞表面未萌发的分生孢子；B：有白粉菌孢子附着，并且进一步形成手型吸器的感病细胞，箭头指示白粉菌分生孢子萌发形成的吸器。C：示瞬时共表达BFR和GUS基因的细胞(pJIT166:BFR)吸器指数较只表达GUS基因的负对照细胞(pJIT166:GUS)显著降低。

图6为CRISPR/Cas9系统中针对BFR基因的sgRNA活性检测。b1表示靶标BFR基因的sgRNA。-T7E1表示分别以pTaU6-b1载体质粒(b1)转化的原生质体DNA为模板和野生型(WT)原生质体DNA为模板进行PCR扩增得到的BFR基因片段，经变性和复性后未加T7E1酶处理。+T7E1表示分别以pTaU6-b1载体质粒(b1)转化的原生质体DNA为模板和野生型(WT)原生质体DNA为模板进行PCR扩增得到的BFR基因片段，经变性和复性后加T7E1酶处理。红色箭头示突变条带。

图7为BFR基因编辑植株的抗白粉病鉴定及其突变类型的测序检测结果。A：BFR基因通过CRISPR/Cas9系统被编辑后，在T1代植株叶片中表达量显著降低。B：BFR基因被编辑突变后，小白冬麦植株失去对白粉菌系E18的抗性，沦为高感。C：T1代植株突变类型的测序检测结果。CK：对照植株。13-3和13-5分别表示编号为13的T0代植株自交获得的两个不同的T1代单株。13-3A：BFR-3A-xiaobaidongmai在13-3株系中的突变类型。13-3B：BFR-3B-xiaobaidongmai在13-3株系中的突变类型。13-3D：BFR-3D-xiaobaidongmai在13-3株系中的突变类型。13-5A：BFR-3A-xiaobaidongmai在13-5株系中的突变类型。13-5B：BFR-3B-xiaobaidongmai在13-5株系中的突变类型。13-5D：BFR-3D-xiaobaidongmai在13-5株系中的突变类型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，均设置3次重复，结果取平均值。

下述实施例中的BSMV-VIGS病毒载体(包括α、β和γ质粒)和GFP(BSMV:GFP)质粒在文献“Holzberg S.,Brosio P.,Gross C.,Pogue G.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.Plant J.,2002,30:315-327.”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)菌系E18在文献“张海泉，马淑琴。34份粗山羊草抗白粉病性鉴定及遗传分析。植物保护，2008，34(2)：37-40。”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的小麦品种科农199(Triticum aestivum var.Kenong199)在文献“李俊明，张相岐，张爱民，王志国，安调过，纪军，王静。高产广适小麦新品种—科农199。麦类作物学报，2007，27(2)：368。”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的小麦品种Chancellor(Triticum aestivum var.Chancellor)在文献“翟雯雯，段霞瑜，周益林，马慧乾。我国小麦地方品种蚂蚱麦、小白冬麦、游白兰、红卷芒抗白粉病性遗传分析。植物保护，2008，1：37-40。”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的质粒pJIT166和pJIT166-GUS在文献“Frederic A.,Carole L.T.,Carsten L.,Niu Y.,Wang D.W.,Andrew J.M.Virus induction of heat shock protein70 reflects a general response to protein accumulation in the plantcytosol.Plant Physiology,2005,138:529-536.”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的质粒pTaU6和pJIT163-2NLSCas9在文献“Qiwei Shan,YanpengWang,Jun Li,Caixia Gao Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cassystem.Nature Protocols,2014,9(10):2395-2410.”中公开过。小麦幼胚转化由转化平台完成。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的GKP Buffer含有50mM甘氨酸(glycine)、30mM K₂HPO₄(pH9.2)、1％(质量百分比)膨润土(bentonite)和1％(质量百分比)硅藻土(celite)。

实施例一、BFR基因cDNA和DNA序列的克隆

1、小麦cDNA和基因组序列的获得

1)小麦基因组DNA和总RNA的提取

取0.5g新鲜小麦叶片，放入装有钢珠的2mL离心管中，用液氮速冻后，在组织研磨仪中将材料研磨成粉末。加入1.0mL裂解液(1％SLS,417mM Tris/HCl pH8.0,417mM NaCl,83mM EDTA)，剧烈震荡，涡旋充分混匀，冰上静置10min，使细胞充分裂解。向离心管中加入与裂解液等体积的提取液(Tris饱和酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1)，缓慢摇匀至乳浊液，冰上(或室温)静置10min，12000rpm离心10min，将上清液移至新的离心管中。重复此操作一次。吸取上清液至另一个1.5mL离心管，加入上清液0.6倍体积的预冷异丙醇，充分混匀，于-20℃沉淀30min。4℃，10000rpm离心10min后，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀两次，每次4℃，10000rpm离心5min后弃上清。然后用无水乙醇洗涤，离心后弃上清，倒置离心管，室温干燥DNA。向干燥的DNA中加入100μL的TE缓冲液，待DNA充分溶解后按1/1000的比例加入RNaseA，消解RNA。用NanoDrop微量核酸蛋白分析仪测定DNA样品的浓度与纯度，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的完整性。

采用RNA提取试剂盒提取普通小麦品种小白冬麦的总RNA。RNA提取试剂盒购自PEXBIO公司(货号：A010400)，具体的提取操作步骤和条件要求按照产品说明书进行。

2)RNA的反转录

利用Takara公司的反转录试剂盒(货号：RR047A)对上述步骤1)中获得的小麦叶片总RNA进行反转录，获得cDNA。具体的操作步骤和条件要求按照产品说明书进行。

