CN114540354B - 含有榨菜ifl1启动子融合gus基因的表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有榨菜IFL1启动子融合GUS基因的表达载体及其应用。本发明涉及一种榨菜IFL1基因启动子，核苷酸序列为如SEQ ID NO.3所示的核酸序列；或由SEQ ID NO.3所示的核酸序列衍生的具有同等功能的序列。本发明还涉及榨菜IFL1基因启动子在驱动目的基因表达中的应用。本发明启动子可以驱动GUS基因在烟草中的表达，可作为体外研究榨菜基因表达的理论基础。本发明启动子序列位于IFL1基因上游，可启动IFL1基因的表达，同时在序列上存在多个激素和胁迫位点，可通过激素或胁迫处理调控IFL1基因表达，调控榨菜生长发育及维管束形成。本发明有利于对榨菜生长发育及维管束形成发育调控机制的深度研究，在榨菜遗传改良及分子育种上具有广阔的应用前景。

Description

含有榨菜IFL1启动子融合GUS基因的表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及含有榨菜IFL1启动子融合GUS基因的表达载体及其应用。

背景技术

维管束是维管植物适应陆地环境的进化产物，由初生木质部、形成层和初生靭皮部共同组成的束状结构。维管束相互连通，是植物体输导水分，无机盐及有机物质的输导系统，同时也对植物体起到支撑作用。维管束形成相关基因中，HD-Zip III是该领域最受研究者关注的基因之一。

HD-Zip III是植物特有的一类转录因子，属同源异型域(homeodomain, HD)转录因子超家族。在拟南芥中，HD-ZIP III转录因子包括5个基因，分别是ATHB14、ATHB9、IFL1、ATHB8和ATHB15。其中，IFL1可调控茎顶端分生组织和花分生组织的胚和胚后发育、生长素的极性运输、植物的形态发育以及植株维管组织形成。因此，研究榨菜中IFL1基因将有利于深入了解该基因在榨菜维管束形成过程中的作用。植物基因的表达受多种顺式作用元件和反式作用因子的协同调控。其中，启动子是一种重要的顺式作用元件，通常位于基因5’端上游，能与RNA聚合酶结合，启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件，对启动子的研究有助于了解基因的转录调控机制。

GUS（β-葡萄糖苷酸酶）基因存在于大肠杆菌等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，常用组织化学法进行检测，若组织细胞发生了gus基因的转化，GUS活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。

但是，目前关于将GUS基因与IFL1基因的启动子联合使用的情况还没有报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种含有榨菜IFL1启动子融合GUS基因的表达载体及其应用，以实现利用该基因研究榨菜维管束发育机制，并应用于榨菜品种分子改良。

本发明提供了一种可以驱动榨菜IFL1基因表达的启动子，其序列中含有植物激素等响应元件可以调控驱动IFL1基因表达的榨菜IFL1启动子。

为达到以上目的，本发明通过一下技术方案实现：

设计一种榨菜IFL1基因启动子，其核苷酸序列SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或与SEQ ID NO.3限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性、具有同等功能的核苷酸序列。

本发明设计一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体的启动子是核苷酸序列为SEQ ID NO.3的启动子。

进一步地，所述重组表达载体中含有GUS基因。

上述榨菜IFL1基因启动子可在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因优选为GUS基因。

上述榨菜IFL1基因启动子启动GUS 基因表达的方法，包括以下步骤：

（1）上述榨菜IFL1基因启动子作为唯一启动子插入含目的基因的表达载体，得到重组表达载体；

（2）将所得重组载体提取质粒，将获得重组质粒导入受体植物，在受体植物中由所述IFL1启动子启动所述重组质粒中GUS基因的表达。所述受体植物优选为双子叶植物，进一步的双子叶植物优选为烟草。

