CN112522307A - 一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体及其应用 - Google Patents

一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体，其中CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和sgRNA，重组载体包括BSMV介导的sgRNA重组载体和BSMV介导的split‑Cas9重组载体。本发明还公开了该重组载体的构建方法，以及该重组载体在植物基因编辑中的应用。利用本发明重组载体可以在植物目的基因中产生系统性编辑结果，建立了一种研究植物基因功能的有效方法，为植物非转基因编辑提供了一个新的思路。

Description

一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体及其应用。
背景技术
基于细菌CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated nuclease 9,Cas9)免疫系统开发的CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术，因其定向、高效、易于设计的特点，迅速革新了生命科学领域的研究方法。该技术仅需两个必须的组件：一个具有核酸酶活性的Cas9蛋白和小片段单链向导RNA(single guideRNA，sgRNA)。sgRNA通过scaffold与Cas9蛋白结合形成Cas9:sgRNA核糖核酸蛋白复合物(Ribonucleoproteins，RNPs)。该复合物能识别双链DNA序列中5’-NGG-3’PAM模序，并引起临近的DNA双螺旋解链，使得sgRNA中的5’引导序列与DNA单链有机会互补复性，若能完全互补形成RNA-DNA稳定双链，即完成靶向定位，并激活Cas9内部的两个核酸酶位点，分别对两条DNA单链中PAM位点前的3至4位核苷酸进行切割。DNA双链断裂能够激活损伤修复机制。细胞或通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)修复在DNA接口处插入、缺失或替换碱基，或在有同源模版的情况下，利用同源介导的修复(homology-directedrepair，HDR)在断裂处引入新的片段，以避免Cas9:sgRNA复合物的再次切割。而这些修复引入的变异，恰恰是我们所需要的靶向位点编辑。仅需要更换sgRNA中前20nt序列，便可配合Cas9蛋白靶向编辑不同的基因，因此对比于锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)和类转录激活效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等基因组编辑技术，CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作更加简便，成本更低，编辑效率更高，脱靶效率更低，目前已经在多种植物中广泛的被应用。
大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)是一种常用于VIGS的RNA病毒，在单子叶植物和双子叶植物中都有应用。BSMV基因组由三条正单链RNA组成，分别是BSMV-α、β和γ。之前已有研究发现，BSMV三组分载体系统可以用于外源基因的超表达，但成功表达的基因都比较小。2018年初，来自加拿大的Cheuk和Houde报道了一种新的BSMV系统超表达系统，他们将BSMV基因组的γ组分重构成了γ1和γ2两个亚组分，这使得该系统的装载能力大大提升，并且提供了两个外源基因的插入位点。当重组的BSMV载体经农杆菌介导进入植物细胞后，病毒的表达系统介导重组病毒RNA在植物细胞内合成，进一步复制以后扩散到发育和分生组织，甚至到生殖细胞系中。
因此，利用BSMV介导CRISPR/Cas9重组载体及在植物中sgRNA投送和sgRNA+Cas9共投送方法的研究是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体，其中CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和sgRNA，重组载体包括BSMV介导的sgRNA重组载体和BSMV介导的split-Cas9重组载体。
进一步地，BSMV介导的sgRNA重组载体包括重组载体BSMV-γ：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1和BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2。
进一步地，BSMV介导的split-Cas9重组载体包括重组载体BSMV-γ2：Cas9N和BSMV-γ2：Cas9C。
本发明还公开了一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体的构建方法，具体包括以下步骤：
S1，构建sgRNA Ti载体；
S11，根据烟草PDS基因的外显子序列信息设计出NbPDS基因的sgRNA靶标序列，然后分析得到两条合适酶切位点的sgRNA1和sgRNA2；
S12，使用BsaI单酶切pKSE401载体，然后凝胶电泳回收大小约15kb酶切产物；
S13，将sgRNA1和sgRNA2的正向、反向引物退火形成的双链DNA，插入到S12中的酶切产物的线性化载体中，获得重组载体pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2；
S2，构建BSMV介导的sgRNA重组载体；
S21，使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体，凝胶电泳回收酶切产物；
S22，使用Q5高保真DNA聚合酶，以sgRNA Ti载体为模板，通过PCR扩增出sgRNA1和sgRNA2片段序列，凝胶电泳回收扩增产物；
