CN109913451B - 水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用。本发明所提供的启动子pSSP5是下述任一：a)SEQ ID No.1；b)SEQ ID No.1的第1‑3799位；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具启动子功能；d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能。实验证明，pSSP5启动子能够有效启动目的基因在水稻雄蕊中特异表达。本发明对于有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用。

背景技术

对于中国这样的人口大国而言，粮食安全是社会稳定和可持续发展不可或缺的保障。随着中国经济的高速发展，城镇化过程不可避免地不断蚕食耕地面积。土地是农业之本，在土地面积不断减少、人口不断增加、人们对粮食的需求水平不断提高的压力下，保障粮食安全的唯一出路，只能是通过对植物生命活动的持续深入的研究，进行更加有效的作物改良，提高单位面积产量。经验表明，利用杂种优势进行育种是一个行之有效的作物改良方法，不仅能有效地利用杂种优势提高产量，还能通过各种不同的组合筛选，实现综合性状(包括品质和抗性)的快速组合，是大规模种业生产上行之有效的策略。

在生产上大规模利用杂种优势的前提是雄性不育系。在传统的杂种优势利用中，人们利用自然变异筛选所获得的雄性不育系曾经成功地实现了大规模提高水稻产量的目标。可是，当杂种优势利用面对综合性状组合和种业的产业化运作时，缺乏具有自主知识产权的多元化雄性不育系就成为杂种优势利用的一个现实的、无法回避的严重技术制约。近年，通过对水稻的大规模突变体研究，人们发现了一批新的、可以造成雄性不育的基因，为创制多元化雄性不育系提供了新的选择。目前所报道的影响雄蕊发育的基因大多在减数分裂之后发挥作用，从植物器官形成和营养物质分配的角度而言，在雄蕊发育早期调控入手创制雄性不育系，将不仅能实现更加稳定的不育效果(彻底抑制雄蕊的形成)，而且还可以减少雄蕊早期发育过程(包括减数分裂)的消耗，让同样的光合产物进行更有效的利用。

在1990年代初，植物花器官特征决定基因(ABC基因)的发现，证明器官特征决定可以由少数基因控制。本发明的发明人在前期工作中也曾成功地利用ABC基因中的B类基因AP3的启动子特异性地改变雄蕊中乙烯信号组分的表达，实现抑制雄蕊早期发育、在拟南芥中实现单性花的目的。迄今为止，尚未见在水稻雄蕊发育早期特异性表达的启动子的报道。显然，要有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权，当务之急就是要找到一批有效的、拥有自主知识产权的水稻雄蕊早期发育过程基因特异表达的调控元件，如启动子。

基因表达的器官/组织/细胞特异启动子或调控元件(因为很多特异性调控元件并不在编码区上游，而在内含子中)的研究是分子生物学发展到1980年代时的一个研究热点。在植物中，欧洲科学家曾热衷于研究在根的各种组织中特异性表达启动子。随着对基因表达调控机制了解的不断深入和基因序列解析手段的发展，目前有关基因表达调控元件的分析也有了更加有效的方法。但由于分子生物学的发展的热点在启动子之后迅速转移到转录因子、染色质修饰、小RNA、大规模测序等新的热点，而植物分子生物学的研究在1990年代之后也将重点转移到突变体的筛选和相关基因分离上，有关器官/组织/细胞特异启动子或调控元件的研究在近年并没有成为大家关注的焦点。虽然这种局面的形成有其合理性，因为没有有功能的基因，也无从了解其表达的调控元件。随着模式植物和重要作物基因组测序的完成，特别是人类ENCODE计划的完成，基因表达的时空特异性精细调控必将成为人们关注的下一个焦点。而且从应用的角度出发，要利用生物技术改变基因表达，实现特定的产业化需求，必然要通过调控元件来控制基因表达的时空特异性。因此器官/组织/细胞特异性基因表达的调控元件的分离克隆和应用，必然成为分子生物学和生物技术研究的下一个无法回避的技术挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，命名为pSSP5启动子，来源于水稻(Oryza sativa)，是下述a)-d)中任一的DNA片段：

a)SEQ ID No.1所示DNA片段；

b)SEQ ID No.1的第1-3799位所示DNA片段；

c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且来源于水稻并具有启动子功能的DNA片段；

d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID No.1共由3926个核苷酸组成，第3780-3926位为5’-UTR序列。