本发明进一步提供了一种在植物中表达外源基因的方法，采用上述重组表达载体，将外源目的基因导入该载体，转化植物，获得的转化植物可以表达外源基因。

本发明启动子可以驱动目的基因在植物中表达，能够作为基础研究的理论支撑。此外，本发明提供的启动子序列上包含激素和转录因子结合位点，有助于促进学者对榨菜生长发育和应答胁迫机理的研究，本发明在农业领域具有广阔的应用前景。

如上所述，本发明的含有榨菜IFL1启动子融合GUS基因的表达载体及其应用，具有以下有益效果：

1. 本发明构建的榨菜IFL1启动子融合GUS基因的植物表达载体，为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，且报告基因的表达不受其他基因表达产物的干扰，为进一步获得IFL1基因启动子过表达植株以及该基因的功能鉴定奠定基础。

2. IFL1 基因启动子可以驱动IFL1 基因的表达，利用转基因和GUS组织染色技术，有助于揭示IFL1 基因启动子驱动GUS基因强弱，从而间接了解IFL1基因的表达强弱；同时采用本发明所提供序列所含的乙烯（ERE）来调控IFL1基因表达强弱，进而调控榨菜代谢产物合成。本发明所构建的IFL1启动子融合GUS基因的植物表达载体可为通过调控启动子的转录活性来调节基因的表达提供理论依据。

附图说明

图1为植物表达载体pC1391-IFL1-Pro-GUS构建示意图；

图2为以榨菜‘永安小叶’基因组DNA为模板克隆IFL1基因启动子电泳图，其中1-4泳道1891bp处条带为IFL1基因启动子；

图3为榨菜IFL1基因启动子PCR产物回收纯化电泳图，其中1-2泳道1891bp处条带为IFL1基因启动子PCR回收纯化产物；

图4为以表达载体pC1391-IFL1-Pro-GUS(重组质粒)为模板的菌落PCR电泳图，其中，1—12泳道2316bp处有目的条带表示为阳性克隆；

图5为以阳性pC1391-IFL1-Pro-GUS(重组质粒)为模板的IFL1基因启动子电泳图，其中1泳道1891bp处条带为IFL1基因启动子；

图6为以阳性pC1391-IFL1-Pro-GUS(重组质粒)为模板的GUS基因电泳图，其中1-2泳道505bp处条带为GUS基因；

图7为克隆的榨菜‘永安小叶’IFL1基因启动子序列中的核心作用元件的分析结果；

图8为重组表达载体pC1391-IFL1-Pro-GUS转化农杆菌后质粒PCR电泳图；

图9为重组表达载体pC1391-IFL1-Pro-GUS侵染烟草K326遗传转化过程图，其中A为共培养的外植体，B为筛选培养基上生出的抗性芽，C为抗性分化苗的生根图，D为移入泥炭土的阳性苗；

图10为转基因烟草的PCR鉴定图，其中，1-7泳道2316bp处有条带即为阳性植株；

图11为榨菜IFL1启动子转化烟草叶片的GUS染色效果。其中左图为转基因阳性苗染色图，右图为野生型烟草K326染色图。

具体实施方式

本文中，术语“ 启动子”是指能够结合RNA聚合酶并且启动与其可操作连接的一个或多个核酸编码序列(例如目的基因)的转录的核酸序列。启动子通常位于同一链上的基因的转录起始位点附近和核苷酸编码序列的上游(有义链中的5 ')。启动子可以单独发挥功能以调节转录或可以通过一个或多个调节序列(例如增强子或沉默子)进一步调节。

本文中，“ 载体”是指可以接受多核苷酸插入或克隆的多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点，并且可以能够在确定的宿主细胞中自主复制，或者可以整合在确定的宿主的基因组内，使得克隆的序列是可复制的。载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

植物材料：榨菜品种‘永安小叶’，烟草K326

实施例1榨菜IFL1启动子序列的扩增与纯化

1. 榨菜DNA的提取

用CTAB法提取榨菜基因组DNA，具体方法如下：

1)取一元硬币大小新鲜叶片（约0.05-0.1 g），于液氮中充分研磨，迅速转移到无菌1.5 ml离心管中；

2)将提前加入巯基乙醇的2%CTAB缓冲液（体积比1:250）置于水浴锅中65 ℃预热30 min，取 500μl加入步骤1)的1.5 ml离心管中，于65 ℃水浴45 min，期间每隔10 min颠倒1次；