S23，通过LIC的连接方法，将S21中的线性化载体和S22中的sgRNA片段连接，构成重组载体BSMV-γ：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1和BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2；
S3，构建BSMV介导的split-Cas9重组载体；
S31，使用ApaI单酶切BSMV-γ2病毒载体，凝胶电泳回收酶切产物；
S32，将spCas9从其第714(S)个氨基酸分割，使用Q5高保真DNA聚合酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9N端和Cas9C端，获得split-Cas9片段；
S33，通过LIC的连接方法，将S31中酶切产物的线性化载体和S32中的split-Cas9片段连接，构成重组载体BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C。
进一步地，S13中sgRNA1和sgRNA2的正向、反向引物为：
sgRNA1正向引物序列：5’-ATTGTTGGTAGTAGCGACTCCATG-3’
sgRNA1反向引物序列：5’-AAACCATGGAGTCGCTACTACCAA-3’
sgRNA2正向引物序列：5’-ATTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGG-3’
sgRNA2反向引物序列：5’-AAACCCTAGGACATCTCTTGCCTC-3’
进一步地，S32中Cas9N端PCR引物为：
正向引物序列：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGATTACAAGGACCACGA-3’
反向引物序列：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTGCTCACCTGAGCCTT-3’。
进一步地，S32中Cas9C端PCR引物为：
正向引物序列：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGGCCAGGGGGACTCGCT-3’
反向引物序列：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTCACTTCTTCTTCTTCGCC-3’。
本发明还公开了一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体的应用。
本发明还公开了一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体投送至超表达SpCas9的本氏烟叶片中的应用。
本发明还公开了一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体在植物非转基因编辑中的应用。
本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明利用大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)重组构建含有α、β、γ三条不同单链RNA的BSMV载体系统或重组构建含有α、β、γ1、γ2四条不同单链RNA的BSMV载体系统。首先在超标达Cas9烟草(KQ334)中验证三组分BSMV和四组分BSMV系统投送sgRNA的可行性，达到基因编辑结果；接下来验证四组分BSMV系统共投送sgRNA+Cas9的可行性，达到非转基因编辑结果。
2)利用本发明重组载体可以在植物目的基因中产生系统性编辑结果，建立了一种研究植物基因功能的有效方法，为新的植物基因编辑提供了一个新的思路。
3)与冗长的农杆菌介导的遗传转化过程相比，本系统具有明显优势，这对RNA病毒介导的CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑的应用研究具有重要意义，也为进一步利用病毒载体侵染生殖组织，进而直接获得非转基因编辑种子的目标奠定了基础。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为pKSE401载体示意简图；
图2为所选择的烟草PDS基因的sgRNA1和sgRNA2以及初步验证了它们的编辑活性；
图3为BSMV载体的主要结构示意图，A图为三组分BSMV系统，B图为四组分BSMV系统；
图4为LIC(Ligation independent cloning)原理示意图；
图5为三组分BSMV投送sgRNA2的PCR/RE实验结果图；
图6为四组分BSMV投送sgRNA2的PCR/RE实验结果图；
图7为四组分BSMV投送双sgRNA(sgRNA1+sgRNA2)的PCR检测大片段缺失结果图；
图8为split-Cas9示意简图；
图9为四组分BSMV共投送sgRNA2+Cas9的PCR/RE实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明提供了一种新的植物基因编辑的思路。本研究利用了植物病毒侵染性强，移动性强等特点，可以系统性侵染多种植物。相比较于传统的双元载体介导的CRISPR/Cas9技术，该病毒介导的植物基因编辑因病毒不断复制使得编辑效率大大提高，并且具有很强的移动性可对整株植物产生有效突变。相比较于目前最常用的转基因技术，本发明提供了一种非转基因编辑的新方法，避免了转基因问题带来的争论，相对安全，大大降低了风险，其广谱性为后续在难以转化的作物方面的应用提供了可能性。本研究对RNA病毒介导的CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑的应用研究具有重要意义，也为进一步利用病毒载体侵染生殖组织，进而获得非转基因编辑种子的目标奠定了基础。本研究中提到的四组分BSMV载体系统因其装载能力有限，对于尺寸较小的基因编辑系统具有更广阔的应用前景，为接下来病毒载体介导的非转基因编辑研究提供重要依据。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所涉及的载体或质粒，如BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ、pMDTM19-T Vector等均为已知载体或质粒，以下实施例中所涉及的BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ来源于中国农业大学李大伟教授馈赠，BSMV-γ1、BSMV-γ2可根据现有文献自行构建。
