CN103261419B - 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法 - Google Patents

一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103261419B
CN103261419B CN201280003773.4A CN201280003773A CN103261419B CN 103261419 B CN103261419 B CN 103261419B CN 201280003773 A CN201280003773 A CN 201280003773A CN 103261419 B CN103261419 B CN 103261419B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
primer
barnase
pollen
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280003773.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103261419A (zh
Inventor
马力耕
李健
邓兴旺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Zhiyu wheat Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Xingwang Investment Pty Ltd
WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xingwang Investment Pty Ltd, WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) Co Ltd filed Critical Xingwang Investment Pty Ltd
Priority to CN201280003773.4A priority Critical patent/CN103261419B/zh
Publication of CN103261419A publication Critical patent/CN103261419A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103261419B publication Critical patent/CN103261419B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

一种创建植物雄性不育系的方法，包括：利用两个不同的植物花粉发育晚期特异表达启动子，分别驱动芽孢杆菌核糖核酸酶基因Barnase N端和C端两个核苷酸片段在植物体内表达。由于Barnase N端和C端所编码的小肽都没有核糖核酸酶的活性，而当其被两个表达时期有重叠的花粉特异启动子驱动在同一细胞中表达时，可以恢复部分天然核糖核酸酶活性，导致植物的雄性不育。