3)于步骤2）的离心管中加500 μl氯仿/异戊醇（24：1）,轻轻颠倒几次，于4 ℃冷冻离心机10000 rmp/min离心15 min；

4)吸取步骤3）离心管中上清液400μl于新的无菌1.5 ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），颠倒几次，于4 ℃冷冻离心机10000 rmp/min离心10 min；

5)吸取步骤4）中上清液于新的无菌1.5 ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20 ℃预冷）颠倒混匀，于-20 ℃下静置30 min后 4 ℃冷冻离心机10000 rmp/min离心10min,轻轻倒掉上清液，将离心管倒置于滤纸上将多余液体吸去；

6)向步骤5）中离心管加入350μl无菌水，手指轻弹，大部分沉淀溶解时 4 ℃冷冻离心机10000 rmp/min离心10 min，吸取300 μl上清于新的无菌1.5 ml离心管中；

7)向步骤6）中离心管加入1/10体积 的3M NaAc，混匀后加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于-20℃静置30min；

8)将步骤7）中离心管于 4 ℃冷冻离心机10000 rmp/min离心15 min,弃上清；

9)向步骤8）中离心管加入70%乙醇350μl，轻轻颠倒洗涤DNA，4 ℃冷冻离心机10000 rmp/min离心5min,弃掉上清，重复2次；

10)将步骤9）中的离心管置于超净工作台上风干DNA，之后加50μl无菌超纯水溶解DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20℃冰箱保存。

2.利用Primer Premier 5.0软件设计榨菜IFL1基因启动子扩增引物：

1391PRO-IFL1-F（SEQ ID NO.1）5 '- TGTTGGGCCCGGCGCGCCAAGCTTCTGCAAAATCTCCACACCGACCA-3 '；

1391PRO-IFL1-R：（SEQ ID NO.2）5 '- TCCTCTTAGAATTCCCGGGGATCCGAAACTAGGAGAAAGCTAA-3 '

3.以提取的榨菜品种‘永安小叶’的DNA为模板，进行PCR反应：

取0.2ml无菌PCR专用管，加入2μl DNA，PrimeSTAR Max Premix（2X）12.5 μl ，上下游引物各0.5μl ，最后ddH2O补足到25μl ；

PCR反应程序：98℃预变性3分钟，98℃变性10秒，55℃退火5秒，72℃延伸10秒，循环35次，72℃后延伸5分钟。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，在1891 bp处可以观察到清晰单一的目的条带。

4. PCR产物回收

使用DNA回收试剂盒（全式金EG101）进行目的片段回收，具体步骤如下：

1）将含目的条带的凝胶置于紫外灯下，切取目标条带；

2）称重，加入3倍体积的溶胶缓冲液（如凝胶重100mg，可视为100μl，以此类推），于55℃水浴溶胶6-10分钟，每隔2-3分钟混合直至溶胶完全融化，观察颜色，加入适量3M醋酸钠（pH5.2），调整至与溶胶缓冲液颜色一致；

