CN109913448B - 水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP2及其应用。本发明所提供的启动子pSSP2是下述任一：a)SEQ ID No.1；b)SEQ ID No.1的第1‑3075位；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具启动子功能；d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能。实验证明，pSSP2启动子能够有效启动目的基因在水稻雄蕊中特异表达。本发明对于有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP2及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP2及其应用。

背景技术

对于中国这样的人口大国而言，粮食安全是社会稳定和可持续发展不可或缺的保障。随着中国经济的高速发展，城镇化过程不可避免地不断蚕食耕地面积。土地是农业之本，在土地面积不断减少、人口不断增加、人们对粮食的需求水平不断提高的压力下，保障粮食安全的唯一出路，只能是通过对植物生命活动的持续深入的研究，进行更加有效的作物改良，提高单位面积产量。经验表明，利用杂种优势进行育种是一个行之有效的作物改良方法，不仅能有效地利用杂种优势提高产量，还能通过各种不同的组合筛选，实现综合性状(包括品质和抗性)的快速组合，是大规模种业生产上行之有效的策略。

在生产上大规模利用杂种优势的前提是雄性不育系。在传统的杂种优势利用中，人们利用自然变异筛选所获得的雄性不育系曾经成功地实现了大规模提高水稻产量的目标。可是，当杂种优势利用面对综合性状组合和种业的产业化运作时，缺乏具有自主知识产权的多元化雄性不育系就成为杂种优势利用的一个现实的、无法回避的严重技术制约。近年，通过对水稻的大规模突变体研究，人们发现了一批新的、可以造成雄性不育的基因，为创制多元化雄性不育系提供了新的选择。目前所报道的影响雄蕊发育的基因大多在减数分裂之后发挥作用，从植物器官形成和营养物质分配的角度而言，在雄蕊发育早期调控入手创制雄性不育系，将不仅能实现更加稳定的不育效果(彻底抑制雄蕊的形成)，而且还可以减少雄蕊早期发育过程(包括减数分裂)的消耗，让同样的光合产物进行更有效的利用。

在1990年代初，植物花器官特征决定基因(ABC基因)的发现，证明器官特征决定可以由少数基因控制。本发明的发明人在前期工作中也曾成功地利用ABC基因中的B类基因AP3的启动子特异性地改变雄蕊中乙烯信号组分的表达，实现抑制雄蕊早期发育、在拟南芥中实现单性花的目的。迄今为止，尚未见在水稻雄蕊发育早期特异性表达的启动子的报道。显然，要有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权，当务之急就是要找到一批有效的、拥有自主知识产权的水稻雄蕊早期发育过程基因特异表达的调控元件，如启动子。

基因表达的器官/组织/细胞特异启动子或调控元件(因为很多特异性调控元件并不在编码区上游，而在内含子中)的研究是分子生物学发展到1980年代时的一个研究热点。在植物中，欧洲科学家曾热衷于研究在根的各种组织中特异性表达启动子。随着对基因表达调控机制了解的不断深入和基因序列解析手段的发展，目前有关基因表达调控元件的分析也有了更加有效的方法。但由于分子生物学的发展的热点在启动子之后迅速转移到转录因子、染色质修饰、小RNA、大规模测序等新的热点，而植物分子生物学的研究在1990年代之后也将重点转移到突变体的筛选和相关基因分离上，有关器官/组织/细胞特异启动子或调控元件的研究在近年并没有成为大家关注的焦点。虽然这种局面的形成有其合理性，因为没有有功能的基因，也无从了解其表达的调控元件。随着模式植物和重要作物基因组测序的完成，特别是人类ENCODE计划的完成，基因表达的时空特异性精细调控必将成为人们关注的下一个焦点。而且从应用的角度出发，要利用生物技术改变基因表达，实现特定的产业化需求，必然要通过调控元件来控制基因表达的时空特异性。因此器官/组织/细胞特异性基因表达的调控元件的分离克隆和应用，必然成为分子生物学和生物技术研究的下一个无法回避的技术挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，命名为pSSP2启动子，来源于水稻(Oryza sativa)，是下述a)-d)中任一的DNA片段：

a)SEQ ID No.1所示DNA片段；

b)SEQ ID No.1的第1-3705位所示DNA片段；

c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且来源于水稻并具有启动子功能的DNA片段；

d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID No.1共由3971个核苷酸组成，第3706-3971位为5’-UTR序列。