Description

一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法
技术领域
本发明属于植物基因工程和植物育种技术领域，具体涉及一种通过将Barnase分成N端和C端两个片段，分别利用两个表达时期有重叠的花粉特异启动子驱动其在植物中的表达，从而加强Barnase表达的组织特异性、克服利用Barnase基因创建植物雄性不育系时毒性泄露问题的方法。
背景技术
杂种优势是生物界的一种普遍现象，利用杂种优势可以显著提高作物产量、品质和抗性。杂交育种已经成为许多作物选育新品种的主要途径，而作物雄性不育系的选育又是杂种优势利用中的关键环节。由于利用常规育种方法选育不育系存在周期长、见效慢、对环境因素影响敏感等问题而不能满足生产发展的需要，近年来，利用基因工程创建雄性不育系被作为最具前景的育种途径，成为当今世界范围内研究、开发和利用的热点。
目前利用植物基因工程创建雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子驱动外源基因在植物中的表达来阻断花粉发育过程从而达到雄性不育的目的，如利用绒毡层特异启动子驱动Barnase基因在植物中特异表达获得基因工程核不育系或利用反义RNA技术特异关闭雄配子体发育关键基因获得基因工程核不育系等。
Barnase是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的一种胞外RNA酶，其产物以前体形式表达，在加工、运输过程中N端被切除约20个氨基酸，成为成熟酶，共有110个氨基酸。Barnase具有强烈的毒性，它在特定细胞中的微量表达就可以造成该细胞的死亡。1990年，Mariani等将具有特异时空表达特性的烟草花药绒毡层特异启动子TA29，与解淀粉芽孢杆菌的Barnase基因结合，构成嵌合基因，用根癌农杆菌介导法，将上述嵌合基因导入烟草和油菜，获得了转基因植物（Mariani C等，Induction of male sterility in plants by achimaeric ribonuclease gene，Nature，1990，347：737-741）。结果，有相当大一部分转基因植株花药皱缩、不散粉、自交不能结实，但雌蕊正常，可由其它植株授粉结实；组织切片未发现绒毡层，花粉囊变形，无小孢子和花粉粒。因此，他们认为，TA29-Barnase嵌合基因在油菜、烟草中的特异表达，选择性破坏了花的绒毡层，从而阻止了花粉的形成，导致雄性不育。
20年来，Barnase被导入油菜、烟草、棉花、小麦、玉米、水稻等各种作物进行了雄性不育诱导的研究。在利用Barnase创建植物雄性不育系的过程中也发现了一系列的问题，如Barnase蛋白的温度敏感性问题、驱动其表达的花粉特异启动子的特异性不够或上游有CaMV35S等强启动子而导致的毒性泄露问题等。对于上游有CaMV35S等强启动子而导致的毒性泄露问题，研究人员采取了在Barnase所在的表达框和上游强启动子所在的表达框之间插入比较长的核酸序列的方法来减少上游强启动子对Barnase表达的时空特异性的影响，从而防止雄性不育植物其他组织器官中不良性状的产生（Jagannath等，The use of a SpacerDNA fragment insulates the tissue-specific expression of a cytotoxic gene(barnase)and allowshigh-frequency generation of transgenic male sterile lines in Brassica juncea L.，Mol.Breeding，2001，8:11–23）
为了解决启动子特异性不够等原因导致的毒性泄露问题，2002年，Burgess等将Barnase也分成了N端（1-36aa）和C端（37-110aa）两个片段，分别由同一个启动子绒毡层特异启动子127a启动转化番茄。只含有N端或C端的转基因植物表现为雄性可育，将两个转基因植物杂交，得到的含有N端和C端两个片段的转基因植物表现为雄性不育，且其他表型完全正常（Burgess等，A novel,two-component system for cell lethality and its useengineering nuclear male-sterility in plants，Plant J，2002，31：113-125）。
上述方法虽然一定程度上提高了Barnase基因表达的特异性、减弱了Barnase基因的泄露对植物生长发育的不良影响，但并没有从根本上解决Barnase基因的毒性泄露问题。针对这一问题，本发明提出了一种新的雄性不育载体的构建策略，一方面在该策略中Barnase基因的表达框位于强启动子CaMV35S的上游，避免了CaMV35S启动子对Barnase基因表达特异性的影响；另一方面在该策略中由两个不同的花粉特异启动子TaPSG719启动子和TaPSG076启动子分别启动Barnase两个半分子Barnase-N和Barnase-C的表达，由于半分子Barnase-N和Barnase-C单独存在时都不具有RNA酶的活性，因此只有在TaPSG719启动子和TaPSG076启动子都具有表达活性的花粉细胞中才同时存在Barnase-N和Barnase-C两个半分子，而这两个半分子可以自我组装成具有RNA酶活性的复合体，行驶RNA酶的功能，从而达到雄性不育的目的。本发明更好的克服了Barnase基因的毒性泄露问题，更有效的实现了Barnase基因在创制植物雄性不育系方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的创建雄性不育系的方法，由于所选启动子为花粉发育后期特异表达启动子，因此通过该方法所获得的雄性不育系可以实现50%的雄性不育比例，并且能够有效避免Barnase毒性泄露问题，还能避免同时转入两个相同的启动子所导致的基因沉默问题。
本发明所涉及的Barnase基因蛋白，是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的一种胞外RNA酶，具有很强的细胞毒性，它在细胞中的特异性表达会造成细胞的死亡，因而被广泛应用于植物雄性不育系的创建等领域。
在本发明中，为了解决Barnase基因毒性太大以及容易泄露，易影响植物正常的生长发育的问题，本发明将Barnase蛋白分成了N端（1-36位氨基酸）和C端（37-110位氨基酸）两个小肽，N端包含2个α螺旋，C端包含5个β片层。由于两个小肽都包含RNA酶活性必需的氨基酸（N端Lys27，C端Glu73和His102），所以任何一段小肽都没有RNA酶活性，但两者在同时转入到一个细胞，并同时表达出蛋白后，可以重新组合成具有RNA酶活性的复合体，该重新组装的蛋白复合体的RNA酶活性可以达到天然蛋白的30%左右，可以导致所表达细胞的死亡。
为了使得细菌来源的Barnase基因更好的在植物中，尤其是在单子叶植物中表达，本发明根据Barnase的高级结构、解淀粉芽孢杆菌密码子的偏好性、单子叶植物密码子的偏好性对Barnase的核苷酸序列进行改造，同时还对决定Barnase温度敏感性的6个重要氨基酸进行了点突变（Q15I,T16R,K19R,G65S,K66A和K108R）。改造并做完点突变的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，野生型序列如SEQ ID NO:2所示。
与野生型的Barnase相比，本发明所提供的突变后的Barnase序列具有在单子叶植物中能够更有效的表达及温度敏感性低（即更耐受高温）的优点，这些优点对于利用其核糖核酸酶活性在单子叶植物中调控花粉育性及建立雄性不育系是非常重要的。