3）融化的凝胶溶液温度降至室温，用移液器悬空加入离心柱中静置1分钟，10000×g离心1分钟，弃废液；

4）加入650μl洗涤液，10000×g离心1分钟，弃废液；

5）10000×g离心2分钟，彻底去除残留的洗涤液；

6）将离心柱置于干净的离心管中，开盖静置1分钟，使残留乙醇挥发干净，向离心柱中央加入50μl 60℃预热的去离子水，室温静置1分钟；

7）10000×g离心1分钟，洗脱DNA，并电泳检测

电泳检测结果如图3所示，得到纯化的榨菜IFL1基因启动子PCR产物。

5.将获得PCR产物进行核苷酸测序，结果符合目标预期，具体如SEQ ID NO.3所示：

GTTTGATCCTCTTTCGATTTTTCTATTTATTACTTTATTATAAAAAGAAAACAAAACAAAAAAATTTAGC 70 ACAATCAAAAATATTTAAAAAGTTAAGTAGCACAATCTAAAATCAAAACAAAAAAAATCAGCAAAATCCA140 AAAAATTATGTATTCTTGAAGGTATGAAGTTTTTTGGTATATAGAAGAATTTCTTGATGTTCTCAAAAGA210 TCCGTGTTTCGTAGTGATACATATTAGAGATGTGACTAATAAAAAACTAGACACTTAAATGATTCTTGAA280 AATCATTAAATATCAAAGAAAGCTTTTGTTTGCAATTTATCCTTCGAAAATAATGGATATTAGGTGCTTA350 TCATGGCTCTTTTTTTTTGTCATGATCATGGCCTCAAGACTCAAGCAATAATATATCCTAAATAAGTCAA420 ACGACAGCACAAAGCTTGTAACTTTCTTCTGCATATTCCATTGGAACTTAACAAAGATTCGGTCTTTTTC490 TATAGTTAAAGAAGAAAAAAGAGAGAGAGAGAGAGAGGAAGATATACCGTATATTGTTTCTGATCAAGCC560 GATCTCTGGAAGCAAAGAAGGATATAGCAGTTTCTTGTCCTTGCTGTGAATTCTTAAAAACCCTACAAAA630 ATTTCTCTCTCTAAAAAGTTCTGAAGTTCTCTTTTTCTTTCTCGATCTCTCTTTCTTTCTATAGACAATG700 AATGAGTAACTTCCTTCGGAAAAACTGATGAAGCATGCTTCACAATGGGAACAACACGATTCAAACTTTA770 GACTCTGCTACAGTTCAACCACTTTCTTTCTCAGTCTTTCCCTCTCTCTCTCTCTAGATAGATAGATCCA840 CAACGTGAAGAGTCAAAAGATTTGTGAAACTTCTATTTAACAATTTGTAGTGGGAAGAGAAAAAAAACTT910 TAGTTTATGGGTGGGCGTGCTTTTTTTATTTAAGCTTAATTTAGGGAATTAATAGAATAGAAATGTGTGT980 ATGAAAAATGAGAGAAGACATGTGTGTCGGGTTGTGTTGAAAAAGAGAGAAGTGAGTACCCTTAATACCA1050 GACAACCACCACTTCTCACTTTTACTTTTTCATTTTTCATTTTTCTATTTTGAAGTGTTACTGTTCTTTT1120 TACTGCCATTTCGTTTGGTCTTGCGTTCCAATACACTCTGAAAAAGACAGACACACATGTCCTCAGTATC1190 GTTTGAAATACGTCACGTCGTAATCATATACACAAGACAAGTATTAAATTCAAAACCTTAACCTCATTGT1260 TTTCAGTATGGTCATGGCAATTATGAATTTGGTTTACTCCTGACTCCTGCTCTTCTATTCCGATGGAATG1330 TATATGTGGCAGGAGGCGCCGCCCCAACTTCATTATTTTACAGATTTGGACAAATTTCTAGGTTATGTAC1400 ATCTATAGTCCACAATTACTAGCGTTCACTTTTTTCTTTCTAGAAAACTATTAATCGCATTTTTGACAAA1470 AGTTTCCAAATTTTCCAGAATATGCTGCTTAGGCATCTACATGAGCATCTTAGCGTTGTGCGTTTGGTTC1540 AATCAGTTGAAAATAGGTTGACAAAAAGTTTACATTCTAAAAGGCTAACCATATATATGCTTAAATATTC1610 ATCAAACTGATAGTTTTCTCTGATAGAAACTCTAAAATACTAATGGTGGTACTATACACTTTGAAACTGG1680 ATATTTTTTCAAGTCAAATTAATTTGAAATAATTAGCAGCTAGTTTTTATCATCATTTGTTCGTATTATA1750 AGATTCAGACCTGAACTGATACTTGAAGTTATTTCATATTTGTTTTATAAATTTGAAAATAGGTTCTGAA1820 TTTCGACCTGAACTTCTATAAAACTCATGGATTCTGTAGAACAAAAGCTGGTCGGTGTGGAGATTTTGCA1890 G 1891

