CN115960899A - 茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用。本发明首次成功克隆了茶树内源CsU6基因启动子，并成功构建了茶树CsU6基因启动子转录活性检测载体，通过瞬时转化烟草叶片、GUS染色和GUS酶活测定，比较了八种CsU6启动子的转录活性，选择转录活性最强的CsU6i和CsU6j启动子用于茶树基因编辑载体构建，在茶树原生质体中验证了这两种启动子应用于茶树CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并实现了CRISPR/Cas9介导的茶树基因组靶向编辑。因此，茶树U6基因启动子克隆及启动子活性的表达分析，为研究与茶树及近缘植物的转化研究提供了高效的启动子序列，也可以实现对茶树高效精准的种质创新与品种遗传改良。

Description

茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物工程技术领域，具体涉及茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是一种多年生经济作物，茶树的新梢可以制成茶叶，为人体提供多种有益营养，包括黄酮、茶氨酸和生物碱等，被超过三分之二的世界人口饮用，茶叶已经成为世界上最受欢迎的健康、无酒精、消耗量仅次于水的饮料。茶树具有基因组大、杂合度高和物种多样性高等特点，广泛存在于茶树种内、种间的杂交不亲和性严重限制了茶树杂交育种中亲本的自由选配及优异基因在育种中的利用，成为限制茶树育种发展的瓶颈。目前茶树新材料的创制和新品种的选育主要是通过常规杂交、辐射诱变等育种方法，这些育种方法具有选育时间长、效率低、程序复杂等特征，因此迫切需要高效的技术手段来对茶树进行遗传改良。

基因编辑主要是利用序列特异核酸酶在特定基因位点产生DNA双链断裂，从而激活细胞自身修复机制——非同源末端连接或同源重组来实现基因的敲除、定点插入、替换和染色体重组等，最终实现基因组序列的改变。基因编辑技术已经在动物、植物和其它生物中得到了成功的应用，并在主要粮食及经济作物的精准育种方面发挥了重要的作用，在提高作物产量、品质和抗性等方面具有良好的应用前景。现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶系统、类转录激活因子效应物核酸酶系统和CRISPR/Cas系统等。其中CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点，成为当前广泛应用的基因编辑系统。目前主要使用的CRISPR/Cas基因编辑体系主要包括CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统等。CRISPR/Cas9系统由gRNA(guide RNA)和Cas9核酸内切酶构成，gRNA通过和靶序列的碱基配对结合到目标DNA上，同时招募Cas9蛋白，Cas9蛋白与gRNA结合并识别靶序列下游的PAM(protospacer adjacent motifs)位点，在PAM上游约3bp处切割DNA双链，形成DNA双链断裂，继而引发生物体内源性的DNA双链断裂修复。在DNA双链修复过程中会在双链断裂的位置引起若干碱基的插入或者缺失从而造成DNA靶位点的基因编辑。

在基因编辑系统中，gRNA的表达由RNA聚合酶III型启动子U3或U6驱动，目前在许多物种中已经克隆出了U3、U6启动子，但是对茶树中的CsU3、CsU6启动子的研究仍然缺乏。虽然U3、U6启动子已在多个物种的基因编辑中成功运用，但同一启动子在同源关系较远的物种间并不一定适用，且同一物种基因中常存在多个U3或U6启动子，其活性及转录效率存在一定差异。因此克隆茶树内源CsU3、CsU6启动子，并筛选出转录活性高的CsU3、CsU6启动子，有利于CRISPR/Cas基因编辑系统的完善以及该技术在茶树遗传育种中的应用，对于茶树的育种技术发展具有重要的作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于涉及提供一种茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用的技术方案。

为了实现以上目的，本申请具体采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了茶树CsU6基因启动子，其包括启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j，所述CsU6a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CsU6b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CsU6c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CsU6e的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CsU6g的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CsU6h的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CsU6i的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CsU6j的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。