在本发明的另一方面，发明人将分别编码Barnase的N端和C端小肽的两个核苷酸序列置于两个不同的花粉发育晚期启动子的驱动下，这两个花粉发育晚期启动子都在花粉发育的后期表达，可以实现Barnase的N端和C端两个小肽的同时空的高效的表达，从而既达到了本发明创制雄性不育系的目的，又能克服组成型表达Barnase基因所导致的对植物正常生长发育的影响及能量的浪费，还能避免某一个花粉特异启动子在其他组织器官中的微弱活性所导致的Barnase基因的毒性泄露问题。将含有上述表达盒的表达载体转化植物，获得的转基因植物中可以实现50%的花粉无活力或活力弱，从而达到目标性调控植物花粉育性的目的。
本发明依次通过下列步骤实现：
（1）根据Barnase的高级结构、解淀粉芽孢杆菌密码子的偏好性、单子叶植物密码子的偏好性对Barnase的核苷酸序列进行改造，同时还对决定Barnase温度敏感性的重要氨基酸进行了点突变（Q15I,T16R,K19R,G65S,K66A和K108R）。改造并做完点突变的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，将该序列交上海英骏生物技术公司合成；
（2）通过PCR方法分别扩增得到编码Barnase N端（1-36位氨基酸）和C端（37-110位氨基酸）的核苷酸片段，连接T载体并测序确认；
（3）通过PCR方法分别扩增得到两个花粉发育晚期特异表达的启动子PTaPSG719和PTaPSG076，连接T载体并测序确认；
（4）构建植物表达载体：将编码Barnase N端（1-36位氨基酸）和C端（37-110位氨基酸）的核苷酸片段分别置于两个花粉发育晚期特异表达的启动子PTaPSG719和PTaPSG076的驱动下；
（5）转化植物，具体地，优选转化水稻和小麦；
（6）将获得的T0代转基因水稻和小麦的花粉进行I2-KI染色分析。I2-KI染色法的基本原理是根据淀粉遇碘变蓝的特性，根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中的淀粉含量，从而确定花粉粒活性的高低。凡是染色成蓝黑色的花粉粒具有较强的活力，成黄褐色的为发育不良的花粉粒。结果表明有50%花粉活力弱或无活力，从而达到目标性调控植物花粉育性的目的。
本发明所述的“启动子”是一段位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。
本发明所述的“核苷酸序列”是核酸(DNA和RNA)中核苷酸的排列顺序。许多情况下，核苷酸序列决定核酸的高级结构和生物功能，即不同序列有不同的高级结构和不同的生物功能。
本发明所述的“花粉发育晚期特异表达启动子”是指该启动子可以驱动目的基因在植物花粉发育晚期的花粉粒中特异表达而在植物的其它器官不表达的启动子。
本发明所述的“植物表达载体”是指现有技术中已知的、能够在植物细胞中恒定表达外源基因的任何一种载体，如pCAMBIA2300，pBI121等。
本发明所述的“转化”是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等
本发明所述的“转基因植物”是指通过基因转移技术获得的整合有外源基因的植物个体。通常转化植物或转基因植物基因组中稳定带有外源基因的核苷酸序列，可将该外源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。
本发明与现有的利用Barnase创建雄性不育系的技术相比，其优势在于只有在两个花粉特异启动子同时具有表达活性的细胞中，无活性的Barnase N端和C端小肽才能够同时存在并组装成有活性的复合体，从而有效避免了花粉特异启动子特异性不够时导致的雄性不育植物其他组织器官发育异常、重要农艺性状受到影响的问题，对植物基因工程雄性不育系的创建和杂种优势的利用都具有重要意义。
附图说明
图1是表达载体pTa95v2的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；P35S表示CaMV35S基因的启动子；NPTII表示新霉素磷酸转移酶II基因；T35S表示CaMV35S基因的终止子；PTaPSG076表示小麦PSG076基因的启动子；BarW-C表示改造后的Barnase基因的C端核苷酸片段；Tnos表示胭脂碱合成酶（nos）基因的终止子；PTaPSG719表示小麦PSG719基因的启动子；BarW-N表示改造后的Barnase基因的N端核苷酸片段；Tmas表示甘露碱合成酶（mas）基因的终止子；HindIII、PstI、XbaI、BamHI、SmaI、KpnI、SacI、EcoRI和BstXI分别表示限制性内切酶的酶切位点。
图2是pTa95v2转基因水稻的PCR鉴定。A为转基因水稻植株的鉴定：M为DNAmarker；1表示以未转基因水稻DNA为模板；2表示未加模板的对照；3-12表示以转基因水稻DNA为模板。B为转基因小麦植株的鉴定：M为DNA marker；1表示以未转基因水稻DNA为模板；2表示未加模板的对照；3-11表示以转基因水稻DNA为模板。
图3是pTa95v2转基因水稻的RT-PCR鉴定。
图4是pTa95v2转基因水稻花粉的I2-KI染色观察。A为未转基因的水稻花粉；B为转基因水稻的花粉；C为未转基因的小麦花粉；D为转基因小麦的花粉。
图5是pTa95v2转基因水稻与非转基因对照植株的形态
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T3连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体p2300由本实验室改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA2300。
实施例1.合成BarnaseW核苷酸片段
根据Barnase的高级结构、解淀粉芽孢杆菌密码子的偏好性、单子叶植物密码子的偏好性对Barnase的核苷酸序列进行改造，同时还对决定Barnase温度敏感性的重要氨基酸进行了点突变（Q15I,T16R,K19R,G65S,K66A和K108R）。改造并做完点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO：1，命名为BarnaseW，将该序列由上海英骏生物技术公司合成获得。
实施例2.植物表达载体pTa95v2的构建
设计用于扩增PTaPSG719的特异性引物：
引物1：5’-aagctt CGCATTCGCAAGGTTCACT-3’
引物2：5’-ctgcag GCATTTCTATATGATATGACCGGCCAA-3’
以小麦的基因组DNA为模板，用上述引物扩增PTaPSG719，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T3，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列是预期的PTaPSG719启动子序列，如序列表中SEQ ID NO:3所示。
设计用于扩增BarW-N的特异性引物：
引物3：5’-ctgcag ATGGCGCAAGTTATTAATACGTTC-3’
引物4：5’-gtcgac TCACCAGCCTAGAGCCTGC-3’
以人工合成的BarnaseW基因为模板，用上述引物扩增BarW-N，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T3，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列是预期的BarW-N序列，如序列表中SEQ ID NO:4所示。
设计用于扩增Tmas的特异性引物：
引物5：5’-gtcgac GATAATTTATTTGAAAATTCATAAGAAAAGC-3’
引物6：5’-tctaga TTGGACTCCCATGTTGGC-3’