实施例2 榨菜IFL1基因启动子融合GUS报告基因的植物表达载体构建

1. 含GUS基因表达载体pCAMBIA1391线性化

使用全式金公司离心柱型质粒小提试剂盒提取扩大培养的pCAMBIA1391载体的质粒，具体操作步骤如下：

1）将扩大培养的15ml菌液10000×g离心1分钟，去上清，加入750μl无色溶液RB（提前加入RNase A），涡旋震荡，使细菌沉淀完全悬浮；

2）加入750μl蓝色溶液LB，轻轻颠倒混合5-6次，形成蓝色透亮溶液；

3）加入1050μl黄色NB溶液，轻轻混合5-6次，颜色由蓝转黄，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min；

4）12000×g离心5分钟，小心吸取上清液加入离心柱中，12000×g离心1分钟，弃废液；

5）加入650μl溶液WB（提前加入无水乙醇），12000×g离心1分钟，弃废液；

6）12000×g离心2分钟，弃废液，彻底去除残留的WB；

7）将离心柱置于新的离心管中，向柱的中央加入50μl去离子水，室温静置1分钟；

8）10000×g离心1分钟进行洗脱，得到质粒溶液。

对提取的pCAMBIA1391表达载体质粒，用Hind III和BamH I进行双酶切，酶切体系及程序为：pCAMBIA1391 5μl，10× Buffer 5μl，Hind III和BamH I各1μl，ddH₂O 补足至50μl；37℃，3h；80℃，20min。

用DNA回收试剂盒回收酶切产物的较大片段，方法同实施例1的步骤4)。利用重组酶（全式金，CU201），采用无缝克隆技术将两个回收产物进行连接，反应体系及程序为：2×Basic Assembly Mix 5μl，pCAMBIA1391回收片段2μl，IFL1基因启动子PCR回收产物2μl，ddH₂O 补足至10 μl；50℃反应45分钟，反应结束后置于冰上冷却。

2.连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞

采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞，具体步骤如下：

1）在冰上融化DH5α感受态细胞

2）取10μl上述步骤2中的重组产物加入100μl感受态细胞中，轻轻弹动离心管壁混匀后，冰上放置30分钟；

3）42℃水浴热激30秒，之后立刻转至冰上冷却2分钟；

4）在超净工作台加入700 μl 37 ℃预热的LB培养基，37℃摇床中250rpm培养1小时；

5）4000×g离心5分钟，吸取750μl 上清弃掉，用枪头将余下的液体与沉淀轻轻吹打混匀，均匀涂布在含卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜；

3.榨菜IFL1基因启动子融合GUS报告基因的植物表达载体的检测

挑取上述步骤培养的单个克隆于10μl无菌水中，利用pCAMBIA1391载体序列作为上游引物和IFL1基因启动子下游引物进行菌落PCR扩增，鉴定阳性克隆，如图4所示，阳性克隆送华大公司测序，测序正确的进行扩大培养，提取阳性质粒备用，表达载体pC1391-IFL1-Pro-GUS构建成功。

以提取的重组质粒pC1391-IFL1-Pro-GUS为模板扩增IFL1基因启动子（图5）和GUS报告基因（图6），均得到目的片段，再次证明榨菜IFL1基因启动子融合GUS报告基因的植物表达载体pC1391-IFL1-Pro-GUS构建成功。

对测序获得的榨菜IFL1基因启动子序列进行核心作用元件分析，如图7所示。该启动子含有真核生物启动子的基本保守元件CAAT-box和TATA-box，还含有转录因子结合位点和ERE等植物激素响应元件。