本发明所涉及的植物材料，转基因SpCas9-OE本氏烟由清华大学刘玉乐教授馈赠，实施例中所涉及的其它植物材料如无特殊说明则均可从商业途径得到。
实施例1构建sgRNA Ti载体
根据spCas9 PAM序列(NGG)以及最优20nt长度的的设计原则，设计了俩条sgRNA,分别连入pKSE401载体中。
sgRNA的设计：
在NCBI上找到烟草PDS基因的CDS序列；
以此序列在烟草基因组网站中找到烟草PDS的基因组序列，并得到烟草PDS基因的外显子序列信息；
根据得到的烟草PDS基因的外显子序列信息利用在线软件CRISPR-P软件设计出NbPDS基因的sgRNA靶标序列；
分析得到俩条合适酶切位点的sgRNA(sgRNA1和sgRNA2)。
sgRNA Ti载体的构建具体为：
(1)靶位点设计引物选择：
sgRNA1正向引物序列：5’-ATTGTTGGTAGTAGCGACTCCATG-3’
sgRNA1反向引物序列：5’-AAACCATGGAGTCGCTACTACCAA-3’
sgRNA2正向引物序列：5’-ATTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGG-3’
sgRNA2反向引物序列：5’-AAACCCTAGGACATCTCTTGCCTC-3’
(2)使用BsaI单酶切pKSE401载体，凝胶电泳回收大小约15kb酶切产物；
(3)将步骤(1)中sgRNA1和sgRNA2的正向和反向引物退火形成的双链DNA，具体的操作步骤为：合成的到两条引物用去离子水溶解为100uM，各取5ul混匀，80℃水浴15min，取出自然降到室温即完成；将上述双链DNA插入步骤(2)中酶切产物的线性化载体中，获得重组载体pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2；
(4)将重组载体pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2转化大肠杆菌感受态细胞，待平板长出单克隆后，随机挑选单克隆于LB液体培养基37℃培养过夜，用菌液PCR结合测序的方法鉴定重组质粒，鉴定正确后大量制备所需的重组质粒。
BasI单酶切体系：1μL CutSmart buffer，0.2μL BsaI，5μL质粒，3.8μL ddH2O；反应条件：37℃条件下酶切1h。
T4连接酶连接反应体系：3μL线性化载体，5μL双链DNA，1μL 10×Ligase buffer，1μL T4 DNA Ligase；反应条件：16℃条件下连接2～3h。
图1示pKSE401载体示意简图；图2(A)示所选的sgRNA1和sgRNA2；图2(B)示sgRNA1编辑效率结果，图2(C)示sgRNA2编辑效率结果。结果表明所选的sgRNA1和sgRNA2均可以对靶基因PDS造成编辑结果。
实施例2：四组分BSMV重组载体的构建：
三组分BSMV系统(BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ)来源于中国农业大学李大伟教授馈赠；参照2017(Mario Houde 2017)，构建了四组分BSMV系统(BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1、BSMV-γ2)，可用于CRISPR/Cas9试剂投送。
图3(A)示三组分BSMV系统载体示意图，图3(B)示四组分BSMV系统载体示意图。
实施例3：Ligation independent cloning(LIC)方法
图4示LIC反应原理图，LIC(Ligation independent cloning)，是一种不依赖于连接酶的克隆方式，克隆效率高，反应时间短，LIC方法为高通量的克隆操作提供了条件。LIC是利用了T4聚合酶的3’-5’端的外切活性，是一段经过设计的序列能够被外切产生一个特定长度，特定序列的较长的粘性末端(一般15bp左右)。当载体和PCR片段被处理产生的粘性末端分别互补配对时，通过变性和退火，15bp长度的互补配对能够在没有连接酶存在的条件下，维持重组质粒的环状结构。将这个未经连接的重组质粒转化入大肠杆菌，利用大肠杆菌的复制系统产生完整的环状重组质粒。其中，反应程序如下：
首先，将LIC载体线性化，将目的片段的PCR产物回收纯化，然后按照以下体系配制反应溶液：
表1线性化病毒载体的配制
试剂成分 用量
线性化病毒载体 100ng
NEBuffer 2.1 2μL
T4 DNA聚合酶 0.5μL
100mM dTTP 1.5μL
水补足 20μL
表2回收片段的配制
试剂成分 用量
回收片段 100ng
NEBuffer 2.1 2μL
T4 DNA聚合酶 0.5μL
100mM dATP 1.5μL
水补足 20μL
反应条件：22℃反应30min，75℃反应20min使酶失活，将10ng处理后的载体和100ng处理后的回收片段涡旋混匀，加热至66℃反应2min，室温放置10min，转化大肠大肠杆菌感受态细胞。
实施例4：BSMV介导的sgRNA重组载体的基因编辑
以构建好的pKSE401-sgRNA1和pKSE401-sgRNA2为模板，通过LIC的连接方法构建BSMV介导的sgRNA重组载体。
(一)构建方法如下：
(1)sgRNA病毒载体片段引物选择，如表3所示：
表3sgRNA病毒载体片段引物
Figure BDA0002845817780000111
(2)使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体，凝胶电泳回收酶切产物；