2、BFR基因DNA和cDNA序列的PCR扩增与测序

以上述步骤1中获得的DNA为模板，利用引物对QCBFRF:5'-TTATGGTRATGAAGATGGAG-3'和QCBFRR2:5'-CACCATGTTCATGGCACGA-3'，以小白冬麦(抗白粉菌菌系E18)基因组DNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系：DNA模板0.5μL(<0.5μg)，dNTP(2.5mM)4μl，QCBFRF(10μM)1μl，QCBFRR2(10μM)1μl，5×TransStart FastPfu Buffer 10μl，TransStart FastPfu DNAPolymerase 1μl(2.5U)，最后用水补足至50μl。PCR反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸5min。

将上述PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶分离纯化后连接到

-Blunt ZeroCloning Vector(Transgen CB501)载体上，得到重组质粒pEASY-T-BFR，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并用通用引物M13F对细菌单克隆进行一代测序。

大量测序结果表明，PCR扩增得到的长度为1857bp的DNA序列即为普通小麦的一个BFR基因全长序列，位于三个不同染色体的三个不同的基因拷贝分别命名为BFR-3A-xiaobaidongmai、BFR-3B-xiaobaidongmai和BFR-3D-xiaobaidongmai。BFR基因三个拷贝的基因组DNA全长序列分别为序列表中的序列1、序列2和序列3。

以上述步骤1中获得的cDNA为模板，利用引物对QCBFRF:5'-TTATGGTRATGAAGATGGAG-3'和QCBFRR2:5'-CACCATGTTCATGGCACGA-3'，以小白冬麦(抗白粉菌菌系E18)cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系：cDNA模板0.5μL，dNTP(2.5mM)4μl，QCBFRF(10μM)1μl，QCBFRR2(10μM)1μl，5×TransStartFastPfu Buffer 10μl，TransStartFastPfu DNA Polymerase 1μl(2.5U)，最后用水补足至50μl。PCR反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸5min。

将上述PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶分离纯化后连接到

-Blunt ZeroCloning Vector(Transgen CB501)载体上，得到重组质粒pEASY-T-BFR，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并用通用引物M13F对细菌克隆进行一代测序。

大量测序结果表明，PCR扩增得到的长度为1857bp的cDNA序列即为BFR基因的编码区全长序列，其对应在小麦的三个不同的染色体上的三个不同的基因拷贝分别命名为BFR-3A-xiaobaidongmai、BFR-3B-xiaobaidongmai和BFR-3D-xiaobaidongmai。BFR基因三个拷贝的基因编码区全长序列分别为序列表中的序列4、序列5和序列6。相应地将BFR基因编码的蛋白分别命名为BFR-3A-xiaobaidongmai、BFR-3B-xiaobaidongmai和BFR-3D-xiaobaidongmai蛋白。BFR蛋白由618个氨基酸残基组成，其氨基酸序列即为序列表中的序列7-9。

比较BFR基因编码区的基因组序列与cDNA序列，显示BFR基因没有内含子。

实施例二、利用KASP标记对BFR基因进行染色体定位

1、KASP分子标记引物设计与合成

1)将实施例一中从小麦基因组DNA中扩增获得的3个BFR基因拷贝，进行同源比对，分别选择162(A/G)、643(G/A)和1245(C/T)bp位置的SNP位点进行引物设计。

2)将选定SNP位点及其上游19nt分别设计为两条正向引物，再在两条正向引物的5'端加FAM:5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'或VIC:5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'荧光报告基团标签序列。再选定SNP位点下游合适位置选取20nt左右的核苷酸序列作为反向引物，使最终PCR扩增获得的片段长度为50～80bp。反向引物不加标签。三个SNP位点的KASP标记引物分别为：

SNP162F1:5'-gaaggtgaccaagttcatgctCTGAGGGTCTTGTTGCTGCA-3'、

SNP162F2:5'-gaaggtcggagtcaacggattCTGAGGGTCTTGTTGCTGCG-3'、

SNP162R:5'-GCAGTTTATTTTGCAAGTCCACA-3'、

SNP643F1:5'-gaaggtgaccaagttcatgctCACCAGTCTCAAATGGCACTAG-3'、

SNP643F2:5'-gaaggtcggagtcaacggattCACCAGTCTCAAATGGCACTAA-3'、

SNP643R:5'-CTTGCAAGCACAGCAGGATT-3'、

SNP1245F1:5'-gaaggtgaccaagttcatgctACCAGTTCCAAGTCTGGTGTC-3'、

SNP1245F2:5'-gaaggtcggagtcaacggattACCAGTTCCAAGTCTGGTGTT-3'和

SNP1245R:5'-TCCATCAAGAACAGCTGCTCT-3'。

3)上述所有KASP标记引物均由北京华大基因股份有限公司合成。

2、模板DNA准备

按照实施例一中基因组DNA提取方法，分别提取中国春缺体-四体系N3AT3B、N3BT3D和N3DT3A的基因组DNA。用天根公司生产的质粒小提试剂盒(货号：DP103-03)分别提取实施例一中包含BFR基因序列全长的3个大肠杆菌单克隆的质粒DNA BFR1、BFR2和BFR3。

3、KASP标记分型及染色体定位

1)上述3个SNP位点的KASP标记引物分别加ddH₂O溶解，使浓度为100μM，然后按两个上游引物分别加12μL，下游引物加30μL，最后再加46μL ddH₂O，混合均匀，配制成引物mix。

2)10μL PCR反应体系中加入5μL 2×KASP Master mix，0.14μL引物mix，0.1μgDNA模板，最后加ddH₂O至10μL，混合均匀。PCR扩增程序为94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火/延伸60s，每循环一次降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火/延伸60s，共26个循环。

