CN112481259B - 两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及两种甘薯RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及两种甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3，并进一步公开其克隆方法与应用。本发明在甘薯中克隆获得两种甘薯RNA聚合酶III型启动子‑‑‑甘薯内源U6启动子IbU6.1与IbU6.3，它们属于甘薯内源RNA聚合酶III型启动子，具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，并通过甘薯稳定转化体系分别验证了这两种启动子的活性及其应用于甘薯CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并实现了CRISPR/Cas9介导的甘薯基因组靶向编辑。

Description

两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用
技术领域
本发明属生物技术领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及甘薯U6启动子的克隆和应用。
背景技术
甘薯是世界上第7大粮食作物，中国是甘薯最大的种植生产和消费国(FAO，2014)。甘薯属于六倍体(2x＝6n＝90)，染色体小、倍型高。遗传组成的复杂性使甘薯遗传研究难度远大于水稻、玉米等作物。此外，广泛存在于甘薯种内、种间的杂交不亲和性严重限制了甘薯杂交育种中亲本的自由选配及优异基因在育种中的利用，成为限制甘薯育种发展的瓶颈(Liu Q.,2017)。甘薯新材料的创制和新品种的选育主要是以传统杂交育种为主，选育时间长、效率低、产量品质抗性等主要性状很难兼顾,因此迫切需要高效的技术手段对甘薯进行遗传改良。
CRISPR(cluIbered regulatory interspaced short palindromic repeats)是广泛存在于细菌和古细菌里基于核酸的适应性免疫系统，它被用来抵抗病毒和质粒的侵入(Wiedenheft et al.,2012)。CRISPR-Cas9属于二型的CRISPR系统，核酸内切酶Cas9与二个非编码RNAs,CRISPR RNA(crRNA)、trans-acting crRNA(tracrRNA)形成复合物通过序列匹配在特定的DNA区域造成双链断裂。作为一种高效的遗传改良工具，现在CRISPR-Cas9被广泛用来在不同植物进行基因编辑产生可遗传的突变，如拟南芥、水稻、大豆，包括甘薯及其近缘物种日本牵牛等(Feng et al.,2013；Shan et al.,2013；Li et al.,2015；WatanabeK et al.；2017Wang et al.,2019)。因此验证Cas9在甘薯基因组上的作用不仅有助于增加甘薯基因功能研究的手段，而且也为将来甘薯的分子育种提供新的工具。
目前，U6 RNA是一种参与mRNA前体剪接的非编码RNA，其对应的U6启动子是一类RNA聚合酶III型启动子，已经在许多物种的CRISPR/Cas9系统中得到了大量的应用。在转基因技术领域，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR系统中sgRNA引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的启动效率。虽然在许多物种中U6启动子已有大量的报道，但外源的U6启动子通常并不适用。可见，缺少适用的内源U6启动子已成为目前甘薯CRISPR/Cas9基因编辑体系的限制因子，也限制了CRISPR/Cas9基因组编辑技术在甘薯育种中的应用。因此，筛选出在甘薯中有功能活性的U6启动子对于甘薯的基因育种技术发展具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供两种甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3，并进一步公开其克隆方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的两种甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3，所述启动子IbU6.1包括如SEQ ID No：1所示的DNA核苷酸序列，启动子IbU6.3包括如SEQ IDNo：2所示的DNA核苷酸序列。
上述甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3都属于甘薯U6 snRNA基因的RNA聚合酶III型启动子，来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)。
具体的，所述启动子IbU6.1的DNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，启动子IbU6.3的DNA核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明还公开了两种甘薯基因编辑载体，即分别含有所述的甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3。
具体的，所述基因编辑载体为重组质粒35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg。
本发明还公开了一种克隆所述的甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3的方法，包括如下步骤：
(1)以甘薯品种川薯228叶片基因组DNA为模板，设计如下特异引物：