实施例3 榨菜IFL1基因启动子活性鉴定

1.农杆菌介导的烟草遗传转化

通过热激法将重组表达载体pC1391-IFL1-Pro-GUS转入农杆菌GV3101中，具体方法如下：

1）将5 μlpC1391-IFL1-Pro-GUS质粒（约 500 ng）与GV3101农杆菌感受态细胞在冰上静置30 min后，转入液氮中冻5 min，再转入37℃水浴锅中热激5 min；

2）热激结束后迅速将装感受态细胞置于冰上5min后，在28℃摇床中160 rmp/min活化2h；

3）将转化后的菌液涂布抗性平板中筛选，获得阳性GV3101菌株。

4）对阳性菌株提取质粒，进行PCR验证，见图8，确定重组质粒转入到了农杆菌中，对鉴定正确的质粒进行扩大培养。

采用叶盘转化法获得转基因烟草，具体方法如下：

1）在超净工作台中，将烟草无菌苗叶片剪成边长0.5 cm左右的正方形，放在上述重悬的菌液中侵染约10min，叶片正面向上转入共培养基于28℃下黑暗培养2 d（图9A）；

2）2 d后将步骤1）中外植体转入筛选培养基中进行第一次筛选；

3）2周后将步骤2）中外植体转入筛选培养基中进行继代培养，以后每2周继代一次；

4）待步骤2）中约4周后产生抗性芽（图9B），将长约1-2cm的抗性芽切下转入生根培养基，促进生根；

5）待步骤4）中抗性芽生根（图9C）且长至瓶高2/3以上时将苗取出，洗净根部培养基放入清水中进行炼苗；

6）2-3 d后将步骤5）中的烟草苗移栽到泥炭土中培养（图9D），培养一周后利用PCR进行转基因阳性植株鉴定，鉴定结果如图10所示。

2. 转基因植株GUS表达活性分析

使用GUS染色试剂盒（酷莱博SL7160）对阳性植株进行染色，具体步骤如下：

1）将X-Gluc溶剂40 ℃水浴融化，加入到X-Gluc干粉中，震荡混匀溶解，即得50×GUS染色浓缩液，用GUS染色缓冲液稀释50倍，即配成GUS染色液；

2）取阳性苗和野生型烟草叶片泡在步骤1）中GUS染色液中，于37 ℃保温过夜；

3）将步骤2）中材料转入70%乙醇中脱色3次，至阴性对照材料呈白色；

4）观察染色部位，如图11所示。

图11结果表明，野生型未染出颜色，转基因阳性植株染出蓝色，表明GUS染液能够正常染色，且染色部位主要在叶脉附近，表明榨菜IFL1启动子能够驱动GUS基因在烟草维管束含量高的组织部位特异表达。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 长江师范学院

<120> 含有榨菜IFL1启动子融合GUS基因的表达载体及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