3)PCR反应结束后，于ABI7500荧光定量PCR仪中，25-30℃，10min，一个循环，读取荧光数据，进行基因分型。

4)上述3个SNP位点的基因分型结果分别为附图中图1的A、B和C图。根据A图可以判断BFR2定位于3B染色体，根据B图可以判断BFR1定位于3A染色体，根据C图可以判断BFR3定位于3D染色体。

实施例三、利用BSMV-VIGS实验验证BFR基因的抗白粉病功能

1、沉默BFR基因小麦的获得

1)诱导BFR基因下调BSMV-VIGS载体系统的构建

(1)根据实施例1中BFR-3B基因序列，在basic-Helix-Loop-Helix结构域以外的非保守区选取了两个沉默片段，一个片段位于编码区的靠近N-端处，具体位置为+109bp～+314bp，长206bp，命名为沉默序列BFR-1，利用引物对V-BFR-F1：5'-ATTGCTAGCTTTGCATACTTGACAAAAG-3'和V-BFR-R1：5'-TAAGCTAGCGGTTCACGGCAAGAGC-3'进行PCR扩增获得。该片段与BFR-3A-xiaobaidongmai在+161bp位置存在一个SNP差异，与BFR-3D-xiaobaidongmai在+161bp和+203bp位置各存在一个SNP差异。另一个片段靠近C-端，起始于+1623bp，到+1795bp结束，长173bp，命名为沉默序列BFR-2，利用引物对V-BFR-F2：5'-ATTGCTAGCCATCCAGGTGGTGCAAGA-3'和V-BFR-R2：5'-TAAGCTAGCAGCCAGGGCACTTGAT-3'进行PCR扩增获得。该片段与BFR-3A-xiaobaidongmai在+1775bp位置存在一个SNP差异，与BFR-3D-xiaobaidongmai的序列完全相同。

上述引物对中的下划线序列即为限制性内切酶Nhe I的酶切识别位点。

(2)载体的构建：将上述步骤1获得的沉默序列BFR-1和BFR-2分别反向插入BSMV-VIGS病毒载体γ的NheI酶切位点处，且保持其它序列不变，得到重组载体γ-BFR-1和γ-BFR-2。

以引物对V-BFR-F1：5'-ATTGCTAGCTTTGCATACTTGACAAAAG-3'和γ-strain-p:5'-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3'对重组载体γ-BFR-1进行PCR扩增和测序鉴定，阳性克隆即为将BFR基因编码区cDNA序列(序列表中的序列2)自5’末端起第109-314位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的Nhe I酶切位点处，且保持其它序列不变的BFR基因沉默载体γ-BFR-1。

以引物对V-BFR-F2：5'-ATTGCTAGCCATCCAGGTGGTGCAAGA-3'和γ-strain-p:5'-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3'对重组载体γ-BFR-2进行PCR扩增和测序鉴定，阳性克隆即为将BFR基因编码区cDNA序列(序列表中的序列2)自5’末端起第1623-1795位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的Nhe I酶切位点处，且保持其它序列不变的BFR基因沉默载体γ-BFR-2。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和γ-GFP载体共同构成病毒载体系统BSMV:GFP。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和重组载体γ-BFR-1共同构成可沉默BFR基因的病毒沉默载体系统BSMV:BFR-1。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和重组载体γ-BFR-2共同构成可沉默BFR基因的病毒沉默载体系统BSMV:BFR-2。

2)BSMV体外转录

(1)用MluI酶切BSMV病毒载体α链、γ-GFP载体、重组载体γ-BFR-1和重组载体γ-BFR-2，用SpeI酶切BSMV病毒载体β链，分别得到线性化质粒。

(2)以上述步骤(1)获得的线性化质粒为模板进行体外转录，分别得到体外转录的BSMV病毒载体α、β、γ-GFP、γ-BFR-1和γ-BFR-2。体外转录反应按照RiboMAX^TMLarge ScaleRNA Production System-T7(Promega公司产品，货号：P1300)说明书进行操作。转录反应体系和条件分别为：反应总体积20.0μl，包括线性化质粒(1.0μg)和无RNase水共6.5μl，5×Transcription Buffer 4.0μl，m7G(5')ppp(5')G 1.5μl(Promega公司产品，货号：P1718)，rNTP PreMix 6.0μl，Enzyme Mix 2.0μl，37℃反应4h，转录产物置-70℃保存备用。

3)BSMV接种

将小白冬麦播种于营养土中，待生长至二叶期，分别取8μl BSMV:BFR-1重组病毒载体溶液和BSMV:BFR-2重组病毒载体溶液涂抹接种于小白冬麦平展的第二叶上，10min后用灭菌超纯水喷施叶面，覆保鲜膜保湿24h，之后转为22℃正常条件培养，分别得到转BSMV:BFR-1植株和BSMV:BFR-2植株。同时，部分植株接种BSMV:GFP重组病毒载体溶液，得到转BSMV:GFP植株，部分植株涂抹1×GKP Buffer，得到模拟接种植株。

上述BSMV:BFR-1重组病毒载体溶液是将体外转录的BSMV-VIGS载体α、β和γ-BFR-1经无RNase水稀释3倍后等量混合，再加入等体积的2×GKP Buffer得到的溶液。

上述BSMV:BFR-2重组病毒载体溶液是将体外转录的BSMV-VIGS载体α、β和γ-BFR-2用无RNase水稀释3倍后等体积混合，再加入等体积的2×GKP Buffer得到的溶液。

上述转BSMV:BFR-1和BSMV:BFR-2的植株即为沉默BFR基因的小麦植株，转BSMV:GFP的植株即为阴性对照植株，涂抹1×GKP Buffer的模拟接种植株即为空白对照植株。