含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1305.1载体的KpnI和SmaI酶切位点间，且将pCAMBIA1305.1载体中的HindIII和NcoI酶切位点间的35S启动子缺失，且保持pCAMBIA1305.1载体的其他序列不变得到的载体。

所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因(来源于所述pCAMBIA1305.1载体)；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pCAMBIA1305.1载体)。

所述DNA分子在启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因表达。

进一步地，所述表达为雄蕊特异性表达。

进一步地，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

更进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更加具体地，所述禾本科植物可为水稻，如水稻品种中花11。

实验证明，本发明所提供的pSSP2启动子，能够有效启动目的基因在水稻雄蕊中的特异性表达。本发明对于有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-10为PCR产物；M为marker。

图2为pCAMBIA1305.1载体的结构图。

图3为PCR鉴定pSSP2:GUS载体的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-16为构建的载体；M为marker。

图4为PCR鉴定转pSSP2:GUS植株琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-16为转pSSP2:GUS植株；17为野生型阴性对照；M为marker。

图5为转pSSP2:GUS植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片。标尺为1mm。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pCAMBIA1305.1载体是CAMBIA公司的产品。

下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mM PBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mM亚铁氰化钾、100mM铁氰化钾、0.5mM EDTA(pH8.0)、10mg/ml X-Gluc、0.1％(体积比)吐温20。

下述实施例中的水稻品种中花11号：购自于中国农业科学院作物研究所；由中国农科院作物所1979年用京风五号/特特普/福锦进行花培。记载于文献“倪丕冲.水稻花培新品种—中花11号.作物品种资源，1989年04期”中。

下述实施例中的农杆菌EHA105是北京全式金生物工程有限公司的产品。

实施例1、pSSP2启动子的获得

1、以水稻品种中花11号的基因组DNA为模板，采用pSSP2-KpnI-F和pSSP2-KpnI-R引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

pSSP2-KpnI-F：5’-agggGGTACCATGTCAGGACGCTCTGTGTC-3’(下划线部分为酶切位点KpnI的识别序列)；

pSSP2-KpnI-R：5’-aaaaGGTACCgttgctcctgctcctgctcgg-3’(下划线部分为酶切位点KpnI的识别序列)。

2、对步骤1获得的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化PCR扩增产物。并对其进行测序。

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp；泳道1-10为PCR扩增产物，约为3.99kb)。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为3991bp的DNA片段，测序后发现核苷酸序列为“5’-agggGGTACC+SEQ ID No.1+GGTACCtttt-3’”。将SEQ ID No.1所示的核苷酸序列命名为pSSP2，即为pSSP2启动子。SEQ ID No.1共由3971个核苷酸组成，第3706-3971位为5’-UTR序列。

实施例2、pSSP2启动子的功能验证

一、转pSSP2:GUS水稻的获得

1、骨架载体pCAMBIA1305NO35S的制备

用限制性内切酶HindIII和NcoI对带有35S启动子及其驱动的GUS报告基因的载体pCAMBIA1305.1(该载体的结构如图2所示)进行双酶切，回收大片段后自连接，得到连接产物，即为骨架载体pCAMBIA1305NO35S。将骨架载体pCAMBIA1305NO35S转化大肠杆菌，挑取阳性菌落进行测序鉴定。

测序结果表明：骨架载体pCAMBIA1305NO35S为将pCAMBIA1305.1载体中的HindIII和NcoI酶切位点间的35S启动子缺失，且保持pCAMBIA1305.1载体的其他序列不变得到的载体。