(3)使用Q5高保真DNA聚合酶，以上述实施例1中重组载体为模板，选择步骤(1)中合适引物通过PCR扩增出各sgRNA片段序列，凝胶电泳回收酶切产物；
(4)通过LIC的连接方法，将步骤(2)中酶切产物的线性化载体和步骤(3)中的sgRNA片段连接，构成重组载体BSMV-γ：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1和BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2；
(5)将重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，待平板长出单克隆后，随机挑选单克隆于LB液体培养基37℃培养过夜，用菌液PCR结合测序的方法鉴定重组质粒，鉴定正确后大量制备所需的重组质粒。
PCR反应体系：4μL 5×Q5 Reaction Buffer，1.6μL 2.5mM dNTP，0.8μL 10μMForward Primer，0.8μL 10μM Reverse Primer，1μL重组载体模版，0.2μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，11.6μL ddH2O；反应程序：98℃变性10s、57℃退火10s、72℃延伸30s、循环35次。
ApaI单酶切体系：1μL CutSmart buffer，0.2μL ApaI，5μL病毒载体质粒，3.8μLddH2O；反应条件：37℃条件下酶切1h。
(二)将BSMV介导的sgRNA重组载体投送至超表达SpCas9-OE本氏烟，具体操作步骤为：
(1)挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆，接种到25ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
取上述农杆菌菌液1ml(按照1:50的比例)接种至新的含有25ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8-10小时；
将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min来收集菌体，然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/L AS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
(2)分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ-sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ2、BSMV-γ1：sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1、BSMV-γ2：sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA1混合均匀形成BSMV三组分系统或四组份系统，28℃黑暗培养3～4个小时；
(3)挑选6～8叶期的超表达SpCas9-OE本氏烟，用针头轻轻触碰其背面造成微伤口，接着用不带针头的注射器分别吸取(2)中的混合菌液通过伤口缓慢注入烟草叶片中，每张叶片选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
(4)注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h，后正常光周期养护7d。
(三)可行性检测
(1)提取实验处理本氏烟的侵染叶片和系统叶片的基因组DNA
(2)PCR以及测序检测基因编辑类型
(Ⅰ)单sgRNA投送：
以提取的烟草叶片DNA为模版，用高保真酶扩增NbPDS3基因相应靶位点的PCR片段，PCR产物回收后，用AvrIII限制性内切酶分别酶切相应靶位点PCR扩增片段，酶切完成后用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-TVector进行测序分析，其中，
sgRNA2的PCR引物为：
5’-GCATGGTACTGTGCCGATCA-3’
5’-GCAACCCAGTCTCGTACCAA-3’
(Ⅱ)双sgRNA投送：
以提取的烟草叶片DNA为模版，用高保真酶扩增NbPDS3基因包括俩个靶位点在内的PCR片段，也野生型作为对照，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，分析胶图是否有片段缺失突变，将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-T Vector进行测序分析，其中，检测缺失的PCR引物为：
5’-AGGTTCACAAGTGGGACAATC-3’
5’-GCAACCCAGTCTCGTACCAA-3’
PCR反应体系：4μL 5×Q5 Reaction Buffer，1.6μL 2.5mM dNTP，0.8μL10μMForward Primer，0.8μL 10μM Reverse Primer，1μL重组载体模版，0.2μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，11.6μL ddH2O；反应程序：98℃变性10s、57℃退火10s、72℃延伸30s、循环35次。
NcoI单酶切体系：1μL CutSmart buffer，0.2μL NcoI，5μLPCR产物，3.8μL ddH2O；反应条件：37℃条件下酶切1h。
图5示三组分BSMV系统投送sgRNA2介导的烟草PDS基因的编辑情况；结果表明，三组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株，在注射叶和系统叶中均可以检测到基因编辑结果。图6示四组分BSMV系统投送sgRNA2介导的烟草PDS基因的编辑情况；结果表明，四组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株，在注射叶和系统叶中均可以检测到基因编辑结果。图7示四组分BSMV系统投送sgRNA1和sgRNA2介导的烟草PDS基因的编辑情况；结果表明，四组分系统可同时投送俩个sgRNA，且可以造成大片段缺失。