本发明第二方面提供了一种克隆上述茶树CsU6基因启动子的方法，其包含以下步骤：

(1)以茶树品种‘龙井43’叶片基因组DNA为模板，针对每个CsU6基因启动子设计特异引物；

(2)使用高保真酶2×Phanta Max Master Mix在50μL体系中进行PCR反应，PCR扩增的反应体系为：1μL模板DNA50-400ng，2μL上游引物10μM，2μL下游引物10μM，25μL 2×Phanta Max Master Mix，20μL ddH₂O；

PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，70℃终延伸5min；

(3)将扩增产物通过BP反应克隆到pDONR221载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆测序，即分别获取包含茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j序列的pDONR221载体。

进一步，针对启动子CsU6a的引物为CsU6a-attB1和CsU6a-attB2，所述CsU6a-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CsU6a-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；针对启动子CsU6b的引物为CsU6b-attB1和CsU6b-attB2，所述CsU6b-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，CsU6b-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；针对启动子CsU6c的引物为CsU6c-attB1和CsU6c-attB2，所述CsU6c-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，CsU6c-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；针对启动子CsU6e的引物为CsU6e-attB1和CsU6e-attB2，所述CsU6e-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，CsU6e-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；针对启动子CsU6g的引物为CsU6g-attB1和CsU6g-attB2，所述CsU6g-attB1的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，CsU6g-attB2的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示；针对启动子CsU6h的引物为CsU6h-attB1和CsU6h-attB2，所述CsU6h-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，CsU6h-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；针对启动子CsU6i的引物为CsU6i-attB1和CsU6i-attB2，所述CsU6i-attB1的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，CsU6i-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；针对启动子CsU6j的引物为CsU6j-attB1和CsU6j-attB2，所述CsU6j-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，CsU6j-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

本发明第三方面提供了一种对上述茶树CsU6基因启动子的转录活性检测的方法，其包含以下步骤：

(1)基于权利要求3的方法得到茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j序列的pDONR221载体；

(2)步骤(1)中的八种CsU6-pDONR221载体分别通过LR反应连接到pMDC162载体上，转化大肠杆菌菌株DH5α，挑取单克隆测序，最终获取CsU6a-pMDC162、CsU6b-pMDC162、CsU6c-pMDC162、CsU6e-pMDC162、CsU6g-pMDC162、CsU6h-pMDC162、CsU6i-pMDC162和CsU6j-pMDC162八种启动子的转录活性检测载体；

(3)将得到的八种启动子转录活性检测载体分别转化烟草，通过GUS染色和GUS定量检测来确定八种CsU6启动子的转录活性。

本发明第四方面提供了一种茶树基因编辑载体，其含有上述茶树CsU6i和CsU6j基因启动子。

进一步，所述树基因编辑载体为重组质粒pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-T2sgRNA-CsU6i-CsMYB73。

本发明第五方面提供了一种构建上述茶树基因编辑载体的方法，其将权利要求1所述茶树CsU6i和CsU6j基因启动子驱动gRNA表达。

本发明第六方面提供了一种对茶树进行基因组编辑的方法，其包括将上述茶树基因编辑载体导入茶树原生质体中。

本发明第七方面提供了上述茶树CsU6基因启动子在茶树分子育种技术领域中的应用。

本发明第八方面提供了上述茶树基因编辑载体在茶树分子育种技术领域中的应用。

本发明具有如下有益效果：将转录活性最高的两个CsU6启动子CsU6i和CsU6j构建到基因编辑载体中，获得茶树内源U6基因启动子驱动gRNA转录的基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-T2sgRNA-CsU6i-CsMYB73，在茶树原生质体中验证了这两种启动子应用于茶树CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并实现了CRISPR/Cas9介导的茶树基因组靶向编辑。因此，本发明克隆的茶树CsU6基因启动子可应用于茶树基因编辑体系，从而实现对茶树高效精准的种质创新与品种遗传改良。

附图说明

图1为茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j与拟南芥AtU6启动子序列比对，其中，灰色框线位置分别为U6snRNA转录的关键元件USE(Upstream Sequence Element)、TATA-likeBox和转录起始位点G，横线标注位置为U6snRNA序列。