4)沉默BFR基因小麦的RT-PCR验证

BSMV-VIGS系统沉默BFR基因效果的具体检测方法如下：将上述步骤3)获得的转BSMV:BFR-1植株和BSMV:BFR-2植株、转BSMV:GFP植株及模拟接种植株(MOCK)在正常条件下培养10天后，取第三叶提取总RNA，反转录后通过定量PCR检测BFR基因的相对表达量，设置TaEF-1α为内参基因，相对表达量通过ΔΔCT法计算得到，由ABI7500型荧光定量PCR仪自带计算公式计算。

检测BFR相对表达量的定量PCR引物对为qBFR13-F：5'-GTGCCATTTGAGACTGGTGTGC-3'和qBFR-R：5'–AGACCTGGTGACCTCTCAATGTG-3'，检测内参基因TaEF-1α的定量PCR引物对为TaEF-1αF：5'-TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT-3'和TaEF-1αR：5'-ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT-3'。

BFR基因的相对表达量的检测结果如图2所示。从图2可以看出，与转BSMV植株以及MOCK植株相比，转BSMV:BFR-1和转BSMV:BFR-2植株中BFR基因的相对表达量较阴性对照植株(BSMV:GFP)和空白对照植株(MOCK)都极显著地降低了，说明本实验所选择的两个沉默片段BFR-1和BFR-2都是有效的。

5)BFR基因沉默植株的白粉病抗性分析

将有效沉默了BFR基因表达的植株(BSMV:BFR-1和BSMV:BFR-2)、阴性对照植株(BSMV:GFP)，以及空白对照植株(MOCK)在第三叶展开后(约16天龄)接种白粉病菌菌系E18，接种10天后观察第四叶发病情况。

结果如图3所示。模拟接种的空白对照植株(MOCK)的叶片没有任何症状，反应型为0级(免疫)。转BSMV:GFP的阴性对照植株叶片可见明显的病毒过敏反应(HR)斑，但没有孢子产生，反应型为0-0；级。而BFR基因沉默效果明显的转BSMV:BFR-1植株和转BSMV:BFR-2植株没有明显的HR反应，出现大量的白粉病菌孢子堆，反应型为3-4级，呈高感表型。

以上结果表明BFR基因表达量的降低使得小白冬麦对白粉病菌菌系E18的抗性完全丧失，沦为高感。由此证明BFR是一个参与小麦抗白粉病反应过程的重要基因。

实施例四、通过活性氧检测实验验证BFR的功能

按照实施例二的方法，获得降低BFR基因表达的小白冬麦植株。将有效沉默了BFR基因表达的植株(BSMV:BFR-1和BSMV:BFR-2)、阴性对照植株(BSMV:GFP)，以及空白对照植株(MOCK)在第三叶展开后(约16天龄)接种白粉病菌菌系E18。接种48小时后剪取叶片中部4cm左右的叶段进行DAB染色：(1)将叶片放入50mL离心管中，加入DAB染色液(1mg/mL，调节pH至5.8。现用现配，避光保存)没过叶片，28℃染色12h。(2)弃去染色液，以无水乙醇对叶片进行脱色漂白。清水漂洗2-3次，50％甘油固定，显微镜观察并统计产生活性氧的细胞数目。

结果如图4所示，白粉菌分生孢子接触小麦叶片后萌发形成芽管，芽管顶部膨大形成附着胞，并在芽管基部产生一个隔膜，在附着胞下形成侵入钉侵入寄主表皮细胞。对照中被白粉菌E18直接入侵的细胞积累了大量的活性氧，并抑制了吸器的形成。而BFR被下调后，活性氧的产生显著减少，并且白粉菌E18可以成功侵染小麦表皮细胞，形成吸器并进而发育成分生孢子梗和分生孢子。

以上结果表明BFR可以作为正向调控因子参与小麦对白粉病的抗性反应。

实施例五、利用小麦叶片表皮细胞瞬时表达实验验证BFR的功能

1、小麦叶片表皮细胞瞬时表达载体构建

1)以实施例1中制备的pEASY-T-BFR-3B质粒为模板，利用BFR-166F和BFR-166R引物对进行PCR扩增，得到大小为1874bp的扩增产物，该序列含有BFR-3B基因编码区cDNA全长序列(1857bp)，如序列表中的序列5所示。PCR扩增引物序列为BFR-166F：5'-ATAAAGCTTCCATGGTAATGAAGATGGAGGTTGAGGAG-3'和BFR-166R：5'-GACGTCGACCACTGAGCTCATGGCGCGAGACATTGC-3'。下划线所示序列分别为HindIII和SalI的酶切识别位点。

2)用HindIII和SalI对步骤1)获得的PCR扩增产物及载体pJIT166进行双酶切，酶切产物分别纯化后用T4DNA连接酶将BFR-3B的cDNA全长克隆到pJIT166载体中，得到重组载体pJIT166-BFR-3B，并对其进行测序验证。正确的pJIT166-BFR-3B载体即为将完整的BFR-3B基因编码区cNDA序列(序列表中序列5)插入pJIT166载体的HindIII和SalI酶切位点之间，且保持其它序列不变的重组载体。

2、小麦叶片的基因枪转化

1)常规种植和培养感病小麦品种Chancellor和科农199至7天龄，取幼苗第一片叶尖部，平铺于苯板(1％琼脂，高温高压灭菌，加入经过无菌过滤的苯并咪唑，至终浓度为50mg/L)中央，每板放5-7片叶子。

2)称取8.5毫克金粉(1.0μm，Bio-Rad公司)于1.5ml的离心管中，65℃烘干4h。加入70％的乙醇水溶液，震荡5min，静置15min，离心2sec，弃上清；加入1.0ml无菌去离子水，震荡2min，静置1min，离心2sec，弃上清。重复3次；加入1.0ml 50％(v/v)的甘油水溶液，震荡充分混匀。置-20℃保存备用。