针对启动子IbU6.1的引物为
IbU6-1-F1:CTCGGTTTGGGAAACAAGTAACT
IbU6-1-R1:TACTACACGCAGGTGCCATGATAC
IbU6-1-F2:CATGATCTAGTATAGAAAATGGGAAG
IbU6-1-R2:GCAGCTTAGCGAATACTTACCGA
IbU6-1-F3:AATATTCTATGTAATACTCC
IbU6-1-R3:AGCATGTGCTTCCATGGCGG
针对启动子IbU6.3的引物为
IbU6-3-F1:TCAAGTGCCGTGAATCCACTGAG
IbU6-3-R1:CTAGGAAAGACCGGAGAATGG
IbU6-3-F2:TGTCCTATTTAAGGGTTTCAACGCA
IbU6-3-R2:TCGGAGAAGCAGGGTTTGGGTG
IbU6-3-F3:AGATCAGCAAATACGTTAGA
IbU6-3-R3:GTTCTTCTTCTTCAATGGCG
(2)使用高保真Prime Star酶在50μl反应体系中进行3轮PCR扩增，针对IbU6.1启动子，第1轮利用IbU6-1-F1/R1引物以川薯228叶片DNA为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为1447bp的第1轮PCR产物；第2轮利用IbU6-1-F2/R2引物以第1轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为961bp的第2轮PCR产物；第3轮利用IbU6-1-F3/R3引物以第2轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为436bp的第3轮PCR产物。针对IbU6.3启动子，第1轮利用IbU6-3-F1/R1引物以川薯228叶片DNA为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为1671bp的第1轮PCR产物；第2轮利用IbU6-3-F2/R2引物以第1轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为910bp的第2轮PCR产物；第3轮利用IbU6-3-F3/R3引物以第2轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为410bp的第3轮PCR产物。
(3)将步骤(2)中得到的IbU6.1与IbU6.3启动子的第3轮PCR扩增产物分别克隆到
Figure BDA0002795248690000031
-Blunt Zero Cloning载体上，转化大肠杆菌DH5α中并挑取单克隆测序，即得436bp的甘薯IbU6.1启动子的DNA片段和410bp的甘薯IbU6.3启动子的DNA片段。
具体的所述步骤(2)中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/min，循环数34个，72℃终延伸7min。
本发明还公开一种构建权利要求3或4所述的甘薯基因编辑载体的方法，包括如下步骤：
(1)将克隆的启动子IbU6.1与IbU6.3分别构建到载体35S-ATU6-Hyg上
用Hind III-HF和XbaI双酶切35S-ATU6-Hyg载体，将拟南芥U6启动子ATU6切下，回收载体骨架片段；
设计用于同源重组克隆的含同源臂的引物：
IbU6.1-F:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAATATTCTATGTAATACTCC
IbU6.1-R:CTAAAACAGAGACCGTCTAGATGGTCTCAGCATGTGCTTCCATGGCGG；
IbU6.3-F:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGATCAGCAAATACGTTAGA
IbU6.3-R:CTAAAACAGAGACCGTCTAGATGGTCTCGTTCTTCTTCTTCAATGGCG；
利用含同源臂的引物IbU6.1-F/R，以IbU6.1片段为模板，PCR扩增获得两端含同源臂的IbU6.1启动子DNA片段，另外利用含同源臂的引物IbU6.3-F/R，以IbU6.3片段为模板，PCR扩增获得两端含同源臂的IbU6.3启动子DNA片段，用
Figure BDA0002795248690000041
重组酶将上述两个片段分别同源重组到线性化的35S-ATU6-Hyg载体上得到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg；
(2)将靶位点构建到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体上
在甘薯IbLCY基因上选择如下靶位点：GCTCTGAACTTCTCTGCAA，针对35S-IbU6.1-Hyg载体，在靶序列两端加上接头序列，设计的靶位点克隆引物如下：
LCY-TF1：ATGCTGGCTCTGAACTTCTCTGCAA
LCY-TR1：AAACTTGCAGAGAAGTTCAGAGCCA
针对35S-IbU6.3-Hyg载体，在靶序列两端加上接头序列，设计的靶位点克隆引物如下：
LCY-TF3：AGAACGGCTCTGAACTTCTCTGCAA
LCY-TR3：AAACTTGCAGAGAAGTTCAGAGCCG
分别将上述LCY-TF1和LCY-TR1，LCY-TF3和LCY-TR3靶点引物混匀，用PCR仪96℃处理3分钟后0.1℃/s降温至16℃退火，形成带有与载体互补粘性末端的双链退火产物，同时用Bsa I分别酶切35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体，然后使用T4 DNA连接酶将靶点片段分别连接到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体上，最终得到35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO的基因敲除载体。