2、重组质粒pSSP2:GUS的构建

1)用限制性内切酶KpnI酶切步骤1获得的pCAMBIA1305NO35S载体，回收大小约为10.5kb的载体骨架；

2)用限制性内切酶KpnI酶切实施例1获得的PCR扩增产物，回收酶切产物；

3)将步骤1)的载体骨架和步骤2)的酶切产物连接，得到pSSP2:GUS载体，并对其进行测序。

测序结果表明：pSSP2:GUS载体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1305NO35S载体的KpnI酶切位点间，且保持pCAMBIA1305NO35S载体的其他序列不变得到的载体。

pSSP2:GUS载体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1305.1载体的KpnI酶切位点间，且将pCAMBIA1305.1载体中的HindIII和NcoI酶切位点间的35S启动子缺失，且保持pCAMBIA1305.1载体的其他序列不变得到的载体。

4)用pSSP2-F和pSSP2-R引物鉴定pSSP2:GUS载体是否连入目的DNA片段。引物序列如下：301bp

pSSP2-F：5’-CGTAGCGTTAGCACGGGTAT-3’；

pSSP2-R：5’-AATGTGTTTGGCAGCACCAC-3’。

部分PCR鉴定电泳图如图3(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp)所示。经鉴定结果表明：PCR扩增得到大小约为301bp的条带的载体为正确连接的pSSP2:GUS载体。

3、重组农杆菌的构建

将步骤2获得的重组质粒pSSP2:GUS导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pSSP2:GUS/EHA105。

将pCAMBIA1305.1载体导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105。

4、转基因植株的获得

用步骤3获得的重组农杆菌pSSP2:GUS/EHA105和重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105分别转化水稻品种中花11(ZH11)，分别得到转基因水稻和对照植株。水稻转化委托未名凯拓公司进行商业化生产(具体方法为常规的水稻幼胚愈伤组织的诱导后侵染农杆菌)，6个月后拿到转化后抗性筛选过的水稻苗。

5、转基因植株鉴定

提取经过抗性筛选后的T₂代转基因水稻植株的叶片的基因组DNA，用GUS-F和NOS-R组成的引物对T₂代转基因水稻植株的基因组DNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转pSSP2:GUS水稻植株。鉴定引物为：

GUS-F：5’-GAGTACTACCAGGCGAACCACGT-3’；

NOS-R：5’-GATGACACCGCGCGCGCGATAATTT-3’。

部分T₂代转pSSP2:GUS水稻植株的PCR鉴定电泳图见图4。图4中，M为DL2000PLUSDNA marker；1-16为PCR鉴定为转基因植株；17为阴性对照(野生型)。经过鉴定表明：T₂代转基因水稻植株中2#，5#，7#，8#，12-15#为T₂代转pSSP2:GUS水稻植株(PCR扩增产物大小约为507bp的植株为T₂代转pSSP2:GUS水稻植株)。

二、转pSSP2:GUS水稻的GUS染色

取经过PCR鉴定为阳性的T₂代转pSSP2:GUS水稻植株、对照植株和野生型水稻植株的成熟花器官、叶片和根进行GUS染色分析。GUS染色分析的具体步骤如下：将植株的花、叶片和根在GUS染色液中37℃浸泡12小时，然后用70％乙醇水溶液脱色2-3次，然后在显微镜下观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。

T₂代转pSSP2:GUS水稻植株的花器官、叶片和根的GUS染色照片见图5，其中，1-6分别为水稻小花的GUS染色结果，7为解剖的雄蕊的GUS染色结果，8为根的GUS染色结果，9为叶片的染色结果。从图中可以看出，T₂代转pSSP2:GUS水稻植株的花器官观察到蓝色，说明GUS基因只在水稻雄蕊中特异的表达，而野生型水稻植株的花器官、叶片和根均没有蓝色，对照植株的花器官、叶片和根中均观察到蓝色。说明本发明提供的启动子pSSP2可以启动GUS基因在水稻雄蕊中特异的表达。