TGTTGGGCCCGGCGCGCCAAGCTTCTGCAAAATCTCCACACCGACCA 47

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

TCCTCTTAGAATTCCCGGGGATCCGAAACTAGGAGAAAGCTAA 43

<210> 3

<211> 1891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

GTTTGATCCTCTTTCGATTTTTCTATTTATTACTTTATTATAAAAAGAAAACAAAACAAAAAAATTTAGC 70

ACAATCAAAAATATTTAAAAAGTTAAGTAGCACAATCTAAAATCAAAACAAAAAAAATCAGCAAAATCCA 140

AAAAATTATGTATTCTTGAAGGTATGAAGTTTTTTGGTATATAGAAGAATTTCTTGATGTTCTCAAAAGA 210

TCCGTGTTTCGTAGTGATACATATTAGAGATGTGACTAATAAAAAACTAGACACTTAAATGATTCTTGAA 280

AATCATTAAATATCAAAGAAAGCTTTTGTTTGCAATTTATCCTTCGAAAATAATGGATATTAGGTGCTTA 350

TCATGGCTCTTTTTTTTTGTCATGATCATGGCCTCAAGACTCAAGCAATAATATATCCTAAATAAGTCAA 420

ACGACAGCACAAAGCTTGTAACTTTCTTCTGCATATTCCATTGGAACTTAACAAAGATTCGGTCTTTTTC 490

TATAGTTAAAGAAGAAAAAAGAGAGAGAGAGAGAGAGGAAGATATACCGTATATTGTTTCTGATCAAGCC 560

GATCTCTGGAAGCAAAGAAGGATATAGCAGTTTCTTGTCCTTGCTGTGAATTCTTAAAAACCCTACAAAA 630

ATTTCTCTCTCTAAAAAGTTCTGAAGTTCTCTTTTTCTTTCTCGATCTCTCTTTCTTTCTATAGACAATG 700

AATGAGTAACTTCCTTCGGAAAAACTGATGAAGCATGCTTCACAATGGGAACAACACGATTCAAACTTTA 770

GACTCTGCTACAGTTCAACCACTTTCTTTCTCAGTCTTTCCCTCTCTCTCTCTCTAGATAGATAGATCCA 840

CAACGTGAAGAGTCAAAAGATTTGTGAAACTTCTATTTAACAATTTGTAGTGGGAAGAGAAAAAAAACTT 910

TAGTTTATGGGTGGGCGTGCTTTTTTTATTTAAGCTTAATTTAGGGAATTAATAGAATAGAAATGTGTGT 980

ATGAAAAATGAGAGAAGACATGTGTGTCGGGTTGTGTTGAAAAAGAGAGAAGTGAGTACCCTTAATACCA 1050

GACAACCACCACTTCTCACTTTTACTTTTTCATTTTTCATTTTTCTATTTTGAAGTGTTACTGTTCTTTT 1120

TACTGCCATTTCGTTTGGTCTTGCGTTCCAATACACTCTGAAAAAGACAGACACACATGTCCTCAGTATC 1190

GTTTGAAATACGTCACGTCGTAATCATATACACAAGACAAGTATTAAATTCAAAACCTTAACCTCATTGT 1260

TTTCAGTATGGTCATGGCAATTATGAATTTGGTTTACTCCTGACTCCTGCTCTTCTATTCCGATGGAATG 1330

TATATGTGGCAGGAGGCGCCGCCCCAACTTCATTATTTTACAGATTTGGACAAATTTCTAGGTTATGTAC 1400

ATCTATAGTCCACAATTACTAGCGTTCACTTTTTTCTTTCTAGAAAACTATTAATCGCATTTTTGACAAA 1470

AGTTTCCAAATTTTCCAGAATATGCTGCTTAGGCATCTACATGAGCATCTTAGCGTTGTGCGTTTGGTTC 1540

AATCAGTTGAAAATAGGTTGACAAAAAGTTTACATTCTAAAAGGCTAACCATATATATGCTTAAATATTC 1610

ATCAAACTGATAGTTTTCTCTGATAGAAACTCTAAAATACTAATGGTGGTACTATACACTTTGAAACTGG 1680

ATATTTTTTCAAGTCAAATTAATTTGAAATAATTAGCAGCTAGTTTTTATCATCATTTGTTCGTATTATA 1750

AGATTCAGACCTGAACTGATACTTGAAGTTATTTCATATTTGTTTTATAAATTTGAAAATAGGTTCTGAA 1820

TTTCGACCTGAACTTCTATAAAACTCATGGATTCTGTAGAACAAAAGCTGGTCGGTGTGGAGATTTTGCA 1890

G

Claims (5)

1.一种榨菜IFL1基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种用于植物遗传转化的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有如权利要求1中所述的榨菜IFL1启动子序列。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有GUS基因。

4.如权利要求1所述的榨菜IFL1启动子在启动烟草中目的基因表达中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述目的基因为GUS基因。