本发明还公开了一种对甘薯进行基因组编辑的方法，即包括将所述的甘薯基因敲除编辑载体利用农杆菌介导侵染甘薯胚性愈伤，并获得再生编辑植株步骤。
本发明还公开了所述的甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3在甘薯分子育种技术领域中的应用。
本发明还公开了所述的甘薯基因编辑载体35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg在甘薯分子育种技术领域中的应用。
本发明首次在甘薯中克隆获得甘薯RNA聚合酶III型启动子--甘薯内源U6启动子IbU6.1与IbU6.3，该启动子为甘薯内源RNA聚合酶III型启动子，该启动子具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，并经过筛选甘薯内源番茄红素ε环化酶基因IbLCY-ε的靶点序列后，将其分别构建到编辑载体35S-IbU6.1-Hyg中IbU6.1启动子下游，与35S-IbU6.3-Hyg中IbU6.3启动子下游。
再通过农杆菌介导甘薯胚性愈伤转化将编辑载体导入甘薯细胞内实现了对IbLCY-ε基因靶位点的编辑，验证了IbU6.1与IbU6.3启动子的活性，在甘薯中建立了有效的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系。
本发明首次将克隆的甘薯内源RNA聚合酶III型启动子IbU6.1与IbU6.3，通过转化甘薯胚性愈伤获得编辑植株，验证了启动子的活性及其应用于甘薯CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并实现了CRISPR/Cas9介导的甘薯基因组靶向编辑。对编辑后的靶基因片段进行TA克隆并测序，结果发现突变类型为单碱基的插入或者缺失。因此，本发明克隆的启动子IbU6.1与IbU6.3可应用于甘薯CRISPR/Cas9基因编辑体系，从而实现对甘薯高效精准的品种改良。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为甘薯IbU6.1基因启动子的克隆电泳图，可见经3轮PCR扩增得到了436bp的IbU6.1基因启动子片段与410bp的IbU6.3基因启动子片段；
图2为甘薯基因敲除辑载体35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg的结构简图，三角形标注了内切酶Bsa1的切割位置；
图3为甘薯再生植株PCR阳性鉴定结果图，其中为H2O为空白对照，N为甘薯野生型对照，P为质粒阳性对照，M为Marker，1-15为35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO载体的独立转化单株，16-24为35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO载体的独立转化单株。
图4为35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO载体转化甘薯获得的突变单株PCR扩增靶位点后进行TA克隆测序分析；可见，这两个载体都能在靶基因位点发现编辑，突变类型为少数碱基的缺失和插入。
具体实施方式
本发明下述实施例中，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1甘薯U6基因启动子IbU6.1与IbU6.3的获得
甘薯U6启动子的克隆和功能验证方法，其具体步骤如下：
1、利用U6启动子snRNA序列的保守性https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与已发表的甘薯单倍型基因组(https://www.ipomoea-genome.org/)序列进行比对。发现甘薯基因组含有多个拷贝的U6基因，利用在线分析网站http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#！对这些U6基因的启动子进行顺式元件分析，包括USE与TATA框等顺式元件，最终选取其中的两个拷贝IbU6.1与IbU6.3的启动子进行克隆。
2、分别在IbU6.1与IbU6.3的上下游由外至内各设计了3对引物，引物序列如下：
IbU6-1-F1:CTCGGTTTGGGAAACAAGTAACT
IbU6-1-R1:TACTACACGCAGGTGCCATGATAC
IbU6-1-F2:CATGATCTAGTATAGAAAATGGGAAG
IbU6-1-R2:GCAGCTTAGCGAATACTTACCGA
IbU6.1-F3:AATATTCTATGTAATACTCC
IbU6.1-R3:AGCATGTGCTTCCATGGCGG；
IbU6-3-F1:TCAAGTGCCGTGAATCCACTGAG
IbU6-3-R1:CTAGGAAAGACCGGAGAATGG
IbU6-3-F2:TGTCCTATTTAAGGGTTTCAACGCA
IbU6-3-R2:TCGGAGAAGCAGGGTTTGGGTG
IbU6-3-F3:AGATCAGCAAATACGTTAGA
IbU6-3-R3:GTTCTTCTTCTTCAATGGCG
其中用于克隆IbU6.1启动子的引物对，由外至内依次为IbU6-1-F1/R1，IbU6-1-F2/R2与IbU6-1-F3/R3，克隆IbU6.3启动子的引物对，由外至外依次为IbU6-3-F1/R1，IbU6-3-F2/R2与IbU6-3-F3/R3。其中IbU6-1-R3与IbU6-3-R3引物分别位于IbU6.1与IbU6.3基因转录起始位点上游，并紧挨着U6的转录起始位点G碱基。