图2为茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j的克隆电泳图。

图3为茶树CsU6基因启动子驱动GUS表达情况。(A)CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j驱动GUS表达染色情况。(B)CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j驱动GUS表达的GUS活性定量检测情况。CK是使用农杆菌GV3101瞬时侵染的对照组。星号代表生物学显著性，**代表和CK比较，P<0.01，*代表和CK比较，P<0.05。

图4为茶树基因编辑载体结构示意图。(A)pPUC19/Cas9P_35S载体结构示意图，(B)pPUC19/Cas9P₃₅-sgRNA scaffold-Terminator载体结构示意图，(C)pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-T2sgRNA-CsU6i-CsMYB73载体结构示意图。

图5在茶树原生质体中检测CsU6启动子对茶树基因CsMYB73的基因编辑情况。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例和说明书附图来对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员应当了解，下述具体实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都属于本发明的保护范围之内。若无特殊说明，实施例均按照常规实验方法或依据生产厂商说明书进行。以下实施例中pDONR^TM221为常用克隆载体，可市购；PMDC162为常用GUS表达载体，可市购；烟草野生型品种为本塞姆氏烟草；大肠杆菌菌株DH5α和农杆菌菌株GV3101是常用菌株，多数分子生物学实验室均有保存。

以下实施例中的主要试剂是：

高保真酶2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，购自于Vazyme公司；BP、LR反应试剂盒购自于ThermoFisher Scientific公司；质粒提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自于Axygen公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自Solarbio公司；X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)和MUG(4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸)购自于COOLABER公司；琼脂糖、卡那霉素、利福平等，购自于Sigma-Aldrich公司。实施例中使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂，均可从商业途径得到。

实施例中需要合成的引物和需要测序的载体均由杭州有康生物科技有限公司提供服务完成。

实施例1：茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6d、CsU6e、CsU6f、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j的获得

具体操作如下：

(1)根据U6 snRNA序列在不同物种间的保守性，利用拟南芥AtU6-26启动子的snRNA序列

(GTCCCTTAGGGGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCATAAATCGAGAAATGGTCCAAATTTTT)在NCBI中与茶树组序列进行BLAST比对，选择同源性高于98％的基因作为茶树CsU6的候选基因，比对结果显示发现茶树基因组含有10个拷贝的U6基因，利用Plant CARE在线分析网站(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对这些U6基因的启动子进行顺式元件分析，包括USE与TATA框等顺式元件,如图1所示。最终设计引物对这10个拷贝的CsU6启动子进行克隆。

(2)以茶树品种‘龙井43’叶片基因组DNA为模板，设计如下特异引物，小写序列为attB1和attB2接头序列：

针对启动子CsU6a的引物为：

CsU6a-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTCTCTATTTCTCTCAACTTAAATTA

CsU6a-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCTTTC

针对启动子CsU6b的引物为：

CsU6b-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTATCATAATTAAAAAAATAATCATA

CsU6b-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCTTTC

针对启动子CsU6c的引物为：

CsU6c-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccCCTTGATGTTGATGATTTCTTG

CsU6c-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcACTATGTTTTCTTTCACTCGTT

针对启动子CsU6d的引物为：

CsU3d-attB1：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccACAGATTCCAAATCCACTTACA

CsU3d-attB2：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCATGCCTTTATTTCCTCTTCTA

针对启动子CsU6e的引物为：

CsU6e-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTATCATAATTAAAAAAATAATCAT

CsU6e-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCT

针对启动子CsU6f的引物为：

CsU6f-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTTTTATAGTAATATTTAGATAGGC

CsU6f-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTATTCTCTTTTCTTCT

针对启动子CsU6g的引物为：

CsU6g-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTTTCTCTCTATTTCTCTCAACT

CsU6g-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCT

针对启动子CsU6h的引物为：

CsU6h-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGTTTATTTTAACATTTTGATTT

CsU6h-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAATGTCTTCTCTTTTCTTCTT

针对启动子CsU6i的引物为：

CsU6i-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccCTATGTTTGTTTTAACAATTTGG