含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1305.1载体的EcoRI和KpnI酶切位点间，且将pCAMBIA1305.1载体中的HindIII和NcoI酶切位点间的35S启动子缺失，且保持pCAMBIA1305.1载体的其他序列不变得到的载体。

所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因(来源于所述pCAMBIA1305.1载体)；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pCAMBIA1305.1载体)。

所述DNA分子在启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因表达。

进一步地，所述表达为雄蕊特异性表达。

进一步地，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

更进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更加具体地，所述禾本科植物可为水稻，如水稻品种中花11。

实验证明，本发明所提供的pSSP5启动子，能够有效启动目的基因在水稻雄蕊中的特异性表达。本发明对于有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-5为PCR产物；M为marker。

图2为pCAMBIA1305.1载体的结构图。

图3为PCR鉴定pSSP5:GUS载体的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-24为构建的载体；M为marker。

图4为PCR鉴定转pSSP5:GUS植株琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-23为转pSSP5:GUS植株；24为野生型阴性对照；M为marker。

图5为转pSSP5:GUS植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片。标尺为1mm。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pCAMBIA1305.1载体是CAMBIA公司的产品。

下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mM PBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mM亚铁氰化钾、100mM铁氰化钾、0.5mM EDTA(pH8.0)、10mg/ml X-Gluc、0.1％(体积比)吐温20。

下述实施例中的水稻品种中花11号：购自于中国农业科学院作物研究所；由中国农科院作物所1979年用京风五号/特特普/福锦进行花培。记载于文献“倪丕冲水稻花培新品种—中花11号.作物品种资源，1989年04期”中。

下述实施例中的农杆菌EHA105是北京全式金生物工程有限公司的产品。

实施例1、pSSP5启动子的获得

1、以水稻品种中花11号的基因组DNA为模板，采用pSSP5-EcoRI-F和pSSP5-KpnI-R引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

pSSP5-EcoRI-F：5’-CCCCGAATTCGAGAACCAAGTAGGCATAAGG-3’(下划线部分为酶切位点EcoRI的识别序列)；

pSSP5-KpnI-R：5’-AAAAGGTACCAGCCCTTCCCTTCCTTTCCCT-3’(下划线部分为酶切位点KpnI的识别序列)。

2、对步骤1获得的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化PCR扩增产物。并对其进行测序。

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp；泳道1-4为PCR扩增产物，约为4.13kb)。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为4126bp的DNA片段，测序后发现核苷酸序列为“5’-CCCCGAATTC+SEQ ID No.1+GGTACCtttt-3’”。将SEQ ID No.1所示的核苷酸序列命名为pSSP5，即为pSSP5启动子。SEQ ID No.1共由3926个核苷酸组成，第3780-3926位为5’-UTR序列。

实施例2、pSSP5启动子的功能验证

一、转pSSP5:GUS水稻的获得

1、骨架载体pCAMBIA1305NO35S的制备

用限制性内切酶HindIII和NcoI对带有35S启动子及其驱动的GUS报告基因的载体pCAMBIA1305.1(该载体的结构如图2所示)进行双酶切，回收大片段后自连接，得到连接产物，即为骨架载体pCAMBIA1305NO35S。将骨架载体pCAMBIA1305NO35S转化大肠杆菌，挑取阳性菌落进行测序鉴定。

测序结果表明：骨架载体pCAMBIA1305NO35S为将pCAMBIA1305.1载体中的HindIII和NcoI酶切位点间的35S启动子缺失，且保持pCAMBIA1305.1载体的其他序列不变得到的载体。

2、重组质粒pSSP5:GUS的构建

1)用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤1获得的pCAMBIA1305NO35S载体，回收大小约为10.5kb的载体骨架；

2)用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切实施例1获得的PCR扩增产物，回收酶切产物；

3)将步骤1)的载体骨架和步骤2)的酶切产物连接，得到pSSP5:GUS载体，并对其进行测序。

测序结果表明：pSSP5:GUS载体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1305NO35S载体的EcoRI和KpnI酶切位点间，且保持pCAMBIA1305NO35S载体的其他序列不变得到的载体。

pSSP5:GUS载体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1305.1载体的EcoRI和KpnI酶切位点间，且将pCAMBIA1305.1载体中的HindIII和NcoI酶切位点间的35S启动子缺失，且保持pCAMBIA1305.1载体的其他序列不变得到的载体。