3、使用Prime Star酶在50μl反应体系中进行PCR扩增，由外至内进行3轮PCR，第1轮PCR的模板为川薯228的DNA，而第2轮的模板为第一轮的PCR产物，第3轮的模板为第2轮的PCR产物，第3轮PCR的结果如图1所示。具体反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/min，34个循环，72℃终延伸7min。将第3轮PCR扩增产物克隆到
Figure BDA0002795248690000071
-Blunt Zero Cloning载体上，转化大肠杆菌DH5α中并挑取重组载体单克隆PCR电泳验证后测序，最后，获得436bp如SEQ ID No：1所示的甘薯U6基因启动子DNA片段IbU6.1与410bp如SEQ ID No：2所示的甘薯U6基因启动子DNA片段IbU6.3。
实施例2甘薯基因编辑载体的构建
(1)将启动子IbU6.1与IbU6.3分别构建到载体35S-ATU6-Hyg上
用Hind III-HF和XbaI双酶切35S-ATU6-Hyg载体，将拟南芥U6启动子切除，回收载体骨架大片段。
设计用于同源重组克隆的含同源臂的引物：
IbU6.1-F:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAATATTCTATGTAATACTCC
IbU6.1-R:CTAAAACAGAGACCGTCTAGATGGTCTCAGCATGTGCTTCCATGG
CGG；
IbU6.3-F:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGATCAGCAAATACGTTAGA
IbU6.3-R:CTAAAACAGAGACCGTCTAGATGGTCTCGTTCTTCTTCTTCAATGGCG；
(下划线所示为与35S-ATU6-Hyg载体同源序列)。
利用含同源臂的引物IbU6.1-F/R，以IbU6.1片段为模板，PCR扩增获得两端含同源臂的IbU6.1启动子DNA片段，另外利用含同源臂的引物IbU6.3-F/R，以IbU6.3片段为模板，PCR扩增获得两端含同源臂的IbU6.3启动子DNA片段，用
Figure BDA0002795248690000081
重组酶将上述两个片段分别同源重组到线性化的35S-ATU6-Hyg载体上得到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg，载体结构示意图如图2所示。
(2)将靶位点构建到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体上
为了验证IbU6.1启动子的功能活性，选择甘薯内源番茄红素ε环化酶基因IbLCY-ε作为CRISRP/Cas9编辑的目标基因，利用单克隆测序寻找其第一个外显子的纯合区域，设计合适靶位点GCTCTGAACTTCTCTGCAA。针对35S-IbU6.1-Hyg载体，在靶序列两端加上接头序列，设计的靶位点克隆引物如下：
LCY-TF1：ATGCTGGCTCTGAACTTCTCTGCAA
LCY-TR1：AAACTTGCAGAGAAGTTCAGAGCCA
针对35S-IbU6.3-Hyg载体，在靶序列两端加上接头序列，设计的靶位点克隆引物如下：
LCY-TF3：AGAACGGCTCTGAACTTCTCTGCAA
LCY-TR3：AAACTTGCAGAGAAGTTCAGAGCCG
下划线所示为用于载体连接的接头序列。
分别将上述LCY-TF1和LCY-TR1，LCY-TF3和LCY-TR3靶点引物混匀，用PCR仪96℃处理3分钟后0.1℃/s降温至16℃退火，形成带有与载体互补粘性末端的双链退火产物，同时用Bsa I分别酶切35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体，然后使用T4 DNA连接酶将靶点片段分别连接到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体上，最终得到35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO的基因敲除载体。
实施例3甘薯基因编辑植株的获得与靶序列突变位点的检测
(1)本实施例以农杆菌EHA105介导编辑载体35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO转化川薯12-4-16的胚性愈伤组织。将35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO载体利用冻融法分别转入农杆菌EHA105，调节菌液浓度为OD600＝0.6,对2.4-D诱导的川薯12-4-16的胚性愈伤组织进行侵染，共培养5天和含10.0mg/L潮霉素的筛选培养基培养一个月后获得阳性愈伤，在1/2M培养基上成苗获得植株。
(2)甘薯IbLCY-ε植株靶序列突变位点的检测：利用CTAB法提取甘薯再生植株叶片基因组DNA,使用引物：HYG-4F:AGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTG；HYG-6R:GTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTH进行转基因阳性鉴定。35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO载体转化甘薯的阳性鉴定结果如图3所示。
PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，28个循环，72℃终延伸7min。