CsU6i-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAATGTCTTCTCTTTTCTTCT

针对启动子CsU6j的引物为：

CsU6j-attB1:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTCTTTTTCTCGATCATCCCT

CsU6j-attB2:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcACTATGTTTTCTTTCACTCG

(3)使用高保真酶2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)在50μL体系中进行PCR反应，PCR扩增的反应体系为：1μL模板DNA(50-400ng)，2μL上游引物(10μM)，2μL下游引物(10μM)，25μL 2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，20μL ddH2O。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，70℃终延伸5min。除了CsU6d和CsU6f没有扩增出条带，其余8个CsU6启动子均扩出预期大小条带，如图2所示。

(4)将扩增产物通过BP反应克隆到pDONR221载体上，转化大肠杆菌菌株DH5α，挑取单克隆测序，即分别获取茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j。所述启动子CsU6a对应核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CsU6b对应核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CsU6c对应核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CsU6e对应核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CsU6g对应核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CsU6h对应核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CsU6i对应核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CsU6j对应核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

实施例2：茶树CsU6基因启动子转录活性检测

具体操作如下：

(1)茶树CsU6基因启动子转录活性检测载体的构建：

将实施例1里获得的8种CsU6-pDONR221质粒通过LR反应连接到pMDC162载体上，转化大肠杆菌菌株DH5α，挑取单克隆测序，最终获取CsU6a-pMDC162、CsU6b-pMDC162、CsU6c-pMDC162、CsU6e-pMDC162、CsU6g-pMDC162、CsU6h-pMDC162、CsU6i-pMDC162和CsU6j-pMDC162八种启动子转录活性检测载体。

(2)茶树CsU6基因启动子农杆菌转化验证：

将构建好的八种CsU6启动子转录活性检测载体分别转化到农杆菌菌株GV3101，通过农杆菌介导的方法注射烟草进行瞬时表达，使用的烟草生长大小为20-30天。培养3天后取烟草叶片进行GUS染色，脱色后观察叶片染色情况，以未转化的农杆菌菌株GV3101做对照，结果显示克隆出的八个CsU6启动子均具有转录活性，染色情况如图3A所示。同时取注射过的叶片研磨后提取GUS蛋白，测定其蛋白浓度和酶活性，结果显示CsUi和CsUj转录活性最高，结果如图3B所示。

实施例3：茶树CsU6i和CsU6j启动子基因编辑重组载体的构建

具体操作如下：

(1)PUC19-Cas9载体的构建：

在NEB Builder网站上设计用于扩增Cas9p序列的引物，引物序列如下：

Cas9p-F：gggacgagctcggtacccgggatccCCTAAGAAGAAGCGGAAG

Cas9p-R：atacgaacgaaagctctgcagCTACTTCTTTTTCTTAGCCTG

以pYLCRISPR_Cas9Pubi-H质粒为模板，PCR扩增获得Cas9p序列，使用BamHI和PstI酶切pUC19-nLUC载体，切掉Linker+nLUC序列，通过无缝克隆的方法连入Cas9p序列。构建好的载体为pPUC19/Cas9P_35S，载体结构示意图如图4A所示。接着设计扩增gRNA scaffold序列的引物，引物序列如下：

gRNA Scaffold+T-F2：

agattgtactgagagtgcacGCATGCCCTAGGACTAGTAGGCCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

gRNA Scaffold+T-R：

gtgcggtatttcacaccgcatatgACGCGTTCCTTTGCTGCC

以pYLsgRNA-AtU3b质粒为模板，PCR扩增获得gRNA scaffold序列，使用NdeI酶切pUC19-Cas9载体，通过无缝克隆的方法连入gRNAscaffold和terminator序列，同时在gRNAscaffold的左端引入SphI、AvrII、SpeI和StuI酶切位点，并在gRNA scaffold右端引物引入MluI、NdeI酶切位点，构建好的载体为pPUC19/Cas9P_35S-sgRNA-scaffold-Terminator，载体结构示意图如图4B所示。