<110> 北京大学

<120> 水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP2及其应用

<130> GNCLN172208

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3971

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

atgtcaggac gctctgtgtc caccttggcc tgttgctcgg cgtcgacgcg catatgcagg 60

aactgcgccg cgtgcgatca aggatccacg gggagcagga taacatggtc acaatacacg 120

atgtcatgga tgcgaggtta gccatgtatt gctgttcctg ttttcagtta atgcaatgag 180

ttttgcttac acctcacagt aatgcaatgg gtcatgttta ctgtatcttt atgatattgg 240

cggccatacc attctgtgat ccattcgttg atgttcttgg ctgttgaata gtatgtagtg 300

ggtagcaatt cttagttgaa attgttaaat ttcggtttcc ctgtaggcag gagtttactt 360

ctgagatccc tgatgctctg aataaactta acacatactt tgccttaaac ccaaggcaaa 420

caattggtcc atagcgtctt gtgtttttct ttgctagaag ccttagatga tctgatcatg 480

gtgttgtggt atttgctgac aagccacaac tctctgaatg ctatctcttt cttccccttg 540

aaacaccgat atataattca agggtgttta catccatggg tgtaaagttt tgccgtgtca 600

catcggatat tatatagggt atcgcatgtg gatgttcgga cactaataaa aaaataatta 660

cagaatccgt aagtaaaccg tgagatgaat ttattaagcc taattaatct atcattagca 720

aatgtttact atagcatcac attgtcaaat catgtagcaa ttaggcttaa aaaattagtt 780

attttttagc gaatatttaa tactttatgc atgtgttgaa acgttcgatg tgatagggtg 840

taaaatttcg atgtgagatc taaacaggcc ctcagttagt gcagtgagtt ttgcttacac 900

ccttacattg gtttactgtt tgataatggt gaccaaatga ctatatcaat cattccatca 960

gccaatgttc ttgacacttg aatactcata ggtatcaatt cttagttaaa ttggtatatt 1020

tctatttcct tgcaagcggg agttttattt ctgagatact gatgctctgg agtctggatg 1080

aacaacgcag gccattggtc caaagtgtct tgtgtatttt ttttctgctg gaagactaga 1140

tgaccttatt atactgttat ttgtatttgc tggctgccgt tattccgtac ttttggcaaa 1200

atccatgaaa cttacaagcc tcgatccttg gctggagttt ttaagaacac tgctggtcct 1260

tttcttatct gatgatatgt gaggatgaag aaaattcttg tctatagcaa tggttgatga 1320

ccagtgatta ggatcaaact attccagaac ccattttgta attaagttta gtacaaatca 1380

caaaagtaaa gcaagaggtt atgtctgttg tggaataatt tgtttccatt gcaggatcaa 1440

cctacgttac catgaatggt agtagtctga ttgttcaata tggcagaata tgtataattg 1500

aaaattactg aaaataggtg cagtgaatta cctaccttgt aatttgcctt aattatatgg 1560

cataatttga attaaaactc ccattaaact gattattttt tctaacacaa aattttagtc 1620

atttatttga aaaatattaa ggatcgtagc gttagcacgg gtatattact agtagatgat 1680

atgaaaaaaa gtagaaatgg tctctcgcaa aagagcctat ttcgtggaaa agctccaagc 1740

aaaccgtcat agcatcatcg acgatgtatg ccgagtttgt agctagttat gaggccacag 1800

ggcagacaaa atggttaaag aagtttgtac ccaggttgaa agtggtcgac agtactcaaa 1860

ggccacactt aagatgtact gcgacaatga gccagtagtg ttttatgctc acaacaataa 1920

gtcaagtggt gctgccaaac acattgacat taagttttat gttgtgaaag agaaaatcca 1980

agatcagaca attagtctcg agcatataag aataaaggag atgttagcgg atccgcttac 2040

aaaaggctta ccacccagtg tgttcagaga acacttagct agcatgggtt tataagaaaa 2100