4)用pSSP5-F和pSSP5-KpnI-R引物鉴定pSSP5:GUS载体是否连入目的DNA片段。引物序列如下：375bp

pSSP5-F：5’-GTGTGCATAGCTCCCACCACCAACTAAAAAAC-3’；

pSSP5-KpnI-R：5’-AAAAGGTACCAGCCCTTCCCTTCCTTTCCCT-3’。

部分PCR鉴定电泳图如图3(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp)所示。经鉴定结果表明：PCR扩增得到大小约为375bp的条带的载体为正确连接的pSSP5:GUS载体。

3、重组农杆菌的构建

将步骤2获得的重组质粒pSSP5:GUS导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pSSP5:GUS/EHA105。

将pCAMBIA1305.1载体导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105。

4、转基因植株的获得

用步骤3获得的重组农杆菌pSSP5:GUS/EHA105和重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105分别转化水稻品种ZH11，分别得到转基因水稻和对照植株。水稻转化委托未名凯拓公司进行商业化生产(具体方法为常规的水稻幼胚愈伤组织的诱导后侵染农杆菌)，6个月后拿到转化后抗性筛选过的水稻苗。

5、转基因植株鉴定

提取经过抗性筛选后的T₂代转基因水稻植株的叶片的基因组DNA，用GUS-F和NOS-R组成的引物对T₂代转基因水稻植株的基因组DNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转pSSP5:GUS水稻植株。鉴定引物为：

GUS-F：5’-GAGTACTACCAGGCGAACCACGT-3’；

NOS-R：5’-GATGACACCGCGCGCGCGATAATTT-3’。

部分T₂代转pSSP5:GUS水稻植株的PCR鉴定电泳图见图4。图4中，M为DL2000PLUSDNAmarker；1-23为PCR鉴定为转基因植株；24为阴性对照(野生型)。经过鉴定表明：T₂代转基因水稻植株中1-3#，6#，8-9#，11-16#，18-20#，22-23#为T₂代转pSSP5:GUS水稻植株(PCR扩增产物大小约为507bp的植株为T₂代转pSSP5:GUS水稻植株)。

二、转pSSP5:GUS水稻的GUS染色

取经过PCR鉴定为阳性的T₂代转pSSP5:GUS水稻植株、对照植株和野生型水稻植株的成熟花器官、叶片和根进行GUS染色分析。GUS染色分析的具体步骤如下：将植株的花、叶片和根在GUS染色液中37℃浸泡12小时，然后用70％乙醇水溶液脱色2-3次，然后在显微镜下观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。

T₂代转pSSP5:GUS水稻植株的花器官、叶片和根的GUS染色照片见图5，其中，1-5分别为水稻小花的GUS染色结果，6为根的染色结果，7为叶片的GUS染色结果。从图中可以看出，T₂代转pSSP5:GUS水稻植株的花器官观察到蓝色，说明GUS基因只在水稻雄蕊中特异的表达，而野生型水稻植株的花器官、叶片和根均没有蓝色，对照植株的花器官、叶片和根中均观察到蓝色。说明本发明提供的启动子pSSP5可以启动GUS基因在水稻雄蕊中特异的表达。

<110> 北京大学

<120> 水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用

<130> GNCLN172211

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3926

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

gagaaccaag taggcataag gattcgctca cgagaaatat ggtagtatag cgttactttc 60

tcacgtacaa aatgcagacg tgccaaaaca gggaggtcgc gtggtctttg ccagacggcc 120

cagaacatgg tggtggcttg ctgcaaggct gcaaatgaag aatcgactct gacgacctga 180

cctgccccgt ctctctgcct tgcatgtggt cccccctgct ttgtggcgat cgatggctga 240

gtccacccac tccaccgcgc gcctgtccgc cacgagcagg ggtgtgtttc ttgttactaa 300

acaaggcctt atttagatct cattttaaaa ttttttattc tatcacattg aacgtttgaa 360

cacataaaaa tattaaatat aggtttaaaa ataactaatt gtacatgttg tgactaattt 420

acgaaatgaa tattttaagc ctaattgctc caagatttga caatgtggtg ctacagtaaa 480

catttgctaa taatagatta attaggctta ataaattcgt ctcgtggttt actcacggat 540

tctgtaatta gtttttttat tagtgctcga accctccatg acaccctata ttatacccga 600

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aacacaactc ggcttgttaa ctctaacgag ctaggcctag ctcggctaga ctctcgaggt 1500