以质粒pFGC5941为模板，用上述引物扩增Tmas，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T3，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列是预期的Tmas序列，如序列表中SEQ ID NO:5所示。
设计用于扩增PTaPSG076的特异性引物：
引物7：5’-tctaga GTGTTGCGGACCCAGGTT-3’
引物8：5’-ggatcc GCTCGCTCGCCGCTAGCT-3’
以小麦的基因组DNA为模板，用上述引物扩增PTaPSG076，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T3，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列是预期的PTaPSG076启动子序列，如序列表中SEQ ID NO:6所示。
设计用于扩增BarW-C的特异性引物：
引物9：5’-ggatcc ATGGTCGCGAGCAAGGGTAATCT-3’
引物10：5’-cccggg TCACCTAATCCTGGTGAAAGTTTG-3’
以人工合成的BarnaseW基因为模板，用上述引物扩增BarW-C，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T3，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列是预期的BarW-C序列，如序列表中SEQ ID NO:7所示。
设计用于扩增Tnos的特异性引物：
引物11：5’-cccggg GATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3’
引物12：5’-ggtacc GATCTAGTAACATAGATGACACCGCG-3’
以质粒pBI121为模板，用上述引物扩增Tnos，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T3，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列是预期的Tnos序列，如序列表中SEQ ID NO:8所示。
引物1中序列aagctt是HindIII的酶切位点，引物2和3中序列ctgcag是PstI的酶切位点，引物4和5中序列gtcgac是SalI的酶切位点，引物6和7中序列tctaga是XbaI的酶切位点，引物8和9中序列ggatcc是BamHI的酶切位点，引物10和11中序列cccggg是SmaI的酶切位点，引物12和13中序列ggtacc是KpnI的酶切位点，引物14中序列gagctc是SacI的酶切位点。
将上述测序验证分别连有PTaPSG719、BarW-N、Tmas、PTaPSG076、BarW-C和Tnos片段的pEASY-T3载体，分别根据引物两侧所带的酶切位点进行双酶切，得到序列正确、两端带有相应酶切位点的上述片段。在pCAMBIA2300载体中依次连入上述片段，最终得到植物表达载体pTa95v2，如图1所示。
实施例3.农杆菌介导的水稻和小麦的遗传转化
利用热激法将植物表达载体pTa95v2转入农杆菌AGL0菌株。
用农杆菌侵染水稻胚性愈伤，暗中共培养2-3天，然后经过两步抗性筛选、预分化、分化和生根培养等步骤，最终获得具有卡那霉素抗性的转基因水稻（转pTa95v2水稻）T0代植株。
以小麦成熟胚为材料暗中诱导愈伤。用农杆菌侵染小麦愈伤组织，暗中共培养3天。将与农杆菌共培养后的愈伤置于加有头孢噻肟的诱导培养基上暗中恢复培养1周，然后转到筛选培养基上筛选4-6周，将抗性的愈伤转入分化培养基诱导芽的分化，再将分化的芽转入生根培养基进行生根培养，最终获得具有卡那霉素抗性的转基因小麦（转pTa95v2小麦）T0代植株。
实施例4.转基因植株的分子鉴定
设计引物对转基因植株进行PCR鉴定。
引物13：5’-CAAGGCACGGAATAGGATGT-3’
引物14：5’-GGTAGCGGATCAGGTAGTCG-3’
反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸40秒；30个循环；72℃延伸10分钟。扩增的是TaPSG076启动子和BarW-N的部分片段，长度为401bp。鉴定结果如图2所示，利用农杆菌转化获得的再生水稻和小麦植株均为转pTa95v2基因的阳性植株。
实施例5.RT-PCR表达分析
取pTa95v2转基因水稻的根、茎、叶、花粉处于减数分裂时期的穗、花粉处于单核期的穗和花粉处于双核及三核时期的穗，提取RNA，用oligo-dT进行反转录。
以cDNA作为模板，以水稻ACTIN基因作为内参，分析TaPSG719启动子驱动的BarW-N基因和TaPSG076启动子驱动的BarW-C基因在转基因水稻中的表达情况。
RT-PCR鉴定用引物为：
引物15：ATGGCGCAAGTTATTAATACGTTC
引物16：TCACCAGCCTAGAGCCTGC
引物17：ATGGTCGCGAGCAAGGGTAATCT
引物18：TCACCTAATCCTGGTGAAAGTTTG
引物19：ACCTTCAACACCCCTGCTATG
引物20：GCAATGCCAGGGAACATAGTG
其中引物15和引物16是BarW-N基因的检测引物，其扩增片段大小为111bp；引物17和引物18是BarW-C基因的检测引物，其扩增片段大小为231bp；引物19和引物20是水稻内参基因ACTIN的分析引物，其扩增片段大小为554bp。PCR检测体系和程序是：
PCR反应条件：94℃，预变性5分钟；94℃，变性30秒；58℃，退火30秒；72℃，延伸30秒；28个循环，72℃，10分钟。
反应结束后，对PCR产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR检测结果如图3所示，在根、茎、叶和不同发育时期的穗等器官中，只在花粉处于双核及三核期的穗中检测到了BarW-N和BarW-C基因的表达。
实施例6.转基因植株花粉的I2-KI染色分析
I2-KI的配制：称取2g KI溶于10ml蒸馏水中，然后加入1g I2，待全部溶解后，加蒸馏水定容至300ml。
染色：取少量花粉置于载玻片上，滴上1-2滴I2-KI染色液，5分钟后在显微镜下观察。
结果判断：凡是染成蓝黑色的为含有淀粉的活力的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。
由于T0代转基因植株均为杂合，并且本发明中所选启动子TaPSG719启动子和TaPSG076启动子均为花粉发育晚期特异表达的启动子，因此预期的结果是在T0代转基因植株中有50%的花粉活力弱或无活力。对T0代转基因植株的染色结果表明有50%花粉活力弱或无活力，其中转基因水稻T0系的染色结果如图4B所示，转基因小麦T0系的染色结果如图4D所示，该结果说明本发明所述构建体能够有效的调控植物花粉的育性。
实施例7.转基因植株pTa95v2的形态分析
Barnase基因在营养器官的微量表达就可以导致转基因植株的死亡或严重畸形，从而影响转基因植株在生产实践中的应用与推广。将转基因水稻pTa95v2与非转基因水稻对照同时种植于田间，对其发育过程和植株形态进行比较观察，如图5所示，转基因植株与非转基因植株相比没有明显差别，说明用本发明所述的方法调控植物花粉育性不会对植物的正常生长发育造成任何不利影响。pTa95v2转基因小麦在种植过程中也未发现与对照组非转基因小麦之间有除花粉育性外的其他发育和形态差异。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  未名兴旺系统作物设计前沿实验室(北京)有限公司
 <120>  一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法
<150>  201110351469.6
<151>  2011-11-08
 