3)取等摩尔的pJIT166-GUS质粒和pJIT166-BFR-3B质粒，共≤1.0μg，补无菌去离子水至5.0μl；取50.0μl制备好的金粉(使用前震荡5min)加入混合好的质粒，震荡3min，并边震荡边逐滴加入50.0μl 2.5M CaCl₂，再迅速加入20.0μl 0.1M亚精胺，继续震荡3min，静置1min，离心2sec，弃上清；加入140.0μl 70％乙醇，震荡混匀，离心2sec，弃上清；加入140.0μl 100％乙醇，震荡混匀，离心2sec，弃上清；加入15.0μl 100％乙醇，震荡混匀，置冰上备用。

4)利用基因枪法(PDS-100/He delivery system Bio-Red)转化小麦叶片。将载体盘置于载体盘holder(购自Bio-Rad公司)中，再次震荡混合上述金粉质粒混合物，全部吸取并滴于载体盘(购自Bio-Rad公司)中央；将900psi可裂盘(购自Bio-Rad公司)放入螺旋头上，旋紧，滴加异丙醇密封；将终止屏放入终止屏holder(购自Bio-Rad公司)上，倒置放入载体盘，旋紧固定旋钮，置于基因枪舱体内最上一层；将载有叶片的苯板放于托盘上，将托盘放在基因枪舱体内第三层；抽真空到27inch，轰击叶片；将轰击过的叶片排列整齐，用3M透气胶带封口，放入培养箱(白天22℃，16h，晚上18℃，8h)中培养4h，得到转BFR-3B基因的Chancellor和科农199叶片。

按照上述步骤1)—4)操作，进行空载体pJIT166的转化，获得转空载体的Chancellor和科农199叶片。

3、白粉病菌接种及吸器指数统计

分别对转BFR-3B基因的Chancellor叶片和科农199叶片以及转空载体pJIT166的Chancellor叶片和科农199叶片接种白粉病菌系E18。具体步骤如下：将上述转BFR-3B基因的Chancellor叶片和科农199叶片以及转空载体pJIT166的Chancellor叶片和科农199叶片在苯板上培养4h，高密度接种白粉病菌系E18的分生孢子，继续放入培养箱培养44h。将培养后的叶片放入15.0ml离心管中，加入X-gluc染液(0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，10mM Na-EDTA，5mM K₄Fe[CN₆]，5mM K₃Fe[CN₆]，0.1％Triton X-100(v/v)，20％甲醇(v/v)，1g/L X-gluc，调至pH至7.0)，抽真空3次，每次5min，37℃放置24h。弃干净染色液。加入脱色液(3倍储液：50％甘油，25％乳酸，25％的ddH₂O，使用前加入两倍体积的100％乙醇)，室温放置48h。将叶片放入水中浸泡清洗1h；用考马斯亮蓝[0.6％(w/v)考马斯亮蓝(Serva Blue R)溶于甲醇或乙醇中]染色几秒钟，清水冲洗两次；将叶片置于载玻片上，用50％的甘油水溶液固定，加盖玻片，镜检。统计被X-gluc染成蓝色的细胞：有孢子附着，但没有吸器形成的细胞记为抗病细胞，而有明显吸器形成的细胞记为感病细胞，并按下列公式计算吸器指数：吸器指数＝感病细胞/(感病细胞+抗病细胞)×100％。

结果如图5所示。图5A示小麦叶片细胞瞬时表达实验获得的抗病细胞，箭头示附着在细胞表面未萌发的白粉病菌系E18的分生孢子。图5B示小麦叶片细胞瞬时表达实验获得的感病细胞，箭头示白粉病菌系E18的分生孢子萌发形成的吸器。图5C为吸器指数统计结果。由图5C可见，瞬时表达BFR基因的感病小麦品种科农199叶片和Chancellor叶片表皮细胞(GUS+BFR-3B)的吸器指数较阴性对照细胞(GUS)的吸器指数显著降低。由此可见，BFR-3B基因对白粉病菌的吸器形成具有明显的抑制作用，说明BFR-3B基因具有提高小麦抗白粉病的功能。

实施例六、利用CRISPR/Cas9基因编辑验证BFR基因的抗白粉病功能

1、BFR基因编辑植株的获得

1)BFR基因编辑引导序列引物设计

为保证基因功能沉默的有效性，避开靠近C端的区域，针对BFRN端900bp以内基因序列搜索NGG(或CCN)PAM序列。再根据pTaU6载体的Bbs I酶切位点序列，连同PAM及其上游(或下游)19-20nt的碱基序列，一起设计为sgRNA(single guide RNA)引物b1F：5'-CAATGATGATGCCAAACAGCGG-3'和b1R：5'-CCGCTGTTTGGCATCATCATTG-3'。为进行后续的酶切检测，设计跨越sgRNA部分的PCR扩增引物引物Testb1F：5'-ATGGTAATGAAGATGGAGGTTGAG-3'和Testb1R：5'-CGAAGTACATAGATGCTAGGAAGAA-3'，用于检测sgRNA引导活性及突变效果。

2)载体构建

将引物b1F和b1R用ddH₂O稀释成10μM，然后分别取9μL，并加入2μL ddH₂O，配成20μL反应体系，于普通PCR仪上，按照程序94℃，5min，90-10℃，每1min降10℃，对寡核苷酸序列进行退火，退火产物于冰上放置备用。pTaU6载体用Bbs I限制性内切酶，按照以下方法进行酶切、检测和载体构建：5μL 10×

buffer，2μg pTaU6载体质粒，1μL Bbs I(20U/μL)，加ddH₂O至50μL，混合均匀，于37℃反应30min，加入10μL 6×Gel loading dye终止反应；用1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化；用T4DNA连接酶将退火后的sgRNA b1与酶切过的pTaU6载体连接，构建成基因编辑载体pTaU6-b1。