实施例5：四组分BSMV共投送sgRNA+Cas9介导的非转基因编辑
以pKSE401为模板，通过LIC的连接方法构建BSMV介导的split-Cas9重组载体。
(一)构建方法如下：
(1)使用ApaI单酶切pCaBs-γ2病毒载体，凝胶电泳回收；
(2)参考(Jorrit Boekel 2015)，将spCas9从其第714(S)个氨基酸分割，使用Q5高保真DNA聚合酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9N端和Cas9C端；其中，Cas9N端PCR引物为：
正向引物：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGATTACAAGGACCACGA-3’
反向引物：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTGCTCACCTGAGCCTT-3’
Cas9C端PCR引物为：
正向引物：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGGCCAGGGGGACTCGCT-3’
反向引物：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTCACTTCTTCTTCTTCGCC-3’
(3)通过LIC的连接方法，将步骤(Ⅰ)中的线性化载体和步骤(Ⅱ)中的split-Cas9片段连接，构成重组载体pCaBs-γ2：Cas9N、pCaBs-γ2：Cas9C；
(4)将重组载体pCaBs-γ2：Cas9N、pCaBs-γ2：Cas9C转化大肠杆菌感受态细胞，待平板长出单克隆后，随机挑选单克隆于LB液体培养基37℃培养过夜，用菌液PCR结合测序的方法鉴定重组质粒，鉴定正确后大量制备所需的重组质粒，之后进行农杆菌的转化，鉴定阳性克隆后划线保存。
(二)将BSMV介导的split-Cas9重组载体投送至野生型本氏烟，具体操作步骤为：
(1)挑取含BSMV介导的split-Cas9重组载体的农杆菌克隆，接种到25ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
取上述农杆菌菌液1ml(按照1:50的比例)接种至新的含有25ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8-10小时；
将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min来收集菌体，然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/L AS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
(2)分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：Cas9N或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：Cas9C混合均匀形成BSMV八组份系统，28℃黑暗培养3～4个小时；
(3)挑选6～8叶期的野生型本氏烟，用针头轻轻触碰其背面造成微伤口，接着用不带针头的注射器分别吸取(2)中的混合菌液通过伤口缓慢注入烟草叶片中，每张叶片选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
(4)注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h，后正常光周期养护7d；
(5)提取RNA，并反转录为cDNA，半定量检测病毒积累情况；
(6)用CTAB法提取本生烟叶片基因组DNA，样品经液氮研磨；
(7)以提取的烟草叶片DNA为模版，用高保真酶扩增NbPDS3基因相应靶位点的PCR片段，PCR产物回收后，用AvrII限制性内切酶酶切相应靶位点PCR扩增片段，酶切完成后用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-T Vector进行测序分析，其中，sgRNA2的PCR引物为：
正向引物：5’-GCATGGTACTGTGCCGATCA-3’
反向引物：5’-GCAACCCAGTCTCGTACCAA-3’
PCR反应体系：4μL 5×Q5 Reaction Buffer，1.6μL 2.5mM dNTP，0.8μL 10μMForward Primer，0.8μL 10μM Reverse Primer，1μL重组载体模版，0.2μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，11.6μL ddH2O；反应程序：98℃变性10s、57℃退火10s、72℃延伸30s、循环35次。
NcoI单酶切体系：1μL CutSmart buffer，0.2μL NcoI，5μLPCR产物，3.8μL ddH2O；反应条件：37℃条件下酶切1h。
图8示Split-Cas9示意简图；图9示四组分BSMV共投送sgRNA+Cas9介导的基因编辑情况。结果表明，四组分BSMV系统可以共投送sgRNA+Cas9造成基因编辑结果。
上述结果表明，BSMV介导的sgRNA重组载体能够在超表达spCas9的本生烟中发生编辑事件，且在系统叶中，编辑事件也被检测到(如图5，6)。针对双位点编辑，PCR结果显示834bp的大片段缺失的条带(如图7)，说明该重组载体能够同时突变两个靶位点，并都具有很高的编辑效率。针对非转基因编辑，结果表明BSMV四组分系统可以实现对sgRNA+Cas9的共投送，PCR/RE实验结果显示了编辑事件的产生(如图9)。