<160>  28   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  336
<212>  DNA
<213>  解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
 
<400>  1
atggcgcaag ttattaatac gttcgatggt gttgccgact acctgatccg ctaccaccga     60
 
ttaccggaca actatatcac caagagcgag gcgcaggctc taggctgggt cgcgagcaag    120
 
ggtaatctgg cggatgtggc accaggtaag tccattggcg gggatatttt tagcaatcgt    180
 
gagggcaagc taccatccgc ctccgggcga acctggcggg aggccgacat caattacacc    240
 
agcggcttta ggaacagcga tagaatcctg tatagctccg attggctcat ctataagacc    300
 
acggatcact accaaacttt caccaggatt aggtga                              336
 
 
<210>  2
<211>  336
<212>  DNA
<213>  解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
 
<400>  2
atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag     60
 
ctacctgata attacattac aaaatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa    120
 
gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg    180
 
gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtg aagcggatat taactataca    240
 
tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca    300
 
acggaccatt atcagacctt tacaaaaatc agataa                              336
 
 
<210>  3
<211>  1771
<212>  DNA
<213>  小麦（Triticum aestivum L.）
 
<400>  3
cgcattcgca aggttcactt tcttggaatg cgagtgcgcc cagctgtcaa catgtcgcgt     60
 