cctatgatcc ttggattaca aaaggcccta gtatttattt ctagatgggg aggtgcattg 2160

tagtcgttgc gtctgatggt ttagtggtga ctgtcatgat gaagcgtgct ctatacatca 2220

atctatttag acgtaaatga taattaatag aatgttatag ttgcgatctc tgaggggatc 2280

gagaaactaa tcctccccac tctgcctacg ctccctgatt gggggcacca gctgttcgtg 2340

gctgtaggcc cctctcacgc agcgcaatac aaaaaggggg gagtcatcgg gcacgcaaac 2400

caacgtttgc cgtgcacaca cgctcccaca caaaacccta gcaaacccac cgatccggga 2460

taggcgctga agtgagggga agtccgccgc cggccgtcgc cactgccgtc gtccacacca 2520

tcaccatcgt ccacaagccc atcacaaggc caccgccaca ccgtcgtcat ggccgcttca 2580

accttttaag gcgaaggtat gtgtctctct ctctcctcgt tcactcacaa aagtcatgtc 2640

tatttattgc tatatgctag agatcaaccc ctagatccgc acctagaaat cctagaattc 2700

taacaaaatc tacacaataa gaaatttata tacttgggtc atgtttgcgt gttgtctctc 2760

ttaaggagaa tccagacaga ctaggaagca ttttttttac aggttgaagc cctccttcaa 2820

gttatagcca tatatcctat caggtggctt gtttctttat tgctagggct aagttcaatt 2880

tatccccctc aacaaaaatt tacctctcaa ctataaaaac ggacaaatta cattcctcaa 2940

ctatttaatc atgaaactat tatatcttgc gaagtttggc cagcgaggaa aggcatatgg 3000

caggtcaaat ggtttggcaa ggatggagat tgttttggaa agatattttg cgccatacat 3060

gctaaatttc ggcatagaga gccaaataac aacggctctt ggagatgctc ttaatttgtg 3120

ctaacaatcc tgattggaag aaaaaaaatt ccgcttagat ggcactctat ttaataattt 3180

aattggttta aaggtgtgta tatatttata tccgtgttaa tgtatcctca tccaataata 3240

acaatataat tgagtttgtc ttgtacaact agttatacct tttactattt tcatggtata 3300

ttatgattaa aatccatgat atattttatg tactggaaac tatataaaac aggacaaaga 3360

cttatactac attctagtta ttaggaggga gtatccgttc agtatttgac ggtaaagatt 3420

caattaaact tttaaaattt aaccatcaat aaattttcaa atacctaatt ataaaacaaa 3480

agaaataata tacattaatt tgtttggaaa atgtaccatt gatggtccca atttaaaata 3540

tttggccgaa tcttaccgca aacgttgtca aatactcgtg attaagagta acaaaaaagc 3600

aagtgaattt gcaattttga agggtattta cgtaattaga caacttgcta ggggcaatat 3660

tggaatcagg gtacttatat aagtacacgc tccttcgctc gctgcgtgca ctgcgcctcc 3720

gcatttctcg cctcgcccac ccccacacgc aaccgaccga cccatcctta ccacccaccc 3780

caccccacgc tcccctcctc cgcgggcttg gcatttcaac aaacacctcg cgtgcacctc 3840

cctcgccgcc acctcctcgc cgcgcgccgc ctcccactcc tcctcctccc ggcctccgcg 3900

cgccaccggc ctcggcagct ccccgtggga cgcgggggaa caagacgagc ccgagcagga 3960

gcaggagcaa c 3971

Claims (7)

1.DNA分子，是下述a)或b)所示的DNA片段：

a)SEQ ID No.1所示DNA片段；

b)SEQ ID No.1的第1-3705位所示DNA片段。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。

3.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

4.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

5.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

7.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在水稻雄蕊特异性表达中的应用。

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