3)sgRNA引导活性检测

将pTaU6-b1载体质粒与pJIT163-2NLSCas9(Shan et al.,2014)质粒用PEG法共转化普通小麦品种科农199的原生质体，并用单转pJIT163-GFP(Shan et al.,2014)质粒的小麦原生质体作为阳性对照，23℃培养48h。在荧光显微镜下观察原生质体状态并通过统计有荧光信号的原生质体数目来计算转化效率。原生质体饱满且呈圆形，转化效率在70％以上，即可以进行后续检测实验。

离心收集培养48h后的原生质体，用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司产品，货号：DP305)提取基因组DNA。然后用检测引物Test1F和Test1R扩增包含突变目标区域的基因片段。取5μL PCR反应产物，分别加入1.1μL 10×T7E1buffer和4.4μL ddH₂O，混合均匀后于PCR仪上进行变性与退火反应(95℃，5min，95-15℃，每分钟降10℃)，以形成杂合双链DNA片段。然后在反应产物中加入0.5μL(2.5units)的T7E1核酸内切酶，37℃消解1h。消解产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。以pTaU6-b1载体质粒转化的原生质体DNA为模板进行PCR扩增得到的BFR基因片段，经变性、复性和T7E1酶切后，电泳图谱中出现了3条带，即除了一条与野生型对照相同的一条带以外，还有两条较短的酶切带(图6)。说明在pTaU6-b1载体质粒转化的小麦原生质体中BFR基因发生了突变，即这说明b1确实具有引导活性(图6)。

4)BFR基因编辑植株的获得

用步骤3)构建的基因编辑载体质粒pTaU6-b1与pJIT163-2NLSCas9共转化小白冬麦的幼胚，经愈伤组织诱导和分化培养(Qiwei Shan,Yanpeng Wang,Jun Li,Caixia GaoGenome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system.NatureProtocols,2014,9(10):2395-2410.)，获得小白冬麦再生植株。小麦遗传转化由中国科学院遗传与发育生物学研究所遗传转化平台完成，公众可以商业化联系该平台完成转化操作。按照步骤3)中的检测方法，用引物对Testb1F和Testb1R对全部再生植株进行目标基因突变检测，将获得的T0代突变株系，于4℃冷室春化4周，然后移栽到营养土中进行常规培养。T0代植株经自交获得T1代BFR基因编辑植株的种子。

2、BFR基因编辑植株的抗白粉病鉴定

1)荧光定量PCR检测BFR基因编辑植株中BFR基因的表达

将上述步骤1中获得的T1代种子，分别播种于10cm×10cm方形花盆中，对生长7天左右的T1代基因编辑株系及对照株系，剪取叶片，按照实施例一和实施例二中的方法，进行RNA提取、RNA反转录和荧光定量PCR，检测BFR基因的相对表达量。定量PCR检测结果如图7A所示，与空白对照相比，BFR基因的表达量在T1代基因编辑植株中显著降低。

2)BFR基因编辑植株白粉病抗性检测

对生长10天左右的小白冬麦BFR基因编辑植株及其空白对照株系进行白粉菌菌系E18的大量接菌，8天后观察叶片表型。大量接菌鉴定结果如图7B所示。对照植株叶片上几乎没有白粉菌孢子的出现，BFR基因编辑T1代株系叶片上则有大量的白粉菌孢子堆出现。

3)BFR基因编辑植株中BFR基因编辑类型的检测

取上述步骤2)中生长18天左右的T1代植株和对照植株的叶片，按照实施例一中的方法，提取基因组DNA，并以此为模板，用引物对Testb1F：5'-ATGGTAATGAAGATGGAGGTTGAG-3'和Testb1R：5'-CGAAGTACATAGATGCTAGGAAGAA-3进行PCR扩增。PCR反应体系：DNA模板0.5μL(<0.5μg)，dNTP(2.5mM)4μl，Testb1F(10μM)1μl，Testb1R(10μM)1μl，5×TransStartFastPfu Buffer 10μl，TransStart FastPfu DNA Polymerase 1μl(2.5U)，最后用水补足至50μl。PCR反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸5min。

将上述PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶分离纯化后连接到

-Blunt ZeroCloning Vector(Transgen CB501)载体上，得到重组质粒pEASY-T-Testb1，转化大肠杆菌感受态细胞Trans-T1(全式金生物技术有限公司，货号：CD501-01)，将菌液平铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上。12h后挑取单克隆，各选取30个菌液PCR鉴定为阳性的单克隆用通用引物M13F对其进行一代测序。测序结果如图7C所示。对照植株中BFR基因没有发生突变，在T1代基因编辑植株中，所有的BFR-3A-xiaobaidongmai和BFR-3D-xiaobaidongmai均有不同形式的突变，BFR-3B-xiaobaidongmai则表现为部分突变。

以上结果表明，小白冬麦基因组中4个或4个以上BFR基因alleles的突变，可以使BFR基因的表达显著下调，使小白冬麦由抗白粉菌系E18转为感白粉菌系E18。由此证明小麦BFR基因参与小麦对白粉病的抗性过程，对小麦抗性育种具有利用价值。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 小麦抗白粉病相关BFR蛋白及其编码基因与应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1857