gctgagcgct tcctcttaat tttattttta tttgtacgta ttttttggat tttaaatgtt    120
 
tttttggttc ttttggcttt tttgtttttg cctgtttctt tttatctttt ttccgaagca    180
 
tacgtgtgct tcttgggata aaaatctatg ctttaaagag aagcacaaat tgcttctcgt    240
 
gaaagcacat atttcttgaa gtacatctgt gctcctcgaa aaggaaaaaa aaagtgcttc    300
 
catgagaaac acagagttgc ttctgcaaga tgcacaattg tgcttgttgg aaaggaattt    360
 
ttttcttcca tgcgaagtac atttttgcta ttcgtggaag cagagatttg cctccgcgat    420
 
gtgcttctcg gagaaaaaac attggagctt cttgaaaagg aaaagaagta aaaaatcgca    480
 
accatgcttc ctggctctat tttatttggt tgccgggttt ttcggttttc gtttttatag    540
 
gattttttgt ttctcgtgga agcagagatt ttttttcaga ttttttttct ctggcctttt    600
 
ccgaactttt ccatcaagac ctattaacgt gggatctagt tatgaagatc ttgacgcgag    660
 
aaatccaatg atgaaaccgg ttaggaatgc ggacgcacat ttcaagagat atatattttt    720
 
ggaataattg gaactacaga aaagcaaaga aaaaaccatg ttgcgacaag tggtgcacat    780
 
tgtcagcgcc taggaagatg ggtgtgacct ttgtaagggc taccgtcagt tgatgatttt    840
 
ggagtatcca gcgcgctgga agaattctat tccgtgcatg gcgcatagaa tagttatgtc    900
 
gggcacccga tagttgcggg ctgaacgata tccgcaggtt cttttgtgct cccttaattt    960
 
ttttgctttt tttgttttct ctctttttcc tcttggttat ttctggtttt tctcctttac   1020
 
cccttttggt ttttattctt tacttttgta ccatattttc ttttcccatg ttatttttga   1080
 
acacgtgatg aacgttaaaa aatatgataa acattttaaa aatacaccaa acatgttttc   1140
 
atttcttatt catttttaga tgttcgtttc cttttaaatg ttttgttttt atacacgcaa   1200
 
acttgaacaa tttcttaggc aatgaacaat tttaatgaaa ctatgaaaac tgaaaaaata   1260
 
tgtgatgacc atttcttggc tatacaattg ccatacctca agtaggcaat tcacatattt   1320
 
tgaatacgtg aaaattattt taaaattttg acagcagttc tttaatacag gattgacatt   1380
 
ttttcatatg ggtgagaaac atttttcata tacacataaa agggtgagcg gcaaggcacg   1440
 
gaataggatg tctcatccaa gagaggagga gcgtcacatg ggttcatgac cggggggcgg   1500
 
tctcagtcgg gaaagaaggg tgtgttgatg tgggagaaaa ctagtgagct caatataatt   1560
 
aacaacgaca ctggtgctta gtttccgtct atagaaaatc acccaagtct ttttcttata   1620
 
taaaagacat aagtacgtag aagaaaatcc acacctcaca tatatatgca tgtctttagt   1680
 
gctaaaattg gagctcggtc cctaaaagga aatttggagc tcggtcgtcg tgtgggtggg   1740
 
cgttttggcc ggtcatatca tatagaaatg c                                  1771
 
 
<210>  4
<211>  111
<212>  DNA
<213>   人工合成
 
<400>  4
atggcgcaag ttattaatac gttcgatggt gttgccgact acctgatccg ctaccaccga     60
 
ttaccggaca actatatcac caagagcgag gcgcaggctc taggctggtg a             111
 
 
<210>  5
<211>  252
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  5
gataatttat ttgaaaattc ataagaaaag caaacgttac atgaattgat gaaacaatac     60
 
aaagacagat aaagccacgc acatttagga tattggccga gattactgaa tattgagtaa    120
 
gatcacggaa tttctgacag gagcatgtct tcaattcagc ccaaatggca gttgaaatac    180
 
tcaaaccgcc ccatatgcag gagcggatca ttcattgttt gtttggttgc ctttgccaac    240
 
atgggagtcc aa                                                        252
 
 
<210>  6
<211>  2254
<212>  DNA
<213>  小麦（Triticum aestivum L.）
 
<400>  6
gtgttgcgga cccaggttcg atctccggat caccttactt cttcactttt ttttgagggg     60
 