(2)基因编辑靶基因的选择和靶点的设计：

选择茶树中负调控茶氨酸合成的一个转录因子CsMYB73基因作为靶基因，并在其两个结构域上分别设计了靶位点。靶点设计在CRISPR-GE网站(http://skl.scau.edu.cn/)上进行。选择的靶点序列如下：

gRNA1：CCGTAACCGGCACGATTTCCCGG(162-143，-)

gRNA2：TGAGAAACAGTTCTTCAGCCAGG(720-739，+)

(3)CsMYB73基因编辑载体的构建：

选择CsU6中转录活性最强的CsU6i和CsU6j启动子，使用诺唯赞官网引物设计软件CE Design(http://www.vazyme.com)设计扩增CsU6j+gRNA1引物，引物两端需带上载体的同源序列，引物序列如下：

CsU6j+sgRNA1-F：cacgcatgccctaggactagtTCTTTTTCTCGATCATCCCTGG

CsU6j+sgRNA1-R：ctctaaaacaggcctactagtGGAAATCGTGCCGGTTACGGACTATGTTTTCTTTCACTCGTTCTTATAAA

以CsU6j-pDONR221质粒为模板，利用引物组合CsU6j+sgRNA1-F和CsU6j+sgRNA1-R，PCR扩增获得CsU6j+gRNA1序列。使用SpeI酶切线性化pPUC19/Cas9P_35S-sgRNA-scaffold-Terminator载体，通过无缝克隆连入CsU6j+sgRNA1序列，构建好的载体为：

pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-CsMYB73。

通过诺唯赞官网引物设计软件CE Design(http://www.vazyme.com)设计再次扩增gRNA scaffold序列的引物，引物两端需带上载体的同源序列，引物序列如下：

gRNA scaffold+T-F：

agagtgcacgcatgccctaggGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA

CsU6i-gRNA scaffold+T-R：

agaaaaagaactagtcctaggTCCTTTGCTGCCGATTCCA

以pYLsgRNA-AtU3b质粒为模板，利用引物组合gRNA scaffold+T-F和CsU6i-gRNAscaffold+T-R，PCR扩增获得gRNA scaffold序列。使用AvrII酶切线性化pYLCRISPR/Cas9P35S-T1sgRNA-CsU6j-CsMYB73载体，通过无缝克隆连入第二个gRNA scaffold序列，构建好的载体为pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-gRNA scaffold-CsMYB73。

通过NEB Builder网站设计扩增CsU6i+gRNA2序列的引物，引物两端需带上载体的同源序列，引物序列如下：

CsU6i+sgRNA2-F：

gtactgagagtgcacgcatgcctatgtttgttttaacaatttgg

CsU6i+sgRNA2-R：

tctagctctaaaaccctaggggctgaagaactgtttctcaaatgtcttctcttttcttct

以CsU6i-pDONR221质粒为模板，利用引物组合CsU6i+sgRNA2-F和CsU6i+sgRNA2-R，PCR扩增获得CsU6i+gRNA2序列。使用SphI酶切载体pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-gRNA scaffold-CsMYB73，通过无缝克隆连入CsU6i+gRNA2序列，构建好的基因编辑载体为pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-T2sgRNA-CsU6i-CsMYB73，载体结构示意图如图4C所示。

(4)CsMYB73基因编辑检测：

参照拟南芥原生质体提取的方法从茶树品种‘龙井43’中提取原生质体，利用PEG法将构建好的pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-T2sgRNA-CsU6i-CsMYB73载体转化茶树原生质体。为了检测基因编辑情况，通过CTAB法从原生质体中提取基因组DNA，接着以转化后的原生质体基因组DNA为模板扩增出CsMYB73基因，连接到Blunt-zero载体，转化大肠杆菌菌株DH5α，挑取单克隆测序，发现靶点1上有一处碱基C突变为碱基T，结果如图5所示。

可见，本发明在茶树中获得了茶树U6 snRNA基因的RNA聚合酶Ⅲ型启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j,被验证具有转录活性，且能够启动sgRNA转录，并首次实现了将茶树内源CsU6启动子应用于CRISPR/Cas9系统。因此，本发明所述启动子可应用于茶树基因编辑体系，从而实现对茶树高效精准的新种质创制与品种改良。