使用引物：LCY-5F：CTGCGTAAAACCAATAATCCGAAGCTC；LCY-6R：CGTGTCCAAAAGCTTAGACTGTTCAT；对转基因阳性植株进行靶基因的扩增，并以LCY-5F作为测序引物对靶基因PCR扩增产物进行Sanger测序。如果测序结果在靶位点附近出现套峰则认为发生了基因编辑。将判定为已发生编辑的植株的靶基因扩增产物克隆到
Figure BDA0002795248690000091
-BluntZero Cloning载体上，转化大肠杆菌DH5α中并挑取单克隆进行测序，通过与野生型的序列比对，分析甘薯IbLCY-ε靶位点序列的突变的频率和类型，35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO这两个载体在甘薯IbLCY-ε基因位点的编辑结果如图4所示，这两个载体在甘薯中都能有效的进行基因编辑，编辑类型主要为少数碱基的插入与缺失。
可见，本发明在甘薯中获得甘薯RNA聚合酶III型启动子IbU6.1与bU6.3启动子具有转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，并首次实现了由内源甘薯U6启动子驱动的甘薯基因组靶向编辑；而编辑后靶位点克隆测序结果发现突变类型为少数碱基的插入和缺失。因此，本发明所述启动子可应用于甘薯CRISPR/Cas9基因编辑体系，从而实现对甘薯高效精准的品种改良。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 436
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 1
aatattctat gtaatactcc gtattatgtc aatatatata tatatatata taaagaggag 60
ggcggaattt tgtcaaaatt ggagtaaaag aaaataaatt ttattactag gataatattg 120
aaaattgctt taaataatgg gttcaataaa gaaggttata tgcacacaaa tataattcca 180
caagaaaata aaactatata atataatatt ttaaagaaat ggagaaaata tttgttgtat 240
actgatttca gaattacgga gtaataaatt ggtaaatttg gattgggcct agatgggccg 300
cttaggagcc gtagccttct aatttacagt acttctttta cgctgtagac tgtagtcact 360
taacttgtca gctcccacat cgggcgatga agcagcttgc ttccagtaca gatagtccgc 420
catggaagca catgct 436
<210> 2
<211> 410
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 2
agatcagcaa atatgttaga tcatgtgtta gctagagtta cgacttctca gcctggtcct 60
catgtttggt tttcttctta tcctgactgt attcatcact tgcttttcaa taattaatat 120
atctcgtttg gttggtttca aaaaacataa ataaatataa tattttttta agaaatggag 180
aaaatattta ttgtatacac attacacatt tgaaattgat agattgaaaa ttttggactg 240
ggcttacatg ccttaatggg cctctataag gaacaatggt cagtcttttt tgagaatgaa 300
caatggtcag tcttaggcag tagtattcgc ttttctgtgt gcagctccca catcgggtga 360
tgaagcagct ctcttccagt acacatagtc cgccattgaa gaagaagaac 410

Claims (10)

1.一种甘薯U6基因启动子，其特征在于，所述甘薯U6基因启动子为IbU6.1或IbU6.3，所述启动子IbU6.1的DNA序列为SEQ ID No：1所示，所述启动子IbU6.3的DNA序列为SEQ IDNo：2所示。
2.一种甘薯基因编辑载体，其特征在于，含有权利要求1中所述的甘薯U6基因启动子IbU6.1。
3.一种甘薯基因编辑载体，其特征在于，含有权利要求1中所述的甘薯U6基因启动子IbU6.3。
4.根据权利要求2或3所述的一种甘薯基因编辑载体，其特征在于，所述基因编辑载体为重组质粒35S-IbU6.1-Hyg或35S-IbU6.3-Hyg。
5.一种克隆权利要求1所述的甘薯U6基因启动子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以甘薯品种川薯228叶片基因组DNA为模板，设计如下特异引物：
针对启动子IbU6.1的引物为
IbU6-1-F1:CTCGGTTTGGGAAACAAGTAACT
IbU6-1-R1:TACTACACGCAGGTGCCATGATAC
IbU6-1-F2:CATGATCTAGTATAGAAAATGGGAAG
IbU6-1-R2:GCAGCTTAGCGAATACTTACCGA
IbU6-1-F3:AATATTCTATGTAATACTCC
IbU6-1-R3:AGCATGTGCTTCCATGGCGG
针对启动子IbU6.3的引物为
IbU6-3-F1:TCAAGTGCCGTGAATCCACTGAG
IbU6-3-R1:CTAGGAAAGACCGGAGAATGG
IbU6-3-F2:TGTCCTATTTAAGGGTTTCAACGCA
IbU6-3-R2:TCGGAGAAGCAGGGTTTGGGTG
IbU6-3-F3:AGATCAGCAAATACGTTAGA