atcacttttt ctcttctttt ctctgcaagc gctcctcctc ctccgcacgt gtatgggccg    120
 
gcccatgggc gtgaggtccc atgctgtttc ttcttatttc tgtttatgtt tttcctattt    180
 
ataattaatt cgagattttt aaaaattcca aatttcagaa agttgtgacg tgactttttt    240
 
tagaaatcat aaattgaatt tcagaaagtt gtgagctgaa gattttttta gaaatcataa    300
 
aatattcgtg aatgcaaaaa atggtaggga actaaaatat tgttcaagat ttttaaaaac    360
 
tgtttgcata ttatttaaaa atcacgattt caagtaaatg ttcatgattt ttaaaaagtg    420
 
atcgtgaacc cacgatatat tcaacgattt gaaaattcag gatttttaaa aattcaaaat    480
 
ttcagaaagt tgtgacgtga agattttttt tagaaatcat aaattcaatt ttagaaagtt    540
 
gtgagctgaa gagttttttt agaaatcata aaattttcat gaattcaaaa aatggtaggg    600
 
aaatcataaa ttgttcaaga tttttaaaaa ctgtttgcat attatttaaa aatcatgatt    660
 
tcaagtaaag gttcatgatt tttaaaaagt gtcagtgaat cctaaaccta ttcaacaatt    720
 
tgtaaattcg ggatttttaa aaattcaaaa tttcagaaag ttgtgatgtg aagatttttt    780
 
ttagaaatca taaattcaat ttcagaaagt tgtgagctga agtttttaga aatcataaaa    840
 
tgttcgtgaa atcaaaaaat ggtacgggaa atcattaatt gttgaagatt taaaaaaaaa    900
 
tatttgcata ttatttaaaa ataacgattt caagtaaatg ttcatgattt ttaaaaactg    960
 
attgtgaatc caaaaatatt cagaaattta aaataatgtc catgaaattt tagaaaatgt   1020
 
tcacaaaaaa ttcaaacaaa gacgtaaatt acgaacaaaa tgaaccatcg cttagataaa   1080
 
gctcttttag gggaaataca gaggttgttt tatgatttta tttaatccat cacacattgg   1140
 
ttaagaaggg tttttgtgtt ctatacaacg cttggcccca gaaaaattaa cacaacttct   1200
 
atgggttaac ttttgtaagc tatatgaaaa tgactaaatg tctaatattc ctcaaaacat   1260
 
agctatcttt attctggtat tgtagttgta ctggttatga aaagcaccac gatgctaggt   1320
 
caaggcgaga cacatcattt atcagtctag cttaggtagg gttcatcaat gcagcttgct   1380
 
tagacaaaag atatttcatt gtggcgcctt aggagatcaa gtcatgagac catcacgttt   1440
 
tcagcttttg aaacgacttc ttgaaagccc cttatctcat cgtgacatga ttcagatgta   1500
 
gtttatgaaa tgacattttt aaagtcctta tcttatcctg acatagtctg attgtttttt   1560
 
cccgttgcaa cgcacgggtg gcatatttgc tagtagtcct aaacaaaggg taatgtgctt   1620
 
cggcccgtta aagatttggc tgacgcaagt ccgttgttga aaaacggagc ccaaaacaac   1680
 
tcacggaaga gagtaggaaa agaaaaggga gcacgaatct taaagcagaa atcaacggct   1740
 
aaaaacgttg atcgggccaa acttaatttt ctggcgattt gcatatggct aaggtgttct   1800
 
tgagccgttg tgcacaagca cagctgccag agtgcataat cgccagccct tattaagccc   1860
 
tgctccaaat ttggcgccaa gcctacctta acttagcaac cacaaactca tcttctattt   1920
 
acgctccgct cgccgcgcag ccgacggttc ccttccttcc atcccacaaa acccccggca   1980
 
ccatcgccat tgatcgaccg cctcctccga cccaccacac cattaacctg aaacggaggg   2040
 
ggcgctgccc atcgccgcta tcacccatcc cgacgatcga acggcgccac gtacggcggc   2100
 
gacggtcaca ttgcacattg cacgctccgc ccacgccgag ggaggtcatc catcggccta   2160
 
gcatctccta aggtccgacg gccgcggtcc cagccccggc cgtcggtgcg cattcgcctc   2220
 
cgttcttgga taagctagct agcggcgagc gagc                               2254
 
 
<210>  7
<211>  231
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  7
atggtcgcga gcaagggtaa tctggcggat gtggcaccag gtaagtccat tggcggggat     60
 
atttttagca atcgtgaggg caagctacca tccgcctccg ggcgaacctg gcgggaggcc    120
 
gacatcaatt acaccagcgg ctttaggaac agcgatagaa tcctgtatag ctccgattgg    180
 
ctcatctata agaccacgga tcactaccaa actttcacca ggattaggtg a             231
 
 
<210>  8
<211>  253
<212>  DNA
<213>  人？
 
<400>  8
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg     60
 
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc    120
 
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac    180
 
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct    240
 
atgttactag atc                                                       253
 
 
<210>  9
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  9
aagcttcgca ttcgcaaggt tcact                                           25
 
 
<210>  10
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  10
ctgcaggcat ttctatatga tatgaccggc caa                                  33
 
 
<210>  11
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  11
ctgcagatgg cgcaagttat taatacgttc                                      30
 
 
<210>  12
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  12
gtcgactcac cagcctagag cctgc                                           25
 
 
<210>  13
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  13
gtcgacgata atttatttga aaattcataa gaaaagc                              37
 
 
<210>  14
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  14
tctagattgg actcccatgt tggc                                            24
 
 
<210>  15
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  15
tctagagtgt tgcggaccca ggtt                                            24
 
 
<210>  16
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  16
ggatccgctc gctcgccgct agct                                            24
 
 
<210>  17
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  17
ggatccatgg tcgcgagcaa gggtaatct                                       29
 
 
<210>  18
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  18
cccgggtcac ctaatcctgg tgaaagtttg                                      30
 
 
<210>  19
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  19
cccggggatc gttcaaacat ttggcaataa ag                                   32
 
 
<210>  20
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  20
ggtaccgatc tagtaacata gatgacaccg cg                                   32
 
 
<210>  21
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  21
caaggcacgg aataggatgt                                                 20
 
 
<210>  22
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  22
ggtagcggat caggtagtcg                                                 20
 
 
<210>  23
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  23
atggcgcaag ttattaatac gttc                                            24
 
 
<210>  24
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  24
tcaccagcct agagcctgc                                                  19
 
 
<210>  25
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  25
atggtcgcga gcaagggtaa tct                                             23
 
 
<210>  26
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  26
tcacctaatc ctggtgaaag tttg                                            24
 
 
<210>  27
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  27
accttcaaca cccctgctat g                                               21
 
 
<210>  28
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工合成引物
 
<400>  28
gcaatgccag ggaacatagt g                                               21
 
 

Claims (2)

1.一种表达盒, 其特征是含有两个不同的花粉发育晚期特异表达启动子，每个启动子分别与Barnase基因的N端或C端相连，其中所述的Barnase基因的N端序列如SEQ ID NO:4所示，C端序列如SEQ ID NO:7所示，所述的花粉发育晚期特异表达启动子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示。
2.一种调控植物花粉育性的的方法，其包括：
（1）构建权利要求1所述的表达盒；
（2）将步骤（1）获得的表达盒导入植物细胞；
（3）再生出转基因植物；
其特征在于所述转基因植物含有部分失活的花粉。
3. 权利要求2所述的方法，其中所述的植物为单子叶植株。
4. 权利要求3所述的方法，其中所述的单子叶植株为水稻或小麦。
CN201280003773.4A 2011-11-08 2012-11-07 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法 Active CN103261419B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280003773.4A CN103261419B (zh) 2011-11-08 2012-11-07 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011103514696 2011-11-08
CN201110351469 2011-11-08
CN201110351469.6 2011-11-08
PCT/CN2012/084200 WO2013067928A1 (zh) 2011-11-08 2012-11-07 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法
CN201280003773.4A CN103261419B (zh) 2011-11-08 2012-11-07 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103261419A CN103261419A (zh) 2013-08-21
CN103261419B true CN103261419B (zh) 2015-06-10