本申请涉及的序列如下：

SEQ ID NO.1茶树CsU6a基因启动子核苷酸序列

TCTCTATTTCTCTCAACTTAAATTATCCAAACAATTAAAAAAATATCTCTTCGTTTTTTTTATTTTTCACTCCAAAACACCCAATCCAAACATAGCGTTAATTTCTAATCTGTGGAGGGCAGATTCAATTCGACCAATGAAGAATCAATAGACAAACACCACACCTATATACATACATACACAGAGAGGGAGAGAGAGAGAAAAAGTATACATACAGGTGATGGCTACGATTCGATGGAGCCTGAGATGTGTCTGTTGGAATTCACGAAGATGGAAGCAGACACCACCATAAAGTCAGTCTGATTGATGTCGTCCCAGTCCCACATCGAAACTTCGACGTTATAGACATGGAGTTTATAAGAAAGAAGAAAAGAGAAGACGTT

SEQ ID NO.2茶树CsU6b基因启动子核苷酸序列

TATCATAATTAAAAAAATAATCATAATTAAAAAAAAAATAACATAACTAAAACTACATGACGTGTCTATAATAGAATTCTCTTAATTTCTAATATCTGGAGGGCAGATCAATTCGACCAATGAAGAATCAATAGACAAACACCATACCTATATACATACATACAGAGACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAAAGTATACATACAGCTGATGGCTACGATTCGATGGAGCCTGAGATGTGTCTGTTGGAATTCACGAAGATGGAAGCAGACACCACCATAAAGTCAGTCTGATTGATGTCGTCCCAGTCCCACATCGAAACTTCGACGTTATAGACATGGAGTTTATAAGAAAGAAGAAAAGAGAAGACGTT

SEQ ID NO.3茶树CsU6c基因启动子核苷酸序列

CCTTGATGTTGATGATTTCTTGAAGCGAAGGCTCTTTTTCTCGATCATCCCTGGCGTCTGGTGTCGGTGGACGATTCACTGAATGCCTCCTATTTTCAACATCACAATCACACAAAATTAAACCAATACATACAAAATCAAAAACCCAATAACAGAATCAGCAATTACCAAGAAGATCGTCTCTAATCTCAGGAAGAGAGAGAGAGAGAGAGTATTTACATACATGTGATGGTTACGATTCGATGGAGCCTGAGATGGGTCTATGTTGGAGTTCACGAAGAGCGAGCACAGAACATATATATAGTTCTGAGTTTAGCTTCAAAACGGCGTCGTGTCAGTTGTCAGACTGATTGATTTAGTCCCACATCGAAACTTTAACGTTGTATAGTTGGGGTTTATAAGAACGAGTGAAAGAAAACATAGT

SEQ ID NO.4茶树CsU6e基因启动子核苷酸序列

TATCATAATTAAAAAAATAATCATAATTAAAAAAAAAATAACATAACTAAAACTACATGACGTGTCTATAATAGAATTCTCTTAATTTCTAATATCTGGAGGGCAGATCAATTCGACCAATGAAGAATCAATAGACAAACACCATACCTATATACATACATACAGAGACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAAAGTATACATACAGCTGATGGCTACGATTCGATGGAGCCTGAGATGTGTCTGTTGGAATTCACGAAGATGGAAGCAGACACCACCATAAAGTCAGTCTGATTGATGTCGTCCCAGTCCCACATCGAAACTTCGACGTTATAGACATGGAGTTTATAAGAAAGAAGAAAAGAGAAGACGTT

SEQ ID NO.5茶树CsU6g基因启动子核苷酸序列

TTTCTCTCTATTTCTCTCAACTTAAATTATCCAAACAATTAAAAAAATATCTCTTCGTTTTTTTTATTTTTCACTCCAAAACACCCAATCCAAACATAGCGTTAATTTCTAATCTGTGGAGGGCAGATTCAATTCGACCAATGAAGAATCAATAGACAAACACCACACCTATATACATACATACACAGAGAGGGAGAGAGAGAGAAAAAGTATACATACAGGTGATGGCTACGATTCGATGGAGCCTGAGATGTGTCTGTTGGAATTCACGAAGATGGAAGCAGACACCACCATAAAGTCAGTCTGATTGATGTCGTCCCAGTCCCACATCGAAACTTCGACGTTATAGACATGGAGTTTATAAGAAAGAAGAAAAGAGAAGACGTT