gatttgttaa gttcgttagg ttcgttgaca tatttatact actttcgtaa tttataattt 1560

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tgacaattca gttagtagtt ttttataaaa aaaaatcagt cagacccatt ctcacccaac 2040

ttttttccct tcacatagtc acatctacac actctctctc tctctcccat gttttcctca 2100

atcacccaca cacactctct ctcccttctc cctctgcttg cttaagagtg cggcactggc 2160

caggccttcg cctactcctc ctcagcatag aaagcacacc gctgtgctgt cttctcccgc 2220

gtgcgatgaa aacgctccaa taagtgaaaa tctgtagaaa ccgaatttca aagttttata 2280

aattcataaa aaaatttact agagatagtt ataagcatga aatacattct ctattctagt 2340

gaaatttgtc tttttctttc tttctttcct cccaaacgaa attaagttta gacttaagat 2400

ttcatattta taccaatctc gagtaatttt ttttagtgaa tttagaaaac tataagttcg 2460

acttcatggc tttatttatt cgatgatttt tacttatatt ttaacataat taaagaccct 2520

ttcaatatga agaaggtgtg gtgccaaaag cggagcacga gagatgtgtt ccgtatgatg 2580

tgttccgtac gaaggagatt cgctcacgag tcgagtagta gtagttgagc gctccagtac 2640

aaagtgttgg aggttggagg ataaaggggt gtttagatgg ggctaaaact ttttagccca 2700

tgtcacatcg gatgtttgga ctctaatttg gagtattaaa catagactag taaaaaaact 2760

aattttataa atgagagcta atccgcgaga tgaatttttt aagcctaatt aattcataat 2820

tattaaaagt ttactgtagc atcacattgt caaaatcatg gcgtaattag actcaaaaga 2880

ttcgtctcgc gaattagtct aagattatgg aatgagtttt gtaattagtg tatgtttaat 2940

actctaaatt agtgtctaaa catccgatat gacagagact tgaaataagt ctctgtaaac 3000

caaacagacc ctaagaatgg tggacacgtt gttacttttt cacgtacggt gcagatgtgc 3060

caaaacggca agctgagctc gcgtggtctt tgccagaagg catggtgggt ttctgcagaa 3120

atgtgtgggt tagtctgtgc ccttgcatgt gggtctgcac gctacagtat atttctatgc 3180

gtgatcggtg gcacgtacga gtggctcact ccacaccaaa gttggtgtac aatgtgtgat 3240

cgaagccaaa gtagggctcc ttaaagccgc tgaaaataca ccggttttaa tactcgagga 3300

agcgatatac tcggttttat agaaagagag tcataggttg tattcctccc tctactttct 3360

cagactcttt tttttttctc tttttcgcac acaagtttgc aaactaataa acattgcatt 3420

ttaaaaaaaa atacaaaaaa attgctttca gaaatcatat taatttattt tttaaaacat 3480

aactatataa gttattctga cattttcctc attcatattg atattaatga gataacccgt 3540

taatgagata atccgtttta agtgtgcata gctcccacca ccaactaaaa aacacaggca 3600

cacagccaca aaaagttttt cctcccatga tcggtgctga agcttggttc ccatttcccg 3660

atcttttacc ggcccatttc gcggaaagcg ccttttgacc aacccattcg tccggcaccc 3720

gtcccggccc ggcccggccc gcagccgaaa cccagggagg acctatacat atatatgcgg 3780

ttggtcaggc actccggtcg tcttcctcgt gacctcgtca agtcctcagc tctcgtttgg 3840

catccaaaga agaattaggt gttattacta gggtttagag aggtgttgat tactagggtt 3900

tagagaggga aaggaaggga agggct 3926

Claims (7)

1.DNA分子，是下述任一的DNA片段：

a)SEQ ID No.1所示DNA片段；

b)SEQ ID No.1的第1-3799位所示DNA片段。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。

3.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

4.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

5.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

7.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在水稻雄蕊特异性表达中的应用。

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