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 1

atggtaatga agatggaggt tgaggaggac ggtgccaatg gaggaaatgg tggggcatgg 60

actgaggagg accgagacct cagcaccact gtgctaggaa gagatgcatt tgcatacttg 120

acaaaagggg gcggtaccat atctgagggt cttgttgctg catcgtcacc tgtggacttg 180

caaaataaac tgcaggagct tatcgaatca gagcatcctg gtgctggttg gaactacgcc 240

atcttctggc agctttcacg cacaaagtct ggtgatcttg tccttgggtg gggtgatggc 300

tcttgccgtg aacccaatga tgctgagttg gcagctgctg cttctgcagg caatgatgat 360

gccaaacagc ggatgtggaa gcgtgtactg cagcggctgc acaaagcatt tggtggtgct 420

gatgaggagg attatgctcc cactattggt caggtgacag atacagaaat gttcttccta 480

gcatctatgt acttcgcgtt tccgcgtcgt gccggtgctc ctggtcaagt ttttgcagct 540

ggcctccctc tctgggttcc caattctgag cgcaatgtat tcccagctaa ttactgttac 600

cggggatacc ttgcaagcac agcaggattt agaactatct tgctagtgcc atttgagact 660

ggtgtgcttg agctgggttc gatgcagcag gtggctgaga gttctgacac tctccagacc 720

ataaagtcag tctttgcggg gacaggtggc aataaggata taatcccgag tcgtgaagga 780

aatggtcaca ttgagaggtc accaggtctg gcaaagattt ttggcaagga tttgaacctt 840

ggtcggtctt cagcagggcc agtgattggg gtatcgaaag tagatgaaag gccgtgggaa 900

cagaggactg ctggtggagg gagctcattg cttcccaatg tccagaaagg attgcagagt 960

ttcacttgga gtcaggcccg gggcctgaat tctcaccagc agaagtttgg caatggtata 1020

ctgatagtga gtaatgaagc tacacacggc aacaatagaa ccgcggacag ctccactaca 1080

acacagtttc agcttcagaa agcacctcag ctccagaaac taccacttct tcagaaacca 1140

ccacagctag tggagccgct gcagatggtc aaccagcaac agctgcagcc acaggcgcct 1200

aggcaaatag attttagtgc agggaccagt tccaagtctg gtgtcctggt tacaagagca 1260

gctgttcttg atggagatag ttcggaggtg aatggcttgt gtaaagagga agggacaaca 1320

cctgtcatag aggaccgacg gccaaggaag aggggaagaa agcctgcgaa tgggagagag 1380

gagccgctga atcatgttga ggctgagcgt caaaggaggg agaagctcaa ccagcggttc 1440

tatgcgttga gagccgttgt gcccaacatc tcgaaaatgg acaaggcttc cctgctgggt 1500

gatgcaatag catacatcac tgaccttcag aagaagctca aagatatgga gacggagaga 1560

gaacgatttc ttgagtctgg tatgggggat ccaagggagc gagcccctag accagaggtt 1620

gacatccagg tggtgcaaga cgaggttctg gttcgagtta tgtctccatt ggagaaccat 1680

ccggcaagga aggtctttga agcgtttgaa gaggcggacg tccgggtagg ggagtcgaaa 1740

ctcacaggca acaatggaac ggtagtgcat tcctttatca tcaagtgccc tggctccgaa 1800

cagcaaacaa gggagaaagt gattgctgca atgtctcgcg ccatgagctc agtgtga 1857

<210> 2

<211> 1857

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 2

atggtaatga agatggaggt tgaggaggac ggtgccaatg gaggaaatgg tggggcatgg 60

actgaggagg accgagacct cagcaccact gtgctaggaa gagatgcatt tgcatacttg 120

acaaaagggg gcggtaccat atctgagggt cttgttgctg cgtcgtcacc tgtggacttg 180

caaaataaac tgcaggagct tatcgaatca gagcatcctg gtgctggttg gaactacgcc 240

atcttctggc agctttcacg cacaaagtct ggtgatcttg tccttgggtg gggtgatggc 300

tcttgccgtg aacccaatgg tgctgagttg gcagctgctg cttctgcagg caatgatgat 360

gccaaacagc ggatgcggaa gcgtgtactg cagcggttgc acaaagcatt tggtggtgct 420

gatgaggagg attatgctcc cactattggt caggtgacag atacagaaat gttcttccta 480

gcatctatgt acttcgcgtt tccacgtcgt gccggtgctc ctggtcaagt ttttgcagct 540

ggcctccctc tctgggttcc caattctgag cgcaatgtat tctcagccaa ttactgttac 600

cggggatacc ttgcaagcac agcaggattt agaactatct tgttagtgcc atttgagact 660

ggtgtgcttg agctgggttc gatgcagcag gtggctgaga gttctgacac tctccagacc 720

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ggtcggtctt cagcagggcc agtgattggg gcatcgaaag tagatgaaag gccatgggaa 900

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ttcacttgga gtcaggcccg gggcctgaat tctcaccagc agaagtttgg caatggtata 1020