SEQ ID NO.6茶树CsU6h基因启动子核苷酸序列

ATGTTTATTTTAACATTTTGATTTAGGATTATTAATCTAATAGATAATTAATCCAACAAAGTTAAAATTATTAGTAATAGTATAGAAGTGAAATTATTAATCTAATAAATATTAATCCAATTAAATAGTGAATACTATACTAATTTAATAAAATTATTAATATTTCGCCATTAATTTTTTGAATCAAACATGAACACAGAGTATACATACAGGTGATGGCTACGATTCGATGGAGCCTGAGATCTGGCTGTTGGAATTCACGAAGATGGAAGCAGACACCACCATAAAGTCAGTCTGATCGATGTCGTCACAGTCCCACATCGAAACTTCGACGTTATAGACATGGAGTTTATAAGAAAGAAGAAAAGAGAAGACATT

SEQ ID NO.7茶树CsU6i基因启动子核苷酸序列

CTATGTTTGTTTTAACAATTTGGTTTAAAATTATTAATCCAATAGATAATTAATCCGACAAATTTATAGAATTATTAATAATAGGATAAAAATAAAATTATTAATCTAATAAATATTAATTCAATTAAATAGTAAATAATATGTTAATGTAAAATTATTAATACTTCACTATTAATGTTTTTGAATCAAACATGAACACAGAGTATACATACGGGTGATGGCTACGATTCGATAGAGGCTGAGATCTGGCTGTTGAATTCACGAAGATGGAAGCAGACACCACCATAAAGTCAGTCTGATCGATGTCGTCACAGTCCCACATCGAAACTTCGACGTTATAGACATGGAGTTTATAAGAAAGAAGAAAAGAGAAGACATT

SEQ ID NO.8茶树CsU6j基因启动子核苷酸序列

TCTTTTTCTCGATCATCCCTGGCGTCTGGTGTCGGTGGACGATTCACTGAATGCCTCCTATTTTCAACATCACAATCACACAAAATTAAACCAATACATACAAAATCAAAAACCCAATAACAGAATCAGCAATTACCAAGAAGATCGTCTCTAATCTCAGGAAGAGAGAGAGAGAGAGAGTATTTACATACATGTGATGGTTACGATTCGATGGAGCCTGAGATGGGTCTATGTTGGAGTTCACGAAGAGCGAGCACAGAACATATATATAGTTCTGAGTTTAGCTTCAAAACGGCGTCGTGTCAGTTGTCAGACTGATTGATTTAGTCCCACATCGAAACTTTAACGTTGTATAGTTGGGGTTTATAAGAACGAGTGAAAGAAAACATAGT

SEQ ID NO.9CsU6a-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTCTCTATTTCTCTCAACTTAAATTA

SEQ ID NO.10CsU6a-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCTTTC

SEQ ID NO.11CsU6b-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTATCATAATTAAAAAAATAATCATA

SEQ ID NO.12CsU6b-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCTTTC

SEQ ID NO.13CsU6c-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccCCTTGATGTTGATGATTTCTTG

SEQ ID NO.14CsU6c-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcACTATGTTTTCTTTCACTCGTT

SEQ ID NO.15CsU6e-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTATCATAATTAAAAAAATAATCAT

SEQ ID NO.16CsU6e-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCT

SEQ ID NO.17CsU6g-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTTTCTCTCTATTTCTCTCAACT

SEQ ID NO.18CsU6g-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACGTCTTCTCTTTTCTTCT

SEQ ID NO.19CsU6h-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGTTTATTTTAACATTTTGATTT

SEQ ID NO.20CsU6h-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAATGTCTTCTCTTTTCTTCTT

SEQ ID NO.21CsU6i-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccCTATGTTTGTTTTAACAATTTGG

SEQ ID NO.22CsU6i-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAATGTCTTCTCTTTTCTTCT

SEQ ID NO.23CsU6j-attB1的核苷酸序列

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccTCTTTTTCTCGATCATCCCT

SEQ ID NO.24CsU6j-attB2的核苷酸序列

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcACTATGTTTTCTTTCACTCG

Claims (10)

1.茶树CsU6基因启动子，其特征在于包括启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j，所述CsU6a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CsU6b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CsU6c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CsU6e的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，CsU6g的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CsU6h的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CsU6i的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CsU6j的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种克隆权利要求1所述茶树CsU6基因启动子的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)以茶树品种‘龙井43’叶片基因组DNA为模板，针对每个CsU6基因启动子设计特异引物；

(2)使用高保真酶2×Phanta Max Master Mix在50μL体系中进行PCR反应，PCR扩增的反应体系为：1μL模板DNA50-400ng，2μL上游引物10μM，2μL下游引物10μM，25μL 2×PhantaMax Master Mix，20μL ddH₂O；

PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，70℃终延伸5min；

(3)将扩增产物通过BP反应克隆到pDONR221载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆测序，即分别获取包含茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j序列的pDONR221载体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，针对启动子CsU6a的引物为CsU6a-attB1和CsU6a-attB2，所述CsU6a-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CsU6a-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；针对启动子CsU6b的引物为CsU6b-attB1和CsU6b-attB2，所述CsU6b-attB1的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，CsU6b-attB2的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；针对启动子CsU6c的引物为CsU6c-attB1和CsU6c-attB2，所述CsU6c-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，CsU6c-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；针对启动子CsU6e的引物为CsU6e-attB1和CsU6e-attB2，所述CsU6e-attB1的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，CsU6e-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；针对启动子CsU6g的引物为CsU6g-attB1和CsU6g-attB2，所述CsU6g-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，CsU6g-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；针对启动子CsU6h的引物为CsU6h-attB1和CsU6h-attB2，所述CsU6h-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，CsU6h-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；针对启动子CsU6i的引物为CsU6i-attB1和CsU6i-attB2，所述CsU6i-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，CsU6i-attB2的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示；针对启动子CsU6j的引物为CsU6j-attB1和CsU6j-attB2，所述CsU6j-attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，CsU6j-attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

4.一种对权利要求1所述茶树CsU6基因启动子的转录活性检测的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)基于权利要求3的方法得到茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j序列的pDONR221载体；

(2)步骤(1)中的八种CsU6-pDONR221载体分别通过LR反应连接到pMDC162载体上，转化大肠杆菌菌株DH5α，挑取单克隆测序，最终获取CsU6a-pMDC162、CsU6b-pMDC162、CsU6c-pMDC162、CsU6e-pMDC162、CsU6g-pMDC162、CsU6h-pMDC162、CsU6i-pMDC162和CsU6j-pMDC162八种启动子的转录活性检测载体；

(3)将得到的八种启动子转录活性检测载体分别转化烟草，通过GUS染色和GUS定量检测来确定八种CsU6启动子的转录活性。

5.一种茶树基因编辑载体，其特征在于，含有如权利要求1所述茶树CsU6i和CsU6j基因启动子。

6.如权利要求5所述一种茶树基因编辑载体，其特征在于，所述树基因编辑载体为重组质粒pYLCRISPR/Cas9P_35S-T1sgRNA-CsU6j-T2sgRNA-CsU6i-CsMYB73。

7.一种构建权利要求5所述茶树基因编辑载体的方法，其特征在于，将权利要求1所述茶树CsU6i和CsU6j基因启动子驱动gRNA表达。

8.一种对茶树进行基因组编辑的方法，其特征在于，包括将权利要求5或6所述茶树基因编辑载体导入茶树原生质体中。

9.如权利要求1所述茶树CsU6基因启动子在茶树分子育种技术领域中的应用。

10.如权利要求5或6所述一种茶树基因编辑载体在茶树分子育种技术领域中的应用。

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