综上所述，BSMV介导的sgRNA投送和sgRNA+Cas9共投送系统可运用于CRISPR/Cas9对植物进行基因编辑。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体，其中CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和sgRNA，其特征在于，所述重组载体包括BSMV介导的sgRNA重组载体和BSMV介导的split-Cas9重组载体。
2.根据权利要求1所述的BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体，其特征在于，所述BSMV介导的sgRNA重组载体包括重组载体BSMV-γ：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1和BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2。
3.根据权利要求1所述的BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体，其特征在于，所述BSMV介导的split-Cas9重组载体包括重组载体BSMV-γ2：Cas9N和BSMV-γ2：Cas9C。
4.一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1，构建sgRNA Ti载体；
S11，根据烟草PDS基因的外显子序列信息设计出NbPDS基因的sgRNA靶标序列，然后分析得到两条合适酶切位点的sgRNA1和sgRNA2；
S12，使用BsaI单酶切pKSE401载体，然后凝胶电泳回收大小约15kb酶切产物；
S13，将sgRNA1和sgRNA2的正向、反向引物退火形成的双链DNA，插入到S12中的酶切产物的线性化载体中，获得重组载体pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2；
S2，构建BSMV介导的sgRNA重组载体；
S21，使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体，凝胶电泳回收酶切产物；
S22，使用Q5高保真DNA聚合酶，以sgRNA Ti载体为模板，通过PCR扩增出sgRNA1和sgRNA2片段序列，凝胶电泳回收扩增产物；
S23，通过LIC的连接方法，将S21中的线性化载体和S22中的sgRNA片段连接，构成重组载体BSMV-γ：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1和BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2；
S3，构建BSMV介导的split-Cas9重组载体；
S31，使用ApaI单酶切BSMV-γ2病毒载体，凝胶电泳回收酶切产物；
S32，将spCas9从其第714(S)个氨基酸分割，使用Q5高保真DNA聚合酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9N端和Cas9C端，获得split-Cas9片段；
S33，通过LIC的连接方法，将S31中酶切产物的线性化载体和S32中的split-Cas9片段连接，构成重组载体BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C。
5.根据权利要求4所述的BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体的构建方法，其特征在于，S13中sgRNA1和sgRNA2的正向、反向引物为：
sgRNA1正向引物序列：5’-ATTGTTGGTAGTAGCGACTCCATG-3’
sgRNA1反向引物序列：5’-AAACCATGGAGTCGCTACTACCAA-3’
sgRNA2正向引物序列：5’-ATTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGG-3’
sgRNA2反向引物序列：5’-AAACCCTAGGACATCTCTTGCCTC-3’。
6.根据权利要求4所述的BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体的构建方法，其特征在于，S32中Cas9N端PCR引物为：
正向引物序列：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGATTACAAGGACCACGA-3’
反向引物序列：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTGCTCACCTGAGCCTT-3’。
7.根据权利要求4所述的BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体的构建方法，其特征在于，S32中Cas9C端PCR引物为：
正向引物序列：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGGCCAGGGGGACTCGCT-3’
反向引物序列：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTCACTTCTTCTTCTTCGCC-3’。
8.根据权利要求1-3任一项所述的一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体的应用。
9.根据权利要求1-3任一项所述的一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体投送至超表达SpCas9的本氏烟叶片中的应用。
10.根据权利要求1-3任一项所述的一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体在植物非转基因编辑中的应用。
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