ctgatagtga gtaatgaagc tacacacggc aacaatagag ccgcggacag ctccactaca 1080

acacagtttc agcttcagaa agcacctcag ctccagaaac taccacttct tcagaaacca 1140

ccacagctag tgaagccact gcagatggtc aaccagcaac agctgcagcc acaggcgcct 1200

aggcaaatag attttagtgc agggaccagt tccaagtctg gtgtcctggt tacaagagca 1260

gctgttcttg atggagatag ttcagaggtg aatggcttgt gtaaagagga agggacaaca 1320

cctgtcatag aggaccgacg gccaaggaag aggggaagaa agcccgcaaa tgggagggag 1380

gagccgctga atcatgttga ggctgagcgt caaaggaggg agaggctcaa ccaacggttc 1440

tatgcgttga gagccgttgt gcctaacatc tcgaaaatgg acaaggcctc cctattgggc 1500

gatgcaatag cttacatcac tgaccttcag aagaagctca aagatatgga gacggagaga 1560

gaacgatttc ttgagtctgg tatggtggat ccaagggagc gagcccctag accagaggtt 1620

gacatccagg tggtgcaaga cgaggttctg gttcgagtta tgtctccatt ggagaaccat 1680

ccggtaaaga aggtctttga agcgtttgaa gaggcggacg tccgggtagg ggagtcgaaa 1740

ctcacaggca acaatggaac ggtagtgcat tccttcatca tcaagtgccc tggctctgaa 1800

cagaaaacga gggagaaagt gattgctgca atgtctcgcg ccatgagctc agtgtga 1857

<210> 3

<211> 1857

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 3

atggtaatga agatggaggt tgaggaggtc ggtgccaatg gaggaaatgg tggagcatgg 60

actgaggagg accgagacct cagcaccact gtgctaggta gagatgcatt tgcatacttg 120

acaaaagggg gcggtaccat atctgagggt cttgttgctg catcgtcacc tgtggacttg 180

cagaataaac tgcaggagct tattgaatca gagcatcctg gtgctggttg gaactacgcc 240

atctcctggc agcttccacg cacaaagtct ggtgatcttg tccttgggtg gggtgatggc 300

tcttgccgtg aacccaatga tgctgagttg gcagctgctg cttctgcagg caatgatgat 360

gccaaacagc ggatgcggaa gcgtgtactg caacggttgc acagagcatt tggtgctgct 420

gatgaggagg attatgctcc cactattggt caggtgacag atacagaaat gttcttccta 480

gcatctatgt acttcgcgtt tccgcgtcgt gccggtgctc ctggtcaagt ttttgcagct 540

ggcctccctc tctgggttcc caattctgag cgcaatgtat tcccagccaa ttactgttac 600

cggggatacc ttgcaagcac agcagggttt agaactatcc tgttagtgcc atttgagact 660

ggtgtgcttg agctgggttc gatgcagcag gtggctgaga gttctgacac tctccagacc 720

ataaagtctg tctttgcggg gacaggtggc aataaggata taattccgag tcgtgaagga 780

aatggtcaca ttgagaggtc accaggtctg gcaaagattt ttggcaagga tttgaacctt 840

ggtcggtctt cagcagggcc agtggttggg gtatcgaaag tagatgaaag gtcatgggaa 900

cagaggactg ctggtggagg gagctcagtg cttcccaatg tccagaaagg attgcagagt 960

ttcacttgga gtcaggcccg gggcctgaat tctcaccagc agaagtttgg caatggtata 1020

ctgatagtga gtaatgaagc tacacacggc aacaatagag ccacagacag ctccactaca 1080

acacagtttc agctacagaa agcacctcag ctccagaaac taccacttct tcagaaacca 1140

ccacagctag tgaagccact gcagatggcc aaccagcaac agctgcagcc acaggcgcct 1200

aggcaaatag attttagtgc agggaccagt tccaagtctg gtgttctggt tacaagagca 1260

gctgttcttg atggagatag ttcaggggtg aacggcttgt gtaaagagga agggacaaca 1320

cctgtcatag aggaccgacg gccaaggaag aggggaagaa agcctgcgaa tgggagagag 1380

gagccgctga atcatgttga ggctgagcgt caaaggaggg agaagctcaa ccagcggttc 1440

tatgctttga gagccgttgt gcccaacatc tcgaaaatgg acaaggcctc tctgttgggc 1500

gatgcaatag catacatcac tgaccttcaa aagaagctca aagatatgga gacggagaga 1560

gaacgatttc ttgagtctgg tatggttgat cctagggagc gagcccctag accagaggtt 1620

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ccggtaaaga aggcctttga agcgtttgaa gaggcggacg tccgggtagg ggagtcgaaa 1740

ctcacaggca acaatggaac ggtagtgcat tccttcatca tcaagtgccc tggctccgaa 1800

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<210> 4

<211> 1857

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atcttctggc agctttcacg cacaaagtct ggtgatcttg tccttgggtg gggtgatggc 300

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gatgcaatag catacatcac tgaccttcaa aagaagctca aagatatgga gacggagaga 1560

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ccggtaaaga aggcctttga agcgtttgaa gaggcggacg tccgggtagg ggagtcgaaa 1740

ctcacaggca acaatggaac ggtagtgcat tccttcatca tcaagtgccc tggctccgaa 1800

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<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

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<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

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<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

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Ala Ala Met Ser Arg Ala Met Ser Ser Val

610 615

Claims

1.一种蛋白质，所述蛋白为如序列8所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因，为如序列2所示的核苷酸序列。

3.一种培育白粉病抗性降低的转基因植物的方法，包括抑制受体植物中权利要求1所述的蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的白粉病抗性低于所述受体植物，所述受体植物为小麦。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：通过将抑制所述的基因表达的物质导入受体植物中来抑制受体植物中权利要求1所述的蛋白质的含量和/或活性，所述抑制基因表达的物质为：BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和γ-TXR,所述γ-TXR为γ-TXR-1或γ-TXR-2，所述γ-TXR-1为将序列表中的序列2自5’末端起第109-314位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ链的其它序列不变的得到的TXR基因沉默载体,所述γ-TXR-2为将序列表中的序列2自5’末端起第1623-1795位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ链的其它序列不变的得到的TXR基因沉默载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统实现抑制受体植物中权利要求1所述的蛋白质的含量和/或活性。

6.一种用于抑制受体植物中权利要求1所述的蛋白质的含量和/或活性的沉默片段，所述沉默片段为如序列2中第109-314位的核苷酸序列或者序列2中第1623到1795位的核苷酸序列，所述受体植物为小麦。

7.一种培育白粉病抗性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的白粉病抗性高于所述受体植物，所述受体植物为小麦。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的白粉病抗性高于所述受体植物体现在如下a)或b)：a)转基因植物的白粉病菌的吸器指数低于受体植物；b)转基因植物的白粉病菌的分生孢子数低于受体植物。