Family

ID=48288529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280003773.4A Active CN103261419B (zh) 2011-11-08 2012-11-07 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN103261419B (zh)
WO (1) WO2013067928A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103740742B (zh) * 2013-08-13 2015-11-25 深圳市作物分子设计育种研究院 一种调控植物花粉育性的方法及其应用
CN103910788A (zh) * 2014-04-17 2014-07-09 首都师范大学 具有mRNA剪接功能的蛋白质及其应用
CN113337631A (zh) * 2021-04-26 2021-09-03 福建农林大学 一种香蕉花粉活力检测的分子探针及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009147179A2 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Nordsaat Saatzuchtgesellschaft Mbh Process of producing male sterile monocotyledonous plants

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101491211A (zh) * 2009-02-25 2009-07-29 西南大学 一种基于植物显性核不育系的全保持方法
CN101491210A (zh) * 2009-02-25 2009-07-29 西南大学 一种植物基因工程雄性不育系的创建方法
US20120283136A1 (en) * 2009-06-24 2012-11-08 The University Of Southern California Compositions and methods for the rapid biosynthesis and in vivo screening of biologically relevant peptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009147179A2 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Nordsaat Saatzuchtgesellschaft Mbh Process of producing male sterile monocotyledonous plants

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Functional analysis of cis-regulatory elements within the promoter of the wheat pollen-specific gene PSG076;Ling Chen等;《第十一届全国植物基因组学大会摘要集》;20100821;第86页第1段 *
Isolation and heterologous transformation analysis of a pollen-specific promoter from wheat (Triticum aestivum L.);Ling Chen等;《Molecular Biology Reports》;20090628;第37卷(第2期);第743页左栏第3段、右栏第1段 *
Isolation and Partial Characterization of a Novel Pollen-specific cDNA with Multiple Polyadenylation Sites from Wheat;Yong-Feng JIN等;《Acta Biochimica et Biophysica Sinica》;20040731;第36卷(第7期);467-476页 *
Step-wise mutation of Barnase to Binase A Procedure for Engineering Increased Stability of Proteins and an Experimental Analysis of the Evolution of Protein Stability;Luis Serrano等;《Journal of Molecular Biology》;19930920;第233卷(第2期);第309页左栏倒数第1段 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013067928A1 (zh) 2013-05-16
CN103261419A (zh) 2013-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106749574B (zh) 一种植物雄性育性相关蛋白ms6021及其编码基因与应用
CN101182523B (zh) 植物花药特异性启动子及其应用
CN103667211A (zh) 影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途
CN103261419B (zh) 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法
CN105111295B (zh) 抗根腐病和纹枯病的转wmyb-r基因小麦的培育方法及其相关生物材料
WO2015154689A1 (zh) 植物花药特异表达启动子pTaASG027的鉴定和应用
CN103667296B (zh) 一个组成型表达启动子及其应用
CN110818784B (zh) 水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用
CN105713079B (zh) 蛋白质及其相关生物材料在提高植物产量中的应用
CN103261417A (zh) 一个植物花粉发育晚期特异表达启动子及其应用
JP3538428B2 (ja) 植物プロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法
CN105585623B (zh) 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
CN103172717B (zh) 植物耐低钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用
CN102559676B (zh) 水稻根特异性启动子及其应用
CN106191073A (zh) Hox3基因在改良棉纤维伸长性状中的用途
CN114573669B (zh) 蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用
CN104109682B (zh) 一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用
CN107365772A (zh) 一种植物花粉特异性启动子psp1及其应用
CN109504703B (zh) 利用p5126-ZmMs1D构建体创制玉米显性核雄性不育系及其育种制种应用方法
KR101441916B1 (ko) 벼 Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도
CN109912703B (zh) 蛋白质OsARE1在调控植物衰老中的应用
CN107739403B (zh) 一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用
KR101554209B1 (ko) 벼 Os05g0543000 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도
KR101441945B1 (ko) 벼 Os04g0585900 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도
CN109504702B (zh) 利用p5126-ZmMs7M构建体创制玉米显性核雄性不育系及其育种制种应用方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: XINGWANG INVESTMENT PTY LTD.

Effective date: 20140114

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140114

Address after: 100085 Haidian District West Road, No. 39, north of the biological city of Beijing

Applicant after: WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) CO., LTD

Applicant after: Xingwang Investment Pty Ltd.

Address before: 100085 Haidian District West Road, No. 39, north of the biological city of Beijing

Applicant before: WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) CO., LTD

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170714

Address after: 102206, Changping District, Zhongguancun Beijing Life Science Park medical industry park, No. 9, building 4, 405

Patentee after: WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) CO., LTD

Address before: 100085 Haidian District West Road, No. 39, north of the biological city of Beijing

Co-patentee before: Xingwang Investment Pty Ltd.

Patentee before: WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) CO., LTD

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210830

Address after: 102206 room 401-2, 4 / F, 101-1-5 / F, area 1, yard 8, shengshengyuan Road, Zhongguancun Science and Technology Park, Changping District, Beijing

Patentee after: Beijing Zhiyu wheat Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 102206 Beijing Changping District Zhongguancun Life Science Park Medical Industrial Park 9 Building 4 floor 405

Patentee before: Weimingwang system crop Design Frontier Laboratory (Beijing) Co.,Ltd.