IbU6-3-R3:GTTCTTCTTCTTCAATGGCG
(2)使用高保真Prime Star酶在50μl反应体系中进行3轮PCR扩增，针对IbU6.1启动子，第1轮利用IbU6-1-F1和IbU6-1-R1引物对以川薯228叶片DNA为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为1447bp的第1轮PCR产物；第2轮利用IbU6-1-F2和IbU6-1-R2引物对以第1轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为961bp的第2轮PCR产物；第3轮利用IbU6-1-F3和IbU6-1-R3引物对以第2轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为436bp的第3轮PCR产物；针对IbU6.3启动子，第1轮利用IbU6-3-F1和IbU6-3-R1引物对以川薯228叶片DNA为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为1671bp的第1轮PCR产物；第2轮利用IbU6-3-F2和IbU6-3-R2引物对以第1轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为910bp的第2轮PCR产物；第3轮利用IbU6-3-F3和IbU6-3-R3引物对以第2轮的纯化产物为模板进行PCR扩增，回收纯化大小为410bp的第3轮PCR产物；
(3)将步骤(2)中得到的IbU6.1与IbU6.3启动子的第3轮PCR扩增产物分别克隆到
Figure FDA0003699923760000021
-Blunt Zero Cloning载体上，转化大肠杆菌DH5α中并挑取单克隆测序，即得436bp的甘薯IbU6.1启动子的DNA片段和410bp的甘薯IbU6.3启动子的DNA片段。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/min，循环数34个，72℃终延伸7min。
7.一种构建含权利要求1所述的甘薯U6基因启动子的甘薯基因敲除编辑载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将克隆的启动子IbU6.1与IbU6.3分别构建到载体35S-ATU6-Hyg上
用Hind III-HF和XbaI双酶切35S-ATU6-Hyg载体，将拟南芥U6启动子ATU6切下，回收载体骨架片段；
设计用于同源重组克隆的含同源臂的引物：
IbU6.1-F:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAATATTCTATGTAATACTCC
IbU6.1-R:CTAAAACAGAGACCGTCTAGATGGTCTCAGCATGTGCTTCCATGG
CGG；
IbU6.3-F:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGATCAGCAAATACGTTAGA
IbU6.3-R:CTAAAACAGAGACCGTCTAGATGGTCTCGTTCTTCTTCTTCAATGGCG；
利用含同源臂的引物对IbU6.1-F和IbU6.1-R，以启动子IbU6.1为模板，PCR扩增获得两端含同源臂的IbU6.1启动子DNA片段，另外利用含同源臂的引物对IbU6.3-F和IbU6.3-R，以启动子IbU6.3为模板，PCR扩增获得两端含同源臂的IbU6.3启动子DNA片段，用
Figure FDA0003699923760000031
II重组酶将这两个片段分别同源重组到线性化的35S-ATU6-Hyg载体上得到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg；
(2)将靶位点构建到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体上
在甘薯IbLCY基因上选择如下靶位点：GCTCTGAACTTCTCTGCAA，针对35S-IbU6.1-Hyg载体，在靶序列两端加上接头序列，设计的靶位点克隆引物如下：
LCY-TF1：ATGCTGGCTCTGAACTTCTCTGCAA
LCY-TR1：AAACTTGCAGAGAAGTTCAGAGCCA
针对35S-IbU6.3-Hyg载体，在靶序列两端加上接头序列，设计的靶位点克隆引物如下：
LCY-TF3：AGAACGGCTCTGAACTTCTCTGCAA
LCY-TR3：AAACTTGCAGAGAAGTTCAGAGCCG
分别将上述LCY-TF1和LCY-TR1，LCY-TF3和LCY-TR3靶点引物混匀，用PCR仪96℃处理3分钟后0.1℃/s降温至16℃退火，形成带有与载体互补粘性末端的双链退火产物，同时用Bsa I分别酶切35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体，然后使用T4 DNA连接酶将靶点片段分别连接到35S-IbU6.1-Hyg与35S-IbU6.3-Hyg载体上，最终得到35S-IbU6.1-Hyg-LCYKO与35S-IbU6.3-Hyg-LCYKO的基因敲除载体。
8.一种对甘薯进行基因组编辑的方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述的甘薯基因编辑载体导入甘薯胚性愈伤组织的步骤。
9.权利要求1所述的甘薯U6基因启动子在甘薯分子育种技术领域中的应用。
10.权利要求4所述的甘薯基因编辑载体35S-IbU6.1-Hyg或35S-IbU6.3-Hyg在甘薯分子育种技术领域中的应用。
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